CN110790258A

CN110790258A - 一种纳米替硝唑碳点及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110790258A
Application number: CN201911174133.XA
Authority: CN
Inventors: 梁高峰; 高社干; 史浩; 景爱华; 李光大; 冯文坡; 李艳; 杜景霞; 安君岭
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2020-02-14

Abstract

本发明公开了一种纳米替硝唑碳点及其制备方法和应用，属于医药技术领域，包括以下步骤：配置浓度为0.1～0.3mol/L的替硝唑溶液，将替硝唑溶液在180～250℃温度下进行水热反应制得产物粗品，产物粗品经过孔径为0.22μm的膜过滤、截留分子量为800Da的透析袋透析、干燥，制得纳米替硝唑碳点；本发明以替硝唑为前药，通过水热条件将替硝唑药物制备成碳点药物，所得到的替硝唑基碳点药物具有小的纳米尺寸和替硝唑的抑菌功能，同时对专性厌氧菌具有选择性抗菌活性，甚至可以穿透细菌生物膜实现深层杀菌，从而可以最大化药物的效果。

Description

一种纳米替硝唑碳点及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种纳米替硝唑碳点及其制备方法和应用。

背景技术

牙周炎是一种慢性牙周组织感染性炎症疾病，多见于35岁之后，牙周炎的发生会导致牙齿脱落，不仅可以影响人体的消化吸收特别是咀嚼功能，而且还会降低脑细胞的活力，导致记忆力减退，同时伴随全身性疾病，例如引发心血管疾病、高血压，时间长了极易产生心脏病等。牙周炎已被证实是由多种牙周致病菌混合感染引起的。一组革兰氏阴性厌氧菌与牙周炎的发生和发展有着紧密的关系，其中牙龈卟啉单胞菌是其最重要的机会致病细菌。

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)是慢性牙周炎最主要的致病菌，有多种毒力因子，如菌毛、牙龈素、脂多糖(LPS)和凝血素等。P.gingivalis既能侵入和破坏宿主的牙周组织，而且能够逃避宿主的防御机制。研究表明：它不仅可以引起口腔疾病，更与食管癌及阿尔兹海默症等多种严重疾病有关，对患者健康及生命造成严重威胁。较之处于浮游状态的同种细菌，生物被膜内的细菌具有更强的耐药性、毒性、对免疫系统的抵抗能力。牙菌斑是牙周病的始动因素，主要由黏性基质和嵌入其中的细菌构成，是一种典型的生物膜结构(biofilm，BF)和有序的微生态系统。牙菌斑生物膜的形成和堆积也是其它口腔疾病如龋病发生和发展的最直接原因。牙菌斑生物膜的形成是一种细菌适应过程，是细菌能够抵抗表面活性剂、抗生素或宿主防御功能的杀灭作用，是各种细菌长期共存，在合适的微环境中发挥不同的致病作用的重要保护伞。因此干扰牙菌斑生物膜的形成或降低牙菌斑生物膜的生物量，是预防和治疗口腔疾病的有效途径。

目前，临床上对牙周炎的治疗多为以机械的方法清除牙菌斑，如超声洗牙等。但是，这种机械性破坏牙菌斑生物膜结构之后，缺少对牙周致病菌尤其是牙菌斑生物膜的抑制，一段时间之后牙菌斑会继续出现。临床上往往采取多种抗生素类联合用药清除致病菌，虽然在治疗牙周病上有一定的疗效，但同时口腔内的正常菌群也会受到抑制。长期治疗后，正常菌群失调，口腔微生态环境遭到破坏，会对机体健康造成严重损害。

因此，亟需找到一种可以专性清除主要致病菌同时清除牙菌斑生物膜防止细菌产生耐药性、协同机械治疗的改良型抗生素药物。

硝基咪唑对革兰氏阴性厌氧菌具有良好的杀菌活性。替硝唑是硝基咪唑的升级版药物，比甲硝唑对厌氧细菌更敏感，替硝唑能迅速消除口腔厌氧菌所致炎症，减轻症状。但是，替硝唑药物水溶性差，药物本身的尺寸比较大，这使得它仅仅能够在短时期内维持一定效率的杀菌，并且由于牙菌斑生物膜复杂的结构和难以穿透的特性，正常剂量的药物可能是无效的，必须高剂量或重复给药，最终会导致一系列副作用，如毒性和高耐药性。此外，大颗粒的替硝唑药物不能很好地渗透到生物膜中，因此通常无法破坏生物膜导致起革兰氏阴性厌氧细菌的耐药性，这对人类口腔疾病的预防和治疗也提出了巨大的挑战。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种纳米替硝唑碳点及其制备方法和应用，以替硝唑为前药，通过水热条件将替硝唑药物制备成纳米碳点药物，所得到的替硝唑基碳点药物具有小的纳米尺寸和替硝唑的抑菌功能，同时对专性厌氧菌具有选择性抗菌活性，甚至可以穿透和清除牙菌斑生物膜实现深层杀菌，从而可以最大化药物的效果，有利于口腔疾病的预防和治疗。

