CN113197839A - 一种治疗细菌感染糖尿病创面的纳米纤维及其制法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗细菌感染糖尿病创面的纳米纤维及其制法与应用。该纳米纤维包括内核姜黄素纳米晶及外壳聚多巴胺纳米管。使用的天然产物姜黄素具有良好的生物安全性，能诱导巨噬细胞M2型极化，进一步促进伤口愈合。聚多巴胺材料具有优异生物相容性，近红外转换性能良好，光热抗菌效果显著等优点。该纳米纤维的制备工艺简单，成本低，重复性好，适合大规模生产。制得的纳米纤维具有良好的抗菌及促进糖尿病创面修复的能力，具有很高的临床应用价值。

Description

一种治疗细菌感染糖尿病创面的纳米纤维及其制法与应用

技术领域

本发明涉及一种用于治疗细菌感染糖尿病创面的纳米纤维及其制法与其应用，属于药物制剂领域与生物医药技术领域。

背景技术

糖尿病患者创面难以愈合，在世界范围内有着较高的发病率和死亡率，损伤后皮肤完整性、动态平衡和保护功能的恢复对于生活质量与生存至关重要。糖尿病创面愈合受阻多伴随着细菌感染，不仅会加重创面恶化，愈合延迟，甚至导致脓毒症最终死亡。目前，活性成分如抗生素、消炎药物、外泌体、生长因子等为抗击细菌感染、抑制炎症反应和加速创面愈合提供了可行性选择。但上述治疗剂也存在一些弊端，如耐药性、不良反应和高昂的治疗费用等。由于临床抗菌制剂的广泛使用、新型抗生素研发不能和细菌耐药性产生相匹配，导致多重耐药细菌的出现。治疗细菌感染的糖尿病创面首先是要控制创面细菌感染，其次是控制局部微环境的炎症反应，从而实现创面愈合。

光热疗法(PTT)具有选择性高、侵袭性小等优点，近年来备受关注。PTT的机制是通过光敏剂将近红外光的能量转化为热能，用于治疗癌症和细菌感染等疾病。到目前为止，已经有多种抗菌光敏剂报道，如碳基纳米粒子、金纳米粒子等。遗憾的是，它们固有的生物安全性及长期毒性限制了进一步体内和临床上的应用。与上述纳米粒子相比，聚多巴胺(PDA)具有制备工艺简单、生物相容性好、光热转换效率高等优势，其在抗菌治疗方面具备极大的潜力。

姜黄素(Cur)是一种从姜黄属植物的根茎提取的酚性结构色素，具有多种药理作用，如抗炎、抗氧化应激等，且对炎症创面、糖尿病、动脉硬化等具有良好的防治作用。有研究发现其对炎症微环境的调控是通过对局部巨噬细胞逆转实现的，因此，姜黄素是极具潜力的治疗糖尿病创面的药用材料。

目前还没有理想的既能控制糖尿病创面耐药细菌感染同时还能促进伤口愈合的药物，急需开发出一种良好的修复糖尿病创面药物所用的材料。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的是提供一种用于修复糖尿病创面的纳米纤维，即姜黄素聚多巴胺纳米纤维，本发明的第二目的是提供一种该姜黄素聚多巴胺纳米纤维的制备方法，本发明的第三目的是提供该姜黄素聚多巴胺纳米纤维在制备治疗细菌感染糖尿病创面药物或试剂中的应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于治疗细菌感染糖尿病创面的纳米纤维，所述纳米纤维为姜黄素聚多巴胺纳米纤维，所述姜黄素聚多巴胺纳米纤维包括内核和外壳，所述内核为姜黄素纳米晶，所述外壳为聚多巴胺纳米管，所述姜黄素纳米晶是将姜黄素溶解于无水乙醇加水析出获得。

进一步地，所述纳米纤维长度为2～30μm，横截面直径为100～200nm。

进一步地，所述纳米纤维表面的电性为负电。

本发明所述的用于治疗细菌感染糖尿病创面纳米纤维的制备方法，该方法基于溶剂交换法和聚多巴胺的碱性条件下自聚的原理，以姜黄素纳米晶为基材，表面包覆聚多巴胺涂层，包括以下步骤：

(1)姜黄素纳米晶的制备：将姜黄素溶解于无水乙醇中，加入水，静置，析出姜黄素纳米晶，得到含姜黄素纳米晶的溶液；

(3)姜黄素聚多巴胺纳米纤维的制备：在含姜黄素纳米晶的溶液中，加入盐酸多巴胺，调节溶液的pH，搅拌，离心洗涤，冷冻干燥，得到姜黄素聚多巴胺纳米纤维。

进一步地，步骤(1)中，所述姜黄素与无水乙醇的固液比为1：1～3mg：mL，所述无水乙醇与水的体积比1：5～8。

进一步地，步骤(2)中，所述姜黄素与盐酸多巴胺的质量比为1:5～10，所述pH为8.5～8.8，所述搅拌时间为24～72h。

本发明所述的纳米纤维在制备治疗细菌感染糖尿病创面药物或试剂中的应用。

进一步地，所述细菌包括但不限于耐甲氧金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等致病菌。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著的优点：

