CN105712967B - 从茅岩莓叶中提取二氢杨梅素和黄杉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从茅岩莓叶中提取二氢杨梅素和黄杉素的方法，干燥过后的茅岩莓经用醇提、过滤、脱色后用树脂吸附、乙醇洗脱，结晶分别制得芦丁、二氢杨梅素和黄杉素纯品。该方法大大提高了矛岩霉的利用效率，提高矛岩霉的附加值，完全缓解了市场对矛岩霉的大量需求。本发明方法操作简单，极大的降低了二氢杨梅素和黄杉素的生产成本，简化了生产过程。

Description

从茅岩莓叶中提取二氢杨梅素和黄杉素的方法

所属技术领域

本发明涉及一种将茅岩莓叶中提取二氢杨梅素和黄杉素的方法，属于天然产物提取技术领域。

背景技术

茅岩莓又名土家甘露、土家神茶、观音草等。其有效成分主要是二氢杨梅素、黄酮，同时含有亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等人体必需的17种氨基酸和钾、钙、铁、锌、硒等14种微量元素，其中黄酮最高检测含量为9.31％，是目前发现的所有植物中黄酮含量最高的，被称植物中的“黄酮之王”。

黄酮广泛存在于植物中，是许多中草药的有效成分，具有杀菌抗炎、清热解毒、镇痛消肿、降脂降压、润喉止咳、提高人体免疫力等功能。对金黄葡萄球菌、甲、乙型链球菌、肺炎双球菌、流感杆菌等有很强的杀灭能力，能排出人体的有害酸酞和酮体，消除血液里的血垢，调节血脂、血压、软化血管、调节肾功能，加强肾小管的重吸收；特别是治疗上呼吸道感染、急慢性咽炎、支气管炎效果明显。黄酮在人体内代谢快，不蓄积，且人体自身不能合成，所以我们需要经常补充。茅岩莓茶就是采用这种纯天然野生植物茅岩莓，采用土家传统制茶方法结合现代科学制茶工艺精制加工而成。具有消炎杀菌、降血脂、软化血管、抑制血小板聚集、抗血栓、抗肿瘤、调节肠胃、对神经系统疾病效果明显。

茅岩莓具有三降、三抗、三调节等作用。降血粘：抑制血小板聚集，降低血浆纤维蛋白原浓度，增强红细胞变形能力而起降血粘度的作用。降血压：通过扩张大、小动脉及在根本上软化血管而起到降压作用。降血糖：促使组织细胞强力利用血糖，活化胰脏功能，促进胰岛细胞分泌。抗血栓：溶栓、预防血栓形成。抗肿瘤：诱导肿瘤细胞凋亡，抑制癌细胞生长，中和致癌物质。抗衰老：捕捉自由基，防止自由基对脑、心肌和血管内皮细胞的氧化损伤。调节血脂：降低甘油三酯、胆固醇，升高高密度脂蛋白。降血压、降血粘度。调节免疫：活化免疫细胞，提高抗病能力。调节肠胃：杀灭胃肠道幽门螺旋杆菌，抑制胃肠道菌群失调。杀灭病菌，抗感染，防止胃肠炎、盱炎。

双氢槲皮素又称黄杉素、毒叶素、花旗松素，是一类黄酮类化合物。无色针状结晶(50％乙醇)，熔点240-240℃，易溶于乙醇、乙酸、沸水，稍溶于冷水，几乎不溶于苯，存在于杨梅科植物杨梅的树皮和茅岩莓叶片中，具有抗菌、抗癌等作用。

二氢杨梅素，主要存在于茅岩莓叶片，茅岩莓是葡萄科蛇葡萄属的一种野生木质藤本植物，其中主要活性成分为黄酮类化合物，此类物质具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎等多种奇特功效；而二氢杨梅素是较为特殊的一种黄酮类化合物，除具有黄酮类化合物的一般特性外，还具有解除醇中毒、预防酒精肝、脂肪肝、抑制肝细胞恶化、降低肝癌的发病率等作用。是保肝护肝，解酒醒酒的良品。它为白色针状结晶(乙醇)，易溶于热水，热乙醇及丙酮，溶于乙醇、甲醇，极微溶于醋酸乙酯，不溶于氯仿、石油醚。Microherb研究表明二氢杨梅素热稳定性较好，但随着温度的升高大于100℃二氢杨梅素会发生不可逆的氧化反应。二氢杨梅素在中性和偏酸性条件下稳定。

