CN114304249A - 一种洋葱源抑菌碳点的制备及其在水产品保鲜中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种洋葱源抑菌碳点的制备及其在水产品保鲜中的应用，属于水产品保鲜技术领域。本发明所述的制备洋葱源抑菌碳点的方法，包括如下步骤：将洋葱和水按照料液比1：3～8混合均匀，之后在200～250℃下进行水热反应4～10h；反应结束后，去除反应后溶液中的不溶性杂质，醇沉，纯化，干燥，得到洋葱源抑菌碳点。本发明的洋葱源抑菌碳点对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌生长、假单胞菌生长具有抑制作用；而且将本发明的洋葱源抑菌碳点用于水产品保鲜，能够使得水产品的各感官品质指标、质构指标、颜色指标与空白对照组均无显著性差异，且具有延长水产品冷藏贮藏期的保鲜效果。

Description

一种洋葱源抑菌碳点的制备及其在水产品保鲜中的应用

技术领域

本发明涉及一种洋葱源抑菌碳点的制备及其在水产品保鲜中的应用，属于水产品保鲜技术领域。

背景技术

新鲜的水产品富含多种不饱和脂肪酸(PUFAs)和蛋白质，并且是维生素和矿物质的优质来源，目前已成为广受消费者喜爱的主要食品之一。水产品的高水分和高营养成分有利于腐败微生物的快速生长和繁殖，极易发生腐败变质，导致水产品在流通贮藏期间感官质量和营养价值的下降。因此，开发可应用于水产品贮藏保鲜的新型无毒无害抑菌材料，减少水产品贮运过程中腐败变质的发生，对于提升水产品品质具有重要意义。

纳米粒子是颗粒尺寸大约在0.1～100nm之间的粒子。随着纳米工业技术的快速发展，纳米技术在食品行业中也得到广泛应用，主要包括食品保鲜、食品包装、食品加工及食品检测等领域。碳纳米粒子的方法制备可分为自上而下和自下而上两种方法，其中自上而下的方法是指大分子碳材料通过一定的物理、化学等方法破碎成小分子的碳纳米颗粒，包括：电解法、酸刻蚀、激光刻蚀和高温热解等方法；而自下而上的方法是指将小分子的碳材料通过一定的化学手段合成团聚成更大分子量的碳纳米颗粒，其中包括：化学合成法、水热法、溶剂热法等方法。碳纳米粒子作为一种新型纳米材料，具有低毒、良好的生物相容性和细胞膜通透性、良好的光学性能以及价廉易得等优点，已广泛应用于光催化、生物成像等领域。

近年来，碳纳米粒子的抑菌性越来越受到人们的关注，但在制备过程中通常需要通过掺杂改性以发挥其抑菌作用；而且已有技术大多采用化学试剂作为原料进行抑菌性碳点的制备，能用到食品保鲜中的应用较少。

发明内容

[技术问题]

目前的抑菌碳纳米粒子需要掺杂改性才能发挥抑菌效果；而且大多采用化学方法制备，不适合用于食品保鲜。

[技术方案]

为了解决上述问题，本发明以洋葱为单一原料合成具有抑菌活性的碳点，其抑菌性能优异，并在水产品保鲜中具有广阔的应用前景。

本发明的第一个目的是提供一种制备洋葱源抑菌碳点的方法，包括如下步骤：

将洋葱和水按照料液比1：3～8混合均匀，之后在200～250℃下进行水热反应4～10h；反应结束后，去除反应后溶液中的不溶性杂质，醇沉，纯化，干燥，得到洋葱源抑菌碳点。

