CN117327210A

CN117327210A - 一种基于β-环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料及其制备方法和应用

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Publication number: CN117327210A
Application number: CN202311630514.0A
Authority: CN
Inventors: 王旻; 周宝龙; 纪洪杰; 边玮玮; 岳琪
Original assignee: Weifang Medical University
Current assignee: Weifang Medical University
Priority date: 2023-12-01
Filing date: 2023-12-01
Publication date: 2024-01-02
Anticipated expiration: 2043-12-01
Also published as: CN117327210B

Abstract

本发明公开了一种基于β‑环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。将β‑环糊精对苯二甲醛包合物和5,10,15,20‑四(4‑氨基苯基)‑卟啉混合并进行研磨，然后加入1,3,5‑三甲基苯、1,4‑二氧六环和冰醋酸水溶液进行反应，得到黑色固体，洗涤干燥后得到基于β‑环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料。本发明以β‑环糊精对苯二甲醛包合物和卟啉为结构单元制备得到基于β‑环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料（Por‑CD‑COF），该材料可通过PTT和PDT协同抗菌，且生物相容性好，无毒副作用。

Description

一种基于β-环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于β-环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料及其制备方法和应用。

背景技术

细菌在自然界和所有生物中无处不在，包括人类，我们无时无刻不在接触不同类型的细菌。滥用抗生素导致耐药性细菌的出现，每年造成70万人死亡，给世界各地的公共卫生系统带来巨大的困难和挑战。因此人们非常希望有一些替代性的抗菌策略，可以减轻成本，提高疗效，减少耐药性。光动力疗法、光热疗法、类芬顿疗法等都是近年来备受关注的新的杀菌方法。其中光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）利用光敏剂吸收光，产生单重激发态，单重激发态通过系间窜越（intersystemcrossing，ISC）过程进一步将能量转移到三重激发态，使周围的三重态氧敏化，形成破坏性单重态氧或其他活性（reactive oxygenspecies，ROS）。ROS可以快速破坏微生物蛋白质、核酸和脂类，达到灭活细菌的目的。另一方面，PDT中的光敏剂不需要进入细胞，细菌难以对其产生耐药性。因此，PDT以其无侵袭性、时空选择性、低毒性和低副作用的优势成为抗生素治疗的替代方法。光热疗法是一种无创、可控、高效和低毒的治疗技术，对肿瘤和感染的治疗有着巨大的治疗潜力。光热疗法是通过产生局部高热破坏肿瘤细胞、细菌的蛋白质结构，影响其正常的生理反应，对肿瘤细胞、细菌造成不可逆的损伤。但是光热抗肿瘤、抗感染需要较高的温度，这对正常组织造成热损伤，限制了其临床应用。因此常与其他治疗方法联合应用以降低光热疗法的副作用，目前研究人员已经发现了多种具有光疗效果的光敏剂，这些光敏剂有一些缺点，如激发波长不在最佳透光区域，存在较大的光毒性等问题。卟啉是一类由四个吡咯类亚基的α-碳原子通过次甲基桥（=CH-）互联而形成的大分子杂环化合物。目前以卟啉为原料制备杀菌材料的报道越来越多，如申请号CN202310601592.1的专利公开了一种基于二茂铁的金属有机骨架材料及其制备方法和应用，以二茂铁和卟啉为结构单元的金属有机框架材料Fc-PP-POP通过PTT和CDT协同抗菌；申请号202310175497.X的专利公开了一种光热-类芬顿反应人工纳米酶及其制备方法和应用，将反应单体钴-卟啉基吸附到模板ZIF-8的表面，在催化剂的存在下，通过共价键氧化偶联，得到钴-卟啉基共轭多孔聚合物(CMP)覆盖的ZIF-8复合物 (PZCo-CMP)，用过光热-类芬顿协同抗菌。但上述含卟啉的抗菌材料其生物相容性都有待提高，所以如何制备高抗菌活性、高生物相容性的光疗抗菌剂是急需解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于β-环糊精对苯二甲醛包合物卟啉微孔复合材料的制备方法和应用。本发明以β-环糊精对苯二甲醛包合物和卟啉为结构单元制备得到基于β-环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料（Por-CD-COF），该材料可通过PTT和PDT协同抗菌，且生物相容性好，无毒副作用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种基于β-环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料的制备方法，所述制备方法为：

将β-环糊精对苯二甲醛包合物和5,10,15,20-四(4-氨基苯基)-卟啉混合并进行研磨，然后加入1,3,5-三甲基苯、1,4-二氧六环和冰醋酸水溶液进行反应，将得到的固体洗涤、干燥，得到基于β-环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料。

优选的，所述研磨的时间为30min，研磨时滴加对甲苯磺酸溶液和无水乙醇。

优选的，所述β-环糊精对苯二甲醛包合物、5,10,15,20-四(4-氨基苯基)-卟啉、1,3,5-三甲基苯、1,4-二氧六环、冰醋酸水溶液的加入量之比为184mg：65.2mg：3mL：3mL：1mL。

优选的，所述反应的温度为120℃，反应的时间为72h。

优选的，所述洗涤为依次用无水甲醇、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、水和乙醇洗至洗出液无色；所述干燥为85℃真空干燥6h。

优选的，所述β-环糊精对苯二甲醛包合物由以下方法制备：

将对苯二甲醛的乙醇溶液滴加到 β-环糊精的水溶液中进行包合反应，过滤得到的沉淀物，洗涤干燥得到灰白色粉末即为β-环糊精对苯二甲醛包合物。

优选的，所述对苯二甲醛的乙醇溶液中对苯二甲醛的浓度为0.1mol/L；所述β-环糊精的水溶液中β-环糊精的浓度为0.033 mol/L；所述对苯二甲醛和β-环糊精的摩尔比为2：3。

