CN114956051A - 一种碳纳米点及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种碳纳米点及其制备方法和用途，所述制备方法包括如下步骤：1)将抗生素、叶酸与水混合得到混合液；2)将步骤1)的混合液进行水热反应，收集反应产物即得到碳纳米点。所述碳纳米点具有生物相容性，能用于制备抗菌和/或促成骨产品中，进而治疗既有骨缺损和感染的各类疾病，例如牙周炎、种植体周围炎、骨髓炎、外伤。

Description

一种碳纳米点及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及一种碳纳米点及其制备方法和用途。
背景技术
骨构成了面部的支架，是颌面部的重要结构，承担咀嚼、吞咽、呼吸、语言等多种生理功能，骨缺损对患者身心健康产生重要影响。既有骨缺损和感染的各类疾病，例如牙周炎、种植体周围炎、骨髓炎、外伤等疾病，骨结构完整性被破坏，形成较大间隙，目前尚无十分有效的同时具备抗菌和促进骨再生的治疗药物。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种碳纳米点及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种碳纳米点的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
1)将抗生素、叶酸与水混合得到混合液；
2)将步骤1)的混合液进行水热反应，收集反应产物即得到碳纳米点。
本发明还提供所述制备方法得到的碳纳米点。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括所述碳纳米点和药学上可接受的载体或辅料。
本发明还提供所述碳纳米点在制备抗菌和/或促成骨产品中的用途。
如上所述，本发明的碳纳米点及其制备方法和用途，具有以下有益效果：该材料具有良好的生物相容性，价格低廉，制备简单，同时具有抗菌和促成骨双功能，且成骨效果和抗菌效果明显，可以避免抗生素使用导致的细菌多药耐药性，为解决感染性骨缺损如种植体周围炎、牙周炎、骨髓炎的治疗提供了新思路。
附图说明
图1显示为本发明的碳纳米点(CDots)的理化性质表征，(a)为CDots的紫外吸收谱图(黑线)和光致发光(PL)谱图(红线)。右上插图：左侧为CDots溶液日光下的照片，右侧为紫外光下照片。(b)CDots的透射电子显微镜(TEM)照片。
图2显示为本发明的CDots的毒性与细胞内分布，(a)CCK-8检测结果：BMSCs细胞分别用0、200、400、600、800、1000、1200、1400μg/mL浓度的CDots处理24小时后的细胞增殖率；(b)细胞凋亡结果：流式细胞术检测0、500、750、1000μg/mL浓度CDots处理BMSCs细胞24小时对凋亡影响的结果；(c)500μg/mL CDots处理后BMSCs细胞24小时后的生物成像：使用从左至右分别为普光照片、激光共聚焦显微镜(CLSM)照片、CLSM与普光合并图片。
图3显示为本发明的CDots诱导BMSCs细胞成骨分化：(a)ALP染色结果：BMSCs细胞分别使用庆大霉素500μg/mL，叶酸500μg/mL，CDots 500/mL处理14天后ALP染色结果，40×；(b)茜素红染色结果：BMSCs细胞分别使用庆大霉素500μg/mL，叶酸500μg/mL，CDots 500/mL处理21天后茜素红染色结果，40×；(c)ALP染色使用ImageJ半定量柱状图；(d)茜素红染色使用ImageJ半定量柱状图；*表示P<0.05，**表示P<0.01。
图4显示为本发明的CDots体外抗菌能力检测：(a)扫描电镜：分别使用CDots0、100、500、1000μg/mL与接种牙龈卟啉单胞菌的纯钛片共培养24小时后的扫描电镜结果；(b)使用ImageJ对扫描电镜结果进行抗菌能力分析；*表示P<0.05，**表示P<0.01。
具体实施方式
本发明提供一种碳纳米点的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
1)将抗生素、叶酸与水混合得到混合液；
2)将步骤1)的混合液进行水热反应，收集反应产物即得到碳纳米点。
本发明步骤1)中对抗生素、叶酸的比例没有特别限制。在一种实施方式中，所述抗生素和叶酸的比例为1：1。
所述抗生素选自抗细菌抗生素或抗真菌抗生素。
具体的，所述抗生素例如为庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、西索米星或链霉素。
本发明步骤1)中对水的使用量没有特别限制，只要保证抗生素、叶酸可以在水中充分分散即可，本领域技术人员可以根据实际应用情况、原料情况以及产物要求进行选择和调整。在一种实施方式中，抗生素、叶酸的总质量和水的质量比为1：2～20。在一较佳的实施方式中，抗生素、叶酸的总质量和水的质量比为1：3～15。在一更佳的实施方式中，抗生素、叶酸的总质量和水的质量比为1：4～10。