在本发明的一种实施方式中，所述的洋葱可以先冷冻干燥或直接切碎，也可以将为洋葱与水混合匀浆液。

在本发明的一种实施方式中，所述的去除反应后溶液中的不溶性杂质是通过过滤或者离心实现，所述的离心转速为8000～12000rpm，离心时间为10～30min。

在本发明的一种实施方式中，所述的醇沉是去除溶液中的多糖，具体是加入2～6倍体积的无水乙醇在2～6℃冷藏过夜，除去沉淀，再旋转蒸发除掉溶剂中的乙醇。

在本发明的一种实施方式中，所述的纯化具体是通过大孔树脂吸附、透析、凝胶色谱、液相色谱中的一种或几种分离提纯收集强荧光组分。

在本发明的一种实施方式中，所述干燥包括旋转蒸发、冷冻干燥、真空干燥中的一种或几种。

本发明的第二个目的是本发明所述的方法制备得到的洋葱源抑菌碳点。

本发明的第三个目的是本发明所述的洋葱源抑菌碳点在食品保鲜中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述的食品包括水产品，水产品包括鱼类，所述的鱼类包括大西洋鲭鱼、黄鱼、鳕鱼、鲑鱼等。

本发明的第四个目的是提供一种基于本发明所述的洋葱源抑菌碳点来保鲜鱼的方法，包括如下步骤：

将鱼切片，之后浸渍在本发明所述的洋葱源抑菌碳点溶液中；取出，沥干，得到保鲜的鱼片。

在本发明的一种实施方式中，所述的洋葱源抑菌碳点溶液为洋葱源抑菌碳点水溶液，浓度为4～10mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述的浸渍是常温(20～30℃)浸渍1～10min。

在本发明的一种实施方式中，沥干后在4℃层析柜中保藏。

[有益效果]

(1)本发明所需的原料来源易得，可利用洋葱不可食用部分，价格低廉；制备工艺简便，绿色，环保。

(2)本发明所制备的洋葱源抑菌碳点可以用来抑制水产品中的腐败微生物，在水产品贮藏保鲜方面具有广泛的应用前景。

(3)本发明的洋葱源抑菌碳点对大肠杆菌生长具有抑制作用，最小抑菌浓度(MIC值)为4mg/mL；对金黄色葡萄球菌生长具有抑制作用，最小抑菌浓度(MIC值)为1mg/mL；对假单胞菌生长具有抑制作用，最小抑菌浓度(MIC值)为2mg/mL；将本发明的洋葱源抑菌碳点用于水产品保鲜，能够使得水产品不再有洋葱的辛辣味，水产品的各感官品质指标、质构指标(硬度、咀嚼度和回复性)、颜色指标与空白对照组均无显著性差异；且具有延长水产品冷藏贮藏期的保鲜效果。

附图说明

图1为实施例1中制备的洋葱源抑菌碳点的透射电子显微镜照片。

图2为实施例1中制备的洋葱源抑菌碳点的粒径统计图。

图3为实施例1中制备的洋葱源抑菌碳点的紫外光谱。

图4为实施例1中制备的洋葱源抑菌碳点的荧光光谱。

图5为实施例1中制备的洋葱源抑菌碳点的不同pH的荧光稳定性。

图6为实施例1中制备的洋葱源抑菌碳点对大肠杆菌(A)、金黄色葡萄球菌(B)及假单胞菌生长曲线(C)的影响。

图7为实施例2中洋葱源抑菌碳点对假单胞菌生长曲线的影响。

图8为实施例4和对比例6中大西洋鲭鱼冷藏过程中的菌落总数。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

测试方法：

粒径的测试：将碳点配制成5mg/mL的去离子水溶液，用0.22μm的水系滤膜过滤，通过透射电镜观察制备的洋葱碳点表面形貌，并对粒径进行统计分析。

紫外光谱：通过紫外可见光谱仪扫描制备的碳点在200～700nm全波段下的紫外可见光谱。

荧光光谱：过荧光光谱仪扫描制备的洋葱碳点在300～450nm范围内的激发波长下的发射波长。

不同pH的荧光稳定性的测试：配置不同pH(2～11)的B-R缓冲溶液，取0.2mL碳点溶液(2mg/mL)分别加入1.8mL不同的pH的B-R缓冲液中，用荧光分光光度计测荧光强度，取三次平均值，得到所制备碳点的pH稳定性。