(1)对姜黄素纳米晶修饰聚多巴胺，使得传统草本提取物姜黄素同贻贝仿生材料聚多巴胺结合，利用聚多巴胺光热响应能力，实现对细菌杀伤，控制糖尿病创面的细菌感染。同时，光热材料聚多巴胺的加入，使得姜黄素具有光热响应性释放特点，使得在细菌感染得到控制后，进一步对创面炎症微环境进行调控。

(2)通过在姜黄素纳米晶表面修饰聚多巴胺，制备姜黄素聚多巴胺纳米纤维，不仅具有良好的光热转换能力，抑制细菌繁殖，同时可以利用姜黄素对炎症微环境巨噬细胞表型的调控功能，促进创面愈合。

(3)本发明制备的纳米纤维是由姜黄素纳米晶表面修饰聚多巴胺制备得到，其中姜黄素纳米晶具有抗炎、促进愈合等作用，聚多巴胺具有制备简单、光热转换性能好、抗菌效果显著等优点

(4)本发明制备的纳米纤维方法简单可控，生产成本低，重复性好，适合大规模生产；纳米材料生物相容性好、安全性高。该纳米纤维可有效控制糖尿病创面细菌感染，促进糖尿病创面愈合，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为姜黄素聚多巴胺纳米纤维的SEM图；

图2为姜黄素纳米晶和姜黄素聚多巴胺纳米纤维的FTIR谱图；

图3为姜黄素聚多巴胺纳米纤维的Raman谱图；

图4为姜黄素聚多巴胺纳米纤维和聚多巴胺纳米管的XRD谱图；

图5为不同浓度姜黄素聚多巴胺纳米纤维的光热性能图；

图6为不同浓度姜黄素聚多巴胺纳米纤维的光热温差统计图；

图7为姜黄素聚多巴胺纳米纤维的光热稳定评价图；

图8为姜黄素聚多巴胺纳米纤维的光热循环能力评价图；

图9为不同浓度姜黄素、聚多巴胺和姜黄素聚多巴胺纳米纤维的光热抗菌图；

图10为姜黄素、聚多巴胺纳米管和姜黄素聚多巴胺纳米纤维经过不同时间近红外光照射后抗菌能力图；

图11为姜黄素、聚多巴胺纳米管和姜黄素聚多巴胺纳米纤维光热抗菌荧光图；

图12为L929细胞迁移图；

图13为L929细胞迁移统计图；

图14为姜黄素、聚多巴胺纳米管和姜黄素聚多巴胺纳米纤维调控巨噬细胞极化图；

图15为MRSA感染糖尿病创面小鼠创面愈合图；

图16为MRSA感染糖尿病创面小鼠创面大小测量图；

图17为MRSA感染糖尿病创面小鼠给药后3、7、14天创面染色图；

图18为MRSA感染糖尿病创面小鼠给药后14天创面免疫荧光统计分析图；

图19为体内给药后各组小鼠体重变化记录图；

图20为体内给药后各组小鼠心、肝、脾、肺、肾HE染色图；

图21为姜黄素聚多巴胺纳米纤维溶血性评价。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

下述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

材料与设备：

(1)盐酸聚多巴胺购自美国Sigma公司；

(2)姜黄素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

(3)SYTO9细菌活死染色试剂盒购自美国Sigma公司；

(4)耐甲氧金黄色葡萄球菌为实验室保存菌株ATCC 44300；

(5)CD11b、CD80、CD86和CD206流式抗体购自美国eBioscience公司；

(6)L929细胞、RAW264.7细胞为实验室保存的小鼠细胞。

实施例1

(1)姜黄素纳米晶的制备：100mg姜黄素(Cur)溶解于100mL无水乙醇中，待充分溶解后加入500mL超纯水，静置2h，有姜黄素纳米晶析出，得到含姜黄素纳米晶的溶液。

(2)姜黄素聚多巴胺纳米纤维的制备：在步骤(1)中得到的含姜黄素纳米晶的溶液中加入500mg盐酸多巴胺，并加入3mL浓度为1.5M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl缓冲溶液调节溶液pH为8.8；密封轻搅拌24h，然后12000rpm离心10min，收集姜黄素聚多巴胺纳米纤维；加入50mL超纯水超声重悬姜黄素聚多巴胺纳米纤维，12000rpm离心10min，重复3次；冷冻干燥机冻干姜黄素聚多巴胺纳米纤维(PDA/CurNFs)，收集备用。