本发明对所述水热反应的温度没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际常规水热反应的条件、原料情况以及产物要求进行选择和调整。在本发明的某些实施方式中，所述水热反应的温度为100～300℃。在一较佳的实施方式中，所述水热反应的温度为150～250℃。在一更佳的实施方式中，所述水热反应的温度为180～220℃。
本发明对所述水热反应的时间没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际常规水热反应的条件、原料情况以及产物要求进行选择和调整。在本发明的某些实施方式中，所述水热反应的时间为3～15小时。在一较佳的实施方式中，所述水热反应的时间为5～12小时。在一更佳的实施方式中，所述水热反应的时间为6～10小时。
在本发明的某些实施方式中，步骤2)中还包括将收集的反应产物过滤。
过滤的目的是除去较大的颗粒。在本发明的某些实施方式中，通过0.22μm滤膜过滤。
在本发明的某些实施方式中，步骤2)中还包括将滤液冻干得到粉末。
滤液冻干可以采用现有技术中的真空冻干技术。冻干时间不做具体限制，可根据样品量等条件调整，只要得到的粉末符合常规冻干粉的标准即可。冻干时间例如为24～72h。
在本发明的某些实施方式中，步骤2)中还包括将冻干后得到的粉末溶解并渗析。优选的，渗析为避光渗析。
本发明对渗析的方法没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际常规渗析的条件以及产物要求进行选择和调整。在本发明的某些实施方式中，渗析为用水渗析12～36小时。
在本发明的某些实施方式中，步骤2)中还包括渗析后收集渗析袋外液体再次冻干。
本发明还提供所述制备方法得到的碳纳米点。
所述碳纳米点的尺寸没有特别限制，可根据实际需求制备不同大小的碳纳米点。在本发明的某些实施方式中，所述碳纳米点的直径为8～16nm。
所述碳纳米点具有蓝色荧光。
所述碳纳米点能被细胞摄取。所述碳纳米点具有良好的生物相容性。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括所述碳纳米点和药学上可接受的载体或辅料。
所述药物组合物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述药物组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
“药学上可接受的”是指当药物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明还提供所述碳纳米点或所述药物组合物在制备抗菌和/或促成骨产品中的用途。
在一较佳的实施方式中，所述碳纳米点用于制备抗菌和促成骨双功能产品中。
具体的，所述碳纳米点用于制备治疗感染性骨缺损、牙周炎、种植体周围炎、骨髓炎、外伤产品中的用途。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1碳纳米点的制备
采用水热法制备，称取1g庆大霉素和1g叶酸溶解于10ml双蒸水中，将搅拌均匀的混合物转移至不锈钢高压反应釜中，放置于恒温烘箱200℃加热8h。待反应完成后取出高压反应釜，冷却至室温，收集反应釜内液体，0.22μm滤器过滤。滤液置于真空冻干机反应48h，收集粉末溶解于20ml双蒸水中。将液体转移至渗析袋(MW14000)中，加入200ml双蒸水，避光渗析24h，可见棕色液体大部分位于渗析袋外，收集袋外液体再次冻干，称重后溶解于双蒸水。
实施例2碳纳米点的表征
透射电镜
利用JEM-2100F场发射透射电子显微镜，在200kV的加速电压下拍摄透射电子显微镜(TEM)照片。
荧光紫外吸收光谱
用Lambda 950紫外可见分光光度计进行紫外可见吸收光谱的检测。
EDS谱
EDS由Inca X-Max仪器测量。
结果如图1所示，在暗室内紫外光照射下则发出蓝色的荧光(图1a)，紫外吸收谱图和光致发光(PL)谱图结果显示，CDots在330nm处有紫外吸收峰；在405nm激光的激发下，CDots的PL发射峰集中在440nm处，为单一发射峰。通过透射电子显微镜(TEM)观察到CDots形态均匀，平均直径约为12nm(图1b)。
实施例3碳纳米点的毒性测试
CCK-8实验：取对数生长期细胞，计数细胞浓度为5×103个/mL，于96孔板每孔加入200μL细胞悬液，使每孔细胞数量为1×103个，于37℃、5％CO2培养箱培养24小时，使细胞贴壁。吸去培养基，每孔加入100μL含不同浓度碳点的培养基，培养24小时。避光条件下吸去培养基，向每孔中加入100μL培养基、10μL的CCK-8溶液，继续置于37℃、5％的CO2培养箱中培养1小时后，应用酶标仪于波长450nm测吸光度值。
凋亡实验：将细胞以2×105细胞/孔的密度接种在6孔板中，并培养过夜使细胞贴壁。吸去培养基，每孔加入2mL含不同浓度碳点的培养基，培养24小时。收集培养基到离心管内备用，消化细胞后将旧培养基一并加入对应离心管中，离心(1000r/min，5min，4℃)收集细胞并用冷PBS洗涤两次，加入100μL结合缓冲液重悬细胞。按照凋亡试剂盒说明书，加入5μL Annexin V/FITC溶液轻轻混匀后室温避光孵育10min，再加入5μL的PI(碘化丙啶)溶液并加400μL PBS，立即使用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。
