CN105723213A

CN105723213A - 高灵敏度电喷射接口

Info

Publication number: CN105723213A
Application number: CN201480059260.4A
Authority: CN
Inventors: 诺曼·多维奇; 孙良亮; 朱贵杰
Original assignee: University Notre Dame
Current assignee: University Notre Dame; University of Notre Dame
Priority date: 2013-08-29
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2034-08-29
Also published as: CN105723213B; EP3042190B1; EP3042190A1; US20150311056A1; HK1226142A1; EP3042190A4; WO2015031820A1; US9465014B2; US9362102B2; JP2016534353A; US20150233877A1; JP6601819B2; EP3042190C0

Abstract

本发明提供了一种用于从毛细管形成电喷射的鞘流接口。由所述接口形成的电喷射能够用作质谱的离子源。所述接口中的动电流能够使鞘液迁移通过毛细管的末端从而与从所述毛细管排出的分析物流出液进行混合。所述鞘液和分析物混合物能够被引到电喷射器从而形成电喷射。

Description

高灵敏度电喷射接口

相关申请

本申请根据U.S.C.§119(e)的规定要求下述在先申请的优先权：2013年8月29日提交的美国临时专利申请61/871,562，其在此通过引用纳入本文。

政府资助

本发明获得了由NationalInstitutesofHealth提供的项目编号为R01GM096767的政府资助。美国政府对于本发明拥有一定的权益。

背景技术

自下而上蛋白质组学(Bottom-upProteomics)是鉴定蛋白质以及在质谱分析之前通过蛋白水解消化描述其氨基酸序列和转译后修饰的实用方法。自下而上蛋白质组学被广泛用于定性和定量分析复杂的生物样品。由微克的物料，有可能从哺乳动物细胞溶解产物鉴定超过10,000种蛋白质以及从原核生物溶解产物鉴定超过2,500种蛋白质。自下而上蛋白质组学方法，对于质量有限的样品，例如激光捕获微小切割组织、循环肿瘤细胞、单胚和单体细胞，操作性能会迅速降低。

有少量的报道涉及采用毛细管液相色谱(LC)-电喷射离子化(ESI)-串联质谱(MS/MS)方法纳克样品的自下而上蛋白质组学。Mann团队从具有几百ng蛋白质含量的单一胰岛细胞鉴定出2,000种蛋白质(Waandersetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2009，106，18902)。Karger团队从50ng的醋酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)消化物鉴定出566种蛋白质(Yueetal.，Anal.Chem.2007，79，938)，并且从～2.5ng的宫颈癌细胞株的胰蛋白酶消化物鉴定出163种蛋白质(Luoetal.，Anal.Chem.2007，79，6174)。Smith小组利用精确质量和时间标签(AMTs)^[8]的方法从低微克量的耐辐射球菌(Deinococcusradiodurans)消化物中检测出870种蛋白质(Smithetal.，Proteomics2002，2，513)。Smith团队还报告了采用AMT方法在0.5pg的样品中检测到三种最大丰度的蛋白质，并且报告在牛血清蛋白(bovineserumalbumin)消化产物中对一种蛋白质的～10zmole检测极限(Shenetal.，Anal.Chem.2004，76,144)。Dovichi及其同事利用具有高能碰撞离解的Q-Exactive质谱仪(Olsenetal.，Nat.Methods2007，4，709)从1ng的RAW264.7巨噬细胞株消化物中鉴定出～100种蛋白组(Sunetal.，RapidCommun.MassSpectrom.2013，27，157)。所有这些分析都需要至少一个小时的仪器时间。因此，对飞克(femtogram)量的蛋白质消化物的更为快捷的自下而上分析方法对于蛋白质组学领域是非常有价值的。

毛细管区带电泳-电喷射离子化-串联质谱(CZE-ESI-MS/MS)对于自下而上蛋白质组学受到关注，并且，对于低纳克样品来说，这种方法一致地优于LC-MS/MS方法。对于微小样品量而言CZE的改良性能大概是由于其非常简单的设计以及在喷射器和配件中消除了样品损耗。从Smith团队的开创性工作入手(Smithetal.，Anal.Chem.1988，60，1948)，为了毛细管电泳已经开发电喷射接口(Maxwelletal.，Anal.Chim.Acta2008，627，25)。然而，有必要开发出新的接口以降低因低鞘流率引起的样品稀释，免除机械泵，允许较宽范围的分离缓冲，以及在纳喷射状态的稳定操作。

发明概述

本发明提供了一种基于改进的动电泵鞘流接口的超灵敏和快速的毛细管区带电泳-电喷射离子化-串联质谱(CZE-ESI-MS/MS)系统。所述接口有多方面的优点，包括由于很低的鞘流率减少样品稀释，免除机械泵，允许较宽范围的分离缓冲，与商业毛细管电泳设备的相容性，以及在纳喷射状态的稳定操作。所述系统对于飞克(femtogram，毫微微克)量蛋白质消化物的快速自下而上分析是非常有用的并且能够提供极高的灵敏度。

于是，本发明提供了一种鞘流接口(sheath-flowinterface)，用来从毛细管中形成电喷射，其中，所述接口包括：

(a)毛细管，设置为含有被测物液体，所述毛细管具有用来接收被测物液体的注射端以及用来排放被测物流出物的末端，其中所述末端的部分的外径逐渐缩减到大约20μm到大约200μm范围的较小外径；

(b)电喷发射体发射体，同轴地设置于至少在所述毛细管的末端周围，所述电喷发射体发射体具有末端，其逐渐变小终止于开口，所述开口被相对于所述毛细管的末端同轴设置；以及

(c)鞘液储存器，流体地连通到所述电喷发射体发射体的内部，使得导电的鞘液能够流出所述鞘液储存器，经过所述毛细管和所述电喷发射体发射体的中间连接器件，穿过所述毛细管的末端，并且通过所述电喷发射体发射体的末端的所述开口。

所述鞘流接口可以设置为使得所述毛细管的末端和所述电喷发射体发射体的孔口在所述电喷发射体发射体内以约750μm到约100nm的距离分开。在一些实施方式中，其中所述毛细管的外径小于所述发射体发射体孔口的直径，所述毛细管的末端可被设置为处于所述发射体发射体孔口的开口之内。另外，所述毛细管的末端可以从所述发射体发射体孔口的开口伸出达大约100μm。

所述鞘液能够提供所述毛细管和所述电喷发射体发射体之间的电接触。所述鞘流接口可以设置用来由鞘流和所述被测物流出物混合的动电流形成纳喷射。此外，所述动电流可以通过所述电喷发射体发射体和与所述发射体发射体的所述开口接近但无物理接触的目标面之间的电势产生。

在各种实施方式中，所述毛细管的末端的外径可以是约20μm到约75μm，或者约45μm至约65μm。所述末端的逐渐缩减到较小外径的部分可以是长度为大约0.1mm到大约10mm，尤其是大约5mm的部分。

所述鞘流接口，当与毛细管区带电泳装置和串联质谱仪配置时，可以在不到12分钟或不到10分钟的质谱仪器时间内从400飞克(femtograms)的肽类样品中检测出多个肽类。所述肽类包括肽消化物，例如E.coli胰蛋白酶消化物。

所述鞘流接口可以配置毛细管区带电泳装置和质谱仪，其中多于150种肽类能够通过精确质量和时间标记从亚皮克(sub-picogram)量的复合蛋白质消化物中在不到12分钟、通常不到20分钟的质谱仪时间内被鉴别出来。

所述质谱检测极限能够是大约1-10仄摩尔(zeptomoles)，例如可以低到大约1仄摩尔(zeptomole)。

本发明还提供了一种方法，用于分析蛋白质消化物，包括将权利要求1所述的鞘流接口配置毛细管区带电泳装置，其中所述分析物通过毛细管区带电泳在分离毛细管中被分离，并且施加约10kV的电势提供大约300V/cm的电场，以形成宽的分析物分离窗区，在此期间，分析物从所述毛细管在大约60分钟内迁移至所述接口。对于肽类分离，可获得平均的250,000理论板到大约350,000理论板。

在一些实施方式中，所述鞘流接口的分离毛细管的内径为约5μm到约75μm。在不同的实施方式中，喷射的总流率为约15到约200nL/minute，约20到约200nL/minute，约15到约25nL/minute，或者约20nL/minute。所述方法可包括将本文所述的鞘流接口配置串联质谱仪，其中所述鞘流接口被配置向质谱仪提供纳喷射进行分析，其中所述目标表面是质谱仪的输入孔口，并且其中所述蛋白质样品的检测下限为大约3飞克(femtograms)至大约5飞克。所述被分析肽类的检测极限可以为大约1仄摩尔(zeptomole)，尤其是对于较小内经的分离毛细管(例如，直径小于大约15微米，特别是大约10微米)。为了实现很低的质量检测极限，需要使用高灵敏度的质谱仪。高灵敏度质谱仪的一个实例是Q-ExactiveQuadrupole-Orbitrap质谱仪(ThermoFisherScientificInc.)。所述被分析肽类的信噪比可以是大约260∶1到大约300∶1。

本发明还进一步提供了一种方法，从而利用本文所述的鞘流接口从毛细管的分析物流出液形成纳喷射，包括施加电压到鞘液储存器足以驱动鞘液储存器中鞘液的电渗流，通过所述毛细管和所述电喷发射体发射体之间的连接构件，穿过所述毛细管的末端，并且通过所述电喷发射体发射体的末端的开口，其中所述分析物流出液在毛细管内通过电压施加到所述毛细管的注射端并由毛细管区带电泳进行分离。

在不同的实施方式中，所述分析物液体可利用动电力或机械泵力经由所述毛细管发生移动。所述分析物液体可在毛细管内被分离，其中采用毛细管区带电泳、胶束动电色谱、毛细管电色谱、毛细管等电聚焦、毛细管液相色谱法，或其组合。所述纳喷射可以通过例如电渗流而形成。所述分析物液体可在毛细管内通过电泳分离，其中所述纳喷射通过电渗流产生，并且其中的电泳和电渗流都是通过在所述毛细管的注射端、所述鞘液储存器和所述目标表面之间施加电势而被驱动。所述分析物液体可以通过色谱法分离，其中物流被通过常规液相色谱中的机械泵或通过电色谱中动电流驱动；这些情况下，电喷射可在发射体发射体内通过电渗流驱动。

所述鞘流接口可设置为向质谱仪作为分析提供纳喷射，并且其中所述目标表面是质谱仪的输入孔口。所述目标表面可以保持接地或者所述目标表面可以持有电位。所述鞘液可配置以提高分析物流出液与质谱仪的相容性能。电喷发射体发射体末端的开口的直径可以是约0.5μm到约50μm，或者约0.5μm到约30μm。

本发明还提供了一种方法，用于分析诸如蛋白质消化物的生物分子。所述方法可以包括从蛋白质消化物形成分析物流出液，并且，利用前述实施方式的流鞘接口，形成从毛细管的分析物流出液的纳喷射。所述形成分析物流出液纳喷射的方法可以包括施加电压到鞘液储存器足以驱动所述鞘液储存器的鞘流的电渗流，通过毛细管和电喷发射体发射体之间的连接构件，穿过毛细管的末端，并且经过位于所述电喷发射体发射体末端的开口。所述分析物流出液在毛细管内通过施加电压到毛细管注射端的毛细电泳进行分离。