优选的，所述滴加的速度为1mL/min；所述包合反应为：在50℃下搅拌3h，然后减压蒸发乙醇，再冰浴12h。

本发明的第二方面，提供上述制备方法得到的基于β-环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料。

本发明的第三方面，提供基于β-环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料在制备抗菌药物中的用途。

本发明的有益效果：

（1）本发明制备基于β-环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料Por-CD-COF的方法简单高效，研磨后极大提高了产率，改善了材料性状，降低了制备成本。

（2）本发明制备的Por-CD-COF通过638nm波长的激光照射产生较好的光热转换效果，也可以催化氧气，转换为单线态氧，从而达到协同抗菌的效果。

（3）本发明制备的Por-CD-COF生物相容性高，对HEK-293细胞的细胞活力影响小，对血细胞的溶解率低于2%，可促进伤口愈合，这有利于其生物领域的应用。

附图说明

图1：β-环糊精对苯二甲醛包合物的氢谱图；

图2：TAPP、CD-TA和Por-CD-COF的相关表征；其中（a）TAPP、CD-TA和Por-CD-COF的红外光谱图；（b）Por-CD-COF固态碳光谱的¹³C NMR；（c）Por-CD-COF的X射线衍射图谱；（d）77K时低温N₂吸收等温线；（e）Por-CD-COF的孔径分布曲线；（f）Por-CD-COF和Por-COF的紫外可见光谱图；

图3：Por-CD-COF的SEM和TEM图，其中（a）5µm比例尺下Por-CD-COF的SEM；（b）500nm比例尺下Por-CD-COF的SEM；（c）500nm比例尺下Por-CD-COF的SEM；（d）500nm比例尺下Por-CD-COF的TEM；（e）200 nm比例尺下Por-CD-COF的TEM；（f）50nm比例尺下Por-CD-COF的TEM；（g）50nm比例尺下Por-CD-COF的TEM；（h）10nm比例尺下Por-CD-COF的HRTEM；（i）5nm比例尺下Por-CD-COF的HRTEM；

图4：Por-CD-COF的元素分布图和EDX图；其中（a）Por-CD-COF的元素分布图；（b）C元素在Por-CD-COF中的分布情况；（c）N元素在Por-CD-COF中的分布情况；（d）O元素在Por-CD-COF中的分布情况；

图5：Por-CD-COF的光效应验证图；其中（a）在1.2 W/cm²的638 nm激光照射下，Por-CD-COF的浓度依赖性光热效应；（b）分别在0.5、0.75、1.0、1.2和1.5W/cm²的638nm激光照射下，Por-CD-COF的激光功率依赖性光热效应；（c）Por-CD-COF 和 Por-COF 在 638 nm激光（1. 2 W/cm2）照射10min的温度变化曲线；（d）638nm激光在1.2 W/cm²下对Por-CD-COF（500μg/mL）进行5次光照冷却的温度变化曲线；

图6：Por-CD-COF的温度变化曲线；其中（a）Por-CD-COF （100~500 μg/mL）在10min内升温过程的热成像图片；（b）Por-CD-COF（500μg/mL）水分散体在638 nm激光照射（1.2W/cm²）的光热效应，照射10min后关闭激光；（c）冷却周期与温度的负自然对数；（d）在638 nm激光（1.2 W/cm2）照射下，用新鲜制备的 Por-CD-COF 水悬浮液在水中孵育 30 天后的温度曲线；

图7：不同材料在激光照射下不同时间的紫外可见光谱；其中（a）DPBF在激光（λ =638 nm, 1.2 W/cm²）照射下不同时间的紫外可见光谱；（b）Por- CD-COF + DPBF在激光（λ= 638 nm, 1.2 W/cm²）照射下不同时间的紫外可见光谱；（c）Por-COF + DPBF在激光（λ =638 nm, 1.2 W/cm²）照射下不同时间的紫外可见光谱；（d）Por-CD-COF和Por-COF在激光（λ= 638 nm, 1.2 W/cm²）照射下诱导DPBF的衰减率比较（%）；

图8：不同浓度Por-CD-COF经激光（λ = 638 nm, 1.2 W/cm²）照射10min的抗菌能力：不同浓度的Por-CD-COF 和 Por-COF经激光处理大肠杆菌（a）与金黄色葡萄球菌（b）培养图；

图9：使用平板计数法测量不同浓度的Por-CD-COF 和 Por-COF经激光处理大肠杆菌的细菌活力（a）与金黄色葡萄球菌的细菌活力（b），（n=3，误差条表示标准偏差）；

图10：Por-CD-COF 和 Por-COF在有无激光（λ =638 nm, 1.2 W/cm²）照射条件下的抗菌能力；其中（a）各组处理的大肠杆菌菌落照片（浓度： Por-COF = 500 μg/mL，Por-CD-COF = 500 μg/mL，λ =1.2 W/cm²，10min）；（b）使用平板计数法测量Por-CD-COF 和Por-COF经有无激光照射处理大肠杆菌菌细菌活力（%）；（c）各组处理的金黄色葡萄球菌菌落照片（浓度： Por-COF = 500 μg/mL，Por-CD-COF= 500 μg/mL，λ = 1.2 W/cm²，10min）；（d）使用平板计数法测量Por-CD-COF 和 Por-COF经有无激光照射处理金黄色葡萄球菌细菌活力（n=3，误差条表示标准偏差）；

图11：由PBS组（I）、Por-COF组（II）、Por-CD-COF组（III）、PBS+激光组（IV）、Por-COF+激光组（V）和Por-CD-COF+激光组（VI）处理后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与活/死染色剂孵育后的荧光图像（浓度： Por-COF = 500 μg/mL，Por-CD-COF = 500 μg/mL，λ =1.2 W/cm²，10min；标尺为 200 μm）；

