CN105664173A

CN105664173A - 透膜短肽-苦参碱及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN105664173A
Application number: CN201610064925.1A
Authority: CN
Inventors: 姚庆强; 孙学英; 牟艳玲; 齐放; 路国梁
Original assignee: Jinan Trio Pharmatech Co ltd; INSTITUTE OF MATERIA MEDICA SHANDONG ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES
Current assignee: Jinan Trio Pharmatech Co ltd; INSTITUTE OF MATERIA MEDICA SHANDONG ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2036-01-29
Also published as: CN105664173B

Abstract

本发明公开了一种靶向作用于上皮来源恶性肿瘤的抗肿瘤药物——透膜短肽-苦参碱抗肿瘤药物，是利用苦参碱衍生物活性酯，在碱性条件下，与透膜七氨基酸短肽进行反应所制得的。本发明的透膜短肽-苦参碱，保留了苦参碱的抗癌效果和短肽的透膜和靶向性，可以靶向性作用于上皮来源的恶性肿瘤，尤其是肝癌。本发明的透膜短肽-苦参碱，与目前临床应用的苦参碱相比较，具有明显肝癌细胞靶向性，可以快速穿透肝癌细胞膜，抑制肝癌细胞的增殖，诱导肝癌细胞的凋亡。

Description

透膜短肽-苦参碱及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种具有靶向作用(靶向作用于上皮来源恶性肿瘤)的抗肿瘤药物——透膜短肽-苦参碱，及其制备方法与应用，属于抗肿瘤药物技术领域。

背景技术

苦参碱是一种从由豆科植物苦参提取的一种生物碱(Zhang,Chengetal.2014)，分子式：C₁₅H₂₄N₂O；分子量：248.3674；CAS号：519-02-8；其化学名为(41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶；其结构如下：

苦参碱注射液具有抑制乙型肝炎病毒复制，改善病理性肝炎症状与体征的作用，毒副作用小，已经被应用于临床慢性肝炎、肝硬化的治疗(Zhang,Wangetal.2011)。近几年来，研究显示苦参碱具有抗癌效果，已经用于肝癌的治疗。苦参碱可以抑制多种癌症细胞包括乳腺癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病等的增殖、诱导细胞凋亡和抑制细胞自噬，其分子作用机理为抑制MAPK和VEGF-AKT信号通路(Li,Tanetal.2010,Liu,Xuetal.2014,Niu,Zhangetal.2014,Ren,Zhangetal.2014,Qian,Liuetal.2015,Wang,Jinetal.2015)。更为重要的是对正常细胞没有毒性，而且可以降低癌症病人的恶病质，改善病人的生活质量(Liu,Xuetal.2014)。然而，苦参碱没有显著的细胞靶向性和特异性，在给病人输注过程中，容易被血液细胞吞噬而失效，造成到达病灶的有效药物浓度大大降低，制约了其抗癌药效的发挥。

全球肝癌发病率近年呈逐年增长趋势，每年新发病例超过60万。我国肝癌新发病例数占全球55％。肝癌患者预后差，缺乏有效药物(Torre,Brayetal.2015)。研发有效的药物靶向肝脏输送技术将会大大增强肝癌治疗中药的效果。

靶向治疗药物的研究一直是新药研发的热点，除抗体药物和小分子激酶抑制剂等的药物研究外，特异性药物靶向输送载体的研究是近年热点。目前国外研究较多的短肽药物载体包括Tat肽(TATP)、Xentry、寡聚精氨酸、MPG肽、PEP和VP22，但只有Xentry具有亲肝特性。其结构如下：