最小抑菌浓度测试：在96孔培养板的孔中加入100μL倍半稀释至0.5、1、2、4、8mg/mL的各样品，或加入不含样品的灭菌TSB培养基为空白组，每个浓度重复3孔。再在每孔中加入100μL用灭菌的TSB培养基稀释至6log CFU/mL的假单胞菌。将96孔培养板放入30℃恒温培养箱中培养24h后，观察结果。孔中培养基保持澄清透明的即为具有抑菌作用，具有抑菌作用的样品最低浓度即为其最小抑菌浓度。

最小杀菌浓度测试：培养24h后的96孔板，从保持培养基澄清的孔中吸取100μL加入到TSA平板中，用灭菌的涂布棒在平板上涂抹均匀，每个稀释度重复3次，在30℃恒温培养箱中倒置培养48h，未见菌落生长的样品最低浓度即为最小杀菌浓度。

大肠杆菌生长曲线的测试：取10μL冻存的大肠杆菌接种于灭菌的150mL TSB培养基中，在37℃恒温摇床中活化(180rpm，24h)，将活化好的菌种按1％的接种量接种于TSB培养基中，在37℃恒温摇床中180rpm培养24h。取培养好的大肠杆菌菌液用灭菌的TSB培养基稀释至6log CFU/mL，以100μL/孔接种于全自动生长曲线仪的蜂窝板中。将洋葱碳点用灭菌的TSB培养基充分溶解，并倍半稀释至不同浓度(1、2、4、8mg/mL)，分别以100μL/孔加入蜂窝板上含有菌液的孔中，或加入不含洋葱碳点的灭菌TSB培养基作为空白组，每个浓度重复3孔。在全自动生长曲线仪中以37℃培养24h，每30min记录各孔的OD₆₀₀值。

金黄色葡萄球菌生长曲线的测试：取10μL冻存的金黄色葡萄球菌接种于灭菌的150mL TSB培养基中，在37℃恒温摇床中活化(180rpm，24h)，将活化好的菌种按1％的接种量接种于TSB培养基中，在37℃恒温摇床中180rpm培养24h。取培养好的金黄色葡萄球菌菌液用灭菌的TSB培养基稀释至6log CFU/mL，以100μL/孔接种于全自动生长曲线仪的蜂窝板中。将洋葱源抑菌碳点用灭菌的TSB培养基充分溶解，并倍半稀释至不同浓度(0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL)，分别以100μL/孔加入蜂窝板上含有金黄色葡萄球菌菌液的孔中，或加入不含洋葱碳点的灭菌TSB培养基为空白组，每个浓度重复3孔。在全自动生长曲线仪中以37℃培养24h，每30min记录各孔的OD₆₀₀值。

假单胞菌生长曲线的测试：利用选择性培养基从腐败的冷藏大西洋鲭鱼中分离纯化得到腐败菌，经16S rDNA鉴定为假单胞菌。将分离纯化得到的假单胞菌接种于灭菌的150mL TSB培养基中，在30℃恒温摇床中180rpm培养18h。取培养好的假单胞菌菌液用灭菌的TSB培养基稀释至6log CFU/mL，以100μL/孔接种于全自动生长曲线仪的蜂窝板中。将洋葱源抑菌碳点用灭菌的TSB培养基充分溶解，并倍半稀释至不同浓度(0.5、1、2、4mg/mL)，分别以100μL/孔加入蜂窝板上含有假单胞菌菌液的孔中，或加入不含洋葱碳点的灭菌TSB培养基为空白组，每个浓度重复3孔。在全自动生长曲线仪中以30℃培养24h，每30min记录各孔的OD₆₀₀值。

色泽的测试：用色度仪对鱼块的色泽进行测试。

质构的测试：用质构仪对鱼肉进行全质构测试(TPA)，测试条件设置如下：平底柱形探头P/50，测前速度1.0mm/s、测定速度1.0mm/s、测后速度1.0mm/s，压缩程度50％，两次测定间隔时间5s。