图12：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的TEM图像，由（I）PBS、（II）Por-COF、（III）Por-CD-COF、（IV）PBS+激光、（V）Por-COF+激光、（VI）Por-CD-COF+激光共培养，图中红色尖头代表损伤位置（浓度： Por-COF = 500 μg/mL，Por-CD-COF = 500 μg/mL，λ =1.2 W/cm²，10min；标尺为2 μm）；

图13：不同浓度的Por-CD-COF的溶血率（n=3，误差条表示标准偏差）；

图14：不同浓度的Por-CD-COF与HEK-293细胞共培养后，HEK-293细胞的细胞活力（n=3，误差条表示标准偏差）；

图15：β-环糊精对苯二甲醛包合物卟啉微孔复合材料的制备路线；

图16：Por-CD-COF在有或无激光照射的情况下以及相应的PBS对照组在每个时间点对感染金黄色葡萄球菌的小鼠背部伤口的代表性照片；

图17：治疗期间小鼠伤口和体重变化曲线；其中（a）治疗期间小鼠体重的变化（n=5，误差条表示标准偏差，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）；（b）相应的伤口收缩与时间的关系曲线（%）；

图18：皮肤染色结果：伤口愈合过程第9天，各个组的伤口组织的H&E染色图像（比例尺为200μm）；

图19：器官染色结果；

图20：不同组（第9天）的血常规检查结果（WBC、RBC、MCV、PLT、MCHC、MCH）；数据使用平均值±标准误差（n = 3）；（a）不同组（第9天）的白细胞（WBC）检查结果；（b）不同组（第9天）的红细胞（RBC）检查结果；（c）不同组（第9天）的平均红细胞体积（MCV）检查结果；（d）不同组（第9天）的血小板（PLT）检查结果；（e）不同组（第9天）的平均血红蛋白浓度（MCHC）检查结果；（f）不同组（第9天）的平均血红蛋白含量（MCH）检查结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所述，现有的卟啉抗菌材料虽然可以发挥较好的光热效果，但含卟啉的抗菌材料其生物相容性有待提高，需要进一步降低溶血率。

基于此，本发明的目的是提供一种基于β -环糊精对苯二甲醛包合物卟啉微孔复合材料的制备方法和应用。本发明制备的微孔复合材料Por-CD-COF是以β-环糊精对苯二甲醛包合物和卟啉为结构单元，采用机械研磨和溶剂热合成相结合的方式进行制备。如图15所示，本发明将超高分子量的环糊精引入卟啉中，先滴加对甲苯磺酸对环糊精和卟啉进行机械研磨旨在形成预聚物，避免CD从多孔骨架泄漏；从而形成的大环结构，使反应制备的材料具备传统光敏剂所不具备的良好生物相容性和光疗性能。由于环糊精的空腔结构能够与药物分子结合形成包合物，增加药物的稳定性和溶解性，同时降低药物的毒副作用。这种包合物能够保护药物分子免受环境因素的影响，提高药物的生物利用度。将对苯二甲醛与环糊精形成包合物后再与卟啉结合成聚合物，可以同时发挥卟啉的光活性和环糊精的高生物相容性以及杀菌作用。Por-CD-COF可以通过光热转换实现局部升温，以达到使细菌细菌膜破裂的效果。此外，Por-CD-COF经过激光照射后，会使周围环境中的氧元素转化为对细菌有害的单线态氧，从而使细菌裂解。Por-CD-COF在最佳抗菌浓度下，几乎没有溶血作用，也几乎不影响正常细胞的生长，使其具有良好的生物应用前景。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

说明：本发明使用的吡咯均为重蒸的无水吡咯，其制备方法为：

准备带有磁力搅拌子的50mL圆底烧瓶，向其中加入10mL吡咯，随后在圆底烧瓶瓶口连接25mL恒压分液漏斗，关闭恒压分液漏斗旋钮使其与下方的圆底烧瓶不流通。在恒压分液漏斗的上端安装球形冷凝管。将上述装置置于90℃的水浴锅中进行重蒸。待装置下方圆底烧瓶内无显著液体残留即为吡咯重蒸过程结束，重蒸所获得的吡咯冷凝并保存至恒压分液漏斗中。

β-环糊精购自上海笛柏生物科技有限公司。

液体培养基的配置方法为：取LB肉汤5g，分散于200 mL蒸馏水中，再使用高压灭菌的方式进行灭菌后即得液体培养基。

固体培养基的配置方法为：取LB肉汤5g，琼脂3g，分散于200 mL蒸馏水中，再使用高压灭菌的方式进行灭菌后即得固体培养基。

实施例

（1）5,10,15,20-四(4-氨基苯基)-卟啉（TAPP）的合成：将对硝基苯甲醛（11.3g，75mmol）、乙酸酐（14mL，151mmol）和丙酸（200mL）在500mL烧瓶中混合，加热至140℃，然后加入重蒸吡咯（5.2mL，75mmol），回流30min后停止加热，冷却至室温后过滤得到沉淀，滤液用N,N-二甲基甲酰胺和热水洗涤至无色，干燥得到5,10,15,20-四(4-硝基苯基)卟啉（TNPP，1.21g，产率：24%）。在 100 mL 三颈烧瓶中加入5,10,15,20-四(4-硝基苯基)卟啉（0.1g，25mmol）、九水合硫化钠（0.604g，2.5mmol）和氯化铵（0.06g，0.1mmol），在氩气保护下加入N,N-二甲基甲酰胺（6mL）和蒸馏水（0.2mL)，升温至90℃搅拌3小时，然后降温至80℃并保持，接着缓慢滴加20mL蒸馏水，滴加完毕后冷却至室温，抽滤蒸馏水洗直至滤液呈无色中性，经室温真空干燥得到蓝紫色固体，产率 94%：4.03（s，8H），7.07（d，8H）；7.99（d，8H）；8.90（s，8H）。