附图简要说明

下述附图属于说明书的一部分并且是用来对本发明的一些实施方式或不同方面作进一步的描述。在一些实例中，本发明的实施方式可以通过参照附图并结合本文提供的详细描述得到更好地理解。这些描述和附图可以突出某些具体的实施例或者本发明的某些方面。然而，本领域技术人员应当理解这些部分的实施例或方面也可用于结合本发明的其他实施例或方面。

图1.(A)根据所公开实施方式的典型的接口的示意图。(B)带有质谱仪的典型的接口的示意图。所述鞘液可以被HV2和质谱仪入口之间电势差驱动的动电流泵送。所述分离作用可通过所述毛细管的入口(HV1)和出口(HV2)之间的电势差来驱动。

图2.根据一种实施方式的接口的组成。

图3.CZE-ESI-MS/MS系统。所述系统的略图(A)，电喷射发射体发射体中的蚀刻毛细管的略图(B)，以及所述发射体发射体中蚀刻毛细管的显微图(C)。

图4.利用CZE-ESI-MS/MS基于串联光谱鉴别从16pg量E.coli分析三重的50种高强度肽类的提取离子电泳图。提取的质量公差为2ppm。

图5.针对16量E.coli消化物每组三重的肽迁移时间的相对标准偏差(RSD)分布。所选择的电泳图是从154种高强度肽生成的。肽峰值提取的质量公差为3ppm。对电泳图进行高斯函数拟合，采用无监督非线性最小二乘拟合：Intensity(t)＝a×exp-0.5*(t-t₀)²/width²+offset；其中t为时间，t₀为峰值迁移时间，a为峰值幅度，width为根据高斯标准偏差的峰值宽度，而offset是指dc偏移。采用MATLAB的拟合程序进行计算。各个电泳图中最高值的振幅和迁移时间被用作初始推测值a和t₀。对于width的初始推测值为3秒。对offset的初始估计值为所述电泳图的中值。对于三重的每样的电泳图迁移时间的相关标准偏差计算为std(t₀)/mean(t_o)×100％。

图6.针对16pg量E.coli消化物三重样品通过CZE-ESI-MS/MS鉴别的肽类的峰值宽度分布。峰值宽度是采用图5所述的非线性回归分析确定。高斯函数半高处的总宽度＝2.35×width，而在基线处的总宽度是4×width。

图7.针对16pg量E.coli消化物三重样品通过CZE-ESI-MS/MS鉴别的肽类的理论板数(N)分布。理论板数的计算为N＝(t₀/width)²，其中t₀和width是采用图5所述的非线性回归分析确定。

图8.从16pg量E.coli消化物的不同测试分析获得的肽强度的相关性(A：对比16pg量E.coli_测试1的肽强度和16pg量E.coli_测试2的肽强度；B：对比16pg量E.coli_测试1的肽强度和16pg量E.coli_测试3的肽强度；C：对比16pg量E.coli_测试2的肽强度和16pg量E.coli_测试3的肽强度)。肽强度是利用数据库检索结果而获得，采用了MaxQuantsoftware(v.1.3.0.5)软件，是总括的与被鉴别肽序列相关的全部同位素族的eXtractedIonCurrent(XIC)。

图9.加载量的E.coli消化物和基于串联光谱(点由线连接)及精确数量和时间标记(star＝AMTs)的鉴定之间的关系。蛋白质鉴别(A)；肽鉴别(B)。每个样品均进行二重或三重的分析。所述基于AMTs从400fg量E.coli消化物的鉴别用星来标示。误差条为平均值的标准差。

图10.由400fg量被鉴别肽获得的提取离子电泳图(上部)，以及由16pg量E.coli消化物相应的电泳图(下部)，其基于精确质量和时间标记(AMTs)方法(其它153对电泳图未示出)。用于峰值提取的质量公差为3ppm。

图11.被鉴别的三种热不稳定延伸因子(elongationfactorTu)肽提取电泳图(A，B和C)，其为通过MS/MS从400fg量的E.coli消化物进行肽的检测极限计算。

图12.血管紧张素II的加载量和碎片离子(y2⁺和b6⁺)强度在CZE-PRM分析之后的宽动态范围校正曲线。所述曲线为针对对数数据未加权线性拟合的结果。

图13.来自三重的CZE-PRM分析的迁移时间和血管紧张素II碎片离子(y2⁺)对于不同加载量(2amole-150fmole)的相对标准偏差(RSDs)。

图14.在CZE-ESI-MS分析之后MCF7消化物的基底峰值电泳图。(A)整个的分离；(B)从12到18分钟分离的细节。通过Lowess过滤器带有具有高斯核和10点的跨度对数据进行处理。所述样品的加载量为～60ng；所述毛细管具有20μm内径和100cm长度；分离缓冲液为0.5％(v/v)FA；以及280V/cm的场强用于分离。

具体描述

在此描述一种动电泵鞘流电喷射接口以及展示所述接口连接毛细管电泳时的用途。对于实用的毛细管电泳系统，参见Wojciketal.，RapidCommun.MassSpectrom.2010；24：2554-60。本文描述了对原先接口的显著改进，而且这种显著的改进提供了对于灵敏度的大致两个量级的提升。所述改进的接口已被用于分析各种消化物，包括400飞克(femtograms)的E.coli胰蛋白酶消化物。在这些消化物中，从超过60种蛋白质的154种肽在10分钟的分析中被鉴别。对于来自同一种蛋白质的三种肽的质量检测极限为大约1仄摩尔(zeptomole)(600个分子)。所述改进的接口对于自下而上的蛋白鉴别技术提供了两个量级的提升，并且对于基于MS肽检测极限的技术提供了一个量级的提升。

所述锥形毛细管的重要性部分地体现在用于商业电泳仪器的规格。这些仪器(例如Beckman仪器)通常使用375微米外径熔融硅石毛细管。这些毛细管用于本文所述改进的接口时实在是太大了，因为当试图减少从毛细管尖端到发射体发射体孔口的距离时标准毛细管尖端会抵触到发射体发射体。通过调整毛细管的末端(例如减小其外径)，就会变得与本文所述的接口相匹配。

定义

下面的定义是用来对说明书和权利要求书提供清晰和一致的理解。本文所采用的术语具有下述的含义。本说明书中所采用的其他术语和短语具有本领域技术人员所能理解的普通含义。这种普通含义可通过参考技术辞典获得，例如Hawley’sCondensedChemicalDictionary14^thEdition，byR.J.Lewis，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y.，2001。

本说明书中提及的“一种实施方式”(″oneembodiment″)、“实施方式”(″anembodiment″)等表明所描述的实施方式可包含特定的方面、特征、结构、部分或特点，但并不是每个实施方式都必须包含这些特定的方面、特征、结构、部分或特点。此外，这些短语可能，但并不一定，适用于在本说明书其它部分提及的相同的实施方式。此外，当特定的方面、特征、结构、部分或特点是结合某种实施方式进行描述的，本领域技术人员应当能够知道将这些特定的方面、特征、结构、部分或特点应用到或关联到其它的实施方式，无论是否明确地表述出来。

单数形式的冠词“a”、“an”和“the”包含多个的指代，除非上下文明确表示不同的含义。因此，例如，“化合物”(“acompound”)的表述包含多个这样的化合物，因此“化合物X”(“acompoundX”)包括多个化合物X的含义。还应当注意到，权利要求书可以撰写为排除任何元素。这样，该陈述意在作为一些排他性术语的先行基础，例如，与本文所述任何元素关联使用以及/或者引述权利要求中元素的“单独地”、“仅仅”等词语，或者使用“否定性”限定。

术语“和/或”(″and/or″)是指相关项目的任何一项、任何组合，或它们的全部。短语“一个或多个”(″oneormore″)和“至少一个”(″atleastone″)是本领域技术人员都能容易理解的，尤其是根据上下文理解。例如，这些短语可以是指一、二、三、四、五、六、十、一百，或大约比已经列举的下限高出10、100或1000倍的任何上限值。例如，一种或多种分析物可以是指一种，一或两种，一到三种，一到四种，一到五种，1-10,1-100，或1-500种不同的分析物或不同类型的分析物。

术语“大约”(″about″)表示特定值可以具有±5％、±10％、±20％或±25％的变化。例如，“大约50”百分比在一些实施方式中可变化为45到55百分比。对于整数范围，术语“大约”可包含在所指范围各端相较于所列举的整数小或大一个或两个整数。除非文中另有说明，术语“大约”是用来包括对于成分、组合或实施例的功能来说等同的接近所列范围的数值。术语“大约”也能够用来对本段前述范围的端点进行调整。

本领域技术人员应当能够理解，包括表示成分含量、诸如分子量的性质、反应条件等等的任何数目都可以是近似的，并且在各种情下都能够采用术语“大约”进行修饰。取决与本领据技术人员通过本文所述方法所期望获得的性质，这些值是可以有变化的。还应当理解，这些值，由于测试中出现的标准偏差必然会导致其内在的可变化性。

本领域技术人员应当能够理解，出于任何各种目的，尤其是就提供文字描述来说，本文提供的任何范围还包括所有可能的子范围和这些子范围的组合，以及构成所述范围的单独值，尤其是整数值。所引述范围(例如重量百分比或碳基团)包括各个特定的数值、整数、小数或所述范围内的特性。应当易于理解，所列举的任何范围能够充分描述并能够使的相同的范围被分解为相等的二等份、三等分、四等分、五等分或十等分。作为非限制性例子，本文所述的每个范围都可容易地分解为下三分之一，中三分之一和上三分之一等等。本领域技术人员也应当能够理解，诸于“高达”、“至少”、“高于”、“低于”、“多于”、“或以上”或类似的术语包含所列举的数字，并且这种术语还指所述范围可随后分成上文述及的子范围。同样地，本文所列的任何比率也包含落在较宽比率之内的子比率。因此，自由基、取代基和范围的具体数值只是用来进行说明；其不排除自由基和取代基的其它指定数值或其它指定范围的数值。

本领域技术人员还应当能够容易理解，当单元被按照通常的方式例如在马库什群组中被组合起来时，本发明不仅包括所列单元组合构成的整体，还包括所述群组单独的每个单元以及所述基本群组的任何可能的亚群组。另外，对于所有的目的，本发明不仅包括基本群组，还包括基本群组去掉一个或多个单元的群组。可见，本发明可以包括明确排除所引述群组的任何一个或多个单元。因此，有关约束条件可以附加于任何公开的范畴或实施方式，其中任何一个或多个单元、种类或实施方式，可从所述范畴或实施方式中排除出来，例如，采用明明显的负性限制。

术语“接触”(″contacting″)是指触及、接触，或者邻接或紧密地靠近，例如，包括在细胞或分子水平，比如在溶液或反应混合物中，在体外或体内，发生生理反应、化学反应或物理变化。

术语“有效量”(“effectiveamount”)是指有效地引起指定效果的量，比如在反应混合物中形成产品所需要的量。对有效量的确定一般是在本领域技术人员的能力之内，尤其基于对本文提供的具体内容的了解。术语“有效量”是指包含一定量的本文所述化合物或试剂，或一定量的本文所述化合物或试剂的组合，例如，足以在反应混合物中有效地形成产物。因此，“有效量”通常是指实现预期效果的用量，例如获取质量光谱的蛋白质最低用量。