公开号为CN1288892的中国专利公开了一种从葡萄科植物中提取二氢杨梅素的方法,包括通过各种溶剂(水和/或有机溶剂)煎煮葡萄科植物,煎煮一次或多次,煎煮液经过滤,浓缩,再用热水溶解,乘热过滤,滤液直接用色谱分离；或者用超声提取,合并滤液,蒸出溶剂,再用热水溶解,乘热过滤,滤液直接用色谱分离,得二氢杨梅素晶体。本发明还涉及二氢杨梅素在制备治疗肝炎,保肝护肝,抗菌消炎和增强免疫系统免疫力的药物和保健品中的用途。

公开号为CN1810798的中国专利公开了一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将藤茶干叶在溶剂中浸泡；(2)过滤，将湿藤茶叶进行微波辐射处理；(3)将滤液与经过微波辐射的藤茶叶合并，水浴加热提取；(4)趁热过滤，滤液结晶分离。

公开号为CN101805321A的中国专利公开了一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法，采用下述步骤：(1)称取藤茶干叶，用微波炉进行微波辐射处理后，粉碎；(2)将上述颗粒加入到微波逆流提取设备中，再加入水，微波提取后过滤，得滤液A，滤渣A；(3)将滤渣A以步骤(2)的方法进行处理，得滤液B，滤渣B；(4)合并滤渣A和滤渣B，加入到微波逆流提取设备中，再加入乙醇，微波提取30-60分钟后过滤，得滤液C；(5)合并滤液A、滤液B及滤液C，浓缩，结晶，干燥。

公开号为CN103833715A的中国专利公开了一种发酵提取茅岩莓茶中二氢杨梅素的方法，包括以下步骤：将茅岩莓茶叶粉碎并回流提取，将滤液浓缩处理后静置得到茶汁；在茶汁中添加蔗糖并灭菌；将酿酒活性干酵母与蔗糖溶液混合，恒温水浴使酿酒活性干酵母活化后接入灭菌后的茶汁中；将接种后的茶汁放入摇床中发酵；浓缩后得到浸膏，干燥后得到二氢杨梅素粗粉重结晶后得到纯的二氢杨梅素。本发明利用液体发酵法提取茅岩莓茶中的二氢杨梅素，可以消耗茅岩莓水提取液中的糖分、蛋白质等营养物质，从而降低了热水提取液浓缩后的黏度，使二氢杨梅素能快速的沉降下来，有效的利用了茅岩莓茶叶资源，提高二氢杨梅素的产率。

公开号为CN103554076A的中国专利公开了一种快速提取显齿蛇葡萄叶中高纯度二氢杨梅素的方法，其操作步骤如下：(1)粉碎：干叶，粉碎至10～20目；(2)浸洗：放入水中，料液质量体积比为1:100(g/mL)，常温浸泡6小时；(3)提取：重新加水，以1:25(g/mL)料液质量体积比，95℃提取60分钟，并趁热分离提取液；(4)结晶：室温或制冷冷却提取液，于4-10℃促进结晶，过滤获得粗品；(5)重结晶：加沸水至粗品全部溶解，重结晶，滤母液，获得产品。所述的操作步骤(1)，原材料若为鲜叶，则须剪碎至1-2mm，操作步骤(2)的浸洗料液为1:80(g/mL)。本发明一次浸洗、一次提取、一次重结晶即能满足较高纯度二氢杨梅素产品的快速制备要求。

公开号为CN103467427A 8的中国专利公开了一种在40-60℃的相对低温下综合提取藤茶中二氢杨梅素和多糖的方法。藤茶茎叶干燥后粉碎过筛，以水为溶剂，一定温度和超声功率下处理一定时间，自然冷却后4℃下静置12-24h使二氢杨梅素结晶沉淀，料液混合物离心，得到的上清液浓缩、乙醇沉淀、洗涤干燥后得藤茶粗多糖；离心后的残渣加沸水搅拌并保温约10min使结晶的二氢杨梅素复溶，然后立即离心，上清液冷却后在4℃下静置12-24h使二氢杨梅素结晶。离心、沉淀干燥后得二氢杨梅素粗提物。