（2）β-环糊精对苯二甲醛包合物（CD-TA）的制备：在无水乙醇（20 mL）中加入对苯二甲醛（0.268g，2 mmol），经超声波振荡后固体完全溶解，得到对苯二甲醛的乙醇溶液。然后将干燥的β-环糊精（3.408g，3mmol）加入到65℃的蒸馏水（90mL）中，并加入1.5mL氨水，直到β-环糊精完全溶解在水溶液中。将对苯二甲醛乙醇溶液以1ml/min滴加入到β-环糊精水溶液，在 50℃下搅拌3小时，然后减压蒸发乙醇，将溶液冰浴12小时。过滤得到的沉淀物，依次用水和乙醇洗涤，然后在真空中干燥滤饼，得到灰白色粉末（2.285g，产率59%），其氢谱图见图1。

（3）Por-CD-COF复合材料的制备：称取β-环糊精对苯二甲醛包合物（184 mg，0.145mmol）和 TAPP（65.2 mg，0. 097 mmol）放入研钵中混合，逐一加入2ml对甲苯磺酸溶液（1.0mol/mL）和1ml无水乙醇，手动研磨30 min 后，转移到耐热玻璃管中，加入 3mL 1,3,5-三甲基苯、3mL 1,4-二氧六环和 1mL 3M 乙酸水溶液，冷冻脱气循环三次，升温至 120 ℃ 反应72 小时，冷却至室温后减压过滤得到固体，依次用无水甲醇、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、水和乙醇洗涤，洗至洗出液无色；85℃真空干燥6h，得到黑褐色粉末状固体（Por-CD-COF）。¹³C NMR（101 MHz，CDCl3）：δ= 152，145.4，137，130.4，121.8，107，103.6，81.8，73.2，60.3。

本实施例的合成路线见图15。

对比例

Por- COF的制备：与实施例的区别在于，不添加β-环糊精（CD）。

表征：

（1）催化剂红外光谱的测定：利用红外光谱确定催化剂的结构，分别取3 mg的5,10,15,20-四(4-(氨基苯基)-卟啉（TAPP）、β-环糊精对苯二甲醛包合物（CD-TA）和Por-CD-COF与干燥溴化钾粉末在研钵中充分研磨并时刻保持干燥，然后放置压片模具中压制成透明无裂痕的模片，将压片放置于红外光谱扫描仪中在500-400 cm^-2范围内扫描36圈。

通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）用于验证Por-CD-COF复合物的构建情况。如图2（a）所示，Por-CD-COF的FT-IR同时结合了TAPP和CD-TA的性质，从中可以同时观察到属于β-环糊精（V_O-H在3370 cm^-1处，V_C-O-C在1030 cm^-1处）和卟啉（V_N-H在3340 cm^-1处，δ_N-H在1610 cm^-1处）的特征吸收峰。同时，对苯二甲醛基团和卟啉基团中醛基（1700 cm^-1）和胺基（3340 cm^-1）的特征峰几乎消失，取而代之的是，Por-CD-COF的傅立叶变换红外光谱中出现了1620cm^-1的新吸收带，该吸收带归因于醛氨缩合产生的C=N伸展振动。证明了β-环糊精对苯二甲醛包合物成功与5,10,15,20-四(4-(氨基苯基)-卟啉聚合，形成了稳定的Por-CD-COF复合物。

（2）通过固态¹³C-NMR进一步确证了Por-CD-COF复合物的碳骨架结构，如图2（b）所示，可以清楚地观察到饱和碳（72.3 ppm和54.0 ppm，属于环糊精）和不饱和碳（81.8和103.6 ppm）以及属于苯环（107 ppm）和卟啉大环（121.8、130.4、137和145.4 ppm）的清晰信号。除此之外还可以检测到152 ppm处与亚胺连接相对应的密集峰，进一步表明复合物网络的形成。

（3）通过 X射线衍射图谱了解Por-CD-COF复合材料的结晶形态，如图2（c）所示。

（4）通过N₂吸附解吸曲线和孔径分布曲线了解Por-CD-COF复合材料的孔隙分布情况。如图2（d）-图2（e）所示，Por-CD-COF复合材料的低温N₂吸附/解吸等温线显示了典型的以中孔主导的孔隙结构。计算出的Por-CD-COF的表面积被确定为35.3 m²·g⁻¹，总孔隙体积为0.177 m³·g⁻¹。通过非局部密度函数理论（NLDFT）实现的Por-CD-COF相应的孔径分布（PSD）进一步揭示了其为典型的II型等温线，宽的中孔分布在2.13-100 nm之间。

（5）催化剂紫外可见光谱的测定：采用紫外可见分光光度计记录催化剂的紫外吸收光谱，分别取1mg的实施例制备Por-CD-COF和对比例制备Por-COF，利用超声仪充分分散于2mL蒸馏水中配置为500μg/mL的悬浮液，用纯水测定基线后分别在800-200nm波长范围内测定Por-CD-COF和Por-COF的吸光度。

通过Por-CD-COF和Por-COF的紫外可见光谱可以确定Por-CD-COF和Por-COF复合材料的结构，如图2（f）所示，Por-CD-COF和Por-COF均出现较宽的吸收，Por-COF的紫外吸收光谱在420nm处表现出卟啉的特征峰，Por-CD-COF的卟啉特征峰几乎消失表明复合材料的成功制备。

（6）扫描电镜SEM和透射电镜TEM：将Por-CD-COF用导电胶黏附在云母基底上并喷金，然后再SEM下观察样品形貌。将超声分散后的Por-CD-COF甲醇分散液滴加到铜网上，阴干后得到观察样本，将样本装至TEM中观察样本形貌并拍照，导出样本元素分析图及各种元素的原子含量表。