Xentry是由乙肝病毒X蛋白氨基酸序列中提取出的7氨基酸短肽(Montrose,Yangetal.2013)。由结构可知Xentry是由亮氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、缬氨酸和甘氨酸七个氨基酸组成的七肽，分子式：C₃₃H₆₀N₁₀O₈S，分子量：757.0，化学名为：亮氨酰-半胱氨酰-亮氨酰-精氨酰-脯氨酰-缬氨酰-甘氨酸(即合成过程中用到的SM2)。其可携带多种药物，包括天然化合物如中药单体；利用在上皮类细胞膜syndecan-4蛋白作为传输通道，避免在药物输送过程中被非上皮类细胞如血液细胞摄取而丢失；具有快速穿透上皮类细胞膜，进入细胞浆和细胞核的功能(Montrose,Yangetal.2013)。Xentry已经由本发明的发明人在2013年4月30日申报PCT国际专利(专利号WO/2013/165262)。作为源于乙肝病毒X蛋白的短肽片段，Xentry可携带多种药物包括中药单体进入肝癌细胞，达到药物靶向肝脏输送的目的。除用于肝癌治疗外，可以携带抗病毒药物，靶向治疗肝炎、肝硬化。此外，还可以携带其他抗肿瘤药物，用于其它源于上皮类细胞的恶性肿瘤包括我国最常见的肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌等多种癌症的治疗。

发明内容

针对上述现有技术，基于中药单体苦参碱和上皮依赖性透膜短肽，本发明合成了一种新型靶向作用于上皮来源恶性肿瘤的透膜短肽-苦参碱抗肿瘤药物，这种药物可以特异性靶向作用于上皮来源的恶性肿瘤，包括我国最常见恶性肿瘤(肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和结直肠癌等)。

本发明是通过以下技术方案实现的：

透膜短肽-苦参碱，其结构式如下：

Y＝O,NH

上述结构式中，L基团选自R基酰胺、R基酯、R基胺、R基醚或R基(优选R基酯)；R为C1～C9脂肪烃基团或芳香基团；m为1～9中的正整数；n为1～6中的正整数(通过改变L基团的结构，可改变化合物溶解性、稳定性和透膜短肽-苦参碱在进入细胞后放出苦参碱的难易，从而达到最佳治疗效果；本发明具体实施例中制备的透膜短肽-苦参碱为治疗效果最佳的化合物)。

所述透膜短肽-苦参碱的制备方法，如下：将透膜七氨基酸短肽(以下简称短肽)溶于溶剂中，20℃下加入碱和苦参碱衍生物活性酯，加完后此温度下搅拌反应90～150分钟；减压浓缩除去溶剂，得到粗品，经液相分离纯化(以水/乙腈/三氟乙酸作为流动相，固定相为C18硅胶)得到白色固体，即为透膜短肽-苦参碱。

所述溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈中的任一种。

所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、N，N-二异丙基乙胺、三乙胺中的任一种。

所述苦参碱衍生物活性酯与短肽的摩尔比为1.8～2.4：1。

进一步地，所述透膜短肽-苦参碱的制备方法如下：

(1)与水加成：

(41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11-烯(俗名：槐果碱，即SM1)在碱性条件下与水发生加成反应得到TM1，即：SM1在水(溶剂原料比为25毫升/克)中加入过量的氢氧化钾10～15当量(优选12当量)，反应温度100℃，反应时间6～10小时(优选8小时)，纯化得到(41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-醇(TM1)。

反应式如下：

本发明中所述“当量”数，是按照化学反应的当量关系，以每步中所用基本原料为基准(1当量)，所需要的其他原材料的当量用量(以下同)。

(2)接戊二酸：

TM1在碱性条件下与戊二酸酐发生酯化反应得到TM2，即：TM1在四氢呋喃(溶剂原料比为10毫升/克)中加入戊二酸酐1～5当量(优选1.5当量)和过量的三乙胺1～5当量(优选3当量)，反应温度20℃，反应时间20～28小时(优选24小时)，纯化得到5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-基)氧基)戊酸(TM2)。

反应式如下：

(3)合成活性酯：

TM2在碱性条件下与丁二酰亚胺碳酸酯酯化反应得到TM3，即：TM2在四氢呋喃(溶剂原料比为10毫升/克)中加入丁二酰亚胺碳酸酯1～5当量(优选2当量)和碳酸钾1～5当量(优选3当量)，反应温度20℃，反应时间16～20小时(优选18小时)，纯化得到5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-基)氧基)戊酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(TM3)。