(3)聚多巴胺纳米管的制备：取50g步骤(2)中制备得到的PDA/Cur NFs并加入100mL无水乙醇，溶解PDA/Cur NFs中的Cur，并于12000rpm离心10min，收集得到聚多巴胺纳米管(PDA NTs)。

(4)重复步骤(1)，将得到的含姜黄素纳米晶的溶液于12000rpm离心10min，收集沉淀得到姜黄素纳米晶(Cur Crystals)。

实施例2

(1)姜黄素纳米晶的制备：100mg姜黄素(Cur)溶解于300mL无水乙醇中，待充分溶解后加入2400mL超纯水，静置2h，有姜黄素纳米晶析出，得到含姜黄素纳米晶的溶液。

(2)姜黄素聚多巴胺纳米纤维的制备：在步骤(1)中得到的含姜黄素纳米晶的溶液中加入1000mg盐酸多巴胺，并加入3mL浓度为1.5M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲溶液调节溶液pH为8.5；密封轻搅拌72h，然后12000rpm离心10min，收集姜黄素聚多巴胺纳米纤维；加入100mL超纯水超声重悬姜黄素聚多巴胺纳米纤维，12000rpm离心10min，重复3次；冷冻干燥机冻干姜黄素聚多巴胺纳米纤维(PDA/CurNFs)，收集备用。

(3)聚多巴胺纳米管的制备：取50g步骤(2)中制备得到的PDA/Cur NFs并加入100mL无水乙醇，溶解PDA/Cur NFs中的Cur，并12000rpm离心10min，收集得到聚多巴胺纳米管(PDA NTs)。

(4)重复步骤(1)，将得到的含姜黄素纳米晶的溶液于12000rpm离心10min，收集沉淀得到姜黄素纳米晶(Cur Crystals)。

实施例3

(1)姜黄素纳米晶的制备：80mg姜黄素(Cur)溶解于160mL无水乙醇中，待充分溶解后加入960mL超纯水，静置2h，有姜黄素纳米晶析出，得到含姜黄素纳米晶的溶液。

(2)姜黄素聚多巴胺纳米纤维的制备：在步骤(1)中得到的含姜黄素纳米晶的溶液中加入640mg盐酸多巴胺，并加入3mL浓度为1.5M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲溶液调节溶液pH为8.7；密封轻搅拌36h，然后12000rpm离心10min，收集姜黄素聚多巴胺纳米纤维；加入80mL超纯水超声重悬姜黄素聚多巴胺纳米纤维，12000rpm离心10min，重复3次；冷冻干燥机冻干姜黄素聚多巴胺纳米纤维(PDA/CurNFs)，收集备用。

(3)聚多巴胺纳米管的制备：取50g步骤(2)中制备得到的PDA/Cur NFs并加入100mL无水乙醇，溶解PDA/Cur NFs中的Cur，并12000rpm离心10min，收集得到聚多巴胺纳米管(PDA NTs)。

(4)重复步骤(1)，将得到的含姜黄素纳米晶的溶液于12000rpm离心10min，收集沉淀得到姜黄素纳米晶(Cur Crystals)。

实施例4

将实施例1得到姜黄素聚多巴胺纳米纤维通过扫描电镜进行表征观察，结果如图1所示。图1为姜黄素聚多巴胺纳米纤维的SEM图，由图1可知，姜黄素聚多巴胺纳米纤维长度为2～30μm、横截面直径为100～200nm，姜黄素聚多巴胺纳纳米纤维为细长杆状，形态均一，分散性好，两端可见开口，利于姜黄素释放。

实施例5

将实施例1得到姜黄素纳米晶和姜黄素聚多巴胺纳米纤维进行傅里叶红外变换谱学(FTIR)表征，结果如图2所示。图2为姜黄素纳米晶和姜黄素聚多巴胺纳米纤维的FTIR谱图，姜黄素纳米晶在1512峰处为ν(C＝O)，δ(CCC)，δ(CC＝O)芳香的ν(CC)，ν(CCH)的混合震动，姜黄素纳米晶在3510峰处为酚-OH的吸收峰；当修饰聚多巴胺后，在1625峰处，芳环伸缩振动，以及在3373峰处，存在加强的共振吸收峰，是由-OH和吲哚的N-H伸缩振动产生，表示聚多巴胺成功修饰在姜黄素上，姜黄素聚多巴胺纳米纤维成功合成；

实施例6

将实施例1得到姜黄素聚多巴胺纳米纤维进行拉曼(Raman)谱学表征，结果如图3所示。图3为姜黄素聚多巴胺纳米纤维的Raman谱图，由图3可知，在姜黄素聚多巴胺纳米纤维样品中，在1300-1600cm^-1处记录到宽峰和强峰，位于1579cm^-1处的峰可归属为ν(C＝C)芳香族化合物，并伴有吡咯环伸缩振动或吲哚环振动，在1355cm^-1处的另一个峰是由于芳香族ν(C-N)伸缩混合吲哚环伸展所致，上述特征峰为聚多巴胺Raman吸收峰，表示姜黄素聚多巴胺纳米纤维成功合成。