术语“纳喷射”(“nanospray”)是指形成亚微米尺度液滴气溶胶的一种方法，或者这种过程的产物。纳喷射是电喷射离子化的一种形式，其中静电场克服了液体的表面张力形成液体喷射。纳喷射可采用玻璃毛细管，其具有微米尺度在nL/minute范围的排出和流动速率。

术语“电渗流”(“electroosmoticflow”)是指由于施加电势经过毛细管路、微管道或其他液体导管所引发的液体运动。

鞘流电喷射接口

毛细管电泳(CE)与电喷射电离质谱(MS)的连用是在1980年代后期开发的，并且这些技术的组合使用从那时起就开始有了稳定的发展。毛细管电泳-电喷射电离接口一般分为三类：无鞘的、同轴鞘流的和液体接界接口。

所述鞘流接口使用同轴的鞘液9，其从所述分离毛细管迁移时与分析物混合。

所述鞘液在电泳分离和电喷射离子源之间提供电接触。所述鞘液还可调节分离缓冲液使其与MS检测更好相容。在现有市售的鞘流接口中，所述分离毛细管的末端被插入同心管道中，而所述毛细管端伸出所述管道。电接触的产生是通过鞘液从由所述管道伸出的所述毛细管流过，雾化气体被提供用于促进喷雾的形成。所述鞘液以维持稳定喷射的比率进行泵送，并且所述接口以相对较高的鞘流速率进行操作，通常为每分钟几个到好几个微升，这样可导致显著的样品稀释。

在液体汇合接口，所述分离毛细管和电喷射发射体发射体孔口以很小的间隙分离。电接触是由所述间隙形成从而驱动电喷射。可惜的是，所述间隙会引起分离效率的损失。

无鞘接口消除了与所述鞘液相关的样品稀释，倾向获得较高的灵敏度。在无鞘接口，分离毛细管通常作为电喷射发射体发射体。当前的无鞘接口设计研究专注于在所述分离毛细管的末端形成电接触。各种形式包括在毛细管的外部尖端涂覆金属，在毛细管的出口插入电极，采用多孔蚀刻毛细管壁，以及采用微量渗析连接。无鞘接口的主要缺点是由于因分离条件导致的非常低的流动速率而引起的喷射不稳定性，以及由于缺乏柱后化学导致的分离缓冲剂选择的限制。

为了克服上述与原来鞘流和无鞘接口设计相关的一些问题，引入一种低流版本的鞘流接口。在这种设计中，分离毛细管被插入到带锥度的玻璃发射体发射体。第二毛细管被插入到所述发射体，提供鞘流，以1L/min的速率泵送。通过插入到所述发射体的不锈钢线提供电喷射电压。

具有带锥度的发射体的鞘流接口可在纳喷射区域进行操作，这样不仅支持较低流速，还和较佳脱溶、较高灵敏度以及高耐盐性相关。然而，试图从CE流出物产生纳喷射存在较多技术问题，必须加以克服从而促进毛细管电泳-质谱仪(CE-MS)领域的发展。本文所述为克服这些技术问题的系统和方法。

相应地，在一种实施方式中，本发明提供了一种用于从毛细管形成电喷射的鞘流接口。所述接口包括(a)毛细管，设置为包含分析物液体，所述毛细管具有用来接收分析物液体的注射端以及用来排放分析物流出液的末端，其中所述末端的部分的外径逐渐缩减到大约20μm到大约200μm、大约20μm到大约100μm或者大约40μm到大约100μm范围的较小外径；(b)电喷发射体，同轴地设置于至少在所述毛细管的末端周围，所述电喷发射体具有末端，其逐渐变小终止于开口，所述开口被相对于所述毛细管的末端同轴设置；以及(c)鞘液储存器，流体地连通到所述电喷发射体的内部，使得导电的鞘液能够流出所述鞘液储存器，经过所述毛细管和所述电喷发射体的中间连接器件，穿过所述毛细管的末端，并且通过所述电喷发射体的末端的所述开口。

所述鞘液能够提供所述毛细管和所述电喷发射体之间的电接触。所述鞘流接口能够设置用来由鞘流和所述分析物流出液混合的动电流形成纳喷射。所述动电流能够通过所述电喷发射体和与所述发射体的所述开口接近但无物理接触的目标面之间的电势产生。因此所述接口可用于从毛细管产生电喷射，所述电喷射可用作质谱分析或其他分析技术的离子来源，而这些技术能够在后续分析的表面将电喷射应用于例如蒸发光散射检测、电感耦合等离子检测以及在靶分子电喷射沉积。

所述鞘流接口可进一步结合图1A进行描述。所述接口100包括毛细管102。所述毛细管102包含注射端104用来接收分析物液体。所述分析物液体能够通过本领域技术人员知晓的各种方式在所述注射端104引入所述毛细管102。例如，所述注射端104可以接合到色谱柱，从而由色谱柱的流出物被注射到所述毛细管102。其他向毛细管102提供分析物的方法包括将注射端104接触分析物的储存器，执行动电的、流体静力学的或流体动力学的喷射操作。

所述毛细管102具有设置为排出分析物流出液的末端106。与毛细管102其余部分的外径相比，末端106的外表面直径是缩小的。所述末端106的末段(例如，所述毛细管102最末的0.1-10mm)具有的外径减小约30％到约90％，或者约40％到75％，通常为约60％，而内径保持大致相同。因此，在一些实施方式中，所述毛细管102的外径为约150μm，所述末端106的外径可减少到外径为约20μm至约200μm，约20μm至约100μm，约40μm至约100μm，约60μm，或约50μm。

通常，所述毛细管的末端的外径可被化学地减小而不影响内径。在其他的实施方式中，内径也可减小，例如，当外径通过加热或牵引技术而减小。其他减少毛细管末端外径的技术包括机械研磨和喷砂。

分析物流出液，如本文采用的，是指流过所述毛细管102长度并且从所述末端106排出的分析物。分析物排出物可通过各种方式例如通过利用动电力(例如电渗和/或电泳流)移动经过所述毛细管102。

电喷射发射体110设置在所述毛细管102周围。所述电喷射发射体被同轴的设置于至少所述毛细管102的所述末端106，使得所述毛细管102和所述电喷射发射体110的开口114可沿轴A同轴地设置，如图1A所示。所述电喷射发射体110的末端112，为了形成所述开口114，由所述发射体的管状柱体逐渐变小。

电喷射可以从流经所述毛细管102并且经过所述发射体110上的所述开口114的所述分析物流出液产生。为了产生电喷射，可提供鞘液，流经所述发射体110的内部116。所述鞘液可以从所述鞘液储存器120输送到内部116。连接构件124可在所述鞘液储存器120和所述内部116之间提供液体连通。

为了提供电喷射，所述鞘液可流经所述发射体110的所述内部116穿过所述毛细管102的所述末端106。当流动穿过所述毛细管102的所述末端106时，所述鞘液与从所述毛细管102排出的所述分析物流出液相互作用并且驱使所述分析物流出液流向所述开口114。因此，所述电喷射的形成包括所述分析物排出物和所述鞘液的混合物。

电喷射的形成可以通过在所述鞘液储存器120和所述目标表面130之间施加至少电压HV2。所述电压HV2驱动所述鞘液的电渗流，利用在所述发射体110内表面的zeta电势。所述HV2电压能够提供电渗流足以从所述开口114形成电喷射。所述电喷射可以是纳喷射。所述目标表面130可以接地或具有电压。

在一些实施方式中，电压HV1被施加到所述毛细管102。然后所述电喷射通过在发射体开口114的电场，其通过电压HV1和HV2组合而形成，或所述目标表面130的表面电势来维持。在这种配置中，HV1和HV2电势均对所述发射体的电场有作用。理想地，所述发射体的电势只被HV2控制。所述毛细管的阻力通常足够大，以致HV1对电喷射的影响很小。相反的，电泳是由HV1和HV2之间的电势差来驱动的。所述HV2电压或目标表面130上的表面电势是另外的电势来资源，其能够被调控以维持在所述发射体的合适电场。

所述毛细管102可用于毛细管电泳(CE)。当所述接口配置CE，从HV1到HV2降低的电压以动电分离的形式对通过所述毛细管102的分析物提供动电流。

所述鞘液具有导电性，从而足以驱动电喷射形成过程的电连接能够提供到所述毛细管102的末端106和所述发射体110的末端112之间。所述电喷射产生的流可与所述液体的导电性成比例。有典型的鞘液包括，例如，在50％的甲醇/乙腈或异丙醇中的10mM甲酸或乙酸。如本领域技术人员所能认识的那样，有机溶剂的百分比可依据相关的分析物而变化。挥发性盐，如甲酸铵或醋酸铵，可以被添加到鞘液。

本发明的分析物可以是经过所述毛细管102的分析物液体所形成物质的不同组合物。所述分析物可以是分析物液体本身，或者所述分析物可以是被溶解在分析物液体中。另外，所述分析物可以是与所述分析物进行非均匀混合。典型的分析物包括极性小分子及其盐，以及大生物分子(例如，代谢物、肽、蛋白质、脂类、聚糖和核酸)。其他的分析物包括杀虫剂、环境污染物质、药物和它们的污染物质、代谢物等。

有关所述接口100的单独组成的进一步详细描述包括如下内容：

所述毛细管102可以是任何适合和有效的提供分析物流出液的毛细管。典型的毛细管可以由玻璃(例如熔融氧化硅)或塑料制成并且可以是圆柱体的并具有管状形式，其中所述毛细管的内径为约0.5微米至约500微米。在一种实施方式中，所述内径为约5微米至约75微米，5微米至约25微米，5微米至约15微米，或约10微米。

所述发射体110可以由玻璃、熔融硅石以及任何其它适合和有效用于发射体的物质构成。聚合物，例如TEFLON，也可用，以及可以形成本文所述合适结构的发射体的110陶瓷和任何非导电材料。所述发射体110在向所述末端112.呈锥形缩小之前通常是均匀的圆柱体。然而，所述发射体110也可从头到尾为锥形，或具有非圆形的截面。

所述发射体110的内径必须大于所述毛细管102的外径从而使所述毛细管能够配置于所述发射体110之内。所述发射体110的内部106被所述毛细管102的外表面和所述发射体110的内表面之间的空间所限定。

所述发射体110的开口114部分地限定了所形成电喷射的形状和大小。在一种实施方式中，在电喷射发射体末端的所述开口114的直径为约0.5微米至约30微米。所述开口114通常是圆形的，尽管在有些实施方式中，所述开口不是圆形的。

在一种实施方式中，所述毛细管106的末端和所述电喷射发射体112的末端(例如，开口114，电喷射发射体孔口)分开小于约750微米的距离。在另一种实施方式中，所述毛细管106的末端和所述电喷射发射体112的末端分开小于约700微米、小于约500微米、小于约250微米、小于约100微米、小于约50微米、小于约10微米、小于约5微米、小于约1微米、或小于约0.5微米的距离。所述毛细管的末端和所述发射体之间的距离可以是10m。在一种实施方式中，所述毛细管的末端和所述发射体的距离为约150微米至约250微米，或约200微米。