本发明的第一个目的是提供一种纳米替硝唑碳点的制备方法，包括以下步骤：

配置浓度为0.1～0.3mol/L的替硝唑溶液，将替硝唑溶液在180～250℃温度下进行水热反应制得产物粗品，产物粗品经过孔径为0.22μm的膜过滤、截留分子量为800Da的透析袋透析、干燥，制得纳米替硝唑碳点。

优选地，所述替硝唑溶液具体是通过以下步骤制得：

将替硝唑纯品研磨粉碎，并溶于水中，搅拌10～50min，制得替硝唑溶液；所述替硝唑溶液浓度为0.1～0.3mol/L。

优选地，所述水热反应条件为180～250℃温度下，反应8～24h。

优选地，过滤、透析、干燥过程具体包括以下步骤：

将产物粗品通过孔径为0.22μm的膜过滤，收集液体并用截留分子量为800Da的透析袋在水中透析12～48h，将透析后的液体冷冻干燥即可。

优选地，所述膜为孔径0.22μm的聚醚砜膜。

本发明的第二个目的是提供上述制备方法制得的纳米替硝唑碳点。

本发明的第三个目的是提供上述纳米替硝唑碳点在制备治疗牙周炎药物方面的应用。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果:

1)本发明选择了替硝唑作为碳源，通过水热反应、膜过滤和透析合成了具有选择抗菌活性的碳点药物，工艺简单易行，耗能低，耗时短，以非常低的成本就可实现药物功能的升级换代；

2)本发明所制得的碳点药物不仅保留了前药替硝唑最重要的杀菌官能团，选择性地杀伤革兰氏阴性厌氧菌，同时对于其他正常菌群和宿主细胞没有造成明显的抑制作用，因此副作用小，即使长期使用，也不会破坏口腔微生态环境，利于维持牙龈口腔微环境；

3)本发明所制得的碳点药物尺寸小，渗透能力强，能够有效地渗透至牙龈卟啉单胞菌产生的生物膜中并进行清除，使得药物的效益得到最大化发挥，避免由于过量的抗生素导致的细菌耐药性增加，降低了治疗的难度；

4)本发明所制得的碳点药物的荧光特性可以对于口腔疾病同时进行成像与治疗，实现疾病的及时评估和治疗的协同性和一致性，在口腔医学领域中有着广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1制得的纳米替硝唑碳点粒径表征结果；其中(1)为透射电镜表征图，(2)为DLS动态光散射粒径分析结果图；

图2为实施例1制得的纳米替硝唑碳点反应前后红外光谱图；

图3为实施例1制得的纳米替硝唑碳点的荧光发射光谱；其中(1)为纳米替硝唑碳点在400nm激发强度，(2)为替硝唑碳点在492nm处呈现蓝绿色荧光；

图4为实施例1制得的替硝唑碳点选择性抗菌效果图；

其中(1)为大肠杆菌(E.coli)，(2)为链球菌(S.aureus)，(3)为牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)，其中-TCDs为未加TCDs的空白对照，+TCDs为TCDs处理过的滤纸片抗菌效果；(4)(5)(6)分别对应为药物在大肠杆菌、链球菌、牙龈卟啉单胞菌液体培养基中的杀菌效果图；

图5为实施例1制得的替硝唑碳点对清除P.gingivalis生物膜作用效果图；

其中(1)为经过结晶紫染色后的残留的生物膜照片，(2)对不同浓度处理过的残留生物膜定量分析图；

图6为实施例1制得的不同浓度的替硝唑碳点药物处理过细菌粘附牙齿模型图。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。

实施例1

一种纳米替硝唑碳点的制备方法，包括以下步骤：

称取3mmol替硝唑纯品并用玛瑙研体充分研磨，之后溶解在10mL超纯水中，充分搅拌10min，将溶液转移到100mL特氟隆衬里的高压釜中，将其密封并在180℃，高温加热反应8h；随后，等待反应器自然冷却至室温，将反应粗产物通过0.22μm聚醚砜膜过滤以除去未反应附聚颗粒，收集液体并在800Da透析袋中对超纯水透析20h；最后，将透析后的液体冷冻干燥过夜，制得纳米替硝唑碳点，用于进一步表征。

实施例2

一种纳米替硝唑碳点的制备方法，包括以下步骤：

称取5mmol替硝唑纯品并用玛瑙研体充分研磨，之后溶解在20mL超纯水中，充分搅拌50min，将溶液转移到100mL特氟隆衬里的高压釜中，将其密封并在250℃，高温加热反应12h，随后，等待反应器自然冷却至室温，将反应粗产物通过0.22μm聚醚砜膜过滤以除去未反应附聚颗粒，收集液体并在800Da透析袋中对超纯水透析48h，最后，将透析后的液体冷冻干燥过夜，制得纳米替硝唑碳点。