反应式如下：

(4)接短肽：

将TM3和短肽(SM2)溶解于溶剂中，加入碱后，在室温下发生酰胺化反应得到S-(5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-基)氧基)戊酰基)-N-((5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-yl)氧基)戊酰基)-D-亮氨酰)-D-半胱胺酰-D-亮氨酰-D-精氨酰-D-脯氨酰l-D-缬氨酰甘氨酸(TP，透膜短肽-苦参碱)；

所述溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈中的任一种；溶剂的用量为10～25毫升/克SM2。

所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、N，N-二异丙基乙胺、三乙胺中的任一种；碱的用量为2～3.5当量。

所述TM3与短肽的摩尔比为1.8～2.4：1(1.8～2.4当量)。

所述酰胺化反应的反应温度为20℃，反应时间为90～150分钟，优选120分钟。

反应式如下：

由于SM2上有两个反应点，并且原料及产品的分子都比较大，活性基团较多，很容易发生副反应，此步反应是本发明的关键步骤，为了筛选和验证最佳工艺参数范围，发明人进行了大量对比试验，并一一进行分析对比，现将结果举例如下：

(1)此反应中碱的优选：使用不同的碱时，得到的反应情况也不同，如表1所示。

表1.不同种类的碱对产品收率的影响

由表1可以看出，无机碱用于上述反应的收率明显低于有机碱，这是因为在产物及原料分子中存在酰胺基和酯基，由于这类基团在碱性条件下，尤其是无机碱存在的条件下，容易发生水解反应，生成副产物，导致收率降低。而酰胺基和酯基在有机碱存在下不容易发生水解反应，所以减少了副反应的发生。N，N-二异丙基乙胺和三乙胺相比，碱性稍弱，反应更温和，减少了副反应的发生。所以反应过程中所用的碱优选为有机碱N，N-二异丙基乙胺。

(2)溶剂的优选：当使用不同的溶剂，其它试剂及用量不变的情况下，获得的产品收率不同，如表2所示。

表2.不同种类溶剂对产品收率的影响

由表2可以看出，当使用水做溶剂时，由于其极性太大，而且体系是碱性，所以酯键或酰胺键容易断裂，生成副产物，造成没有目标产物生成。以二甲基亚砜为溶剂，由于收率稍低，而且不易除去，所以未选择此溶剂。乙腈对原料的溶解性较差，所以造成反应时间长，副产物增多。所以溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺。

(3)TM3用量的优选：在其他条件不变的情况下，改变TM3的用量，也会对收率有影响，如表3所示。

表3.TM3的用量对产品收率的影响

由表3可以看出，TM3的用量越大，收率越高，当超过2.2当量时，收率不再增加，这是由于反应是2当量的TM3与1当量的SM2发生反应，所以当TM3用量不足时，SM2与TM3反应不完全，转化率低，所以收率低。增加TM3的用量可以提高SM2的转化率，当TM3的用量超过2.2当量时，已经足以使SM2完全转化，所以再增加TM3用量也没有变化。TM3的用量优选为2.2当量。

(4)N，N-二异丙基乙胺用量的优选：在其他条件不变的情况下，改变N，N-二异丙基乙胺的用量，也会对收率有影响，如表4所示。

表4.N，N-二异丙基乙胺用量对产品收率的影响

由表4可以看出，N，N-二异丙基乙胺越大，收率越高，当超过3当量时，收率的变化不明显，所以N，N-二异丙基乙胺的用量优选为3当量。

(5)溶剂用量的优化：在其他条件不变的情况下，改变溶剂N，N-二甲基甲酰胺越大的用量，也会对收率有影响，如表5所示。

表5.N，N-二甲基甲酰胺的用量对产品收率的影响

由表5可以看出，溶剂用量偏少，反应受影响，收率偏低，用量在20毫升/克时收率较高。用量提高至25毫升/克时，收率反而有下降趋势，可能是用量过高致使产品纯化回收时造成损失。