在另一种实施方式中，所述毛细管106的末端可被设置在所述电喷射发射体112的所述末端之内。另外，所述毛细管106的末端可以延伸超出所述发射体孔口的开口114多达100μm，条件是所述毛细管106的外径小于所述发射体孔口开口114的直径。在一些实施方式中，所述毛细管106的末端可延伸超出所述发射体孔口的开口114约5μm、约25μm、约50μm、约75μm或约100μm，或任意两个上述值之间的范围。这种结构配置与当所述毛细管106的末端和所述电喷射发射体的末端112分开的距离小于750微米时产生的效果类似。

阀门，管道以及其它流体控制组件都可用作所述连接构件124。所述连接构件124的一个典型的实例如图2所示。所述连接构件124可由TEFLON或其他的聚合物管材、玻璃或熔融硅石制成。需要的话，开关阀可用于多种鞘液之间(例如在多个鞘液储存器120之间)的转换。所述连接构件124的尺寸与所述毛细管102和所述发射体110的尺寸相关。典型的内径为约10μm至约5μm，长度为约1mm至约30cm。

电势通常用来驱动所述接口100的操作。在一种实施方式中，电势HV2被施加于所述鞘液储存器120，其中所述目标表面130接地或具有相反的电势。HV2可通过多种方式施加到所述鞘液储存器120，例如通过电接触到设置在所述鞘液储存器120中的电极。例如，可将电极线潜入所述鞘液储存器120中，或者可将电极设置在所述鞘液储存器120的壁上。

在一种实施方式中，分析物流出液通过诸如动电力或机械泵力的作用流过所述毛细管。所述动电力为本领域技术人员所知，包括但不限于介电泳、电渗流或电泳流。

采用动电流时，可选择性地使用电压HV1。HVI的施加可以通过形成与鞘液的电接触。例如，电极可设置在毛细管102的注射端104，或者电极线可用于连接所述注射端104附近的分析物流出液。

所述分析物液体可在毛细管内分离，采用毛细管区带电泳、毛细管电色谱、介电泳或其组合。所述分析物液体可在进入所述毛细管注射端之前通过液相色谱分离。所述分析物液体并不需要在通过所述毛细管时一直进行分离。不同的是，所述毛细管可接纳预先分离的流出物并仅仅传送所述分析物以形成电喷射。多种不同的色谱技术可用来提供所述分析物液体到所述毛细管，只要所述色谱过程的流出物可以被提供和接合到所述毛细管的注射端。

在一种实施方式中，分析物液体是在所述毛细管内通过电泳分离的，其中所述纳喷射是通过电渗流产生，并且其中电泳和电渗流均可通过在所述毛细管注射端、所述鞘液储存器和所述目标表面之间施加电势进行驱动。

在一些实施方式中，所述鞘流接口110被设置为为质谱仪提供纳喷射进行分析(见图1B)。在这种实施方式中，所述目标表面130为质谱仪的输入孔口。这样的配置会在下面的实施例中更详细地描述。

当所述接口100用于质谱仪，所述鞘液可配置为提高分析物流出液和质谱仪的相容性。如果分析物流出液不是本身与MS相容，可以对鞘液进行选择以便实现有效的MS。例如，如果CE被用来提供分析物流出液，有些常用的流出物可能与MS不相容。然而，如果选用合适的鞘液，本文所述的缓冲剂和分析物就能够通过MS进行分析。

本发明还提供了一种使用本文所述的鞘流接口从毛细管的分析物流出液形成纳喷射方法。在一种实施方式中，所述方法包括施加电压到鞘液储存器足以驱动鞘液储存器中鞘液的电渗流，通过所述毛细管和所述电喷发射体之间的连接构件，穿过所述毛细管的末端，并且通过所述电喷发射体的末端的开口。所述分析物流出液能够在毛细管内通过电压施加到所述毛细管的注射端并由毛细电泳进行分离。然而，在另外的实施方式中，所述分析物流出液在进入所述毛细管之前通过液相色谱分析(或其他的分离方法)进行分离。在进一步的其他实施方式中，所说分析物流出液在进入所述毛细管之前或流经所述毛细管时并不进行分离。如上所述，所述接口可被用于质谱的离子源，其中所述电喷射被离子化并引到质谱仪输入孔口进行分析。

CE-MS纳喷射接口的设计和测试

本发明提供了一种纳喷射鞘流接口，其中利用很低的鞘液流速实现稳定的喷射，可选择不用泵或雾化气体。所述分离毛细管可置于发射体内，比如锥形玻璃ES发射体。所述鞘液可被在所述发射体表面的zeta电势产生的电渗透进行驱动。所述鞘液流过所述分离毛细管的末端，闭合电路并与尖端内的所述毛细管流出物混合。所述毛细管、电喷射发射体和鞘液导管可以例如通过PEEK交叉接头连接起来。较小的发射体尖端尺寸(2到10μm内经)允许在纳喷射区间操作。

在以前的接口设计中，电喷射电压被直接施加到电喷射尖端，这通常需要使用金属或金属涂覆的发射体或内置金属丝电极的发射体。所述金属涂覆发射体的寿命是有限的从而需要经常更换。尽管金属发射体比玻璃的更结实，金属表面的氧化还原反应常常会导致气泡形成和电晕放电，这就限制了电喷射的灵敏度和稳定性。线电极也有其局限性。例如，它们会造成湍流以及分离效率的损失。碳涂覆和导电性聚合物涂覆的毛细管已被用于为所述尖端提供电流。然而，碳涂层的寿命有限从而需要定期更换。此外，需要将导电性聚合物施加到所述发射体的外部，这样可能会引起发射体尖端的堵塞。这些问题都可通过将电压间接施加到所述尖端来回避，例如，通过在鞘缓冲储存器中设置铂电极。

接口：图1B所示为一种接口的示意图。所述分离毛细管可以通过使用交叉接头(例如具有0.5mm内径5mm长的交叉通道)拧进玻璃电喷射发射体。所述交叉接头的一个臂可配用HPFA管道(0.5mm内径)，其可以沉入充当鞘液储存器的微量离心管。所述储存器中的液体的高度可以维持在所述发射体尖端相同的高度从而避免动电流。高电压可被施加到所述毛细管的注射端(HV1)以及到所述鞘液储存器(HV2)。所述分离操作可以利用这些电位之间的差异来驱动。HV2可提供驱动所述发射体内电渗流的电势。所述质谱仪入口可保持地电位。所述交叉接头的其他臂可以在试验开始时用于鞘液对接口进行冲洗。

在各种实施方式中，电喷射发射体可从10cm长的硼硅酸盐玻璃毛细管(1mm外径，0.75mm内径)拉出，例如利用P-1000Sutter型拉制器。所采用的尖端的尺寸范围可为约2μm至约50μm内径，或约2μm至约10μm内径，并具有锥形长度约3mm。所述尖端的直径可在显微镜下对所述尖端的检测确定。所述尖端的外径可被观测到，而所述内径可以基于初始玻璃毛细管的内径对外径的比率加以确定。

附图2A显示了接口的一个实施例的详细描述。熔融硅石分离毛细管(50μm内径，150μm外径，45cm长度)能够拧进穿过PEEK锥形交叉构件(Upchurch)。所述毛细管随后拧进所述电喷射发射体。所述毛细管和发射体尖端能够通过套筒、套圈和螺帽帽固定到位。所述毛细管尖端到发射体尖端的距离能够在显微镜对系统进行观察下所述连接构件固紧时进行调节。利用连接到所述交叉构件的HPFA管可以将鞘液引到所述电喷射的尖端。所述交叉构件的第四个端口能够连接到注射器，从而在实验开端利用鞘液冲洗所述接口。

电压可通过铂电极从电源供应器(例如SpellmanCZE1000R)中传送，其中所述铂电极与流动缓冲剂以及鞘液储存器发生接触。所述交叉构件能够连接到设置于ThermoLCQ离子捕集器源的位移平台。

CE-MS：CE-MS实验能够利用诸如ThermoFinniganLCQ离子捕集器的仪器进行。样品可以是生物分子，例如酶或肽。毛细管的调节可采用0.1MHCl，接着用1MNaOH，然后是分离缓冲剂，都是使用前在10psi压力下被注射5分钟。

在连续输注实验中，所述样品可被动电地引入所述分离毛细管。连续输注可用来对所述仪器进行调节以获得最佳的肽信号。对于毛细管电泳分析，样品可被动电地注射。在不同的实施方式中，所述发射体尖端可置于与离子源相距2mm的位置。一组有效的调谐参数包括-38V的透镜电压和165℃的毛细管温度。

在正离子模式实验中，分离缓冲剂可以是例如大约10nM的醋酸铵，pH7.8，并且所述鞘液可为约10nM含水乙酸和甲醇的等体积混合物。

在负离子模式实验中，可将UltratrolLN(TargetDiscovery，TM)涂层施加到所述毛细管从而使电渗流最小化。所述分离缓冲剂可由10mM的醋酸铵，pH8组成，而且所述鞘液可为10nM含水乙酸铵和甲醇的等体积混合物。

以相等的电渗流，所述分离缓冲剂和鞘液的电势之比率可以与所述分离缓冲剂和鞘液的流率之比成比例。

毛细管出口和发射体尖端之间的距离：从所述毛细管的出口到所述发射体的出口的距离对所述ESI发射体的操作性能有显著的影响。美国专利公布号2013/0140180(Dovichietal.)描述了一种鞘流接口，并且是在所述分离毛细管的末端和所述发射体的尖端之间的距离被从2mm减小到1mm的情形进行的实验，这样由于减少的柱外谱带扩展，也使得峰值振幅变窄和增高。然而，当使用美国专利公布号2013/0140180(Dovichietal.)中的装置和技术，所述发射体尖端的内径和所述毛细管的外径就形成了物理屏障从而防止所述毛细管的末端与所述发射体的尖端靠得比800μm还近。这种所述毛细管末端的外径边缘和所述发射体尖端的内径之间非常接近的情形会引起系统操作性能降低，包括信号振幅降低、色谱峰宽增大以及板数降低。

使所述毛细管的末端更为靠近所述发射体的尖端的尝试在物理上受到限制由于与所述发射体壁的接触。当使用较大(例如375微米)外径的毛细管的场合，比如在许多商业电泳仪器中，上述问题尤为突出。这些毛细管需要在所述毛细管出口和所述发射体孔口之间有几毫米分开的距离，这就会显著降低灵敏度。将所述这种大外径毛细管的末端靠近所述发射体的尖端可导致所述毛细管尖端的破损，从而需要对装置进行分拆和重装。

针对上述问题本文描述了解决方案，通过减小所述毛细管的外径，例如通采用玻璃毛细管的外径蚀刻，所述毛细管的末端可以更为靠近所述发射体的孔口。通过所述毛细管外表面的仔细蚀刻，所述毛细管可以与所述发射体的尖端靠近到100nm(例如，通过进一步蚀刻图3B所示的实例)。当所述毛细管的末端被修整使其外径小于所述发射体孔口的直径，所述发射体的尖端也可被置位于所述发射体的孔口之内以及超过所述发射体孔口达100微米。所述分离毛细管的尖端和所述发射体的尖端之间的较短距离，或其延伸穿过所述发射体孔口，导致柱外谱带扩展的显著降低。