实施例3

一种纳米替硝唑碳点的制备方法，包括以下步骤：

称取3mmol替硝唑纯品并用玛瑙研体充分研磨，之后溶解在30mL超纯水中，充分搅拌20min，将溶液转移到100mL特氟隆衬里的高压釜中，将其密封并在200℃，高温加热反应24h，随后，等待反应器自然冷却至室温，将反应粗产物通过0.22μm聚醚砜膜过滤以除去未反应附聚颗粒，收集液体并在800Da透析袋中对超纯水透析12h，最后，将透析后的液体冷冻干燥过夜，制得纳米替硝唑碳点。

上述实施例1～3制得的纳米替硝唑碳点性能近似，下面仅以实施例1制得的纳米替硝唑碳点为例，说明其性能。

采用透射电镜(TEM,JEM-2100F)对上述纳米替硝唑碳点的透射电镜图像进行了表征；纳米替硝唑碳点的红外光谱记录在Nicolet 200型傅里叶变换红外光谱仪上(美国Thermo Nicolet)；从图1(1)TEM电镜图片可以看出通过水热方法制备的纳米替硝唑碳点的大小约为20nm，粒径分析结果图1(2)显示主要集中分散在17.5nm左右；图2为反应前替硝唑和反应后的纳米替硝唑碳点的红外光谱表征，可以看出尽管是通过高温高压的反应制备，替硝唑碳点仍然保留了原始替硝唑药物的重要的杀菌基团(—NO₂)，厌氧菌可以通过电子转移蛋白将硝基咪唑硝基还原为羟胺，进而与细菌蛋白和DNA发生反应，阻止所有核酸的合成，硝基的存在是抗菌活性的重要保证，上述结果证明，采用简单、绿色的水热法制备的纳米替硝唑碳点保留了选择性抑菌能力的可能性。

荧光表征：

利用日立Flworomax-4荧光光谱仪对纳米替硝唑碳点的荧光发射光谱进行了分析；从图3(1)中我们可以看出，纳米替硝唑碳点在400nm激发下具有良好的发射强度，发射波长为492nm；图3(2)所示的插入图像显示替硝唑碳点在492nm处呈现蓝绿色荧光，这些结果证实了纳米替硝唑碳点的成功制备，为下一步奠定了基础。

抗菌效果表征：

针对纳米替硝唑碳点的选择抗菌效果实验，我们测试了采用不同浓度的纳米替硝唑碳点对大肠杆菌ATCC25922(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和P.gingvivalis进行研究(上述所用菌种均为现有技术)，将50μL第三代P.gingvivalis菌液(1×10⁸CFU/mL)均匀涂布在固体培养基上并在厌氧培养箱(37℃，5％CO₂，10％H₂，85％N₂)中培养，持续6小时之后，将半径为5mm的无菌圆形滤纸完全浸入药物中1小时，然后涂布在固体培养基平板上并培养24小时，S.aureus和E.coli以与P.gingvivalis相似的条件处理。

同时通过OD 600nm计算牙龈卟啉单胞菌的数量制备成P.gingvivalis悬浮液(5×10⁷CFU/mL),96孔平底塑料组织培养板在每个孔中接种100μL的P.gingvivalis悬浮液(阴性对照孔仅用培养基填充)，并在厌氧培养箱(37℃，5％CO₂，10％H₂，85％N₂)中培养24小时，将100μL配置好的不同浓度的替硝唑碳点0μg/mL至125μg/mL加入该板中，在570nm处记录细菌生长。S.aureus和E.coli以与P.gingvivalis相同的方式处理，并且在570nm处记录它们的细菌生长情况；选择抗菌实验的结果如图4所示。

图4中(1)(2)显示纳米替硝唑碳点针对革兰氏阴性菌E.coli和革兰氏阳性菌S.aureus没有明显的抑菌圈形成，然而通过药物浸泡的滤纸片对P.gingvivalis的抑菌圈大小(图4(3))抑菌范围有显著的增加；图4(4)-(6)是对应的液体培养基吸光度值实验的结果，与抑菌圈实验结果一致，替硝唑碳点针对E.coli和S.aureus的生长没有抑制作用，但是针对P.gingvivalis的生长抑制效果显著。