结果如图2所示，CDots在0到1000μg/mL的浓度区间内不会对BMSCs的增殖和凋亡产生明显的影响，具有良好的生物相容性和生物安全性(图2a、b)。使用激光共聚焦显微镜(CLSM)显示(图2c)，BMSCs细胞可检测到蓝色荧光，CDots被BMSCs细胞摄取。
实施例4CDots诱导BMSCs细胞成骨分化
碱性磷酸酶染色(ALP)及半定量：取对数生长期BMSCs P3细胞，以5×104个/孔接种于12孔板，培养贴壁后，吸去培养基，均加入含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50mg/L维生素C、1×10-7mmol/L地塞米松的α-MEM培养基，除对照组之外的各组加入对应浓度的药物，每3天换液，培养14天。固定并按照碱性磷酸酶试剂盒说明染色，使用光镜观察蓝紫色染色并拍照，使用ImageJ半定量分析。
茜素红染色及半定量：取对数生长期BMSCs P3细胞，计数细胞，以5×104个/孔接种于使用1％明胶包被过的6孔板中，培养24小时，使细胞贴壁。设置5组同碱性磷酸酶实验，每3天换液，在培养至约2周有钙结节形成时采取隔天半量换液。培养21天后固定并使用1ml0.1％茜素红染液于常温下染色30分钟，清洗后光镜下观察橙红色钙化结节并拍照，使用ImageJ半定量分析。
将庆大霉素、叶酸、CDots分别与加入了成骨诱导液的BMSCs进行共培养，设置只加成骨诱导液作为对照组。培养14天后，进行ALP染色，培养21天后，进行茜素红染色。结果如图3所示，ALP染色结果中CDots组呈蓝紫色的细胞数量明显大于其余三组，且具有统计学差异(P<0.01)(图3a、c)。茜素红染色结果显示，CDots组和叶酸组橙红色钙化结节量明显多于另外两组，叶酸组具有统计学差异(P<0.05)，CDots组不具有明显的统计学差异(P>0.05)(图3b、d)。
实施例5CDots的抗菌能力检测
牙龈卟啉单胞菌在脑心浸液和含有0.0005％血红素、0.0001％甲萘醌和5％脱盐羊血的BHI琼脂中培养。获得细菌并以5000转/分钟离心4分钟，然后重悬于生理盐水中使用。将纯钛片置于24孔板中，然后在标准厌氧条件(80％N2、10％H2、10％CO2，37℃)下在1mL含细菌培养基(106CFU/mL)中培养12小时。加入各组对应药物至孔中，与细菌共培养24小时。用不同浓度的乙醇溶液逐步脱水，利用扫描电子显微镜观测细菌形貌，使用ImageJ对SEM结果进行抗菌能力分析。
结果如图4所示，100、500、1000μg/mL的CDots均能使钛片上的细菌数量明显减少，具有统计学意义(P<0.05)，且500、1000μg/mL浓度组较100μg/mL组效果更加显著。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (11)

1.一种碳纳米点的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
1)将抗生素、叶酸与水混合得到混合液；
2)将步骤1)的混合液进行水热反应，收集反应产物即得到碳纳米点。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗生素和叶酸的比例为1：1；和/或，抗生素、叶酸的总质量和水的质量比为1：2～20。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗生素选自抗细菌抗生素或抗真菌抗生素；优选的，所述抗生素选自庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、西索米星或链霉素。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述水热反应的温度为100～300℃；和/或，所述水热反应的时间为3～15小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中还包括将收集的反应产物过滤；优选的，通过0.22μm滤膜过滤。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中还包括将滤液冻干得到粉末。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中还包括将冻干后得到的粉末溶解并渗析；优选的，步骤2)中还包括渗析后收集渗析后的液体再次冻干。
8.权利要求1-7任一所述的制备方法得到的碳纳米点。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求8所述的碳纳米点和药学上可接受的载体或辅料。
10.权利要求8所述的碳纳米点或权利要求9所述的药物组合物在制备抗菌和/或促成骨产品中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述碳纳米点用于制备治疗感染性骨缺损、牙周炎、种植体周围炎、骨髓炎产品中。
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