实施例7

将实施例1得到聚多巴胺纳米管和姜黄素聚多巴胺纳米纤维进行X射线衍射表征，结果如图4所示。图4为姜黄素聚多巴胺纳米纤维和聚多巴胺纳米管的XRD谱图，其中，PDA/Cur NFs代表姜黄素聚多巴胺纳米纤维，PDA NTs代表聚多巴胺纳米管。由图4可知，姜黄素聚多巴胺纳米纤维和聚多巴胺纳米管出现在24.30附近的聚多巴胺特征吸收峰，表示聚多巴胺成功修饰，姜黄素聚多巴胺纳米纤维成功合成。

实施例8

1、光热性能表征：称取实施例1得到的姜黄素聚多巴胺纳米纤维，用超纯水稀释配置成不同浓度含姜黄素聚多巴胺纳米纤维的溶液(100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL)，同时以PBS溶液(0.01M)作为实验对照处理。

将上述不同浓度含姜黄素聚多巴胺纳米纤维的溶液经0.8W 808nm近红外光发射器照射5min，进行光热性能表征，结果如图5所示。图5为不同浓度姜黄素聚多巴胺纳米纤维的光热性能图，其中，a为PBS溶液(0.01M)，b为浓度100μg/mL的姜黄素聚多巴胺纳米纤维，c为浓度200μg/mL的姜黄素聚多巴胺纳米纤维，d为浓度300μg/mL的姜黄素聚多巴胺纳米纤维，e为浓度400μg/mL的姜黄素聚多巴胺纳米纤维。由图5可知，随着浓度的提高，光热后温度也不断提高，同时，不同浓度含姜黄素聚多巴胺纳米纤维的溶液均在120s左右达到阈值。其中，400μg/mL含姜黄素聚多巴胺纳米纤维的溶液近红外光发射器照射后最高能到60℃，表明姜黄素聚多巴胺纳米纤维光热转换良好，与剂量成正相关。

2、光热温差统计：将上述不同浓度的含姜黄素聚多巴胺纳米纤维的溶液经0.8W808nm近红外光发射器照射5min，进行光热温差统计，结果如图6所示。图6为不同浓度姜黄素聚多巴胺纳米纤维的光热温差统计图，由图6可知，100μg/mL的姜黄素聚多巴胺纳米纤维光热5min后温度变化幅度为15℃，200μg/mL的姜黄素聚多巴胺纳米纤维光热5min后温度变化幅度为22℃，300μg/mL的姜黄素聚多巴胺纳米纤维光热5min后温度变化幅度为28℃，400μg/mL的姜黄素聚多巴胺纳米纤维光热5min后温度变化幅度为30℃，说明聚多巴胺纳米纤维后具有良好的光热性能；

3、光热稳定性能测试：取1mL上述浓度为400μg/mL含姜黄素聚多巴胺纳米纤维的溶液置于1.5mL EP管中，管盖敞口，将0.8W808nm近红外光发射器垂直距离管口10cm进行照射，近红外照射300s后关闭近红外光激光发射器，并检测纳米材料温度降低过程，持续200s。该过程将温度检测仪置于管内，每隔30s记录温度并绘制温度变化曲线，结果如图7所示。图7为姜黄素聚多巴胺纳米纤维的光热稳定评价图，由图7可知，浓度为400μg/mL的姜黄素聚多巴胺纳米纤维经0.8W 808nm近红外光发射器照射3min，便达到平台期，温度升至58℃，可见姜黄素聚多巴胺纳米纤维光热响应性能优异。

4、光热循环能力评价：取1mL上述浓度为400μg/mL含姜黄素聚多巴胺纳米纤维的溶液经0.8W 808nm近红外光发射器照射3min，关闭近红外光发射器2min，重复5次，进行光热循环能力评价，结果如图8所示。图8为姜黄素聚多巴胺纳米纤维的光热循环能力评价图，由图8可知，姜黄素聚多巴胺纳米纤维经过近红外光照射后，温度上升，同时关闭近红外光，温度下降，重复5次，温度上升幅度均保持一致，说明姜黄素聚多巴胺纳米纤维光热稳定性良好。