公开号为CN102875510A的中国专利公开了一种从显齿蛇葡萄中提取高含量二氢杨梅素的工艺方法，将显齿蛇葡萄500Kg，粉碎至20目后投入提取罐中，用去离子水于90℃状态下提取3次，每次均加入2500Kg的去离子水，提取时间分别为1h、1h、1h，每次过滤后的滤渣进入下一次提取；将3次显齿蛇葡萄提取液浓缩至原料重0.5倍重量，即250kg；将浓缩液放出，自然冷却至室温20-25℃；在此温度下保持24h静置时间；将冷却静置后的浓缩液，三足离心机过滤，收集固体称重128kg(其中水分含量为25％)，将固体用90％以上食用乙醇溶解，溶剂用量为过滤得固体重量的5倍量即640kg，常温溶解搅拌溶解1h，过滤，采用压滤或真空抽滤都可以；在溶剂溶解过滤后的液体中加入固体重量20％即25.6kg弱酸性pH＝5-6活性炭，搅拌脱色30min；将脱色完的液体用快速滤纸压滤或真空抽滤，将滤液真空浓缩至无醇味；脱色液浓缩好后，加入固体重量2倍的去离子水即256kg去离子水，煮沸溶解完全，放出，自然冷却至室温20-25℃结晶24h；结晶完后，采用三足离心机过滤结晶，结晶过滤完后得78kg结晶湿品(其中含水量23％)，用4倍结晶重量即312kg的去离子水煮沸溶解完全，放出，自然冷却至室温20-25℃结晶24h；真空干燥,用三足离心机将重结晶过滤，滤完后用少量即40-50kg去离子水淋洗，滤干，真空干燥，真空度保持-0.08，温度保持60℃，干燥16h，得98％二氢杨梅素48kg，性状为白色针状结晶。

公开号为CN102584766A的中国专利公开了一种从蛇葡萄属植物中同时分离二氢杨梅素和杨梅素的方法，样品干燥粗碎(20-40目)，两次沸水提取，合并提取液，趁热抽滤，滤液在0-4℃静置析出白色沉淀，抽滤或离心，滤沉淀用无水乙醇溶解，静置抽滤，滤液减压浓缩得浓稠液，挥干乙醇，控温干燥，得总黄酮。用丙酮回流提取总黄酮，提取液浓缩得粗二氢杨梅素，用乙醇-水(1:1)回流提取不溶性残渣，提取液浓缩得粗杨梅素1。用水重结晶纯化二氢杨梅素(重结晶次数≥3)时，通过加热(温度为85-95℃)过滤，滤液为黄色透明溶液，滤纸上有大量黄绿色物质(杨梅素2)，将其收集干燥得杨梅素2。经HPLC检测，杨梅素2纯度87.37％，二氢杨梅素(白色针晶)纯度为89.87％。

综上所述，针对茅岩莓提取二氢杨梅素文献资料很多，但嫩茎叶中总黄酮含量高达38.965％，其中DMY含量高达10.598％以上，因此在提取二氢杨梅素过程中，其它活性成份未能得到很好的利用。

发明内容

本发明采用的技术方案包括：干燥过后的茅岩莓经用醇提、过滤、脱色后用树脂吸附、乙醇洗脱，结晶分别制得二氢杨梅素和黄杉素纯品。

因此，本发明提供一种从茅岩莓叶中提取二氢杨梅素和黄杉素的方法，步骤包括：

(1)粉碎干燥矛岩霉，并将茅岩莓、85％～95％乙醇水溶液按重量kg/体积比L为1:5～15进行混合，在30℃～45℃加热回流提取；

(2)过滤除渣后，减压浓缩至原有体积的1/5～1/15,得浓缩液；

(3)将浓缩液用两到四倍体积的石油醚进行萃取，去除含石油醚部分，得到不含石油醚部分的萃取液；

(4)将不含石油醚部分的萃取液上大孔吸附树脂柱，先用一倍体积的10％乙醇水溶液进行冲洗后；

(5)用两倍至四倍柱体积的20％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到洗脱液A；

(6)再用两倍至四倍柱体积的pH5，40％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到洗脱液B；

(7)最后用两倍至五倍柱体积的pH6，70％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到洗脱液C；