(6)对反应时间的优选：对此反应进行所需要的时间进行了优选，如表6所示。

表6.溶剂对产品收率的影响

由表6可以看出，由于反应时间越长，SM2转化越充分，所以收率越高。但是超过120分钟以后，反应已经转化完全，再延长时间，产品会发生降解，造成副产物增多，目标物减少，使收率降低。所以反应时间优选为120分钟。

通过上述优选试验对比，确认本发明所述目标物透膜短肽-苦参碱(TP)制备方法的优选工艺条件如下：TM3在碱性条件下与SM2发生酰胺化反应得到TP，即：SM2在N，N-二甲基甲酰胺中(溶剂原料比为20毫升/克)中加入TM31.8～2.4当量(优选2.2当量)和N，N-二异丙基乙胺2～3.5当量(优选3当量)，反应温度20℃，反应时间90～150分钟(优选120分钟)，纯化得到TP。

以上制备透膜短肽-苦参碱的总的化学反应式如下：

本发明利用化学方法将苦参碱和短肽通过分子结构修饰，将苦参碱接在短肽上，提高靶向性和穿透性，使其在血液中不易穿透细胞膜进入细胞而被摄取，但可以快速进入肝脏细胞，并在细胞内发生降解，生成苦参碱，发挥其抗癌的活性。因此，本发明合成的透膜短肽-苦参碱保留了苦参碱的抗癌效果和短肽的透膜和靶向性，可以靶向性作用于上皮来源的恶性肿瘤(胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌等)，尤其是肝癌。本发明的透膜短肽-苦参碱，与目前临床应用的苦参碱相比较，具有明显肝癌细胞靶向性，可以快速穿透肝癌细胞膜，抑制肝癌细胞的增殖，诱导肝癌细胞的凋亡。

附图说明

图1：TP的核磁氢谱图。

图2：TP的质谱图。

图3：透膜短肽-苦参碱快速进入肝癌细胞示意图，其中，A为孵育5分钟后，B为孵育30分钟后。

图4：肝癌细胞HepG2增殖和细胞周期阻滞示意图，其中，A：同样的摩尔浓度下，苦参碱与透膜短肽-苦参碱抑制细胞增殖的作用；B：苦参碱、透膜短肽-苦参碱处理的细胞中各期的分布。

图5：肝癌细胞HepG2凋亡示意图，其中，A：空白对照、苦参碱、透膜短肽-苦参碱处理的细胞凋亡情况；B：空白对照、苦参碱、透膜短肽-苦参碱处理的细胞凋亡情况对比；C：空白对照、苦参碱、透膜短肽-苦参碱处理的细胞凋亡照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1制备透膜短肽-苦参碱

步骤如下：

(1)(41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-醇(TM1)的合成：

在100毫升的圆底烧瓶中加入30毫升水和3.36克氢氧化钾，溶液加热到100℃，加入1.2克SM1，反应8个小时后，将体系降至室温，用二氯甲烷萃取四次，每次30毫升；合并有机相，用无水硫酸钠干燥后，除去溶剂得粗品油状物，此油状物用正己烷重结晶，得0.12克白色固体TM1，收率9％。

(2)5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-基)氧基)戊酸(TM2)的制备：

20℃下在50毫升圆底烧瓶中加入120毫克TM1和1.2毫升四氢呋喃，此温度搅拌下再依次加入138毫克三乙胺和77毫克戊二酸酐，此温度下搅拌反应24小时；将反应液浓缩后进行柱层析分离(流动相为二氯甲烷/甲醇，体积比为20/1；固定相为100～200目硅胶)，收集目标馏分，并减压旋转蒸发除去溶剂得到125毫克淡黄色油状物TM2，收率73％。

(3)5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-基)氧基)戊酸-N-羟基丁二酰亚胺酯(TM3)的合成：