实施例9

将实施例1得到的姜黄素纳米晶(Cur Crystals)用LB培养液配成不同浓度溶液，浓度分别为25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL；将实施例1得到的聚多巴胺纳米管(PDANTs)用LB培养液配成配成不同浓度溶液，浓度分别为75μg/mL、150μg/mL、225μg/mL、300μg/mL；将实施例1得到的姜黄素聚多巴胺纳米纤维(PDA/Cur NFs)用LB培养液配成配成不同浓度溶液，浓度分别为100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL，与上述姜黄素纳米晶及聚多巴胺纳米管含量相同；取上述配置好的不同浓度的含姜黄素纳米晶的溶液、含聚多巴胺纳米管的溶液和含姜黄素聚多巴胺纳米纤维的溶液100μL分别同100μL的金黄色葡萄球菌菌液孵育成菌液，并0.8W 808nm近红外光发射器照射5min；同时设置Control组即100μL LB培养液加入100μL的金黄色葡萄球菌菌液孵育。接着分别取上述菌液平板克隆，经37℃细菌培养箱培养12h后，统计平板菌落数，如图9所示。图9为不同浓度姜黄素、聚多巴胺纳米管和姜黄素聚多巴胺纳米纤维的光热抗菌图，其中，Control代表只加入100μL LB培养液处理组，作为阳性对照。Cur Crystals+NIR代表姜黄素作用细菌的同时，0.8W 808nm近红外光发射器照射5min，PDA NTs+NIR代表聚多巴胺作用细菌的同时，0.8W 808nm近红外光发射器照射5min，PDA/Cur+NIR NFs代表姜黄素聚多巴胺纳米纤维细菌的同时，0.8W 808nm近红外光发射器照射5min。由图9可知，PDA NTs和PDA/Cur NFs随着浓度升高，抗菌效果进一步加强，在PDA NTs为300μg/mL的时候，大部分细菌都已经被杀死，同时，对应PDA NTs等量PDA质量的PDA/Cur NFs组在400μg/mL的时候，已经没有细菌存活，这可能与光热升温，细菌细胞壁受损，Cur更容易进入细菌内部发挥抗菌作用有关。

实施例10

分别取实施例8中配置的50μg/mL的含Cur crystals的溶液100μL和150μg/mL的含PDA NTs的溶液100μL以及200μg/mL的含PDA/Cur NFs的溶液100μL，同100μL的金黄色葡萄球菌菌液孵育成菌液，并经0.8W 808nm近红外光发射器照射2.5min、5min、7.5min、10min，同时设置只含LB培养液100μL的LB培养液组，分别取上述光热后的菌液平板克隆，经37℃细菌培养箱培养12h后，统计平板菌落，结果如图10所示。图10为姜黄素、聚多巴胺纳米管和姜黄素聚多巴胺纳米纤维经过不同时间近红外光照射后抗菌能力图。由图可10可见，PDA+NIR组、PDA/Cur+NIR组两个组随着照射时间增加细菌数量减少，当近红外光照射10min后，可见姜黄素聚多巴胺纳米纤维光热抗菌效果优异。

实施例11

于24孔板中培养金黄色葡萄球菌细菌爬片，用0.01M的PBS缓冲溶液洗涤爬片去除多余菌液后，加入实施例8中配置的200μg/mL含姜黄素聚多巴胺纳米纤维的溶液100μL，即PDA/Cur NFs组，同时设置PDA组(加入实施例8中配置的150μg/mL含聚多巴胺纳米管的溶液100μL)和Cur组(加入实施例8中配置的50μg/mL含姜黄素纳米晶的溶液100μL)以及不做任何处理的Control组，将上述PDA/Cur组和PDA组以及Control组经0.8W 808nm近红外光发射器照射5min，得到PDA/Cur+NIR组、PDA+NIR组和Control+NIR组。用0.01M PBS缓冲溶液分别洗去上述加入的溶液，接着根据SYTO9细菌活死染色试剂盒说明书处理细菌爬片，首先是PI染料处理细菌爬片10min，PBS洗涤去除未结合的荧光，接着用SYTO9染料处理细菌爬片5min，用PBS洗涤去除未结合的荧光，接着用镊子取出细菌爬片，于载玻片上滴加甘油，封片并置于激光共聚焦显微镜下观察；结果如图11所示。图11为姜黄素、聚多巴胺纳米管和姜黄素聚多巴胺纳米纤维光热抗菌荧光图，其中，Control组表示活细菌，显示绿色，同时，Control+NIR组未见细菌死亡，表明单独近红外光照射对细菌无明显损伤；Cur组发现约有6％的细菌死亡，单独Cur抗菌效果不明显；PDA组细菌都是绿色，表明无近红外光照射，单独的PDA NTs没有抗菌作用，但PDA+NIR组死细菌占比98％，可见PDA经过近红外光照射后，光热升温，细菌受损；PDA/Cur组同PDA组，无细菌死亡，但PDA/Cur+NIR组死细菌占比约99％，细菌基本死亡，可知PDA/Cur光热响应性能同PDA组一致，同时光热后Cur的释放，以及光热后细菌细胞壁的受损，使得Cur更容易进入细菌内部发挥抗菌作用。