感官评价测试：选取15名评价员组成感官评价小组，进行感官评分，评分标准如表1所示。

表1感官评价的评分标准

实施例1洋葱源抑菌碳点

一种制备洋葱源抑菌碳点的方法，包括如下步骤：

取20g洋葱切碎，与120mL水混合，加入到200mL水热反应釜的聚四氟乙烯内衬中，在鼓风干燥箱中200℃加热8小时，自然冷却至室温；过滤除去不溶性沉淀，将滤液在60℃条件下旋转蒸发浓缩至约30mL，加入3倍体积乙醇，在4℃层析柜中冷藏过夜，高速离心(10000rpm，10min，4℃)除去沉淀，旋转蒸发除去乙醇，再用0.22μm的水系滤膜过滤，滤液用大孔吸附树脂柱分离提纯，收集强荧光组分旋转蒸发浓缩，通过冷冻干燥得到洋葱源抑菌碳点粉末。

将得到的洋葱源抑菌碳点粉末进行测试测试，结果如下：

实施例1制备得到的洋葱源抑菌碳点粉末大小均匀，形态规则，呈近球型(图1)，统计得到洋葱碳点粒径尺寸集中在1～3nm(图2)；由紫外光谱图(图3)可见：在280nm处出现了π→π*跃迁的特征吸收峰；由荧光光谱(图4)可见：随着波长增加出现了明显的红移现象，洋葱源抑菌碳点的最大激发波长出现在360nm处；洋葱源抑菌碳点在pH为5～11的范围内荧光较稳定，在pH为2～4的范围内荧光强度下降(图5)。

图6为洋葱源抑菌碳点对大肠杆菌(A)、金黄色葡萄球菌(B)及假单胞菌生长曲线(C)的影响，从图6可以看出：加入1和2mg/mL洋葱源抑菌碳点的组中大肠杆菌生长相较于空白组略微缓慢，而加入4和8mg/mL洋葱源抑菌碳点的OD值几乎没有增加，说明洋葱源抑菌碳点对大肠杆菌生长具有抑制作用，最小抑菌浓度(MIC值)为4mg/mL；

加入0.25和0.5mg/mL洋葱源抑菌碳点的组中金黄色葡萄球菌生长相较于空白组略微缓慢，而加入1和2mg/mL洋葱源抑菌碳点的OD值几乎没有增加，说明洋葱源抑菌碳点对金黄色葡萄球菌生长具有抑制作用，最小抑菌浓度(MIC值)为1mg/mL；

加入0.5和1mg/mL洋葱源抑菌碳点的组中假单胞菌生长相较于空白组略微缓慢，而加入2和4mg/mL洋葱源抑菌碳点的OD值几乎没有增加，说明洋葱源抑菌碳点对假单胞菌生长具有抑制作用；最小抑菌浓度(MIC值)为2mg/mL。

对比例1大蒜源碳点

调整实施例1中的洋葱为大蒜，其他和实施例1一致，具体操作如下：

取20g大蒜切块，与120mL水混合，加入到200mL水热反应釜的聚四氟乙烯内衬中，在鼓风干燥箱中200℃加热8小时，自然冷却至室温；过滤除去不溶性沉淀，将滤液在60℃条件下旋转蒸发浓缩至约30mL，加入3倍体积乙醇，在4℃层析柜中冷藏过夜，高速离心(10000rpm，10min，4℃)除去沉淀，旋转蒸发除去乙醇，再用0.22μm的水系滤膜过滤，滤液用大孔吸附树脂柱分离提纯，收集强荧光组分旋转蒸发浓缩，通过冷冻干燥得到大蒜源碳点粉末。