通过SEM观察Por-CD-COF复合材料的形态，如图3所示，图3（a）-图3（c）显示了Por-CD-COF复合材料在5 μm和500nm下的形貌，显示了制备的 Por-CD-COF 的块体结构，它具有二维（2D）片状堆积结构。此外，从扫描电子显微镜中还可以同时观察到均匀分布在块体上的互生大孔。图3（d）-图3（g）显示了Por-CD-COF复合材料在500 nm、200 nm和50nm下的形貌，可以进一步观察到层状结构，同时观察到类似石墨烯的少层结构和明显的小尺度薄片，经过高分辨TEM的观察，如图3（h）-图3（i）所示，通过明场暗场对比可以证明有微孔存在。图4显示了Por-CD-COF的元素分布，显示了其各种元素分布均匀。

（7）Por-CD-COF复合材料的光热性能：通过改变Por-CD-COF复合材料的浓度（100、200、300、400和500 μg/mL）或激光的功率密度（0.5、0.75、1.0、1.2和1.5 W/cm²），对Por-CD-COF的光热转化性能进行了细致的研究。其中，不同浓度Por-CD-COF复合材料的配置方法为：首先称取10 mg的Por-CD-COF利用超声仪充分分散于1 mL蒸馏水中配置为10 mg/mL的母液，再分别从母液中吸取10、20、30、40和50μL于990、980、970、960和950μL的蒸馏水中，最终配置为100、200、300、400和500 μg/mL的Por-CD-COF水分散液。

首先，在激光照射下（λ=638 nm，1.2 W/cm²，10min），对不同浓度的Por-CD-COF的升温行为进行了研究。如图5（a）-图5（b）所示，Por-CD-COF呈现出浓度和功率依赖性的光热转换能力，其温度随着Por-CD-COF浓度和功率的增加而明显增加。例如，如图5（c），在连续辐照10min后，Por-CD-COF 分散液（500 μg/mL）的温度从33.5℃升至 66.4℃。然而，等含量（500μg/mL）的 Por-COF分散体的温度仅达到 41.5℃。值得注意的是，Por-CD-COF分散体的温度在激光照射后的最初50秒内迅速升至44.2℃，这表明Por-CD-COF具有将光能转化为热能的高效光热转换能力。图5（d）显示了通过五个连续的激光开/关循环来估计Por-CD-COF的光热稳定性。可以清楚地看到Por-CD-COF呈现出高效的光热反应，在重复五次开/关循环后几乎没有温度波动，这对实际应用是相当重要的。此外，从热成像仪获得的温度图片也可以直观地反映出浓度依赖性的升温行为，见图6（a）。

此外，根据光热转换效率公式1来计算Por-CD-COF的光热转换效率：

η (%) = [hS (T_max– T_surr) – Q_dis]/ I (1 – 10^{–A 638})（公式1）；

公式中每个元素的含义是： "h "是传热系数；S是容器的表面积；"T_max"是照射10min后的平衡温度（66.3℃）；"T_surr"是实验时的环境温度（36.4℃）；"Q_dis"是测试单元的散热量（11.34mW）；"I"代表638纳米的激光功率（1.2 W/cm²）。"A638 "是Por-CD-COF水溶液在638纳米处的吸光度（0.5098）。

根据公式2计算hS值：

hS = m_H2OC_H2O/τS（公式2）；

公式中每个元素的含义是： "m_H2O"是实验时水溶剂的质量（1×10^-3kg）；"C_H2O"是水的比热容（4.2×10³J/kg℃)。

根据公式3计算τS值：

t= -τS (Inθ)（公式3）；

τS是Por-CD-COF时间常数（226.64）；"θ"是ΔT和T_Max的比率。图6（b）-图6（c）中显示了公式中τS与θ值。

综上所述，Por-CD-COF的光热转换效率（η）确定为65.47%。图6（d）显示了在638 nm激光（1.2 W/cm2）照射下，用新鲜制备的 Por-CD-COF 水悬浮液在水中孵育 30 天后的温度曲线，可以看出在水中长时间放置后温度只降低0.3℃，对光热效果并无明显影响，说明复合材料有较强的稳定性。

（8）Por-CD-COF的光动力性能：对Por-CD-COF在638 nm激光（1.2 W/cm²）照射下的光动力性能进行了研究。

首先，以1, 3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）作为光动力探针，它可以和光敏剂（Por-CD-COF组）混合溶解在二甲基亚砜中，通过改变激光照射光敏剂的时间，来控制光敏剂所产生的单线态氧（¹O₂）。单线态氧产生的越多，DPBF消耗的越多。在此基础上，确定Por-CD-COF组与其他组（纯DPBF组和Por-COF组）产生的单线态氧。其中，Por-CD-COF组和Por-COF中Por-CD-COF和Por-COF的浓度为50μg/mL。配置方法为：称取1mg的Por-COF或Por-CD-COF利用超声仪充分分散于1mL 二甲基亚砜中配置为1mg/mL的母液，从Por-COF或Por-CD-COF的母液中吸取50μL于950μL的DMSO中，配置为50μg/mL的Por-COF和Por-CD-COF二甲基亚砜分散液。

为了研究Por-CD-COF的光动力特性，如图7（a）-图7（c）所示，其中纯DPBF组为对照组，即为不加任何光敏剂，仅存在DPBF探针，除了纯DPBF溶液的吸光度几乎没有变化外，其他两组Por-COF和Por-CD-COF组，在~416nm处的紫外可见吸收光强度均随着激光照射时间的增加呈现明显的下降趋势，表明DPBF在光照下不断消耗。例如，在638nm激光照射10min后，Por-CD-COF组的下降率达到59.26%（相对于纯DPBF组的4.28%），这比纯DPBF组高得多。而Por-COF组则只有36.81%。从吸收强度随时间变化的曲线图7（d）可以更直观地反映出性能差异。这样的结果验证了Por-CD-COF可以在激光激发下产生可用于光动力的¹O₂。