出乎意料地，所述修整为自下而上蛋白鉴别工艺水平带来两个量级改进，并且为基于MS的肽检测极限带来一个量级的改进。灵敏度的提高允许从非常少量的样品进行肽检测。此外，对于相同量的材料，所述接口相比常规的设计能够允许检测更多的肽和蛋白质。另外，意想不到的还有更为清晰的质谱检测背景以及更长的喷射发射体使用寿命。所述修整获得的接使得非常小量的样品(例如4-400fg的多肽)能够在小于12分钟质谱仪器时间内进行分析。质谱仪的检测极限可以低到大约1仄摩尔(zeptomole)(～600个分子)，从而可以检测到的质量可以低到大约1阿克(attogram)。因此，所述增加的灵敏度允许更小样品的分析，如本文所述，以及从与先前接口设计中使用的相同数量的样品中鉴别出更多的肽类。

以下实施例是用于对上述的发明内容进行阐述，并且不应当解释为缩小其范围。本领域技术人员很容易能够意识到，所述实施例提示有很多其他方法可用于本发明的实施。应当理解，能够进行很多的变化和调整，然而仍然处于本发明的范围之内。

实施例

实施例1.飞克(Femtogram)量的复合蛋白质组消化物的超灵敏和快速自下而上分析

蛋白质组消化物

毛细管区带电泳被连接到改进的鞘流电喷射接口用来以自下而上蛋白分析所要求材料量得到两个量级的改进。本实施例描述了基于改进的纳喷射接口的超灵敏的毛细管区带电泳-质谱系统。所述系统还可用于分析皮克(picogram)到飞克(femtogram)量的消化物，比如E.coli消化物。基于串联质谱，从16pg消化物中鉴定了超过100种蛋白质；基于精确质量和时间标签法在10分钟内从400fg消化物中鉴定了超过60种蛋白质。

纳克样品的自下而上蛋白质组方法，采用毛细管液相色谱(LC)-电雾化电离(ESI)-串联质谱(MS/MS)分析，需要至少一个小时的仪器时间。在本实施例中，报道了基于改进的动电泵鞘流接口的一种超灵敏和快速的毛细管区带电泳(CZE)-ESI-MS/MS系统。我们展示了对飞克量的E.coli蛋白消化物进行快速自下而上分析的系统。

对于低纳克样品CZE-ESI-MS/MS总是优于LC-MS/MS，部分原因在于其改进的接口。本实施例描述了另外一种接口的开发，其基于动电泵鞘液接口(图3A)(见Wojciketal.，RapidCommun.MassSpectrom.2010，24，2554foranexampleofaprevioussheath-flowinterface)。所述新的接口有几个优点，包括由于鞘流流速很低而减少样品的稀释，免除机械泵，允许使用宽泛的分离缓冲剂，以及使得纳喷射体系操作稳定。我们还将CZE连接到三重四极质谱仪并且采用了利用多重反应监测针对复杂混合物中亮氨酸-脑啡肽进行量化分析的接口，而且我们获得了335zmole的肽检测极限，其显示出所述系统对于高灵敏分析的能力(Lietal.，Anal.Chem.2012，84，6116)。

动电泵鞘流接口的COMSOL模型预测以及实验验证了灵敏度随着所述毛细管末端靠近所述发射体孔口而增加。毛细管尖端和孔口之间的典型最小距离，在使用150微米外径毛细管时为大约1mm，以及当使用375毫米外径毛细管时为大约2.5mm。所述距离的下限阀值被分离毛细管的外径所限制，其最终抵到所述锥形发射体的内壁。

如本文所述，发明人用氢氟酸蚀刻了分离毛细管尖端的外部几个毫米，将其外径从约150μm减小到约60μm或约50μm。这种简单的步骤允许我们将所述毛细管的末端在很大程度上更为接近所述发射体的孔口(例如，～200μm)(图3B和3C)，这样就使系统的灵敏度得到显著的改进。发明人使用了未经涂覆的熔融硅石毛细管(32cm和40cm，10μm内径/150μm外径)进行电泳，以及使用了Q-Exactive质谱仪进行肽的鉴定。实验的细节陈述与本实施例的实验部分。

硅石毛细管的制备在SutterInstrumentCompanyPipetteCookbook中已有描述(2011，Novato，CA，http：//www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf)。然后这些毛细管能够被蚀刻从而为本发明所述的接口提供毛细管。根据一种实施方式，可用毛细管的实施例具有下列尺寸：25-30cm长度，10μm内径/150μm外径，带有锥形端头(～5mm长度，～50-60μm外径)。对于具有较大外径的毛细管(例如250-300μm外径)，所述蚀刻端头的外径可以减小到大约200μm外径，例如，在所述毛细管发射体被设置为允许所述毛细管的末端位于距离所述发射体开口不到750μm的情形。所述毛细管的末端也可被蚀刻使外径减小到约20μm到约100μm，约20μm到约80μm，约40μm到约80μm，约60μm到约80μm，约40μm到约60μm，或约50μm到约60μm。

发明人首先评估了对于28pg量E.coli消化物的分离电压的效果。所述分离操作是在32cm长的毛细管内并在15kV(500V/cm)和10kV(300V/cm)的条件下进行的。电泳图谱的形成采用了MaxQuant软件(v.1.3.0.5)(Nat.Biotechnol.26，1367-1372(2008))。所述10kV电势，与15kV相比，产生了较宽的分离窗区，使得明显更多的蛋白质(129±18vs.88±14)和肽(375±27vs.246±19)得到鉴别。下述工作中使用了300V/cm的电场。

然后我们评估了我们的CZE-ESI-MS/MS系统并采用40cm毛细管对于16pg的E.coli蛋白消化物进行分析的可重复性。基于串联质谱三重的自下而上分析，发明人鉴别了105±17种蛋白质和256±9种肽。对于复杂蛋白质消化物的串联质谱分析的工艺水平是在1ng级别具有～100种蛋白的鉴别。发明人的系统从两个量级较少的样品实现了相同数量的蛋白质鉴别。

所述分离是可重复并且是高效的。来自50种肽的信号被概括形成提取离子电泳图(图4)。154种肽的迁移时间的平均相对标准偏差为0.7％(图5)。所述电泳峰是相当尖锐的，根据采用高斯函数的标准偏差对峰值进行拟合所定义的平均宽度为0.7s(半高处全宽1.6s)(图6)。对于肽的分离，发明人获得一致的平均超过300,000理论板(图7)。不同的测试之间，峰值强度也是一致的(图8)。分离操作是在不到10分钟的时间完成，与现有的高灵敏自下而上复合蛋白质组分析相比，体现出在分析时间上一个量级的改进。

然后，我们测定了基于串联质谱的的鉴定数目和E.coli消化物装载之间的关系(图9)。在400fg装载的双重样品中，在对串联质谱的手动评估之后确信地鉴别出了对应于4±1种蛋白质的9种肽。在E.coli中的最大丰度蛋白质，延长因子Tu，构成总蛋白质量的～1％。这样，对于400fg的E.coli消化物的分析就会包括大约4fg的这种蛋白。通过串联质谱进行鉴别的最小蛋白量为不到4fg，从而表现出工艺水平上两个量级的提升(Shenetal.，Anal.Chem.2004，76，144)。当样品的装载量增至84pg时，蛋白质和肽的鉴定数目分别增加到162±8和570±11(图9)。

发明人还以16pg的E.coli数据作为数据库采用了Smith精确质量和时间标签法。超过60种蛋白质和150种肽被从400fg的E.Coli消化物中被鉴别，质量公差为3ppm，迁移时间公差为0.3min(未对齐)，并且对每个肽具有至少两个被检测的同位素峰(图9)。图10显示了一种典型的提取离子电泳图谱。结果是，对于基于亚皮克蛋白质组分析的AMTs，获得了蛋白鉴定数量上20倍的改进。

最后，我们从所述400fg的E.Coli数据对肽的检测极限进行了评估。我们对来自延长因子Tu(由MS/MS光谱鉴别出来具有1ppm的质量偏差)的三种肽的电泳图进行了手动提取。利用Xcalibur软件(ThermoFisherScientific)求得信噪比，其中采用峰后0.3min至2.3min的噪声区域(图11)。基于样品(4fg)中存在的延长因子Tu的量及其分子量(～43kDa)，取～100zmole的这些肽进行分析。这些肽产生的信噪比(S/N)为270～290；质量检测极限(S/N＝3)为～1zmole(～600个分子)，呈现出对基于MS的肽检测工艺水平一个量级的改进。

针对从CZE-MS系统获得高灵敏度的解释包括以下方面的内容。第一，所述肽只需要0.2s或以下的时间从所述毛细管端部迁移到所述喷射发射体的端部(基于发明人工作的近似计算)，这样大大地减少了样品在喷射发射体的扩散并且形成更高的肽信号，从而获得更佳的肽检测极限。第二，所述分离毛细管和在所述喷射发生器中的电渗流率是大致相同的，由于相似的缓冲剂和施加的电压(～300V/cm)，并且喷射的总流率为大约20nL/min，其产生高的离子化效率，导致高的灵敏度。第三，我们使用了相当窄小内径的毛细管，其减小了样品的流率并且产生非常有效的分离。

我们还注意到，在本次工作中获得的蛋白质鉴定数量为～200种蛋白，由于相对较短的肽分离窗区，限制了所获串联光谱的数量，这样就限制了生物样品中较低丰度蛋白质的检测。基于CZE-MS系统Waysto改进蛋白质鉴别，是在所述CZE-MS分析之前进行在线/离线肽预分馏，使用较长的分离毛细管以减慢分离，或使用涂覆的毛细管以减少电渗析并增大分离窗区。

总之，本实施例描述了一种用于飞克蛋白质组学分析的超灵敏和高通量CZE-ESI-MS/MS系统。采用所述系统导致了在由串联质谱所获材料的量、利用精确质量和时间标签法从亚皮克的复杂蛋白质消化物鉴定的蛋白质量、肽质量检测限以及分析时间诸方面的一到两个量级的改进。所述系统可用于单细胞分析。迄今，可用于单细胞蛋白质分析的最高灵敏度的工具采用了激光诱导荧光检测。尽管灵敏，荧光固有地会产生低信息含量的信号，其仅仅提供信息蛋白识别的不完整信息。开发具有1-zmol检测极限的CZE-质谱系统为对较高丰度蛋白具有确信鉴别的单细胞蛋白质分析打开了大门。

材料：牛胰腺TPCK处理的胰蛋白酶、尿素、碳酸氢铵(NH₄HCO₃)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)是购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。乙腈(ACN)、甲酸(FA)、氢氟酸(HF)是购自FisherScientific(Pittsburgh，USA)。甲醇和水是购自HoneywellBurdick&Jackson(Wicklow，Ireland)。熔融硅石毛细管(10μm内径/150μm外径)是购自PolymicroTechnologies(Phoenix，USA)。完整的微型蛋白酶抑制剂的混合物(EASY包袋中提供)是购自Roche(Indianapolis，USA)。例如PEEK交叉构件、螺母、套环，套筒和PHFA管道的设备或构件可以购自诸如IdexHealthandScience(OakHarbor，WA，USA)的供应商。