将得到的大蒜源碳点粉末溶解在灭菌的TSB培养基中，并倍半稀释为0.5、1、2、4、8mg/mL，加入到96孔板中进行假单胞菌最小抑菌浓度测试。

对比例2生姜源碳点

调整实施例1中的洋葱为姜，其他和实施例1一致，具体操作如下：

取20g生姜切块，与120mL水混合，加入到200mL水热反应釜的聚四氟乙烯内衬中，在鼓风干燥箱中200℃加热8小时，自然冷却至室温；过滤除去不溶性沉淀，将滤液在60℃条件下旋转蒸发浓缩至约30mL，加入3倍体积乙醇，在4℃层析柜中冷藏过夜，高速离心(10000rpm，10min，4℃)除去沉淀，旋转蒸发除去乙醇，再用0.22μm的水系滤膜过滤，滤液用大孔吸附树脂柱分离提纯，收集强荧光组分旋转蒸发浓缩，通过冷冻干燥得到生姜源碳点粉末。

将得到的生姜源碳点粉末溶解在灭菌的TSB培养基中，并倍半稀释为0.5、1、2、4、8mg/mL，加入到96孔板中进行假单胞菌最小抑菌浓度测试。

对比例3洋葱匀浆滤液

取8g洋葱，与50mL去离子水匀浆，经双层80目滤布过滤；滤液用灭菌的TSB培养基十倍稀释，再用0.22μm的无菌滤膜过滤；用灭菌的TSB培养基倍半稀释为0.5、1、2、4、8mg/mL，加入到96孔板中进行假单胞菌最小抑菌浓度测试。

实施例1和对比例1、2、3的假单胞菌最小抑菌浓度的测试结果如表2：

从表2可以看出：洋葱源碳点对假单胞菌的最小抑菌浓度为2mg/mL时，最小杀菌浓度为4mg/mL；大蒜源碳点对假单胞菌的最小抑菌浓度为8mg/mL；在实验浓度下，生姜源碳点对假单胞菌均不具有抑菌活性，在实验浓度条件下，洋葱滤液对假单胞菌均不具有抑菌活性。可见，洋葱源碳点的抑菌效果，明显优于大蒜源碳点。

表2不同样品对假单胞菌的抑菌活性

注：*“++”表示96孔板上可观察到假单胞菌生长，“+”表示96孔板上未见假单胞菌生长，“-”表示TSA平板上未见菌落。

实施例2

一种制备洋葱源抑菌碳点的方法，包括如下步骤：

取20g洋葱匀浆，将洋葱汁滤除，取固形物与120mL水混合，加入到200mL水热反应釜的聚四氟乙烯内衬中，在鼓风干燥箱中200℃加热8小时，自然冷却至室温；过滤除去不溶性沉淀，将滤液在60℃条件下旋转蒸发浓缩至约30mL，加入3倍体积乙醇，在4℃层析柜中冷藏过夜，高速离心(10000rpm，10min，4℃)除去沉淀，旋转蒸发除去乙醇，再用0.22μm的水系滤膜过滤，滤液用大孔吸附树脂柱分离提纯，收集强荧光组分旋转蒸发浓缩，通过冷冻干燥得到洋葱源抑菌碳点粉末。

将得到的洋葱源抑菌碳点粉末进行假单胞菌生长曲线的测试，测试结果如下：

图7为洋葱源抑菌碳点对假单胞菌生长曲线的影响。从图7可以看出：加入0.5和1mg/mL洋葱源抑菌碳点的组中假单胞菌生长相较于空白组略微缓慢，而加入2和4mg/mL洋葱源抑菌碳点的OD值几乎没有增加，说明洋葱源抑菌碳点对假单胞菌生长具有抑制作用，最小抑菌浓度(MIC值)为2mg/mL。

实施例3洋葱源碳点

一种基于实施例1的洋葱源抑菌碳点来保鲜鱼的方法，包括如下步骤：

取大西洋鲭鱼片，将背脊的鱼肉切成4cm的段，之后常温浸渍在8mg/mL的实施例1的洋葱源抑菌碳点水溶液中5min；取出，在超净台中风干鱼肉表面水分，得到保鲜的鱼片。