在50毫升的圆底烧瓶中加入1.25毫升四氢呋喃，20℃搅拌下依次加入125毫克TM2、169毫克丁二酰亚胺碳酸酯和137毫克碳酸钾，此温度下搅拌18小时；反应液浓缩至干，加入正己烷洗涤3次，每次1毫升，干燥得80毫克淡黄色油状物TM3，收率51％。

(4)S-(5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-基)氧基)戊酰基)-N-((5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-yl)氧基)戊酰基)-D-亮氨酰)-D-半胱胺酰-D-亮氨酰-D-精氨酰-D-脯氨酰l-D-缬氨酰甘氨酸(TP)的合成：

在2毫升的反应器中加入0.7毫升N，N-二甲基甲酰胺，20℃搅拌下依次加入35毫克SM2、18毫克N，N-二异丙基乙胺和48毫克TM3，此温度下搅拌反应120分钟；在20℃下减压浓缩除去溶剂，得粗品油状物，用制备液相色谱仪进行分离纯化(流动相为水/乙腈/三氟乙酸，体积比为90/10/0.1～10/90/0.1；检测波长为214纳米；固定相为C18硅胶)，收集目标物馏分，20℃下除去有机溶剂后得水溶液，进行冻干处理，得到17毫克白色固体TP，收率24.9％。

上述制备得到的TP的核磁氢谱图如图1所示，质谱图如图2所示，核磁氢谱数据为：

¹HNMR(400MHz,d⁶-DMSO/D₂O):δppm0.61-0.88(m,18H),1.13-1.25(m,2H),1.26-2.07(m,41H),2.08-2.38(m,10H),2.52-2.69(m,3H),2.72-2.88(m,1H),2.88-3.13(m,6H),3.19-3.38(m,5H),3.41-3.56(m,3H),3.59-3.77(m,6H),4.07(d,J＝6.4Hz,1H),4.21-4.48(m,7H),4.91-5.19(m,2H).

对比例：S-(5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-基)氧基)戊酰基)-N-((5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-yl)氧基)戊酰基)-D-亮氨酰)-D-半胱胺酰-D-亮氨酰-D-精氨酰-D-脯氨酰l-D-缬氨酰甘氨酸(TP)的其它制备方法对比：

在2毫升的反应器中加入0.7毫升二甲基亚砜，20℃搅拌下依次加入35毫克SM2、14毫克三乙胺和52毫克TM3，此温度下搅拌反应135分钟；在20℃下减压浓缩除去溶剂，得粗品油状，用制备液相进行分离纯化(流动相为水/乙腈/三氟乙酸＝90/10/0.1～10/90/0.1，检测波长为214纳米)，收集目标物馏分，20℃下除去有机溶剂后得水溶液，进行冻干处理，得到11.5毫克白色固体TP，收率16.8％。

实验透膜短肽-苦参碱的细胞实验

(1)透膜短肽-苦参碱快速透膜进入肝癌细胞实验：

人肝癌细胞系HepG2常规接种于8孔培养板，每孔5×10⁶个细胞，培养于含10％胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)的DMEM(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium)培养液中。在37℃和5％CO₂条件下，孵育过夜。然后用不含有胎牛血清的培养液洗三遍，加入荧光标记的透膜短肽-苦参碱(最终浓度为10μM)。孵育5和30分钟后，用PBS冲洗，4％甲醛固定30分钟。然后在NikonE600荧光显微镜下观察细胞。

结果如图3所示，图3显示，荧光素(FITC)标记的透膜短肽-苦参碱和肝癌细胞HepG2孵育5分钟后透膜进入细胞；而30分钟后，更多的透膜短肽-苦参碱进入细胞浆和细胞核。