纳米替硝唑碳点的选择性抗菌实验及生物膜抑制验证：

替硝唑碳点抑制并清除P.gingvivalis生物膜实验：生物膜形成实验具体为：牙龈卟啉单胞菌(P.gingvivalis)通过OD 600nm计算牙龈卟啉单胞菌的数量制备成P.gingvivalis悬浮液(5×10⁷CFU/mL)。96孔平底塑料组织培养板分别接种100μLP.gingvivalis悬浮液(阴性对照孔仅用培养基填充)并在厌氧培养箱中(37℃，5％CO₂，10％H₂，85％N₂)培养24小时形成生物膜。培养后，用PBS洗涤96孔板三次以除去浮游的P.gingvivalis细胞。每孔加入100μL培养基稀释过的不同浓度替硝唑碳点药物，37℃，并在厌氧培养箱中(37℃，5％CO₂，10％H₂，85％N₂)孵育24小时。然后向每个孔中加入100μL99.0％甲醇以固定生物膜10分钟。固定后，将板洗涤一次并在室温下风干，用0.1％(w/v)结晶紫(Sigma-Aldrich)染色并用PBS彻底冲洗直至阴性对照孔显示无色。然后，每孔用150μL95％(w/v)乙醇振荡对板脱色。通过使用微量板读数器测量570nm处的光密度来定量吸光度。替硝唑碳点药物对生物膜的清除作用结果如图5所示；处理后用结晶紫染色的P.gingvivalis生物膜的图像如图5(1)所示，由于没有纳米替硝唑碳点的处理，第一个孔完全维持生物膜的完整性，由于受到不同浓度的纳米替硝唑碳点处理后的影响，P.gingvivalis生物膜的产生逐渐减少，在150μg/mL浓度下几乎没有产出，图5(2)中的结晶紫定量结果与上述结果一致，替硝唑碳点对P.gingvivalis生物膜的产生抑制效果非常明显。

牙菌斑抑制表征：

已知P.gingvivalis在厌氧环境中粘附牙齿并形成生物膜，这是牙菌斑的来源之一。因此，使用单通道直根牙确定替硝唑药物对斑块粘附的影响。将成年牛的牙齿直接用盐水溶液，3mL 25.5％次氯酸钠和3mL 17％EDTA洗涤，以去除玷污层，洗涤后，将牙齿在121℃高压灭菌器中高压灭菌30分钟，我们收集正常人口腔唾液通过0.22μm针头过滤器以去除其他细菌，然后将牙齿浸入其中。接下来，将它们加入含有不同浓度纳米替硝唑碳点药物处理过的细菌悬浮液(1×10⁸CFU/mL)中，并在(37℃，5％CO₂，10％H₂，85％N₂)的条件的影响下在厌氧条件下孵育48小时。随后，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤样品以除去非粘附细菌。最后，通过用0.1％番红染料(Sigma-Aldrich)染色来测量在表面形成的生物膜。细菌粘附实验的结果如图6所示。在存在不同浓度的纳米替硝唑碳点的情况下测试牙龈卟啉单胞菌在牙齿表面上的粘附，如图6所示，在用12.5至200μg/mL浓度下的纳米替硝唑碳点处理后的实验中细菌的粘附受到影响，而未处理组对粘附活性没有抑制作用，细菌的粘附对纳米替硝唑碳点具有高度敏感性。

由上述结果可得，本发明选择了替硝唑作为碳源，通过水热一步法即合成具有选择抗菌活性的碳点药物，工艺简单易行，耗能低，耗时短，以非常低的成本就可实现药物功能的升级换代；所制得的碳点药物不仅保留了前药替硝唑最重要的杀菌官能团，选择性地杀伤革兰氏阴性厌氧菌，同时对于其他正常菌群和宿主细胞没有造成明显的抑制作用，因此副作用小，即使长期使用，也不会破坏口腔微生态环境，利于维持牙龈口腔微环境；所制得的药物可以有效地清除牙龈卟啉单胞菌产生的生物膜，使得药物的效益得到最大化发挥，避免由于过量的抗生素导致的细菌耐药性增加，降低了治疗的难度；碳点药物的荧光特性可以对于口腔疾病同时进行成像与治疗，实现疾病的及时评估和治疗的协同性和一致性，在口腔医学领域中有着广阔的应用前景。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种纳米替硝唑碳点的制备方法，其征特在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的纳米替硝唑碳点的制备方法，其征特在于，所述替硝唑溶液具体是通过以下步骤制得：

3.根据权利要求1所述的纳米替硝唑碳点的制备方法，其征特在于，所述水热反应条件为180～250℃温度下，反应8～24h。

4.根据权利要求1所述的纳米替硝唑碳点的制备方法，其征特在于，过滤、透析、干燥过程具体包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的纳米替硝唑碳点的制备方法，其征特在于，所述膜为孔径0.22μm的聚醚砜膜。

6.根据权利要求1～5任一项制备方法制得的纳米替硝唑碳点。

7.根据权利要求6所述的纳米替硝唑碳点在制备治疗牙周炎药物方面的应用。