E.coli样品的制备：E.coli(Dh5-Alpha)是根据Faserletal.(Anal.Chem.2011，83，7297)所描述的方案培养的。所述E.coli颗粒在经过培养之首先用PBS洗涤(3次)。然后，所述颗粒被悬浮于8M尿素和100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH8.0)缓冲液，其含有蛋白酶抑制剂，并且在冰上声波处理15分钟以细胞裂解。将所述裂解液在18,000gg离心15分钟，然后采用BCA方法((Cohenetal.，Annu.Rev.Anal.Chem.2008，1，165))测定蛋白质浓度。将等份试样的蛋白质(900μg)用冷的丙酮在-20℃沉淀过夜。离心后，所述蛋白质颗粒用冷的丙酮再次进行洗涤以除去污染物质。蛋白质在室温(～22℃)下培养几分钟至干燥后，被溶于100mMNH₄HCO₃(pH8.5)中300μL的8M尿素，然后在37℃历时60分钟进行蛋白质改性，利用DTT(8mM)在60℃还原1小时，并且利用IAA(20mM)黑暗中在室温下经过30分钟烷基化。

接着，加入1.2mL的100mMNH4HCO3(pH8.5)以稀释尿素浓度到2M以下。最后，将经过处理的60μL等分试样的蛋白质溶液(36μg)采用胰蛋白酶/蛋白之比为1/30(w/w)的胰蛋白酶进行消化在37℃过夜。所述消化物通过甲酸(FA)(0.5％最终浓度)酸化以终止反应。胰蛋白酶的消化物被利用ZipTipC18(Millipore，Bedford，USA)进行脱盐，然后由真空浓缩器(ThermoFisherScientific，Marietta，USA)进行冻干。干燥后的蛋白质消化物被溶解于含有20％(v/v)CAN的0.05％(v/v)FA含水缓冲液，从而得到浓度为0.1mg/mL和0.01mg/mL的溶液，用于后续分析。

分离毛细管的制备：采用温和火焰去除1cm长度的聚酰胺涂层，其与熔融硅石毛细管(10μm内径/150μm外径，～50cm长度)的一端相距大约3-4cm。在200μL的Eppendorf管的底部采用比毛细管外径略大的钻头钻一小洞，从而制得反应室。毛细管被拧进所述小洞，从而所烧制部分的毛细管被保持在所述Eppendorf管中。

最后，将～150μL的氢氟酸(HF，～50％w/w)加入到所述Eppendorf管中，并在风柜中在室温培养～20分钟。蚀刻之后，蚀刻区域的外径为大约60μm，而毛细管的内径不变，因其未与HF接触。所述毛细管的外部用去离子水洗涤，以除去残余的HF，然后所述毛细管被截至～40cm长，并且在所述末端带有～5mm蚀刻区域。在进行HF溶液的操作过程中，应当小心并采取适当的安全措施。被蚀刻的毛细管依次采用氢氧化钠(1M)、去离子水、盐酸(1M)、去离子水和0.5％(v/v)FA进行洗涤。

CZE-ESI-MS/MS分析：所述毛细管电泳系统是利用曾经报道过的部件组装而成(seeMoini，Anal.Chem.2007，79，4241；Lietal.，Anal.Chem.84，1617-1622(2012)；Sunetal.，Anal.Chem.85，4187-4194(2013))。还可参见图3A。采用两个SpellmanCZE1000R高压电源为所述分离和电喷射过程提供高压。电压程序是通过LabView软件进行控制的。

分离毛细管的总长度为40cm(对于400fg、4pg和16pg量的E.coli消化物)或32cm(对于28pg和84pg量的E.coli消化物)。分离缓冲剂为去离子水中的0.5％(v/v)FA，以及鞘液为0.1％(v/v)FA，其中包括10％(v/v)甲醇。样品溶解在含有0.05％(v/v)FA和20％(v/v)乙腈的水性缓冲剂。所述样品利用空气压力(10-20psi和1-9s)被注入分离毛细管，并且所述样品的注射容积是基于Poiseuille定律计算的。

动电泵鞘流接口被用来将毛细管连接到质谱仪。电喷射发射体是由硼硅玻璃毛细管(1.0mm外径，0.75mm内径和10cm长度)采用SutterinstrumentP-1000flaming/brown型微量移液管拉制器拉成的。所述发射体尖端为～8μm外径和6μm内径并带有3mm锥形。分离毛细管的蚀刻端部被拧进aPEEK锥形交叉端口(Upchurch，OakHarborUSA)并进入所述喷射发射体。所述毛细管尖端和发射体尖端之间的距离为200μm(见图3B和C)。鞘液通过连接到所述交叉构件的HPFA管路被引入电喷射尖端。所述交叉构件的第四端口连接到注射器，用于实验开始时冲洗发射体。

喷射电压(HVII，图3A)在每项试验中为1.2kV。高电压I(HVI，图3A)对于32cm毛细管为11.2kV(13.2kV对于40cm毛细管)以形成穿过分离毛细管的～300V/cm电场。并且16.2kV的电势作为HVI被施加于28pg量的E.coli消化物，同时对分离条件进行优化。

为了获得不同的载样量，在含有20％(v/v)CAN的0.05％(v/v)FA含水缓冲剂中的0.01mg/mL的E.coli消化物被用作400fg实验的样品，以及0.1mg/mL的E.coli消化物被用作4-和84-pg实验的样品。每个样品的分析多进行了两次或三次。

在实验中使用Q-Exacfive质谱仪(ThermoFisherScientific)，利用数据依赖性采集模式。在Orbitrap质谱分析仪，在m/z380-1,800(对于28和84pgE.coli样品)和m/z400-1,000(对于400fg、4pg和16pg的E.coli样品)进行了完全MS扫描，分辨率为70,000(在m/z200)。目标值和最大注射时间为1.00E+06和250ms(对于16、28和84pg的E.coli样品)；3.00E+06和500ms(对于400fg和4pgE.coli样品)。

对于400fg的E.coli消化物分析，电荷态为2或3、强度超过2.00E+03的两个最强峰(Top2法)在四极杆中以2m/z的分离窗被依次分离，在归一化的碰撞能量为28％的高能碰撞解离碰撞池中被分裂，而且在Orbitrap质量分析器中获得分辨率35,000(m/z200)、目标值1.00E+06以及最大喷射时间500ms的串联质谱。

对于4pg的E.coli消化物分析，采了Top4法，用于串联质谱的最大注射时间为250ms。对于16pg的E.coli消化物分析，采用Top6法。用于串联质谱的最大注射时间为120ms，强度阈值为4.00E+03以及电荷排除为1、5或更高。对于28和84pg的E.coli消化物分析，采用Top6法。用于串联质谱的最大注射时间为120ms，强度阈值为8.00E+03以及电荷排斥为1、7或更高。对于每项实验，动态排除为6.0s，微扫描为1，启用肽匹配，并且启用同位素排除。

数据分析：原始MS文件是利用MaxQuantsoftwareversion1.3.0.5进行分析的。MS/MS谱图的检索利用了Andromedasearchengine(Coxetal.，J.ProteomeRes.10，1794)针对包括正向与反向序列(包括正向与反向序列的8,320条目)的NCBI-E.coli(DH1)数据库。所述数据库还包括常见的污染物质。

MaxQuant分析包括初始检索，前体质量公差为10ppm，主检索前体质量公差为5ppm，以及分裂质量公差为20ppm。所述检索包括胰蛋白酶作为酶，可变修饰的甲硫氨酸氧化作用、N-端乙酰化作用和脱酰胺作用(NQ)，以及固定修饰的氨甲基半胱氨酸。最小肽长设为7个氨基酸，最大漏切数目设为2。错误发现率对于肽和蛋白质的鉴别均设为0.01。相同组的肽所鉴别的蛋白质被列为一种蛋白质组。蛋白和肽表被筛选以去除来自于反向数据库和常见污染物质的鉴别。

实施例2、用于定量平行反应监控的CZE-ESI-MS/MS

本实施例描述利用毛细管区带电泳-电喷射离子化-串联质谱(CZE-ESI-MS/MS)进行肽丰度的定量平行反应监测以及人类细胞系的单次蛋白质组分析。

我们将毛细管区带电泳(CZE)与超灵敏动电泵纳喷射离子源连接用于对复杂蛋白质组的串联质谱(MS/MS)分析。我们首先利用该系统对掺入到0.45mg/mL牛血清白蛋白(BSA)消化物中的血管紧张素II进行平行反应监测(PRM)分析。在血管紧张素II的装载量和血管紧张素II碎片离子强度之间形成校准曲线。CZE-PRM形成了线性校准曲线，跨过对应于血管紧张素II装载量为2amole至150fmole的4.5个量级的动态范围。迁移时间的相对标准偏差(RSDs)为＜4％，而碎片离子强度的RSDs为～20％或更低，除了150fmole血管紧张素II装载量的数据(～36％RSD)之外。

我们进一步将该系统用于首次对人细胞系的自下而上蛋白质组分析，使用了CZE-MS/MS。我们从针对MCF7乳癌细胞系消化物的1小时长的单次CZEMS/MS分析获得283种蛋白质鉴定，对应于大约80ng装载量。利用C18固相萃取柱对所述MCF7消化物进行分级。单个级份的单次分析产生468中蛋白质鉴别，这是迄今为止利用CZE针对哺乳动物蛋白质组样品的最大数量蛋白质鉴别。

毛细管电泳(CE)-电喷射离子化(ESI)-质谱(MS)已被用于鉴别范围广泛的分析物，包括完整的蛋白质，肽和代谢物。我们开发的鞘流接口是一种有用的CE-纳喷射接口，采用带有～5-μm孔口的玻璃发射体(Wojciketal.，RapidCommun.MassSpectrom.24(2010)2554)。在玻璃表面电渗透以很低的速率驱动鞘液。所述接口具有多种优点，包括由于很低鞘流率最小化的样品稀释，免除机械泵，允许宽范围的分离缓冲剂，以及在纳喷射状态的稳定操作。我们已经将所述动电泵鞘流纳喷射接口CE-MS/MS系统进行鸟枪法蛋白质组学分析，针对Mycobacteriummarinum分泌组(Lietal.，Anal.Chem.84(2012)1617)、酵母裂解液级份(Wojciketal.，Talanta88(2012)324)、E.coli蛋白质组(Zhuetal.，Anal.Chim.Acta.810(2014)94)、皮克量(picogram，微微克)的RAW264.7细胞裂解液(Sunetal.，Analyst138(2013)3181)以及PC12细胞裂解液(Zhuetal.，Anal.Chem.85(2013)7221)。此外，所述系统还应用于自上而下完整蛋白质鉴定(Sunetal.，Anal.Chem.85(2013)5989)、肽丰度的定量多重反应监测(MRM)(Lietal.，Anal.Chem.84(2012)6116)以及磷酸肽鉴定(Mouetal.，Anal.Chem.85(2013)10692)。

在上述实施例1中，我们描述了对我们的接口的简单修改从而获得超灵敏操作性能。我们对分离毛细管尖端的外部几毫米用氢氟酸进行了蚀刻使其外径从～150μm减小到～60μm。该步骤使得所述毛细尖端能够置于200μm的发射体孔口之内，导致系统灵敏度的显著提高(Sunetal.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.52(2013)13661)。通过采用10μm内径的分离毛细管、Q-Exactive质谱仪以及改进的CE-MS接口，我们获得1zmole(1zmol＝10^-21mol＝～600个分子)肽的检测极限(S/N＝3)。从16pg的E.coli消化物基于串联质谱获得超过100种蛋白的鉴别，从400fg载荷量的样品实现了来自60种蛋白的154种肽的鉴别。