(2)透膜短肽-苦参碱抑制肝癌细胞增殖的实验：

将肝癌细胞HepG2接种96孔板,每孔1×10⁵个细胞，培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中。在37℃和5％CO₂条件下，孵育过夜。然后用不含有胎牛血清的培养液洗三遍，每孔加入含有不同浓度的苦参碱和透膜短肽-苦参碱(0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4μM)的培养液100微升。培养24小时后，每孔加入110微升新鲜培养液(含CCK-8溶液10微升)，轻微震荡96孔板10秒，然后放入培养箱继续孵育2小时，随后再次振摇10秒后检测比色，去除气泡；以空白对照孔为调零孔，选择450nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值)，记录结果。计算细胞增殖抑制抑制率(％)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。所有实验重复3次。同时利用流式细胞仪对0.8μM苦参碱和透膜短肽苦参碱处理的细胞进行细胞周期分布进行检测。PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。以ModFitLT3.0软件计算分析细胞周期中各期的分布，至少计数10000个细胞。

结果如图4所示，图4A显示，与苦参碱相比较，透膜短肽-苦参碱在同样的摩尔浓度下，具有更强的抑制细胞增殖的作用。图4B显示，与苦参碱(34.7％)相比较，透膜短肽-苦参碱处理的细胞有更多的细胞(67.1％)阻滞于G1期。结论：与苦参碱相比较，透膜短肽-苦参碱具有更强的抑制肝癌细胞增殖的作用。

(3)透膜短肽-苦参碱诱导肝癌细胞凋亡的实验：

肝癌细胞分别与相同摩尔浓度(0.8μM)的苦参碱以及透膜短肽-苦参碱孵育相同时间(以含10％胎牛血清的DMEM培养液孵育相同时间为空白对照)，利用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行了细胞凋亡的检测。

结果如图5所示。图5B中的细胞的一部分，利用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行了细胞凋亡的检测。取5～10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μLAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5μLAnnexinV-FITC，室温避光孵育10分钟。1000g离心5分钟，弃上清，加入190μLAnnexinV-FITC结合液和加入10μL碘化丙啶(PI)染色液，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测。同时对这些细胞进行confocal荧光显微镜观察。AnnexinV-FITC染色为绿色荧光，表示早期凋亡细胞；而PI染色为红色荧光，表示晚期凋亡细胞。

结果：图5A和图5B显示，未处理细胞中的凋亡细胞比例非常低(3.2％)；苦参碱和透膜短肽-苦参碱均可诱导肝癌细胞的凋亡。然而，与苦参碱(13.4％)相比较，透膜短肽-苦参碱(22.5％)具有更强的诱导细胞凋亡的作用。图5C显示，与苦参碱相比较，透膜短肽-苦参碱处理的肝癌细胞中有更多的凋亡细胞。结论：与苦参碱相比较，透膜短肽-苦参碱具有更强的诱导肝癌细胞凋亡的作用。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种透膜短肽-苦参碱，其结构式如下：

YR,R

Y＝O,NH

其中，m为1～9中的正整数；n为1～6中的正整数。

2.根据权利要求1所述的透膜短肽-苦参碱，其特征在于：所述L＝-OCO(CH₂)₃-。

3.权利要求1或2所述的透膜短肽-苦参碱的制备方法，其特征在于：将透膜七氨基酸短肽溶于溶剂中，室温下加入碱和苦参碱衍生物活性酯，加完后搅拌反应90～150分钟；减压浓缩除去溶剂，得到粗品，经液相分离纯化得到白色固体，即为透膜短肽-苦参碱；

所述溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈中的任一种；

所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、N，N-二异丙基乙胺、三乙胺中的任一种；

所述苦参碱衍生物活性酯与短肽的摩尔比为1.8～2.4：1。

4.根据权利要求3所述的透膜短肽-苦参碱的制备方法，其特征在于：所述苦参碱衍生物活性酯是通过以下方法制备得到的：

(1)与水加成：

(41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-11-烯在碱性条件下与水发生加成反应得到TM1，即：SM1在水中加入过量的氢氧化钾，反应温度100℃，反应时间6～10小时，纯化得到(41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-醇；