试验例1：体外抗菌试验

（1）细菌培养：本试验采用了E. coli和S. aureus两种细菌，利用二代细菌来完成以下实验。二代细菌具体的培养方法为：首先复苏冻存的细菌，在37°C的条件下将冷冻细菌融化，取100 µL菌液于装有5 mL液体培养基的摇菌管中，放置恒温摇床（110rpm，37℃）培养12h，取培养后的菌液100 µL置于装有900 µL的2 mL 的EP管中，再按梯度稀释的办法按梯度10^-2稀释5-10管，取每管中的菌液100 µL，使用涂布棒均匀的涂在装有固体培养基的培养皿中，在37℃下孵育24h，观察克隆形态与菌落数量，取菌落数大约为1000个的培养皿为一代细菌。使用挑菌棒挑出一代细菌中的一个菌落加入装有5 mL液体培养基的摇菌管中，按培养一代细菌的方法培养得到菌落数大约为1000个的培养皿为二代细菌。

（2）平板计数法测定Por-CD-COF的抗菌活性：经过对Por-CD-COF关于PTT和PDT的性能测试，可以得出Por-CD-COF具有一定的抗菌潜力，用平板计数法研究了Por-CD-COF的激光照射诱导的抗菌能力。其中，不同浓度的Por-CD-COF或Por-COF组细菌分散液的具体配置方法为：取Por-CD-COF或Por-COF粉末10 mg，充分分散于1 mL PBS中，配置成10mg/mL的Por-CD-COF或Por-COF母液，在6个2 mL EP管中分别加入100 µL 10⁸CFU mL^-1细菌溶液，再分别加入850、860、870、880、890和900 μL的PBS，再分别加入50、40、30、20、10和0 μL的10mg/mL的Por-CD-COF或Por-COF母液，配置为500、400、300、200、100和0 μg/mL的Por-CD-COF或Por-COF溶液，即为不同浓度的Por-CD-COF或Por-COF组细菌分散液。然后使用激光照射不同浓度的Por-CD-COF和Por-COF溶液（激光的参数：λ=638 nm，1.2 W/cm²，10min），不同浓度的Por-CD-COF和Por-COF溶液分别放置恒温摇床（110 rpm，37℃）培养12h，然后按细菌培养的方式将培养后的菌液梯度稀释10⁵倍，将吹匀的菌液转移100 μL到固体培养基中，并涂抹均匀，在37℃下孵育24h，以观察克隆的形态。计算菌落并与各组比较细菌活性。如图8-9所示，与经 PBS 处理的细菌相比，经 Por-CD-COF 和 Por-COF 处理的存活细菌数量在激光照射（638 nm，1.2W cm²，10min）后显著减少。值得注意的是，抗菌效果随着 Por-CD-COF和 Por-COF 剂量的增加而明显提高。与 Por-COF 相比，在相同的材料剂量下，Por-CD-COF的杀菌能力更强随着Por-CD-COF溶液浓度的增加，对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E.coli）的杀菌性能大大增强。

为了比较，还评估了Por-CD-COF和Por-COF的体外抗菌能力。还是利用平板计数法研究在有无光照的条件下观察Por-CD-COF和Por-COF（500 μg/mL）的抗菌效果。将体外细菌实验分为六组，分别为PBS组（I）、Por-COF（II）和Por-CD-COF组（III）、PBS+激光组（IV）、Por-COF+激光组（V）、Por-CD-COF+激光组（VI），六组均配置成1ml的液体。不同组共培养溶液的配置方法为：首先配置Por-COF或Por-CD-COF母液，即为分别取Por-COF或Por-CD-COF各10 mg，充分分散于1 mL PBS中，配置成10mg/mL的Por-COF或Por-CD-COF母液。

Por-COF或Por-CD-COF组处理办法为，在2 mL EP管加入100 µL 10⁸CFU mL^-1细菌溶液，再加入850 μL的PBS，再加入50 μL的10mg/mL的Por-COF或Por-CD-COF母液，得到Por-COF或Por-CD-COF分散液；记为Por-COF或Por-CD-COF组（浓度均为500 μg/mL，总体积均为1ml）。

Por-COF+激光组或Por-CD-COF+激光组处理办法为，按Por-COF或Por-CD-COF组处理办法配置浓度为500 μg/mL的Por-COF或Por-CD-COF分散液，再用激光照射分散液，得到处理后的Por-COF+激光组或Por-CD-COF+激光组（总体积均为1ml）。

激光的参数：λ=638 nm，1.2 W/cm²，10min；然后按照组别分别放置恒温摇床（110rpm，37℃）培养12h，然后按细菌培养的方式将培养后的菌液梯度稀释10⁵倍，将吹匀的菌液转移100 μL到固体培养基中，并涂抹均匀，在37℃下孵育24h，以观察克隆的形态。计算菌落并与各组比较细菌活性。从图10可以看出， PBS 和 PBS + 激光组在 LB 琼脂平板上生长的菌落数量几乎相同，表明单独激光照射对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活力没有影响。相比之下，在相同剂量为500μg/mL的条件下，激光照射10 min后，Por-CD-COF和Por-COF的抑菌效率显著提高。Por-CD-COF+激光组治疗后，98.42%的金黄色葡萄球菌和98.28%的大肠杆菌死亡；Por-COF+激光组治疗后，35.35%的金黄色葡萄球菌和47.69%的大肠杆菌被杀死。结果表明，在有光和无光条件下，Por-CD-COF的杀菌效果远高于Por-COF。这是由于Por-CD-COF结合了CD和TAPP的抗菌能力，实现了协同的光热（PTT）光动力（PDT）杀菌效果。总之，Por-CD-COF具有良好的协同PTT和PDT抗菌能力，可以作为一种具有潜在抗菌能力的光谱抗菌剂来代替抗生素。