我们组将动电泵鞘流接口用于M.marinumin2012的分泌蛋白组的毛细管区带电泳分析；鉴别出140种蛋白组(Lietal.，Anal.Chem.84(2012)1617)。我们利用线性聚丙烯酰胺涂覆毛细管和叠加注入改进了肽分离工艺。通过不到1小时的单次分析(Zhuetal.，Anal.Chem.85(2013)2569)从100ng的E.coli消化物鉴别出大约300种蛋白质组。通过对由离线C18-SPE分提(Yanetal.，Proteomics13(2013)2546)的7个E.coli消化物级份的分析，蛋白质鉴别的数量增加到871种。我们还使用毛细管等电聚焦MS/MS系统与动电泵鞘流接口，通过基于八重iTRAQ的定量蛋白质组分析区分PC12细胞；835种蛋白组被鉴别(Zhuetal.，Anal.Chem.85(2013)7221)。据我们所知，还没有使用CZE-MS/MS分析人细胞系的公开发表物。

对于目标蛋白质组学研究，多重/选择反应监测(MRM/SRM)通常使用三重四极质谱仪(QqQ)。简单地说，靶向肽的母离子是在第一个四极(Q1)分离的，然后在第二个四极(Q2)分裂。来自靶向肽的一个或多个碎片离子被进一步由第三个四极(Q3)进行检测。最近，引入了新的目标蛋白质组学技术，即平行反应监测(PRM)，其采用了台面四极Orbitrap质谱仪(Petersonetal.，Mol.Cell.Proteomics11(2012)1475)。对于PRM，目标肽是在所述四极进行选择，然后在碰撞池中进行分裂。所产生的碎片离子时在所述Orbitrap中进行分析从而生成一个完整、高分辨率的MS/MS谱。由于在所述方法开发步骤中不需要碎片离子的m/z比率，该过程就比SRM/MRM更为简便。此外，由于Orbitrap分析仪的高分辨率，PRM与SRM/MRM相比对于背景矩阵具有更好的宽容性。

在本实施例中，我们描述了CZE-PRM的首个实施例。我们采用如上述实施例1所描述的改进动电泵鞘流纳米喷射接口进行肽分析。标准肽、血管紧张素II被掺加到0.45mg/mL的牛血清白蛋白消化物以评估CZE-PRM系统的操作性能。我们观察到对于对应于负载量为2至150,000amole的血管紧张素II的四个半量级的线性动态范围。我们还呈现了对于人细胞系的自底向上分析的CZE-MS/MS第一个实施例。在具有～80ng装载量1小时的单次喷射CZE-MS/MS分析中，从MCF7完整细胞裂解消化物获得了几乎300种蛋白质的鉴别。

实验

1、原料和试剂：经牛胰腺TPCK处理的胰蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA)、尿素、碳酸氢铵(NH₄HCO₃)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)和血管紧张素II(人，Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。乙腈(ACN)、甲酸(FA)和氢氟酸(HF)购自FisherScientific(Pittsburgh，PA)。甲醇和水购自HoneywellBurdick&Jackson(Wicklow，Ireland)。熔融硅石毛细管(50μmi.d./150μmo.d.)和线性聚丙烯酰胺(LPA)涂覆毛细管(50μm内径./150μm外径)购自PolymicroTechnologies(Phoenix，AZ)。

鹰的最小必需培养基(EMEM)、胎牛血清(FBS)、GlutaMAX^TM(100×)、胰岛素和抗生-抗菌素(Anti-Anti，100×)购自LifeTechnologiesCorporation(GrandIsland，NY)。用于细胞裂解的哺乳动物细胞-PELB^TM缓冲剂购自G-Biosciences(St.Louis，MO)。完整的微型蛋白酶抑制剂混合物(EASYpacks中提供)购自Roche(Indianapolis，IN)。

2、样品制备：牛血清白蛋白(BSA，0.5mg/mL)在含有8M尿素的100mMNH₄HCO₃(pH8.0)中变性，于37℃达30分钟，然后利用DTT和IAA进行标准的还原和烷基化。用100mMNH₄HCO₃(pH8.0)稀释后，将尿素浓度降到2M以下，采用胰蛋白酶/蛋白质之比为1/30(w/w)的胰蛋白酶在37℃进行12小时的蛋白质消化。酸化之后，所述蛋白质消化物利用C18-SepPak柱(Waters，Milford，MA)进行脱盐，然后采用真空浓缩器(ThermoFisherScientific，Marietta，OH)进行冻干。经过干燥的样品溶解于0.05％(v/v)FA形成0.5mg/mL溶液并储存于-20℃备用。

将血管紧张素II溶液掺加入BSA消化物形成在0.05％(v/v)FA中的5个样品，其中含有0.45mg/mLBSA消化物和不同浓度的血管紧张素II(10nM、100nM、1μM、10μM和100μM)，每个样品通过CZE-PRM进行三重分析。

有关MCF7细胞培养、细胞裂解、蛋白丙酮沉淀、变性、还原和烷基化的过程被Sun等人描述(J.Chromatogr.A.1337(2014)40)。简单地说，在细胞培养之后，MCF7细胞利用声波作用发生裂解，接着是BCA蛋白质浓度测量和丙酮沉淀。然后，690μg蛋白质等分试样被溶于8M尿素和100mMNH₄HCO₃(pH～8.0)，在37℃变性1小时，并且在～40mMDTT中于37℃还原1.5小时，再利用100mMIAA在室温进行烷基化30分钟。采用100mMNH₄HCO₃(pH～8.0)稀释后，尿素浓度被降到2M以下，然后胰蛋白酶/蛋白比为1/30(w/w)的条件下利用胰蛋白酶对蛋白质进行消化，在37℃过夜。蛋白质消化物用FA(1％最终浓度)进行酸化并利用C18-SepPak柱(Waters，Milford，MA)进行脱盐，然后进行冷冻干燥。肽混合物被溶解于含有20％(v/v)CAN的0.04％(v/v)FA中，得到3.5mg/mL的样品，然后进行CZE-ESI-MS和MS/MS分析。大约300μg的消化物被再次冻干，并重新溶解于0.1％(v/v)FA。所述消化物被装载到C18-SepPakSPE柱(Waters)，并利用含有0.1％(v/v)FA的1mL的12％(v/v)CAN进行洗脱。洗脱物被冻干并进一步溶解于28μL的0.04％(v/v)FA和30％(v/v)CAN进行CZE-ESI-MS/MS分析。

3、CZE-ESI-MS/MS分析：所述毛细管电泳系统是由上述实施例1中的部件装配而成。两个SpellmanCZE1000R高压电源被用来为分离和电喷射提供电压。超灵敏动电泵鞘流接口被用来将CZE连接到Q-Exactive质谱仪(ThermoFisherScientific)。所述电喷射发射体是用SutterinstrumentP-1000flaming/brown型微量吸液管拉制器由硼硅酸盐玻璃毛细管(1.0mm外径，0.75mm内径)拉成，而所述发射体孔口的尺寸为8-10μm。电压程序是用LabView软件控制的。

在CZE-PRM实验中，带有蚀刻尖端(～60μm外径，～5mm长)的32cm长的毛细管(10和20μm内径/150μm外径)被用来进行分离操作。分离缓冲剂是采用0.5％(v/v)FA。在注射端的电压为16.2kV，而1.2kV被当作喷射电压。对于完整MCF7细胞裂解液消化分析，采用了带有～5mm长蚀刻端(～60μm外径)的100cm长毛细管(20μm内径/150μm外径)，分离缓冲剂为0.5％(v/v)FA。对于MS1-only实验，在注射端施加了29.2kV电压；对于数据依赖性采集(DDA)模式的MS/M试验，在注射端施加了29.2kV电压。在这两种情况下，都是施加1.2kV用于电喷射，

为了对来自C18-SPE柱的MCF7细胞裂解消化物的12％(v/v)CAN洗脱物进行分析，采用了带有～5mm长蚀刻端(～70μm外径)的LPA涂覆毛细管(62cm，50μm内径/150μm外径)，而分离缓冲剂为0.12％(v/v)FA。在注射端施加的电压为16.2kV，而1.2kV被作为喷射电压。

对于所有的实验，所述鞘缓冲剂是10％(v/v)甲醇和0.1％(v/v)FA。分离毛细管端部和喷射发射体尖端之间的距离为大约200μm。样品是利用氮压注射到分离毛细管的，并且注射体积的计算是基于Poiseuille定律。对分离毛细管的所有的HF蚀刻操作采用了与上述实施例1中相同的方案。经蚀刻的10和20μm内径的分离毛细管在使用之前依次用氢氧化钠(1M)、去离子水、盐酸(1M)、去离子水和0.5％(v/v)FA进行冲洗。经蚀刻的LPA涂覆分离毛细管(50μm内径)在使用之前依次用去离子水冲洗和0.12％(v/v)FA进行冲洗。

对于CZE-PRM实验，所述Q-Exactive是在启用内含清单(inclusionlist)的target-MS²模式进行编程。在所述内含清单中，所述目标m/z和电荷被设为523.7734和+2。所述归一化的碰撞能量(NCE)为25％。其它参数如下：MS/MS的分辨率为17,500，AGC目标为5E5，最大喷射时间为500ms，隔离窗口为1m/z，以及微扫描为11。

为了分析人类细胞系消化物，进行了MS1-only和常规DDA模式的实验。对于MS1-only实验，质谱获取的参数包括380-1800m/z的范围、分辨率(在m/z200)为70,000、AGC目标为1E6、最大注射时间为250ms、微扫描为1。对于DDA模式的实验，采用了Top12方法。对于MS1完全扫描，所采用的参数与MS1-only实验的完全相同。对于MS/MS，来自MS谱图的十二个最强峰被依次在四极(隔离窗口为2.0m/z)分离出来，并且在高能碰撞解离(HCD)池(NCE为28％)中被进一步分裂，然后进行Orbitrap分析。采用的分辨率为35,000(在m/z200)、AGC目标为1E6、最大注射时间为120ms、微扫描为1。选择电荷态高于+1以及强度高于8.3E3的母离子用来进行分裂。动态排除被设置为10s对于20μm内径毛细管，以及15s对于50μm内径毛细管。启用了肽匹配和同位素排除。

4、数据分析：对于CZE-PRM实验，所述数据利用ThermoXcalibur软件被进行手动分析。来自血管紧张素II的碎片离子以10ppm的质量公差被人工提取，并且在峰上进行了高斯平滑(5点)处理。

对于人细胞裂解物消化物数据，包含串联谱图的原始文件通过ProteomeDiscoverer1.3软件(ThermoFisherScientific)进行了分析。Mascot2.2被用来对带有人(20,335序列)分类的Swiss-Prot数据库进行数据库检索。胰蛋白酶被选择作为消化酶，而最大漏切数目设为2。母离子和碎片离子的质量公差分别设为10ppm和0.05Da。动态修正包括氧化(M)、脱酰胺化(NQ)和乙酰化(K和蛋白质N-端)。脲甲基化(C)设定为固定修饰。进行了针对相应反向数据库的数据库检索用以评估错误发现率(FDR)(EliasandGygi，Nat.Methods4(2007)207)。

集成于ProteomeDiscoverer1.3的Percolator软件(version1.17)被用来对数据库检索结果进行评价。对于肽水平分析，高肽置信度值被用于对肽鉴别进行筛选，对应于肽水平FDR低于1％。对于肽/蛋白设置，采用了以下的参数，包括最小肽数目为1，只计数rank1肽，并且只在最高得分的蛋白质中进行肽计数。此外，启用了蛋白质组合。