对比例4空白对照

调整实施例3中的鱼肉切块后不经过任何处理，作为空白对照，其他和实施例3一致，得到鱼片。

对比例5洋葱匀浆滤液

调整实施例3中洋葱源抑菌碳点水溶液为8mg/mL的对比例3的洋葱去离子水匀浆滤液，其他和实施例3一致，得到鱼片。

将实施例3和对比例4、5得到的鱼片进行测试，测试结果如下：

表3是实施例3和对比例4、5中大西洋鲭鱼感官评价的结果。从表3中可以看出：洋葱滤液处理的鱼肉具有明显的洋葱辛辣味，而洋葱碳点处理的鱼肉不再有洋葱的辛辣味，洋葱源碳点处理的鱼肉各感官品质指标与空白对照组均无显著性差异。

表3不同处理方法对大西洋鲭鱼感官评价的影响

表4是实施例3和对比例4、5中大西洋鲭鱼色差和质构指标的影响。从表4中可以看出：洋葱源碳点和洋葱滤液处理与空白对照相比对鱼肉的色泽均不产生显著影响。洋葱源碳点处理与空白对照相比对硬度、咀嚼度和回复性均不产生显著差异。

可见本发明制备的洋葱源抑菌性碳点对鱼肉的感官特性和物理性质不产生显著影响。

表4不同处理方法对大西洋鲭鱼肉色差及质构的影响

实施例4洋葱源抑菌碳点

一种基于洋葱源抑菌碳点来保鲜鱼的方法，包括如下步骤：

取大西洋鲭鱼片，切成4cm的段，之后常温浸渍在8mg/mL的实施例1的洋葱源抑菌碳点水溶液中5min；取出，在超净台中风干鱼肉表面水分，每个鱼块单独在自封袋中分装并贮藏在4℃的层析柜中，得到保鲜的鱼片。

对比例6水

调整实施例4中洋葱源抑菌碳点水溶液为单纯水溶液，其他和实施例4一致，得到鱼片。

每天分别从实施例4和对比例6中随机取出鱼片；称取5g鱼肉与45mL生理盐水加入无菌均质袋中，12次/秒拍打1min，制备10倍系列稀释样品匀液，选择2～3个适宜稀释度(30～300菌落/平板为宜)的样品，取100μL加入到TSA平板中，用灭菌的涂布棒在平板上涂抹均匀，每个稀释度重复3次，在37℃恒温培养箱中倒置培养48h，记录菌落数量，并计算为logCFU/g。

图8是实施例4和对比例6中大西洋鲭鱼在4℃冷藏过程中的菌落总数(TVC)。从图8可以看出：贮藏4天后对比例6的菌落总数超过6log CFU/g，而实施例4的样品在贮藏第6天菌落总数超过6log CFU/g。可见，实施例4中洋葱源抑菌碳点具有延长水产品冷藏贮藏期的保鲜效果。

Claims (10)

1.一种制备洋葱源抑菌碳点的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将洋葱和水按照料液比1：3～8混合均匀，之后在200～250℃下进行水热反应4～10h；反应结束后，去除反应后溶液中的不溶性杂质，醇沉，纯化，干燥，得到洋葱源抑菌碳点。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的去除反应后溶液中的不溶性杂质是通过过滤或者离心实现，所述的离心转速为8000～12000rpm，离心时间为10～30min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的醇沉是去除溶液中的多糖，具体是加入2～6倍体积的无水乙醇在2～6℃冷藏过夜，除去沉淀，再旋转蒸发除掉溶剂中的乙醇。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纯化具体是通过大孔树脂吸附、透析、凝胶色谱、液相色谱中的一种或几种分离提纯收集强荧光组分。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥包括旋转蒸发、冷冻干燥、真空干燥中的一种或几种。

6.权利要求1～5任一项所述的方法制备得到的洋葱源抑菌碳点。

7.权利要求6所述的洋葱源抑菌碳点在食品保鲜中的应用。

8.一种基于权利要求6所述的洋葱源抑菌碳点来保鲜鱼的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将鱼切片，之后浸渍在权利要求6所述的洋葱源抑菌碳点溶液中；取出，沥干，得到保鲜的鱼片。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的洋葱源抑菌碳点溶液为洋葱源抑菌碳点水溶液，浓度为4～10mg/mL。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的浸渍是20～30℃浸渍1～10min。

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