(8)将洗脱液A减压浓缩到原有体积的1/2～1/4后，在室温过夜结晶和重结晶，过滤得芦丁纯品。

(9)将洗脱液B减压浓缩到原有体积的1/3～1/5后用0.001mol/L氢氧化钠调节pH6.0-6.5，再加入乙醇至终浓度为53％，在0～4℃下过夜结晶和重结晶，过滤得黄杉素纯品。

(10)将洗脱液C减压浓缩到原有体积的1/4～1/6后在0～4℃下过夜结晶和重结晶，过滤得二氢杨梅素纯品。

上述减压浓缩一般都在35～55℃下进行真空泵抽气造成的负压浓缩。

上述过滤是陶瓷膜过，其中，优选是陶瓷膜过滤1次。

在一个实施方案中，步骤(1)中所述的乙醇溶液是用0.01mol/L乙酸或0.001mol/L盐酸将85％～95％乙醇水溶液调节至pH5.0-5.5，％是指乙醇体积L与水体积L比。

在一个实施方案中，步骤(4)中为大孔吸附树脂，优选是HP-20、D101和AB-8。

在一个实施方案中，步骤(5)中所述20％乙醇水溶液的配制，用80mL的水与20mL的乙醇进行混合制成。

在一个实施方案中，步骤(6)中所述pH5，40％乙醇水溶液的配制，用60mL pH5的水与40mL的乙醇进行混合制成。

在一个实施方案中，步骤(7)中所述pH6，70％乙醇水溶液的配制，用30mL pH6的水与70mL的乙醇进行混合制成。

技术效果：

1、该方法大大提高了矛岩霉的利用效率，提高矛岩霉的附加值，完全缓解了市场对矛岩霉的大量需求。

2、本发明方法操作简单，极大的降低了二氢杨梅素和黄杉素的生产成本，简化了生产过程。

3、本发明所用的试剂均为无毒、廉价、量产的化学试剂，整个过程中可利用成熟的试剂回收常规技术，这极大地降低了向环境排放废弃物。

具体实施方式

下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

实施例1

粉碎干燥矛岩霉100kg，加入700L的pH5.5、90％乙醇水溶液(用盐酸调节)进行混合，在35℃左右加热回流提取。提取液经陶瓷膜过滤1次除渣后，在40℃下减压浓缩,得50L浓缩液。将浓缩液用150L的石油醚进行萃取，去除含石油醚部分，得到不含石油醚部分的萃取液48L。将萃取液上AB-8大孔吸附树脂柱，先用一倍体积的10％乙醇水溶液进行冲洗后，用三倍柱体积的20％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到15L洗脱液A；再用四倍柱体积的pH5，40％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到20L洗脱液B；最后用五倍柱体积的pH6，70％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到25L洗脱液C。将洗脱液A在50℃下减压浓缩到5L后，在室温下过夜结晶和重结晶，陶瓷膜过滤1次得0.798kg芦丁纯品。将洗脱液B在45℃下减压浓缩到5L后用0.001mol/L氢氧化钠调节pH6.0-6.5，再加入乙醇至终浓度为53％，在0～4℃下过夜结晶和重结晶，陶瓷膜过滤1次得0.885kg黄杉素纯品。将洗脱液C在45℃下减压浓缩到5L后在0～4℃下过夜结晶和重结晶，陶瓷膜过滤1次得2.451kg二氢杨梅素纯品。经HPLC法进行检测，所得各个样品中芦丁的含量为97.45％，黄杉素的含量为98.26％，二氢杨梅素的含量为98.54％。

实施例2

粉碎干燥矛岩霉200kg，加入1000L的pH5.3、92％乙醇水溶液(用盐酸调节)进行混合，在40℃左右加热回流提取。提取液经陶瓷膜过滤1次除渣后，在40℃下减压浓缩,90L浓缩液。将浓缩液用200L的石油醚进行萃取，去除含石油醚部分，得到不含石油醚部分的萃取液。将萃取液上AB-8大孔吸附树脂柱，先用一倍体积的10％乙醇水溶液进行冲洗后，用四倍柱体积的20％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到40L洗脱液A；再用四倍柱体积的pH5，40％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到40L洗脱液B；最后用五倍柱体积的pH6，70％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到50L洗脱液C。将洗脱液A在45℃下减压浓缩到20L后，在室温下过夜结晶和重结晶，陶瓷膜过滤1次得1.523kg芦丁纯品。将洗脱液B在45℃下减压浓缩到8L后用0.001mol/L氢氧化钠调节pH6.0-6.5，再加入乙醇至终浓度为53％，在0～4℃下过夜结晶和重结晶，陶瓷膜过滤1次得1.784kg黄杉素纯品。将洗脱液C在45℃下减压浓缩到原有体积的9L后在0～4℃下过夜结晶和重结晶，陶瓷膜过滤1次得4.962kg二氢杨梅素纯品。经HPLC法进行检测，所得各个样品中芦丁的含量为98.26％，黄杉素的含量为98.31％，二氢杨梅素的含量为98.73％。

实施例3

粉碎干燥矛岩霉400kg，加入2000L的pH5.2、93％乙醇水溶液(用盐酸调节)进行混合，在35℃左右加热回流提取。提取液经陶瓷膜过滤1次除渣后，在40℃下减压浓缩,得150L浓缩液。将浓缩液用350L的石油醚进行萃取，去除含石油醚部分，得到不含石油醚部分的萃取液145L。将萃取液上D101大孔吸附树脂柱，先用一倍体积的10％乙醇水溶液进行冲洗后，用两倍柱体积的20％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到36L洗脱液A；再用四倍柱体积的pH5，40％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到72L洗脱液B；最后用五倍柱体积的pH6，70％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到90L洗脱液C。将洗脱液A在45℃下减压浓缩到9L后，在室温下过夜结晶和重结晶，陶瓷膜过滤1次得3.243kg芦丁纯品。将洗脱液B在45℃下减压浓缩到15L后用0.001mol/L氢氧化钠调节pH6.0-6.5，再加入乙醇至终浓度为53％，在0～4℃下过夜结晶和重结晶，陶瓷膜过滤1次得3.568kg黄杉素纯品。将洗脱液C在45℃下减压浓缩到17L后在0～4℃下过夜结晶和重结晶，陶瓷膜过滤1次得9.745kg二氢杨梅素纯品。经HPLC法进行检测，所得各个样品中芦丁的含量为98.21％，黄杉素的含量为98.77％，二氢杨梅素的含量为99.02％。

Claims (1)

1.一种从茅岩莓叶中提取二氢杨梅素和黄杉素的方法，步骤包括：

(1)粉碎干燥茅岩莓 ，并将茅岩莓、85％～95％乙醇水溶液按重量kg/体积比L为1:5～15进行混合，在30℃～45℃加热回流提取，其中所述乙醇溶液是用0.01mol/L乙酸或0.001mol/L盐酸将85％～95％乙醇水溶液调节至pH5.0-5.5；

(2)过滤除渣后，减压浓缩至原有体积的1/5～1/15,得浓缩液；

(3)将浓缩液用两到四倍体积的石油醚进行萃取，去除含石油醚部分，得到不含石油醚部分的萃取液；

(4)将不含石油醚部分的萃取液上大孔吸附树脂柱，先用一倍体积的10％乙醇水溶液进行冲洗后，其中所述大孔吸附树脂为HP-20、D101和AB-8；

(5)用两倍至四倍柱体积的20％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到洗脱液A；

(6)再用两倍至四倍柱体积的pH5，40％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到洗脱液B；

(7)最后用两倍至五倍柱体积的pH6，70％乙醇水溶液进行洗脱并收集得到洗脱液C；

(8)将洗脱液A减压浓缩到原有体积的1/2～1/4后，在室温过夜结晶和重结晶，过滤得芦丁纯品；

(9)将洗脱液B减压浓缩到原有体积的1/3～1/5后用0.001mol/L氢氧化钠调节pH6.0-6.5，再加入乙醇至终浓度为53％，在0～4℃下过夜结晶和重结晶，过滤得黄杉素纯品。

(10)将洗脱液C减压浓缩到原有体积的1/4～1/6后在0～4℃下过夜结晶和重结晶，过滤得二氢杨梅素纯品。