结果和讨论

1、CZE-PRM用于肽检测：对于CZE-PRM实验，所述Q-Exactive是在target-MS²模式进行编程。在内含清单中，m/z523.7734(+2)对应于采用血管紧张素II(人，Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)。血管紧张素II标准肽掺入0.45mg/mLBSA消化物以产生一系列的样品，含有10nM、100nM、1μM、10μM和100μM的血管紧张素II，对应于15amol至150fmole的血管紧张素II在BSA消化物的恒定背景的情形下载到分离毛细管(20μm内径)。

我们还采用10μm内径的分离毛细管用来对由掺入0.45mg/mLBSA消化物的10nM血管紧张素II制备的样品进行分析。在本实验中，大约2amole的血管紧张素II被加载到毛细管。在进行了三重的CZE-PRM分析之后，血管紧张素II的两个最强的碎片离子(b6⁺和y2⁺)被从所获取的具有10ppm质量公差的数据中提取出来用于构建校准曲线(图12)。我们对log-log数据进行了未加权的加权线性拟合。所述碎片离子信号随血管紧张素的装载量以5个数级(log-logb6⁺slope＝0.90，r＝0.99；y2⁺slope＝0.89，r＝0.99)呈线性增加。我们注意到，血管紧张素II的两个碎片离子在每个CZE-PRM测试中发生共迁移，这就证实了所述标准肽的检测。

使用2amole血管紧张素II，在0.45mg/mL(～7μM)BSA消化物背景存在时，产生血管紧张素II的最大丰度碎片离子(y2⁺)的～2.0E+03信号。该信号是我们以前工作中所获得信号的～20倍以上，所述以前工作中也注入了～2amole的Leu-enkephalin，存在有66nM的BSA消化物的背景，并且采取了CZE-MRM分析(Lietal.，Anal.Chem.84(2012)6116)。

这种信号振幅的显著改进是由几种因素引起的。首先，在早先的工作中使用的是我们的第一代动电泵鞘流接口，然而在本工作中使用了改进版本的接口(上述实施例1)。因为分离毛细管尖端和喷射发射体尖端之间的距离，在改进的接口比原始版本的要短5倍，肽在喷射发射体中的扩散被降低，肽峰要尖很多，并且肽的信号对应地更强。第二，我们使用的分离毛细管具有小得多的内径(10-20μm相对于50μm)以及分离缓冲液具有低很多的pH值(低于3相对于低于6-8)，这就降低了分离毛细管中的流量，得到更佳的灵敏度。第三，本工作采用了在线堆叠，这也可以使峰锐化。样品基质的传导性(0.05％(v/v)FA)远低于分离缓冲液(0.5％FA)，从而当高电压施加穿过毛细管时使肽被浓缩。此外，在本工作中使用了分辨率高很多的质量分析器(Orbitrap相对于四极)，其对背景基质产生高得多的宽容度。

我们还根据血管紧张素II碎片离子(y2⁺)的迁移时间和强度对CZE-PRM系统的重现性进行了评估(图13)。三重分析的迁移时间的相对标准偏差(RSDs)小于4％。三重分析的碎片离子强度的RSDs对于150fmole加载量为～36％，对于150amol到15fmole加载量为大约10％或更低、以及对于2和15amol加载量为接近20％。

对于2和15amol加载量的RSDs略微高些，可能有两方面的原因。首先，共分离的BSA肽的强度比肽血管紧张素II的要高很多，导致对于很低加载量时较高的检测变化。第二，相对于较高加载量的数据而言，对应于2和15amol加载量数据的非常尖锐的碎片离子峰(峰的半高处的全宽≤2s)导致穿过所述峰的数据点较少。对于150fmole加载量数据，RSD明显较高，这是由于所述CE-MS系统是稍微过载，从而产生非高斯峰形。此外，血管紧张素II碎片离子b6⁺的迁移时间和碎片离子强度的RSDs数据与y2+的吻合较好。

2、CZE-ESI-MS和MS/MS用于人细胞裂解消化物分析：上述实施例1描述了使用基于CZE-MS/MS系统的蚀刻尖端的动电泵鞘流纳米喷射接口，用于分析高飞克(high-femtogram)到中等皮克(mid-picogram)量的E.coli细胞裂解消化物。该研究表明改进的系统对于原核生物蛋白质组消化物的分离和检测具有较高的性能和可重复性。至今，尚没有公开利用CZE-MS/MS对人蛋白质组进行自底向上分析。

这里，我们报道将CZE-MS/MS首次应用于人蛋白质组，MCF-7人乳腺癌细胞系的蛋白质组的自下往上分析。开始是将超灵敏接口用于分析～60ng的全细胞消化物(图14)。分离过程是由280V/cm电场驱动。肽在11分钟时开始从所述毛细管迁移，而且分离过程是在11分钟时接近完成(图14A)，尽管在较后时间观察到少量的强峰。所述分离过程是高效的，并且谱峰也很尖锐(图14B)。

从跨过13-14分钟的1分钟分离窗口的电泳谱图基峰分解出大约10-20个峰。我们从具有2ppm质量公差的数据提取一个肽(m/z400.77161，z＝+2)，产生525,000个理论板。这些就显示出由所述仪器得到的非常高的分离效率。

我们然后将单次CZE-MS/MS用于MCF7全细胞裂解消化物的自底向上分析。大约80ng的肽被加到100cm长、20μm内径的分离毛细管。所述分离过程是在200v/cm的电场进行的。在所述串联谱数据库的检索，1159种肽和283种蛋白质被确信地鉴别，以及176种蛋白质基于至少两种蛋白质被鉴别出来。所述分离在大约40分钟内完成。

为了测试从MCF7蛋白质组通过单次CZE-MS/MS能够鉴别出多少肽和蛋白质，我们通过蛋白组的分级对简化MCF7细胞裂解消化物进行了简化。肽首先在C18SPE柱上被俘获，然后利用12％(v/v)ACN洗脱出级份用来进行分析。LPA涂覆的分离毛细管被用于降低电渗透，从而提高分离能力。为了提高样品注入体积，我们使用50-μm内径的毛细管并注入大约130nL的样品。在进行数据库检索之后，单次喷射分析鉴定出1,199种肽和468种蛋白。有219种蛋白的鉴别是基于至少两种肽。所述分离过程在60分钟内完成。组合数据集包含2,005种肽和537种蛋白的鉴别特征。

文中描述了上述的一些实施方式和实施例，但这些描述都只是示意和说明性的，对本发明的范围不产生限制作用。根据本领域的普通技术可能进行一些改变和修饰，然而并不脱离本发明由下列权利要求所定义的较为宽泛的范围。

所有的出版物、授权专利和专利申请文献均通过参考纳入文本，就如各自单独通过参考纳入本文那样。由这些公开物，应当不会引入与本文公开内容不一致的限制。本发明的描述引述了各种特定和优选的实施方式和技术方案。应当理解，还有许多变化和修饰可被采纳，仍然都应属于本发明的精神和范围。

Claims

1.一种用于从毛细管形成电喷射的鞘流接口，包括：

(a)毛细管，设置为包含分析物液体，所述毛细管具有用来接收分析物液体的注射端以及用来排放分析物流出液的末端，其中所述末端的部分的外径逐渐缩减到大约20μm到大约200μm范围的较小外径；

(b)电喷发射体，同轴地设置于至少在所述毛细管的末端周围，所述电喷发射体具有末端，其逐渐变小并终止于开口，所述开口被相对于所述毛细管的末端同轴设置；以及

(c)鞘液储存器，流体地连通到所述电喷发射体的内部，使得导电的鞘液能够流出所述鞘液储存器，经过所述毛细管和所述电喷发射体的中间连接器件，穿过所述毛细管的末端，并且通过所述电喷发射体的末端的所述开口；

其中，所述鞘液提供所述毛细管和所述电喷发射体之间的电接触，所述鞘流接口设置用来由鞘流和所述分析物流出液混合的动电流形成纳喷射，并且，所述动电流是通过所述电喷发射体和与所述发射体的所述开口接近但非物理接触目标面之间的电势所产生。

2.根据权利要求1所述的鞘流接口，其中所述毛细管的末端是与所述发射体孔口的末端相距大约750μm至从所述发射体孔口的开口伸出大约100μm。

3.根据权利要求2所述的鞘流接口，其中所述毛细管的末端是与所述发射体孔口的末端相距大约100nm至大约750μm。

4.根据权利要求2所述的鞘流接口，其中所述毛细管的末端延伸于所述发射体孔口的末端的端点之内至延伸出所述发射体孔口的末端大约100μm。

5.根据权利要求1所述的鞘流接口，其中所述毛细管的末端的外径为大约20μm至大约75μm。

6.根据权利要求1所述的鞘流接口，其中所述末端的逐渐缩减到较小外径的部分包括长度为大约0.1mm到大约10mm的部分。

7.根据权利要求1所述的鞘流接口，其中所述鞘流接口，当与毛细区带电泳和串联质谱仪配置时，能够在不到12分钟的时间内从400femtograms的肽样品中检测出多个肽。

8.根据权利要求7所述的鞘流接口，其中所述肽包括E.coli胰蛋白酶消化物。

9.根据权利要求7所述的鞘流接口，其中所述其中所述质谱检测极限是大约1-10zeptomoles。

10.根据权利要求7所述的鞘流接口，其中所述质谱检测极限是大约1zeptomole。

11.根据权利要求1所述的鞘流接口，其中所述鞘流接口配置有毛细区带电泳装置和串联质谱仪，其中多于150种肽能够通过精确质量和时间标记从亚皮克量的复合蛋白质消化物中在不到12分钟的质谱仪时间内被鉴别出来。

12.一种分析蛋白质消化物的方法，包括将权利要求1所述的鞘流接口配置有毛细区带电泳装置，其中所述分析物通过毛细区带电泳在分离毛细管中被分离，并且施加约10kV的电势提供大约300V/cm的电场，以形成宽泛的分析物分离窗区，在此期间，分析物从所述毛细管在大约60分钟内迁移至所述接口。

13.根据权利要求12所述的方法，其中为肽分离获得平均的250,000理论板到大约350,000理论板。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述鞘流接口的分离毛细管的内径为大约5μm到大约75μm。

15.根据权利要求12所述的方法，其中喷射的总流率为大约20-200nL/minute。

16.根据权利要求12所述的方法，包括将权利要求1所述的鞘流接口配置串联质谱仪，其中所述鞘流接口被设为向质谱仪提供纳喷射进行分析，其中所述目标表面是质谱仪的输入孔口，并且其中蛋白质样品的检测下限为大约3femtograms至大约5femtograms。

17.根据权利要求16所述的方法，其中被分析肽的检测极限为大约1zeptomole。

18.根据权利要求16所述的方法，其中被分析肽的信噪比为大约260∶1到大约300∶1。

19.一种使用权利要求1所述的鞘流接口从毛细管的分析物流出液形成纳喷射的方法，包括施加电压到鞘液储存器足以驱动鞘液储存器中鞘液的电渗流，通过所述毛细管和所述电喷发射体之间的连接构件，穿过所述毛细管的末端，并且通过所述电喷发射体的末端的开口，其中所述分析物流出液在毛细管内通过电压施加到所述毛细管的注射端并由毛细区带电泳进行分离。