试验例2：细菌活/死染色试验：

SYTO-9和PI被用来区分活的和死的微生物细胞。SYTO-9能穿透所有的细菌膜（完整的和受损的），因此将细菌标记为绿色。另一方面，PI只穿透受伤的细菌膜，将细菌标记为红色，同时减少SYTO-9的绿色。

按试验例1中的方法配置PBS组（I）、Por-COF组（II）、Por-CD-COF组（III）、PBS+激光组（IV）、Por-COF+激光组（V）和Por-CD-COF+激光组（VI）的菌液。之后取各个组的细菌悬液100µL与 20 µL SYTO-9（1.0×10^-3M）和20 µL PI（1.5×10^-3M）在37℃下黑暗中共孵育进行15min。染色后，将样品在PBS中离心，以去除多余的SYTO-9和PI。然后将细菌重新悬浮在50 µL PBS中，并放置在载玻片表面。然后用荧光倒置显微镜捕捉大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的图像。

从图11可以看出，活/死染色的结果与前述共培养实验的结果一致，不同处理下的两种细菌都呈现不同的荧光信号，用PBS和PBS+激光组处理的细菌，只呈现强烈的绿光荧光。但是对于其他组的处理下的细菌，用激光照射的组呈现出比单独的材料强得多的红色荧光。Por-CD-COF+激光组呈现出最突出的灭菌效果，其中几乎所有的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都被标记为红色。而对于Por-COF+激光组，只有一部分金黄色葡萄球菌与大肠杆菌被染成红色。进一步证明了Por-CD-COF在协同PTT和PDT抗菌方面的优越性。

试验例3：细菌透射电镜：

按试验例1中的方法配置PBS组（I）、Por-COF组（II）、Por-CD-COF组（III）、PBS+激光组（IV）、Por-COF+激光组（V）和Por-CD-COF+激光组（VI）的菌液。之后，取细菌菌液100μL在2.5wt%戊二醛溶液中固定（4 °C，2h），用PBS洗三次，嵌入琼脂并封锁。然后用乙醇溶液（30 wt %、50 wt %、70 wt %、90 wt%、95 wt %和100 wt %）在室温下连续处理10min使细菌脱水，接着用丙酮在室温下处理3h，用包埋介质（环氧树脂）梯度浸润包埋（分别用丙酮和环氧树脂质量比3:1、1:1、1:3分别浸透1小时，最后纯环氧树脂浸透过夜）阴性染色，在镍网上切片。镍网被放在TEM下观察，捕获细菌形态。

用TEM来观察不同组别处理的细菌膜的完整性。如图12中所示，PBS（I）和PBS+激光组（IV）中，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌膜在有光和无光的情况下都是完整的，表明细菌的活力没有受到光的影响。处理Por-COF+激光组（V）下的细菌膜有较弱损伤，但损伤程度明显小于Por-CD-COF+激光组（VI）。与活/死染色结果相似，其他组处理后的，细菌膜也有不同程度的损伤。图12中的 VI组所示，Por-CD-COF+激光对其细菌膜的破坏最为严重，有大量的细菌内容物流出。因此，具有协同PDT和PTT抗菌能力的Por-CD-COF复合材料作为一种不含抗生素的广谱抗菌剂具有巨大的应用潜力，可以有效地杀死细菌。

试验例4：体外生物相容性实验：

（1）溶血实验

新鲜血液取自BALB/c雌性小鼠（购自济南朋悦实验动物繁育有限公司）。以1500rpm离心20min收集红细胞，然后用PBS洗涤三次。然后将红细胞（4% w/w）与Por-CD-COF（100-500 µg/mL）以1:9（v/v）的比例在37℃下孵育3h，然后以12000 rpm离心20min。然后，将每组100μL上清液置于96孔板中，用酶标仪在570nm处测量每组的吸光度。蒸馏水被用作阳性对照，PBS被用作阴性对照。使用下列公式4计算溶血量：

溶血量（%）=（A-An）/（Ap-An）×100%（公式4）；

其中 "A "是在红细胞中加入Por-CD-COF后取上清液得到的吸光度。" An "是在红细胞中加入PBS后取上清液得到的吸光度（阴性对照）。"Ap "是在红细胞中加入蒸馏水后取上清液得到的吸光度（阳性对照）。

如图13所示，Por-CD-COF在显示出抗菌活性的浓度范围内，只显示出少量（低于2%）或没有溶血活性。Por-CD-COF的溶血率随Por-CD-COF的浓度而变化，随着浓度从100到500 μg/mL的增加，溶血率从0.88±0.01%上升到1.27±0.01%。说明Por-CD-COF具有良好的血液相容性，对红细胞膜没有或可以忽略的损害。

（2）细胞毒性实验

在96孔板中，HEK-293细胞（由5型腺病毒（Ad 5）转化的人类原代胚胎肾脏建立，德国细胞库（DSMZ）：ACC 305）以每孔5×10³个细胞的密度播种，每孔180µL细胞，在周围的重复孔中加入200 µL PBS进行液体密封，以防止过度蒸发。孵化24h后，加入20 µL不同浓度（100-500 μg/mL）的Por-CD-COF孵化72h。然后在每个孔中加入20 µL的MTT（4mg/mL）溶液，在培养箱中培养4h。4h后，吸出上清液并加入150 µL二甲基亚砜，溶解MTT（四甲基偶氮唑蓝）。在摇床上溶解10min后，用酶标仪在570nm处测量96孔板的吸光度。每组实验重复三次。

同时，为了进一步研究材料本身对正常细胞的不良损害，进行了Por-CD-COF对HEK-293的细胞毒性试验。如图14显示了用不同浓度的Por-CD-COF（100-500 μg/mL）培养3天的HEK-293细胞的细胞活力。可以清楚地看到，随着材料浓度的降低，相对细胞活力逐渐增加，其数值在所有实验浓度下都能保持大于80%，接近于100%，表明对HEK-293细胞没有毒性。所有这些结果证实，具有良好生物相容性的Por-CD-COF是细菌的选择性药剂。

试验例5：

（1）体内伤口愈合实验：

使用5周大的雌性BALB/c小鼠（济南朋悦实验动物繁育有限公司）（每组n = 6，20-25 g），分为4组，即空白组、对照组、无光照组和光照组；

空白组：不对小鼠进行建模处理，无伤口。

对照组：建立伤口模型后，用PBS处理伤口，100 µL；

无光照组：建立伤口模型后，用500 µg/mL Por-CD-COF处理伤口，100 µL；

光照组：建立伤口模型后，用500 µg/mL Por-CD-COF+激光处理伤口，激光参数为λ=638 nm，1.2W/cm²，10min；100 µL。

为了评估Por-CD-COF在伤口愈合中的作用，建立了金黄色葡萄球菌感染BALB/c小鼠背部皮质受损伤口模型。为了进行比较，还估算了对照组、无光照组和光照组的体内抗菌能力。具体方法为：金黄色葡萄球菌感染BALB/c小鼠背部皮质受损伤口模型建立一天后，每组伤口处按上述用量处理伤口，即为伤口治疗。第0天至第1天为建模时间，用金黄色葡萄球菌感染受损的伤口。此外，分别在第1、3、5、7和9天对小鼠的伤口进行拍照和记录。如图16所示，第1天显示的是小鼠背部伤口提供了治疗一天后背部伤口的照片。可以看出所有的伤口都显示出细菌感染的特征，所有组的伤口收缩率几乎相同（~30%）。与无光照组的肿胀相比，用激光治疗组（光照组）的伤口随着治疗时间的延长，不同治疗方法下的伤口进一步收缩。图17（b）显示了不同组的伤口收缩率。在第9天，对照组伤口面积最大，伤口收缩率分别达到48.45±2.86%（对照组）、65.54±5.3%（无光照组）及87.41±2.65%（光照组）。相比之下，光照组经治疗的伤口在第9天愈合情况良好，明显优于其他两组。从图16的叠加伤口图可以更明显地看出，经激光照射组处理的伤口愈合情况要比无激光组好得多。所有这些结果表明，与其他组相比，激光照射Por-CD-COF不仅可以明显减少细菌入侵，还可以加速伤口收缩。同时，每天记录BALB/c小鼠的体重以进一步比较。如图17（a）所示，在9天的治疗中，各组小鼠没有明显的行为异常，体重也没有明显变化。

（2）体内生物相容性研究：组织染色实验（HE染色）

为了进一步研究各组小鼠的伤口愈合情况，采用苏木精和伊红（H&E）染色来评估（1）体内伤口愈合试验中小鼠的伤口愈合情况。如图18所示，对感染金黄色葡萄球菌的伤口进行的组织学分析显示，所有组都不同程度地出现了新的毛细血管和皮肤生长。最直观的可以看出，光照组的伤口结痂面积比对照组和无光照组都小，说明Por-CD-COF组在激光照射后的愈合速度明显加快。对照组的结痂面积最大，新的毛细血管和皮肤很少，而且有大量的炎症细胞。因此，Por-CD-COF在激光照射后能更快地加速伤口重建。

为了研究Por-CD-COF的体内生物相容性，对BALB/c小鼠的心、肝、脾、肺和肾进行组织切片和H&E染色。如图19所示，结果发现，各组的不同器官没有明显的炎症和形态学损伤。

（3）血常规实验

在第9天，从小鼠的眼底动脉收集1至2毫升的血样。每个血样取200μL进行常规血液分析，包括白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、平均红细胞体积（MCV）、血小板（PLT）、平均血红蛋白浓度（MCHC）和平均血红蛋白含量（MCH）。

为了研究Por-CD-COF的体内生物相容性，从上述BALB/c小鼠的眼睛中抽取血液进行血常规检测。如图20所示，各组的血常规值没有发现明显差异。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种基于β-环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述研磨的时间为30min，研磨时滴加对甲苯磺酸溶液和无水乙醇。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述β-环糊精对苯二甲醛包合物、5,10,15,20-四(4-氨基苯基)-卟啉、1,3,5-三甲基苯、1,4-二氧六环、冰醋酸水溶液的加入量之比为184mg：65.2mg：3mL：3mL：1mL。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为120℃，反应的时间为72h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述洗涤为依次用无水甲醇、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、水和乙醇洗至洗出液无色；所述干燥为85℃真空干燥6h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述β-环糊精对苯二甲醛包合物由以下方法制备：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述对苯二甲醛的乙醇溶液中对苯二甲醛的浓度为0.1mol/L；所述β-环糊精的水溶液中β-环糊精的浓度为0.033 mol/L；所述对苯二甲醛和β-环糊精的摩尔比为2：3。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述滴加的速度为1mL/min；所述包合反应为：在50℃下搅拌3h，然后减压蒸发乙醇，再冰浴12h。

9.利用权利要求1~8任一项所述的制备方法得到的基于β-环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料。

10.权利要求9所述的基于β-环糊精对苯二甲醛包合物的卟啉微孔复合材料在制备抗菌药物中的用途。