JP6498497B2 - シースレスｃｅ−ｍｓ用スプレーデバイスの作成方法、シースレスｃｅ−ｍｓ用スプレーデバイス、及び、シースレスｃｅ−ｍｓ装置 - Google Patents

Description

本発明は、シースレスＣＥ（キャピラリー電気泳動）−ＭＳ（質量分析）用スプレーデバイスの作成方法、シースレスＣＥ−ＭＳ用スプレーデバイス、及び、シースレスＣＥ−ＭＳ装置に係り、特に、化合物を高感度に測定することが可能なシースレスＣＥ−ＭＳ用スプレーデバイスの作成方法、例えば該作成方法によって作成されたシースレスＣＥ−ＭＳ用スプレーデバイス、及び、これを備えたシースレスＣＥ−ＭＳ装置に関する。

メタボローム測定法の一つである、キャピラリー電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）法は、様々な生体試料中のイオン性代謝物の測定に非常に有効であり、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）法や、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）法とは大部分の測定対象が重複しないため、非常に特異性の高い分析法である。

通常、ＣＥ−ＭＳにおいては、図１に示す如く、ネブライザーと呼ばれるエレクトロスプレーインターフェース（ＥＳＩ）スプレー（以下、単にスプレーと称する）１０に内蔵された、例えばステンレス製のニードル１２の先端で、キャピラリー１４の中から出てくる緩衝泳動液（以下、単に泳動液又はバッファと称する）１６にシース液１８と呼ばれる有機溶媒を含む溶液を混合し、更にその外側より、細かい液滴を生成してイオン化を促進するための、例えば窒素ガスでなるネブライザーガスを噴霧することによって、電気泳動のための電圧印加と泳動液１６中の代謝物のイオン化を行っている（特許文献１〜３参照）。このシース液１８によって安定した測定が可能になった。

しかしながら、現在のシース液１８を用いたＣＥ−ＭＳ法の大きな問題点は、他のメタボローム解析手法と比べて濃度感度（同じ濃度のサンプルを測定した際の検出感度）が劣ることである。ＣＥ−ＭＳ法で感度が低下する原因は、前述したネブライザー（１０）の先端でキャピラリー１４中から出てくる泳動液１６が、シース液１８と混合することによって、試料中の測定対象物が希釈されてしまうためである。例えば、発明者らが通常行っている測定条件において、その希釈率を計算したところ、泳動液１６の流速は５０ｎＬ／ｍｉｎであるのに対し、シース液１８の流速は１０μＬ／ｍｉｎであることから、約２００倍希釈されていることがわかった。

従って、ネブライザー（１０）先端でのシース液１８による代謝物の希釈を低減させる、もしくは、シース液１８を使わないシースレス測定法が可能になれば、ＣＥ−ＭＳでの濃度感度が最大で２００倍に上昇することが期待できる。

シースレス法はキャピラリー１４出口での希釈が無いために感度の上昇が見込める一方、シース液１８が無いために安定的なＣＥ−ＭＳ測定を行うことが難しい。これまでに大きく分けると次の３つのシースレスＣＥ−ＭＳ法が報告されている。
（１）図２に示す如く、キャピラリー１４に微小な穴を開けてキャピラリー１４に電極２２を直接埋め込み、接着剤２４で固定して電気泳動を行う方法（非特許文献１）。
（２）図３に示す如く、キャピラリー１４の出口に導電性金属（例えば金など）２６を蒸着させて電気泳動を行う方法（非特許文献２）。
（３）キャピラリーの途中に泳動液リザーバーを設けて通常の電気泳動を行いながら、泳動液中の化合物を電気浸透流（電圧を印加した際に自然発生する液流）ＥＯＦを利用してオフラインで泳動させる方法（非特許文献３）。

特開２００１−８３１１９号公報 特許第３３４１７６５号公報 特許第４３８５１７１号公報

Cao, P and Moini M,"A Novel Sheathless Interface for Capillary Electrophoresis / Electrospray Ionization Mass Spectrometry Using an In-capillary Electrode", J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8, 561-564, 1997. Kele Z., Ferenc G., Klement E., Toth GK., Janaky T.,"Design and performance of a sheathless capillary electrophoresis/mass spectrometry interface by combining fused-silica capillaries with gold-coated nanoelectrospray tips", Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 881-885, 2005. Shi LH., Jin YX., Moon DC., Kim SK. and Park SR."A sheathless CE/ESI-MS interface with an ionophore membrane-packed electro-conduction channel", Electrophoresis 30, 1661-1669, 2009. Faserl K., Sarg B., Kremser L. and Lindner H."Optimization and Evaluation of a Sheathless Capillary Electrophoresis-Electrospray Ionization Mass Spectrometry Platform for Peptide Analysis: Comparison to Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry", Anal. Chem. 83, 7297-7305, 2011. Whang C-W and Chen I-C. Cellulose acetate-coated porous polymer joint for capillary zone electrophoresis. Anal. Chem., 64 (1992), 2461-2464. Soga, T., Ohashi, Y., Ueno, Y., Naraoka, H., Tomita, M., and Nishioka, T.,"Quantitative Metabolome Analysis Using Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry", J. Proteome Res. 2, 488-494, 2003. Soga, T., Baran, R., Suematsu M., Ueno, Y., Ikeda, S., Sakurakawa T., Kakazu, Y., Ishikawa, T., Robert, M., Nishioka, T., Tomita, M.,"Differential Metabolomics Reveals Ophthalmic Acid As An Oxidative Stress Biomarker Indicating Hepatic Glutathione Consumption", J. Biol. Chem. 281, 16768-16776, 2006.

しかしながら、（１）や（２）の方法は、電極における電気分解により発生する酸素や水素によってスプレーが安定せず、うまく測定が行うことができない。

一方、（３）の方法については、エービーサイエックス社でＣＥＳＩ−ＭＳという製品名称で市販されているものが存在する。

このインターフェイスは、図４に示す如く、内径３０μｍ、外径１５０μｍのキャピラリー１４の先端約３ｃｍをフッ酸により化学処理し、ガラス厚を約５μｍまで薄くすることにより多孔質の先端１５として、泳動液１６中のイオンの透過を可能とし、電気泳動を達成している。図４において、２０は導電性液体でなる泳動液供給用の泳動液キャピラリーである。多孔質の先端１５を透過できるのは水素イオンや水酸化物イオンに限定され、試料中の代謝物イオンなどは透過せずにそのままキャピラリー１４出口まで運ばれ検出される。これによって、シースレスＣＥ−ＭＳを可能にしている（非特許文献４）。

しかしながら、この装置は非常に高価であり、また使用できるキャピラリーのラインアップも現在のところは内径３０μｍのみであるという問題点を有していた。

一方、非特許文献５には、ＣＺＥ（キャピラリー電気泳動）用キャピラリーにクラックを作成して、ＣＥにおける電気化学検出を行うことが記載されているが、ＣＥ−ＭＳへの適用は考えられていなかった。

本発明は、前記従来の問題点を解決するべくなされたもので、より安価且つ簡便な手順で作成でき、様々な内径のキャピラリーに対応可能なスプレーデバイスを提供することを課題とする。

本発明は、シースレスＣＥ−ＭＳ用スプレーデバイスの作成方法において、キャピラリーの先端を鋭角に加工するステップと、可撓性を有する絶縁板に、泳動液が通過可能な泳動液通過孔を開けるステップと、前記泳動液通過孔を覆うように電気透析膜を接着するステップと、該電気透析膜の上側の前記泳動液通過孔以外の部分の絶縁板に、キャピラリーを隙間のないように接着固定するステップと、前記泳動液通過孔以外の部分が絶縁板に完全に固定されたキャピラリーの前記泳動液通過孔の部分にクラックを形成するステップと、キャピラリーを絶縁板に完全に接着固定するステップと、絶縁板のキャピラリー非固定側面に、泳動液を入れるためのリザーバーを設置するステップと、該リザーバーの上部に、電極を挿入するための電極挿入孔を開けるステップと、前記電極挿入孔に電極を挿入して固定するステップと、を有することにより、前記課題を解決したものである。

ここで、前記クラックを形成するステップは、キャピラリーの前記泳動液通過孔の部分の表面にカッターで傷を付けるステップと、絶縁板を撓ませることによりキャピラリーを曲げて、前記泳動液通過孔の部分にクラックを形成するステップと、を有することができる。

本発明は、又、先端が鋭角に加工され、中間部にクラックが形成されたキャピラリーと、該キャピラリーが接着固定される、前記クラックが形成された部分に、泳動液が通過可能な泳動液通過孔が形成された絶縁板と、該絶縁板の泳動液通過孔上に接着された電気透析膜と、前記絶縁板のキャピラリー非固定側面に設置された、泳動液を入れるためのリザーバーと、該リザーバーの上部に挿入・固定された電極と、を備えたことを特徴とするシースレスＣＥ−ＭＳ用スプレーデバイスを提供するものである。

本発明は、又、前記のスプレーデバイスを備えたことを特徴とするシースレスＣＥ−ＭＳ装置を提供するものである。

本発明の特徴は、キャピラリーの微細孔作成技術と電気透析膜を組み合わせた新規なシースレスＣＥ−ＭＳ用スプレーデバイスの作成方法にある。基本原理は、［背景技術］（３）のキャピラリーの途中に泳動液リザーバーを設けて通常の電気泳動を行いながら、泳動液中の化合物を電気浸透流ＥＯＦを利用してオフラインで泳動させる方法を応用したものである。

分析に用いるキャピラリーは内径が数十μｍと非常に微細であり、これらを精度良く結合するには顕微鏡下で慎重に行う必要があり、非常に手間であったが、本発明ではキャピラリーを例えばプラスチックプレートでなる可撓性を有する絶縁板に固定した後、絶縁板を撓ませてクラック（きず）を入れることにより、特別な装置や工具を必要とすることなく、精度の高い結合を可能にしている。また、キャピラリー先端の形状もスプレーがしやすいように鋭角加工を施している。更に、分画分子量の非常に小さい（例えばカットオフ質量１００Ｄａ）電気透析膜を用いることによって、測定対象物のクラックからの漏出を最小限に抑えている。この装置を用いることにより、電気分解をスプレーヤーの先端から手前で起こして、従来のシースレスＣＥ−ＭＳで問題となっていたガスの発生によるスプレーの乱れを防ぐことが可能になる。従って、本発明によれば、特に陽イオンのメタボローム測定において、従来法に比べ数倍〜数百倍の高感度測定が可能になる。

更に、クラックより先では、対象化合物は電気浸透流のみによって移動しており、クラックからキャピラリー出口までの距離が長くなるほどピーク形状が広がる恐れがあるため、例えばクラックからキャピラリー出口までの距離を２ｃｍ以下にして、ピークの格差を最小限に抑えることが可能である。また、本発明のスプレーデバイスで用いるキャピラリーは、どのような内径のものにも適用可能であり、汎用性が高い。

従来のシースフローＣＥ−ＭＳ法で用いられているネブライザー（スプレー）の概略構成を示す断面図 従来のシースレスインターフェイスの一例のキャピラリー先端を示す断面図 同じく他の例のキャピラリー先端を示す断面図 同じく更に他の例のキャピラリー先端周辺を示す断面図 本発明の実施形態におけるスプレーデバイスの作成手順を示す流れ図 同じくキャピラリー先端を鋭角加工している状態を示す斜視図 同じく作成工程を示す斜視図 完成したスプレーデバイスを示す（Ａ）正面図、（Ｂ）底面図、（Ｃ）側面図 本発明に係る実施形態が装着されたＣＥ−ＭＳ装置の全体構成を示す概略図 作成したシースレスＣＥ−ＭＳデバイスを飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）に接続し、従来のシースフローＴＯＦＭＳとの感度比較を行った結果を示す図 同じく三連四重極型質量分析計（ＱｑＱＭＳ）に接続し、従来のシースフローＴＯＦＭＳ及び図１０に示したシースレスＴＯＦＭＳとの感度比較を行った結果を示す図

以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態及び実施例に記載した内容により限定されるものではない。又、以下に記載した実施形態及び実施例における構成要件には、当業者が容易に想定できるもの、実質的に同一のもの、いわゆる均等の範囲のものが含まれる。更に、以下に記載した実施形態及び実施例で開示した構成要素は適宜組み合わせてもよいし、適宜選択して用いてもよい。

以下、本発明に係るスプレーデバイスの作成方法を、図５を用いて説明する。

まず最初に、ステップ１００で、キャピラリー１４先端の例えばポリイミド被膜を、図６に例示する如く、例えばミニルーター（例えばＰＲＯＸＸＯＮ社製，ＭＭ３０ＧＣ，砥石１５０番）等で鋭角に加工する。この工程は、スプレーを安定的に行うために必要である。ここで、キャピラリー１４としては、一般的なフューズドシリカキャピラリーの他、例えば発明者が特許文献１で提案したコーティングキャピラリーなど、任意のキャピラリーを用いることができる。なお、キャピラリー先端を鋭角に加工する方法は、ミニルーターによる方法に限定されない。

次いで、ステップ１１０で、可撓性を有する絶縁板（例えば厚さ約２ｍｍのアクリル樹脂製のプラスチックプレート）４０に、図７（Ａ）に例示する如く、泳動液が通過可能な泳動液通過孔４２を開ける。ここで、泳動液通過孔４２の大きさは小さい方が好ましいが、小さすぎると表面張力で泳動液が入っていかなくなるので、直径２ｍｍ程度が望ましい。なお、ピペットで入れれば直径１ｍｍでも可能である。

前記絶縁板４０の種類としては、アクリル樹脂製のプラスチックプレートの他、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ＰＥＴ樹脂、ＡＳ樹脂、ＰＶＣ（塩化ビニール）など、ＣＥ−ＭＳで用いる泳動液によって変質せず、力を加えると僅かに曲がるプラスチックプレートや、超薄型フレキシブルガラス（例えばコーニング（登録商標）社のWillow Glass（登録商標））など曲げられるガラスプレートを用いることができる。

次いで、ステップ１２０で、図７（Ｂ）に例示する如く、泳動液通過孔４２を覆うように例えばイオン交換膜（例えばＨＡＲＶＡＲＤ apparatus製の酢酸セルロース膜，7427-CA100）でなる電気透析膜４４を接着する。なお、電気透析膜４４の種類はイオン交換膜に限定されない。

次いで、ステップ１３０で、図７（Ｃ）に例示する如く、絶縁板４０の泳動液通過孔４２以外の部分にキャピラリー１４を隙間が無いように接着剤４６で接着固定する。

接着剤４６が固化し、キャピラリー１４が動かなくなるまで放置した後、ステップ１４０で、例えばセラミックカッターを用いてキャピラリー１４の電気透析膜４４の直上の泳動液通過孔４２の所に傷をつける。そして、絶縁板４０の両端を持ち、絶縁板４０を僅かに撓ませることによって、キャピラリー１４に、図７（Ｄ）に例示するようなクラック（ひび）４８を形成する。

次いで、ステップ１５０に進み、図７（Ｅ）に例示する如く、絶縁板４０全体に接着剤４６を塗り、キャピラリー１４を完全に固定する。

次いで、ステップ１６０に進み、図７（Ｆ）に例示する如く、絶縁板４０を反転させ、絶縁板４０の反対側（使用時の上側）に泳動液１６を入れるためのリザーバー５０を設置する。ここで、リザーバー５０は、例えばポリプロピレンや他のプラスチック等、ＣＥ−ＭＳで用いる泳動液で変質しない任意の絶縁体製とすることができる。又、泳動液１６としては、ギ酸、酢酸、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウムなどの揮発性のあるものであれば何でも使用可能である。

次いで、ステップ１７０に進み、図７（Ｇ）に例示する如く、リザーバー５０の上部に、電極を挿入するための電極挿入孔５２を開ける。電極挿入孔５２の直径は、電極のサイズに合わせて、例えば１ｍｍ程度とすることができる。

次いで、ステップ１８０に進み、図８に示す如く、電極挿入孔５２に電極（例えば白金電極）６０を挿入してスプレーデバイスを完成する。図において、５４は、リザーバー５０を絶縁板４０に固定するための接着剤である。

前記接着剤４６、５４としては、例えばシリル化ウレタン樹脂、シアノアクリレート樹脂、ウレタン樹脂など、ＣＥ−ＭＳで用いる泳動液で変質しないものを用いることができる。

完成したスプレーデバイスを、ＣＥ７０とＭＳ８０の間に接続してシースレスＣＥ−ＭＳ装置を構成した状態を図９に示す。図において、５６はベースプレートである。

図９に示したシースレスＣＥ−ＭＳ装置を用いて測定を行った。陽イオン性代謝物質測定条件は、次のとおりである（非特許文献６、７参照）。
（ｉ）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）の分析条件
キャピラリー１４には、様々な内径のフューズドシリカキャピラリー（例えば内径５０μｍ、外径３６０μｍなど）を用いることが可能である。緩衝液１６には、１０％（ｖ／ｖ）酢酸（ｐＨ約２．２）を用いた。印加電圧は、＋３０ｋＶ、キャピラリー温度は２０℃で測定した。試料は、加圧法を用いて５０ｍｂａｒで１５秒間注入した。
（ii）飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）の分析条件
正イオンモードを用い、イオン化電圧は１．８ｋＶ、フラグメンター電圧は１７５Ｖ、スキマー電圧は５０Ｖ、ＯｃｔＲＦ電圧は１００Ｖに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度３００℃に設定した。質量電荷比（ｍ／ｚ）５０〜１，０００までの化合物を対象に、スキャン速度１．５サイクル／秒で測定を行った。
（iii）三連四重極型質量分析計（ＱｑＱＭＳ）の分析条件
正イオンモードを用い、イオン化電圧は２．４ｋＶ、フラグメンター電圧は９０Ｖに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度３００℃に設定した。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）法によって、各化合物名に最適化されたプレカーサーｍ／ｚ、プロダクトｍ／ｚ、コリジョンエネルギーにて測定を行った。

作成したシースレスＣＥ−ＭＳ装置をＴＯＦＭＳに接続し、従来のシースフローＴＯＦＭＳとの感度比較を行った結果を図１０に示す。

５３種の陽イオン性代謝物質標準溶液を測定した結果、８３％（４５／５４）の化合物で２倍以上の感度上昇が見られ、平均３．８倍の感度上昇が達成された。なお、ヒポキサンチンとスペルミジンについては感度が低下したが、これは、泳動液によりバックグランドノイズが増えたためと考えられる。従って、泳動液の種類を変えることで容易に対応できる。

又、このシースレスＣＥ−ＭＳ装置をＱｑＱＭＳに接続し、従来のシースフローＴＯＦＭＳ及び図１０に示したシースレスＴＯＦＭＳとの感度比較を行った結果を図１１に示す。この場合には、シースフローＴＯＦＭＳに比べて全ての化合物で感度が上昇し、グルタミンで７０９倍、シスタチオニンで５８０倍、Ｓ−アデノシルメチオニンで５６１倍の高感度化が達成できた。

１０…スプレー
１２…ニードル
１４…キャピラリー
１６…泳動（緩衝）液
４０…絶縁板
４２…泳動液通過孔
４４…電気透析膜
４６、５４…接着剤
４８…クラック
５０…リザーバー
５２…電極挿入孔
６０…電極

Claims (4)

1. キャピラリーの先端を鋭角に加工するステップと、
   可撓性を有する絶縁板に、泳動液が通過可能な泳動液通過孔を開けるステップと、
   前記泳動液通過孔を覆うように電気透析膜を接着するステップと、
   該電気透析膜の上側の前記泳動液通過孔以外の部分の絶縁板に、キャピラリーを隙間のないように接着固定するステップと、
   前記泳動液通過孔以外の部分が絶縁板に完全に固定されたキャピラリーの前記泳動液通過孔の部分にクラックを形成するステップと、
   キャピラリーを絶縁板に完全に接着固定するステップと、
   絶縁板のキャピラリー非固定側面に、泳動液を入れるためのリザーバーを設置するステップと、
   該リザーバーの上部に、電極を挿入するための電極挿入孔を開けるステップと、
   前記電極挿入孔に電極を挿入して固定するステップと、
   を有することを特徴とするシースレスＣＥ−ＭＳ用スプレーデバイスの作成方法。
2. 前記クラックを形成するステップが、
   キャピラリーの前記泳動液通過孔の部分の表面にカッターで傷を付けるステップと、
   絶縁板を撓ませることによりキャピラリーを曲げて、前記泳動液通過孔の部分にクラックを形成するステップと、
   を有することを特徴とする請求項１に記載のシースレスＣＥ−ＭＳ用スプレーデバイスの作成方法。
3. 先端が鋭角に加工され、中間部にクラックが形成されたキャピラリーと、
   該キャピラリーが接着固定される、前記クラックが形成された部分に、泳動液が通過可能な泳動液通過孔が形成された絶縁板と、
   該絶縁板の泳動液通過孔上に接着された電気透析膜と、
   前記絶縁板のキャピラリー非固定側面に設置された、泳動液を入れるためのリザーバーと、
   該リザーバーの上部に挿入・固定された電極と、
   を備えたことを特徴とするシースレスＣＥ−ＭＳ用スプレーデバイス。
4. 請求項３に記載のスプレーデバイスを備えたことを特徴とするシースレスＣＥ−ＭＳ装置。