(2)接戊二酸：

TM1在碱性条件下与戊二酸酐发生酯化反应得到TM2，即：TM1在四氢呋喃中加入戊二酸酐1～5当量和过量的三乙胺，反应温度20℃，反应时间20～28小时，纯化得到5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-基)氧基)戊酸；

(3)合成活性酯：

TM2在碱性条件下与丁二酰亚胺碳酸酯酯化反应得到TM3，即：TM2在四氢呋喃中加入丁二酰亚胺碳酸酯1～5当量和碳酸钾1～5当量，反应温度20℃，反应时间16～20小时，纯化得到5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-基)氧基)戊酸-N-羟基丁二酰亚胺酯，即为苦参碱衍生物活性酯。

5.根据权利要求3或4所述的透膜短肽-苦参碱的制备方法，其特征在于：所述透膜短肽-苦参碱的制备方法为：SM2在N，N-二甲基甲酰胺中中加入TM31.8～2.4当量和N，N-二异丙基乙胺2～3.5当量，溶剂原料比为20毫升/克，反应温度20℃，反应时间90～150分钟，纯化得到TP。

6.根据权利要求5所述的透膜短肽-苦参碱的制备方法，其特征在于：SM2在N，N-二甲基甲酰胺中中加入TM32.2当量和N，N-二异丙基乙胺3当量，溶剂原料比为20毫升/克，反应温度20℃，反应时间120分钟，纯化得到TP。

7.根据权利要求3或4所述的透膜短肽-苦参碱的制备方法，其特征在于：所述透膜短肽-苦参碱的制备方法的步骤如下：

(1)(41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-醇的合成：

在100毫升的圆底烧瓶中加入30毫升水和3.36克氢氧化钾，溶液加热到100℃，加入1.2克SM1，反应8个小时后，将体系降至室温，用二氯甲烷萃取四次，每次30毫升；合并有机相，用无水硫酸钠干燥后，除去溶剂得粗品油状物，此油状物用正己烷重结晶，得白色固体TM1；

(2)5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-基)氧基)戊酸的制备：

20℃下在50毫升圆底烧瓶中加入120毫克TM1和1.2毫升四氢呋喃，此温度搅拌下再依次加入138毫克三乙胺和77毫克戊二酸酐，此温度下搅拌反应24小时；将反应液浓缩后进行柱层析分离，流动相为二氯甲烷/甲醇＝20/1，得到淡黄色油状物TM2；

(3)5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-基)氧基)戊酸-N-羟基丁二酰亚胺酯的合成：

在50毫升的圆底烧瓶中加入1.25毫升四氢呋喃，20℃搅拌下依次加入125毫克TM2、169毫克丁二酰亚胺碳酸酯和137毫克碳酸钾，此温度下搅拌18小时；反应液浓缩至干，加入正己烷洗涤3次，每次1毫升，干燥得淡黄色油状物TM3；

(4)S-(5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶并[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-基)氧基)戊酰基)-N-((5-氧代-5-(((41S,7aS,13bR)-10-氧代十二氢-1H,5H,8H-二吡啶[2,1-f:3',2',1'-ij][1,6]萘啶-12-yl)氧基)戊酰基)-D-亮氨酰)-D-半胱胺酰-D-亮氨酰-D-精氨酰-D-脯氨酰l-D-缬氨酰甘氨酸的合成：

在2毫升的反应器中加入0.7毫升N，N-二甲基甲酰胺，20℃搅拌下依次加入35毫克SM2、18毫克N，N-二异丙基乙胺和48毫克TM3，此温度下搅拌反应120分钟；在20℃下减压浓缩除去溶剂，得粗品油状物，液相分离纯化，流动相为水/乙腈/三氟乙酸＝90/10/0.1～10/90/0.1，检测波长为214纳米，收集目标物馏分，20℃下除去有机溶剂后得水溶液，进行冻干处理，得到白色固体TP。

8.权利要求1或2所述的透膜短肽-苦参碱作为有效成分在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为上皮来源的恶性肿瘤。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述恶性肿瘤选自胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌。