CN107522857A - 一种丹参酮ⅱa高分子化合物及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种式(I)、(II)、(III)所示的丹参酮IIA高分子化合物及中间体的制备及其生物活性的研究。药理实验表明本发明化合物能够明显提高丹参酮IIA的水溶性，并且保留了丹参酮IIA的抗肿瘤活性、脑缺血及心肌缺血活性。本方法制备产品纯度高，操作简便，产率高，成本低。

Description

一种丹参酮IIA高分子化合物及其制备和应用
技术领域
本发明具体涉及一种丹参酮II A高分子化合物及其在制药中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
中药丹参在临床上广泛用于冠心病、心绞痛的治疗。作为丹参最多的提取成分之一，丹参酮II A具有抗炎、抗氧化和细胞毒活性，以及神经元保护作用。然而，丹参酮II A的致命缺陷是口服生物利用度低，究其原因，一是由于水溶性差导致吸收差，这与其结构特点密不可分。丹参酮II A作为一个二萜类化合物，是一个疏水性很强的平面分子，极性很小，在水中几乎不溶，在甲醇、乙醇中溶解度也不大，只在一些弱极性有机溶剂如氯仿、乙酸乙酯、乙醚中等有较好的溶解度，这一特点极大地限制了其临床应用。其二是由于丹参酮II A经口服给药后存在严重的首过效应，导致进入血液浓度极低。
临床上使用的大多数药物是小分子药物，这使其快速的分散到健康的组织，最后分布到全身。结果只有相对较少的药物到达了靶点，并且在治疗过程中伴随着严重的副反应。这些副反应经常是剂量依赖性不能达到有效的治疗。高分子药物具有长效、高效、低毒、缓释、选择性好、副作用小等优点。一般来说高分子化合物的合成是通过共价键将母体药物分子连接到合适的高分子上。这种高分子化合物在人体中可以通过水解或酶解成为母体药物分子和高分子。高分子化合物一方面能有效地减少药物的副作用，另一方面能延长药物的释放时间，增加溶解性。
聚乙二醇(PEG)为线性结构，具有良好的水溶性和生物相容性，无毒、无免疫性、无致畸性且无抗原性，是获得FDA批准的药用合成聚合物之一。本发明用聚乙二醇为载体，通过不同的间隔基团与丹参酮IIA进行共价结合，得到共价结合物增加了丹参酮IIA的水溶性，提高了其生物利用度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种药用价值高的丹参酮IIA高分子化合物及其中间体，该高分子化合物及中间体结构如式(I)、(II)、(III)所示：
X为各种氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸)，以及两种氨基酸组成的二肽；-(C＝O)-R1-(C＝O)-，其中R1为C1-C4直链饱和烷基、C1-C4直链不饱和烷基、C1-C4支链饱和烷基、C1-C4支链不饱和烷基。
Y1为-NH2、-OH；Y2为单甲氧基PEG，其平均分子量为550、750、1000、2000、5000、8000；Y3为PEG、羧基PEG，其中PEG的平均分子量为600、800、1000、1500、2000、4000、6000、8000、10000、20000；羧基PEG的平均分子量为600、800、1000、1500、2000、4000、6000、8000、10000、20000。
二肽为甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中任意两种氨基酸组成的二肽。
当X为氨基酸时，Y1为-NH2；当X为-(C＝O)-R1-(C＝O)-时，Y1为-OH。
当X为氨基酸时，Y3为羧基PEG；当X为-(C＝O)-R1-(C＝0)-时，Y3为PEG。
本发明的另一目的在于提供丹参酮IIA高分子化合物及其中间体的制备方法，合成路线如下：
路线一：X为-(C＝O)-R1-(C＝O)-
路线二：X为氨基酸
本发明的丹参酮IIA高分子化合物具有良好的水溶性、显著的药理活性，可用于制备以下疾病的预防或治疗药物：动脉粥样硬化、高脂血症、脑缺血、中风、心肌梗死、心律失常、心绞痛、心肌症、心肌肥厚等心脑血管疾病；阿尔茨海默症、早老年性痴呆等神经系统疾病；病毒性肝炎、肝硬化等肝脏疾病；乳腺癌、白血病、肝癌、结肠癌、黑色素瘤等癌症。
通过以下实施例进一步举例说明本发明，但应注意本发明的范围不受这些实施例的任何限制。
附图说明
图1为丹参酮IIA高分子化合物体外脑缺血活性测试结果
具体实施方式
实施例1：4-羧基-丁酯丹参酮IIA(WGZB-24)的制备
称取5g(17mmol)丹参酮IIA，5.6g(51mmol)SeO2于1L单颈瓶中，加入700～800ml乙腈作溶剂，回流反应5～6h，停止加热并冷却至室温，减压蒸馏得固体，二氯甲烷将固体溶解后抽滤，用饱和氯化铵溶液洗涤滤液2～3次，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化，得1.32g红色固体化合物2，收率25％。
称取620mg(2mmol)化合物2，300mg(3mmol)丁二酸酐于100ml单颈瓶中，用30ml无水二氯甲烷溶解后，加入0.83ml(6mmol)三乙胺，抽真空并氮气保护，室温反应30～40min后停止反应，用饱和氯化铵溶液洗涤反应液2～3次，无水硫酸钠干燥后减压蒸馏得800mg红色固体化合物4-羧基-丁酯丹参酮IIA，收率97.56％。
同法制得间隔基团为C1-C4直链不饱和烷基；C1-C4支链饱和烷基；C1-C4支链不饱和烷基的式(I)。
实施例2：4-羧基-丁酯丹参酮IIA-mPEG的制备
称取100mg(0.24mmol)4-羧基-丁酯丹参酮IIA，220mg(0.29mmol)分子量为750的mPEG，74mg(0.36mmol)DCC，44mg(0.36mmol)DMAP于100ml单颈瓶中，用40ml无水二氯甲烷溶解后，抽真空并氮气保护，25～45℃下反应24h，抽滤除掉DCU，用饱和氯化铵溶液洗涤滤液2～3次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏后得红色油状物，用少许的二氯甲烷将油状物溶解后，冰浴条件下加入大量乙醚，生成沉淀，抽滤并干燥后得到红色粉末状固体化合物4-羧基-丁酯丹参酮IIA-mPEG。
同法制得间隔基团为C1-C4直链不饱和烷基；C1-C4支链饱和烷基；C1-C4支链不饱和烷基，mPEG平均分子量为550、1000、2000、5000、8000的4-羧基-丁酯丹参酮IIA-mPEG。
实施例3：4-羧基-丁酯丹参酮IIA-PEG的制备
称取100mg(0.24mmol)4-羧基-丁酯丹参酮IIA，720mg(0.36mmol)分子量为2000的PEG，74mg(0.36mmol)DCC，44mg(0.36mmol)DMAP于100ml单颈瓶中，用45ml无水二氯甲烷溶解后，抽真空并氮气保护，25～45℃下反应24h，抽滤除掉DCU，用饱和氯化铵溶液洗涤滤液2～3次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏后得红色油状物，用少许的二氯甲烷将油状物溶解后，冰浴条件下加入大量乙醚，生成沉淀，抽滤并干燥后得到红色粉末状固体化合物4-羧基-丁酯丹参酮IIA-PEG。
同法制得间隔基团为C1-C4直链不饱和烷基；C1-C4支链饱和烷基；C1-C4支链不饱和烷基，PEG平均分子量为600、800、1000、1500、4000、6000、8000(WGZB-01)、10000、20000的4-羧基-丁酯丹参酮IIA-PEG。
实施例4：甘氨酸-丹参酮IIA(WGZB-02-1)的制备
称取310mg(1mmol)化合物2，210mg(1.2mmol)Boc-甘氨酸，248mg(1.2mmol)DCC，122mg(1mmol)DMAP于100ml单颈瓶中，用45ml无水二氯甲烷溶解后，抽真空并氮气保护，25～45℃下反应30～40min后停止反应，抽滤除掉DCU，用饱和氯化铵溶液洗涤滤液2～3次，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化，得305mg红色固体化合物Boc-甘氨酸-丹参酮IIA，收率65.3％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.25(9H，s，-CH3×3)，δ1.38(6H，s，-CH3×2)，δ1.74(2H，m，CH2)，δ1.83(2H，m，CH2)，δ3.19(2H，t，J＝6.45Hz，CH2)，δ3.90(2H，d，J＝5.73Hz，CH2)，δ5.24(2H，s，CH2)，δ7.44(1H，s，Ar)，δ7.52(1H，d，J＝8.16Hz，Ar)，δ7.60(1H，d，J＝8.16Hz，Ar)；ESI-MS(m/z)：490[M+Na]+.
称取292mg(0.62mmol)化合物9于50ml单颈瓶中，用8ml二氯甲烷将Boc-甘氨酸-丹参酮IIA溶解，加入4ml三氟乙酸(V二氯甲烷∶V三氟乙酸＝2∶1)，室温反应30min后停止反应，减压蒸馏除去二氯甲烷和三氟乙酸，得红色油状物，加入氯仿使其溶解，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机相2次，无水硫酸钠干燥有机相，柱层析纯化，得140mg红色固体化合物甘氨酸-丹参酮IIA，收率61.1％。
同法制得间隔基团为丙氨酸(WGZB-06-1)、赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸(WGZB-10-1)、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸的式(I)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.37(6H，s，-CH3×2)，δ1.63(2H，m，CH2)，δ1.75(2H，m，CH2)，δ3.10(2H，t，J＝6.45Hz，CH2)，δ3.57(2H，s，CH2)，δ5.24(2H，s，CH2)，δ7.44(1H，s，Ar)，δ7.52(1H，d，J＝8.16Hz，Ar)，δ7.60(1H，d，J＝8.16Hz，Ar)；ESI-MS(m/z)：368[M+H]+.
实施例5：甘氨酸-丹参酮IIA-羧基PEG的制备
称取50mg(0.14mmol)甘氨酸-丹参酮IIA，340mg(0.17mmol)分子量为2000的羧基PEG，35mg(0.17mmol)DCC，20mg(0.14mmol)DMAP于100ml单颈瓶中，用40ml无水二氯甲烷溶解后，抽真空并氮气保护，25～45℃下反应24h，抽滤除掉DCU，用饱和氯化铵溶液洗涤滤液2～3次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏后得红色油状物，用少许的二氯甲烷将油状物溶解后，冰浴条件下加入大量乙醚，生成沉淀，抽滤并干燥后得到粉末状红色固体化合物甘氨酸-丹参酮IIA-羧基PEG(WGZB-02)。
同法制得羧基PEG平均分子量为600、800、1000、1500、4000(WGZB-03)、6000、8000(WGZB-04)、10000、20000(WGZB-05)的甘氨酸-丹参酮IIA-羧基PEG。
同法制得间隔基团为丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸，羧基PEG平均分子量为600、800、1000、1500、2000、4000、6000、8000、10000、20000的丹参酮IIA-羧基PEG。其中丙氨酸-丹参酮IIA-羧基PEG产物为WGZB-06、WGZB-07、WGZB-08、WGZB-09；苯丙氨酸-丹参酮IIA-羧基PEG产物为WGZB-10、WGZB-11、WGZB-12、WGZB-13；谷氨酸-丹参酮IIA-羧基PEG产物为WGZB-14、WGZB-15、WGZB-16、WGZB-17；天冬氨酸-丹参酮IIA-羧基PEG产物为WGZB-18、WGZB-19、WGZB-20、WGZB-21；
实施例6：丹参酮IIA高分子化合物血浆稳定性实验
色谱条件：C18色谱柱：Shimadzu VP-ODS 150L×4.6；流动相：A：0.03％磷酸水溶液B：乙腈；流速：1mL/min；检测波长：270nm；柱温：25℃；进样：20μL。
溶液的配制：分别称取25mg样品于10mL容量瓶中，用乙醇溶解配成2.5mg/mL的溶液(需超声助溶)。对照溶液的配制：精密称取丹参酮IIA 10mg，用乙醇溶解，配成40μg/mL的对照溶液。
样品溶液的处理：分别取上述各溶液1mL于2mL的EP管中，挥干溶剂后，各加1.5ml的空白血浆，涡旋混匀，放置于37℃水浴下培养0，0.5，2，4，6，8，12h，在每个时间点分别取200μL的血浆，加入2倍体积(400μl)的乙腈-甲醇(1∶1)沉淀蛋白，涡旋混合2min，12000rpm离心5min，取上清液100μL，取20μL进样分析。取TS的对照溶液0.5mL，挥干溶剂后，加入0.5mL的空白血浆，涡旋混匀，加入2倍体积(400μl)的乙腈-甲醇(1∶1)沉淀蛋白，涡旋混匀2min，12000rpm离心5min，取上清液100μL，取20μL进样分析。
空白血浆：取200μL空白血浆，同上处理沉淀蛋白后，12000rpm离心5min，取上清液100μL，取20μL进样分析。
实验结果：间隔基团相同的条件下，PEG分子量越大释放出母体药物分子的量越少，延长了药物的半衰期。
表1不同分子量不同间隔基团的丹参酮IIA高分子化合物在血浆中释放出母体药物分子百分比
实施例7：丹参酮IIA高分子化合物体外抗肿瘤活性实验
材料：人乳腺癌细胞MCF-7
试验方法：将处于细胞对数生长期的要进行实验的肿瘤细胞按一定的细胞量接种于96孔培养板内，培养24h后加入所筛样品(悬浮细胞接板后可直接加)，细胞在37℃5％CO2条件下继续培养48h后，加入MTT继续培养4h小时，用DMSO溶解在酶标仪下进行检测。
实验结果：间隔基团相同的条件下，分子量越大抗肿瘤活性越强，其中WGZB-01、WGZB-04、WGZB-05、WGZB-07、WGZB-09、WGZB-15的活性要强于丹参酮IIA，并且丹参酮IIA制备成高分子前药后仍保留抗肿瘤活性
表2丹参酮IIA高分子化合物体外抗肿瘤筛选结果
MCF-7 IC50(μM)
WGZB-01 0.2198
WGZB-02 45.62
WGZB-03 42.21
WGZB-04 12.41
WGZB-05 6.706
WGZB-06 48.53
WGZB-07 19.41
WGZB-09 6.887
WGZB-13 329
WGZB-15 10.98
WGZB-24 28.46
WGZB-02-1 29.86
WGZB-06-1 8.69
WGZB-10-1 13.43
丹参酮IIA 41.79
实施例8：丹参酮IIA高分子化合物体外脑缺血活性实验
实验方法：在低糖DMEM培养基中加入的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)干粉充分溶解，使终浓度20mM，用NaHCO3调pH为7.2，即为缺氧液。原代皮层神经元细胞在24孔板细胞培养板中培养7-10天，选取生长状态良好的细胞进行实验。给药前轻轻吸去24孔板中的培养基，用PBS缓冲液洗涤2次后，用含药培养基继续培养。实验共包括空白对照组、模型对照组、WGZB-02、WGZB-03、WGZB-04、WGZB-05、WGZB-06、WGZB-07、WGZB-08、WGZB-09、WGZB-02-1、WGZB-06-1、Lead compound样品组。24h后。去除含药的培养基，置换成缺氧液，空白对照组中加入等体积的维持培养基(Neurobasal Media49ml+B27-Supplement 1ml)。将培养基在培养箱中孵育2h后完全去除上清液，用PBS缓冲液洗涤两次后加入维持培养基。再次放入37℃，5％CO2孵箱中继续培养2h后，造模完成，神经元细胞可用于实验。造模后将细胞培养板置于倒置显微镜下观察皮层神经元细胞的生长及细胞损伤情况。除去24孔板内的培养基，加入维持培养基450μL后每孔再加入MTT溶液(5mg/ml)50μL，放入37℃孵育4h。弃含MTT的培养基之后，每孔加入DMSO液200μL，放在摇床上震荡10min。从每孔中取出150μL移至96孔板中，在酶标仪490nm处测定各孔的OD值，以OD值反映细胞的存活情况。实验重复3次。
实验结果：如图1所示，神经元细胞缺氧/复氧损伤后，模型组神经元细胞存活率和空白组相比极显著性降低(P＜0.01)。与模型组相比，化合物WGZB-02、WGZB-03、WGZB-04、WGZB-05、WGZB-06、WGZB-07、WGZB-08、WGZB-09、WGZB-02-1和Lead compound可极显著性升高造模后神经元细胞的存活率而WGZB-06-1克显著升高造模后神经元细胞的存活率。
以上所述仅是本发明的优选实验方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种丹参酮IIA高分子化合物及其中间体，其特征在于该丹参酮IIA高分子化合物及中间体的结构如式(I)、(II)、(III)所示：
2.根据权利要求1所述，式(I)、(II)、(III)其特征在于X为各种氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸)，以及两种氨基酸组成的二肽；-(C＝O)-R1-(C＝O)-，其中R1为C1-C4直链饱和烷基、C1-C4直链不饱和烷基、C1-C4支链饱和烷基、C1-C4支链不饱和烷基。
3.根据权利要求1所述，式(I)、(II)、(III)其特征在于Y1为-NH2、-OH；Y2为单甲氧基PEG，其平均分子量为550、750、1000、2000、5000、8000；Y3为PEG、羧基PEG，其中PEG的平均分子量为600、800、1000、1500、2000、4000、6000、8000、10000、20000；羧基PEG的平均分子量为600、800、1000、1500、2000、4000、6000、8000、10000、20000。
4.根据权利要求2所述，其特征在于二肽为甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中任意两种氨基酸组成的二肽。
5.根据权利要求1所述，式(I)其特征在于当X为氨基酸时，Y1为-NH2；当X为-(C＝O)-R1-(C＝O)-时，Y1为-OH。
6.根据权利要求1所述，式(III)其特征在于当X为氨基酸时，Y3为羧基PEG；当X为-(C＝O)-R1-(C＝O)-时，Y3为PEG。
7.根据权利要求1所述的丹参酮IIA高分子化合物及其中间体，其合成路线如下所示：
(1)路线一：X为-(C＝O)-R1-(C＝O)-
具体步骤如下：
i.化合物1(丹参酮IIA)经氧化剂SeO2(摩尔比＝1∶3～5)氧化，回流反应5～6小时，得到化合物2，所用溶剂为乙腈，二氧六环，乙酸，DMF，DMSO；
ii.化合物2在Et3N(摩尔比＝1∶3～5)为碱，无水二氯甲烷、无水氯仿作溶剂，室温条件下和酸酐(摩尔比＝1∶1.5～3)反应得到式(I)；
iii.在催化剂和缩合剂的作用下式(I)和PEG(摩尔比＝1∶1.5～2)或者mPEG(摩尔比＝1∶1.2～2)在25～45℃下反应得到式(II)、(III)，溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿和无水DMF；所用催化剂和缩合剂：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N-二甲氨基丙基-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及类似功能催化剂及缩合剂。
(2)路线二：X为氨基酸
具体步骤如下：
i.根据路线一所述的方法制备化合物2；
ii.25～45℃条件下，在催化剂和缩合剂的作用下化合物2和化合物4(各种氨基保护的氨基酸，摩尔比＝1∶1.2～2)于无水二氯甲烷、无水氯仿中得到化合物5；所用催化剂和缩合剂：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N-二甲氨基丙基-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及类似功能催化剂及缩合剂。
iii.化合物5在脱氨基保护基条件下得到式(I)；
脱氨基保护基：叔丁氧羰基(Boc)脱除条件——三氟乙酸(TFA)、HCl/EA或HCl/CH3OH，苄氧羰基(Cbz)脱除条件——溴化氢(HBr)、氢气(H2)还原或Na/NH3(液)，2-联苯基-2-丙氧羰基(BPoc)脱除条件——三氟乙酸(TFA)或溴化氢(HBr)，对甲苯磺酰基(Tosyl)脱除条件——钠(Na)或氨(NH3)。
iv.25～45℃条件下，在催化剂和缩合剂的作用式(I)和羧基PEG(摩尔比＝1∶1.2～2)于无水二氯甲烷、无水氯仿和无水DMF中得到式(III)；所用催化剂和缩合剂：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N-二甲氨基丙基-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及类似功能催化剂及缩合剂。
8.根据权利要求1所述的式(I)一种以高分子为载体的丹参酮IIA高分子化合物及其中间体，保护其在对以下疾病预防或治疗中的应用：心脑血管疾病(包括动脉粥样硬化、高脂血症、脑缺血、中风、心肌梗死、心律失常、心绞痛、心肌症、心肌肥厚等)；神经系统疾病(包括阿尔茨海默症、早老年性痴呆等)；肝疾病(包括病毒性肝炎、肝硬化等肝脏疾病)；癌症(包括乳腺癌、白血病、肝癌、结肠癌、黑色素瘤等)。
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