实施例12

分别于含1％血清的基础培养基(DMEM)中加入实施例1得到的姜黄素纳米晶、聚多巴胺纳米管和姜黄素聚多巴胺纳米纤维(经光热10min)，得到浓度为50μg/mL的含姜黄素纳米晶的溶液、150μg/mL的含聚多巴胺纳米管的溶液和200μg/mL的含姜黄素聚多巴胺纳米纤维的溶液。将L929细胞于6孔板培养12h，用200μL枪头做细胞划痕，分别加入上述配置的溶液，其中，Control组为空白组，未加任何药物处理，Cur组为加入50μg/mL含姜黄素纳米晶的溶液1mL，PDA组为加入150μg/mL含聚多巴胺纳米管的溶液1mL，PDA/Cur组为加入200μg/mL含姜黄素聚多巴胺纳米纤维(经光热10min)溶液1mL。加上述溶液培养细胞划痕后的L929细胞24h，各个实验组细胞迁移结果如图12所示。图12为L929细胞划痕迁移图，由图12可知，L929细胞做划痕经过24h后，Control组仅有少量细胞迁移，而Cur组细胞迁移明显，PDA组细胞也有促进细胞迁移能力，但效果没有Cur组明显，同时PDA/Cur组可见细胞划痕明显缩小，基本迁移完成，证明是由于Cur和PDA对细胞迁移的协同作用所致。所以姜黄素聚多巴胺纳米纤维能够明显促进L929细胞迁移，效果优于单独的Cur组和PDA组。对图12细胞划痕迁移实验结果用Image J软件分析，统计细胞划痕后迁移的区域并作柱状图，如图13所示。图13为L929细胞迁移统计图，由图13可知，通过对图12细胞划痕迁移的定量分析，可知，Control组细胞划痕迁移约80％，Cur组细胞划痕迁移60％，PDA组细胞划痕迁移50％，PDA/Cur组细胞划痕迁移23％。总之，PDA/Cur能够促进细胞迁移，这意味着姜黄素聚多巴胺纳米纤维能够在体内募集L929细胞，不仅实现光热抗菌，还能促进创面愈合。

实施例13

首先RAW264.7细胞培养于24孔板，由含10％血清的基础培养基(DMEM)培养于37℃5％CO₂的细胞培养箱中，细胞培养12h后，弃去旧培养基，用下述培养基继续培养24h。将DMEM中添加脂多糖(LPS)，使得LPS浓度为10μg/mL，由该培养基处理后的细胞称为LPS组；在10μg/mL LPS的DMEM的基础上，同时加入Cur crystals，使得Cur最终浓度为12.5μg/mL，即含Cur、LPS的DMEM培养基，由该培养基处理后的细胞称为LPS+Cur组；在10μg/mL LPS的DMEM的基础上，同时加入PDA NTs，使得PDA NTs最终浓度为37.5μg/mL，即含PDA NTs、LPS的DMEM培养基，由该培养基处理后的细胞称为LPS+PDA组；在10ug/mL LPS的DMEM的基础上，同时加入PDA/Cur NFs，使得PDA/Cur NFs终浓度为50μg/mL，即含PDA/Cur NFs、LPS的DMEM培养基，由该培养基处理后的细胞称为LPS+PDA/Cur，同时将含PDA/Cur NFs、LPS的DMEM培养基经过0.8W 808nm近红外光发射器照射10min，使得Cur释放，由该培养基处理后的细胞称为LPS+PDA/Cur+NIR组。各组细胞经过24h处理后，收集细胞并用0.1M的PBS溶液洗涤，孵育抗体CD11b/CD80后流式上机检测；按上述方法同时做CD86及CD206检测，对实验结果用Flow Jo软件分析，并统计绘制成柱状图，结果如图14所示。图14为姜黄素、聚多巴胺纳米管和姜黄素聚多巴胺纳米纤维调控巨噬细胞极化图，其中，a表示不同分组处理后对264.7细胞表面分子CD80表达的影响，CD80为巨噬细胞M1型标志物；b表示不同分组处理后对RAW264.7细胞表面分子CD86表达的影响，CD86为巨噬细胞M1型标志物；c表示不同分组处理后对RAW264.7细胞表面分子CD206表达的影响，CD80为巨噬细胞M2型标志物。根据图a可知，LPS组处理后，CD80指标上调，细胞极化为M1表型，LPS+Cur组CD80指标显著下调，说明姜黄素能够抑制巨噬细胞极化，LPS+PDA组巨噬细胞CD80指标无明显差异，说明聚多巴胺对巨噬细胞调控没有影响，LPS+PDA/Cur结果同LPS+PDA一致，此时Cur因为没有光热，所以没有得到有效的释放，所以未能调控巨噬细胞极化，LPS+PDA/Cur+NIR组结果显示CD80指标明显下降，同LPS+Cur组保持一致，可知近红外光照射后，Cur释放，实现对巨噬细胞极化的调控；根据图b可知，LPS组处理后，CD860指标上调，细胞极化为M1表型，LPS+Cur组CD86指标显著下调，说明姜黄素能够抑制巨噬细胞极化，LPS+PDA组巨噬细胞CD86指标无明显差异，说明聚多巴胺对巨噬细胞调控没有影响，LPS+PDA/Cur结果同LPS+PDA一致，此时Cur因为没有光热，所以没有得到有效的释放，所以未能调控巨噬细胞极化，LPS+PDA/Cur+NIR组结果显示CD86指标明显下降，同LPS+Cur组保持一致，可知近红外光照射后，Cur释放，实现对巨噬细胞极化的调控；根据图c可知，LPS组处理后，CD206指标下调，细胞极化为M1表型，LPS+Cur组CD206指标显著上调，说明姜黄素能够抑制巨噬细胞极化为M1，同时将巨噬细胞极化为M2，LPS+PDA组巨噬细胞CD206指标无明显差异，说明聚多巴胺对巨噬细胞调控没有影响，LPS+PDA/Cur结果同LPS+PDA一致，此时Cur因为没有光热，所以没有得到有效的释放，所以未能调控巨噬细胞极化，LPS+PDA/Cur+NIR组结果显示CD206指标明显上调，同LPS+Cur组保持一致，可知近红外光照射后，Cur释放，将巨噬细胞从M1型极化为M2型；通过上述实验可知姜黄素聚多巴胺纳米纤维在近红外光照条件下能够有效的调控巨噬细胞极化。

实施例14

1、实验部分：用生理盐水分别加入实施例1得到的Cur crystals、PDA NTs和PDA/Cur NFs，得到浓度分别为50μg/mL的含Cur crystals的溶液、150μg/mL的含PDA NTs的溶液和150μg/mL含PDA/Cur NFs的溶液。选用20±2g的雄性ICR小鼠，腹腔注射STZ造模进行Ⅰ型糖尿病造模；对糖尿病小鼠背部用8mm*8mm打孔器制备创面，滴加菌液浓度为1×10⁸CFU/mL的耐甲氧金黄色葡萄球菌(MRSA)菌液20μL，24h后即制备耐药菌感染的糖尿病小鼠创面。对造模成功小鼠分组：对感染MRSA的糖尿病小鼠创面给予200μL生理盐水，称为Saline组，同时也是本实验的对照组。对感染MRSA的糖尿病小鼠创面给予200μL生理盐水，同时经0.8W808nm近红外光发射器照射5min，称为Saline+NIR组。对感染MRSA的糖尿病小鼠创面给予上述制备的50μg/mL的含Cur crystals的溶液200μL，称为Cur组。对感染MRSA的糖尿病小鼠创面给予上述制备的150μg/mL的含PDA NTs的溶液200μL，称为PDA组。对感染MRSA的糖尿病小鼠创面给予上述制备的150μg/mL的含PDA NTs溶液200μL，同时经0.8W 808nm近红外光发射器照射5min，称为PDA+NIR组。对感染MRSA的糖尿病小鼠创面给予上述制备的200μg/mL的含PDA/Cur NFs的溶液200μL，称为PDA/Cur组。对感染MRSA的糖尿病小鼠创面给予上述制备的200μg/mL的含PDA/Cur NFs的溶液200μL，同时经0.8W 808nm近红外光发射器照射5min，称为PDA/Cur+NIR组。

2、创面愈合拍照记录：对上述给药治疗后0、3、7、14天小鼠创面拍照记录，如图15所示，图15为MRSA感染糖尿病创面小鼠创面愈合图，由图15可以看出，经过14天的治疗后，单独的Cur组治疗和PDA NTs组光热治疗组伤口面积有所降低，愈合效果得到了改善，但伤口尚未痊愈，表明单独修复的效果欠佳，有待提高；值得一提的是，PDA/Cur+NIR组结合了光热抗菌和Cur抗炎的双重功效，发挥了协同增效作用，其伤口基本愈合，MRSA感染糖尿病创面的修复得到了最优的效果；

3、创面大小测量：用游标卡尺对上述给药治疗后0、3、7、14天小鼠测定创面大小，如图16所示。图16为MRSA感染糖尿病创面小鼠创面大小测量图，由图16可知，创面测量数据同图15创面愈合图结果基本一致，PDA/Cur+NIR组能够在较短时间内愈合创面；

4、创面染色：对上述给药治疗后0、3、7、14天小鼠创面采样做苏木精-伊红染色(HE)和Masson染色，结果如图17所示。图17为MRSA感染糖尿病创面小鼠给药后3、7、14天创面染色图，其中，a为MRSA感染糖尿病创面小鼠给药后3、7、14天创面HE染色图，b为MRSA感染糖尿病创面小鼠给药后3、7、14天创面Masson染色图。由图17中a可知，箭头区域所指为创面大小，Saline组以及Saline+NIR组第3、7天组织炎症反应未得到控制，PDA/Cur+NIR组在第4天创面炎症反应基本得到控制，第7天伤口已经愈合大部分，无明显炎症现象，第14天有毛囊新生，创面愈合完成；由图17中b可知，Saline组以及Saline+NIR组第3、7天组织胶原沉积量较少，Masson染色显示PDA/Cur+NIR组在第4天和第7胶原沉积明显，说明创面正处于良好的愈合阶段，较其他组优势明显。

5、创面组织免疫荧光测试：上述给药治疗后各组第14天进行免疫荧光测试，结果如图18所示。图18为MRSA感染糖尿病创面小鼠给药后14天创面免疫荧光统计分析图，其中，图a为对M1型巨噬细胞标记物iNOS免疫荧光染色后各治疗组荧光强度分析，图b为M2型巨噬细胞标记物CD163免疫荧光染色后各治疗组荧光强度分析。由图a可知，Saline组荧光强度为1，Cur组同Saline组相比荧光强度只有40％，差异显著，PDA+NIR组荧光强度和Saline组无明显差异，PDA/Cur+NIR组同Saline组相比荧光强度只有15％；说明Saline组第14天炎症反应还未得到控制，创面巨噬细胞仍然处于M1型，但是Cur组能够下调巨噬细胞M1指标，PDA/Cur+NIR效果显著，M1型标记物显著下调。由图b可知，Saline组荧光强度为1，Cur组荧光强度为5，PDA+NIR组荧光强度为3，PDA/Cur+NIR组荧光强度为6，说明Saline组第14天创面巨噬细胞仍然处于M2型，但是Cur组能够上调巨噬细胞M2指标，PDA/Cur+NIR效果显著，M2型标记物显著上调。综上，PDA/Cur+NIR组能够下调M1巨噬细胞表型指标iNOS，上调M2巨噬细胞表型指标CD163，表明PDA/Cur+NIR治疗多重耐药菌感染糖尿病创面小鼠除了光热抗菌外，还通过调控巨噬细胞表型抑制炎症反应，促进创面愈合。

6、实验小鼠体重记录：对上述给药后各组小鼠体重进行称量，结果如图19所示。图19为体内给药后各组小鼠体重变化记录图各组体重无明显差异；

实施例15

对实施例14的各组小鼠治疗后取心(Heart)、肝(Liver)、脾(Spleen)、肺(Lung)、肾(Kidney)进行HE染色，结果如图20所示。图20为体内给药后各组小鼠心、肝、脾、肺、肾HE染色图。由图20可知，实验结果表明经过不同实验组治疗后，心、肝、脾、肺、肾这些主要脏器无损伤，说明上述使用的各纳米材料安全性好，没有毒害。

实施例16

用生理盐水配置的6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的含姜黄素聚多巴胺纳米纤维的溶液，分别取上述配置的溶液0.5mL溶解于0.5mL的2％的红细胞悬液中，对姜黄素聚多巴胺纳米纤维溶血性进行评价，结果如图21所示。图21为姜黄素聚多巴胺纳米纤维溶血性评价图，由图21可知，浓度为6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的姜黄素聚多巴胺纳米纤维对1％的红细胞无溶血现象，姜黄素聚多巴胺纳米纤维生物安全性良好，无红细胞溶血现象。

Claims (7)

1.一种用于治疗细菌感染糖尿病创面的纳米纤维，其特征在于，所述纳米纤维为姜黄素聚多巴胺纳米纤维，所述姜黄素聚多巴胺纳米纤维包括内核和外壳，所述内核为姜黄素纳米晶，所述外壳为聚多巴胺纳米管，所述姜黄素纳米晶是将姜黄素溶解于无水乙醇加水析出获得。

2.根据权利要求1所述的用于治疗细菌感染糖尿病创面的纳米纤维，其特征在于，所述纳米纤维长度为2～30μm，横截面直径为100～200nm。

3.权利要求1-2任一项所述的用于治疗细菌感染糖尿病创面纳米纤维的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)姜黄素纳米晶的制备：将姜黄素溶解于无水乙醇中，加入水，静置，析出姜黄素纳米晶，得到含姜黄素纳米晶的溶液；

(2)姜黄素聚多巴胺纳米纤维的制备：在含姜黄素纳米晶的溶液中，加入盐酸多巴胺，调节溶液的pH，搅拌，离心洗涤，冷冻干燥，得到姜黄素聚多巴胺纳米纤维。

4.权利要求3所述的用于治疗细菌感染糖尿病创面纳米纤维的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述姜黄素与无水乙醇的固液比为1：1～3mg：mL，所述无水乙醇与水的体积比1：5～8。

5.根据权利要求3所述的用于治疗细菌感染糖尿病创面纳米纤维的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述姜黄素与盐酸多巴胺的质量比为1：5～10，所述pH为8.5～8.8，所述搅拌时间为24～72h。

6.权利要求1-2任一项所述的用于治疗细菌感染糖尿病创面的纳米纤维在制备治疗细菌感染糖尿病创面药物或试剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细菌包括耐甲氧金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌。

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