CN109851773A

CN109851773A - 一种peg两端同时偶联抗肿瘤药物偶联物的合成和应用

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Publication number: CN109851773A
Application number: CN201811432958.2A
Authority: CN
Inventors: 郭娜; 郁彭; 汤晶晶; 郝甜甜; 付颖
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2019-06-07

Abstract

一种PEG两端同时偶联抗肿瘤药物偶联物的合成和应用。本发明涉及一类抗肿瘤疏水性药物的靶向传递系统，通过简便高效的一步活化反应在聚乙二醇两端同时偶联上E选择素肽配体，E选择素肽配体再以二硫键为连接桥偶联不同的疏水性药物。该靶向传递系统与传统的以聚乙二醇为载体的药物偶联物相比具有更强的靶向性和双倍的载药量。这些偶联物在水溶液中自聚为纳米粒子从而通过EPR效应被动靶向到肿瘤部位；同时E选择素肽配体可主动识别肿瘤部位活化内皮细胞上高表达的E选择素并与之结合，从而竞争性抑制肿瘤细胞与E选择素的结合来达到抑制肿瘤细胞迁移的目的。

Description

一种PEG两端同时偶联抗肿瘤药物偶联物的合成和应用

技术领域

本发明属于新化合物合成和药物应用领域，尤其是一种PEG两端同时偶联抗肿瘤药物偶联物的合成和应用，涉及一类新型谷胱甘肽敏感的两亲性E选择素肽配体-聚乙二醇-羟基喜树碱偶联物的合成、评价及应用。

技术背景

E-选择素可特异性识别白细胞和肿瘤细胞表面的某些糖蛋白和糖脂分子的末端结构域，通过这种识别作用介导的E-选择素与白细胞或肿瘤细胞间的作用，可使白细胞或肿瘤细胞在内皮细胞黏附，继而随血流发生迁移，分别导致白细胞介导的促炎症反应和肿瘤细胞的扩散迁移。理论上E-选择素的特异性配体可以作为靶向分子将其它抗肿瘤药物带到肿瘤部位，同时还可以发挥该配体对肿瘤细胞迁移的抑制作用，因此设计和合成E-选择素配体与抗肿瘤药物的偶联物有望达到肿瘤靶向和抑制肿瘤转移的双重作用。

纳米载体已经被广泛用于抗癌药物的转运来提高药物在水中溶解度和通过 EPR效应提高肿瘤的被动靶向性，从而改善治疗效果。通常在高分子前药的制备中，常见的载体有右旋糖酐、血清蛋白、聚乙二醇等，其中聚乙二醇因其高亲水性、生物相容性好、无毒等优良特性，是FDA批准的可药用聚合物之一，它经常被应用于连接抗癌药物和治疗性蛋白，以提高药物的溶解度、生物利用度等。

发明内容

本发明是在本申请发明人以往的专利申请内容(201610542481.8)基础上所做的进一步创新发明，主要改进内容包括：使用PEG代替以往发明中的mPEG,通过氨基甲酸酯连接桥更加简便高效的在PEG两端同时偶联上E选择素多肽配体，反应步骤简单，产率高，最终获得PEG两端偶联双价抗肿瘤药物和双价肽配体的新化学实体。这类偶联物具有更强的靶向性和双倍的载药量，可提供一种新型抗肿瘤药物靶向递送系统，该系统可通过其结构上的两亲性在水溶液中自组装为纳米胶束，从而通过EPR效应实现被动靶向于肿瘤部位，同时利用E选择素配体将药物主动靶向于肿瘤新生血管。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

抗肿瘤药物偶联物结构VI中PP为E选择素多肽配体；m＝50-1200；n＝1-3。

抗肿瘤药物三元偶联物IX结构中PP为E选择素多肽配体；m＝50-1200；C1与 C2原子可能相连，形成5-7元芳香环。

化合物VI的通用制备方法如下：

化合物IX的通用制备方法如下：

其中PEG分子量从2000～50000。E选择素肽配体PP为IELLQAR、IDLMQAR、DITWDQLWDLMK、DITWDELWKIMN、RNMSWLELWEHMK、 DLWDWVVGKPAG等序列多肽及其这些多肽的反序肽、环肽、D构型多肽等，抗肿瘤药物包括：喜树碱、羟基喜树碱、SN-38等疏水性药物，R选自烷基，烷氧基，或者芳基，PEG-E选择素肽配体的偶联物与喜树碱类抗肿瘤药物的偶联位点包括喜树碱类药物的10位或20位羟基等。

中间体III的合成如下：

化合物VI和IX及作为阴性对照品的中间体III的体外抗肿瘤活性结果如表 1所示。

表1体外抗肿瘤活性测试结果(IC₅₀，μM)

表1结果表明，该类偶联物具有与HCPT相当的活性，抗肿瘤效果明显，而多肽和PEG偶联物并没有明显细胞毒作用，发挥作用的还是原药HCPT。

上述的抗肿瘤药物偶联物作为靶向药物递送系统的应用。

上述靶向药物递送系统为抗肿瘤药物递送系统。

上述系统通过其结构上的两亲性在水溶液中自组装为纳米胶束，从而通过 EPR效应实现被动靶向于肿瘤部位。

上述的抗肿瘤药物偶联物作为制备治疗或抑制或抗肿瘤转移的药物的应用。

本发明的优点和积极效果如下：

1、本发明所涉及的递药系统合成在以往基础上更加简便，适用于多种疏水性抗肿瘤药物。

2、本发明获得的偶联物偶联了双价配体和双价抗肿瘤药物，因而具有更强的靶向性和更高的载药量。

3、本发明以水溶性良好的PEG为载体，在其两端同时偶联上疏水性抗肿瘤药物，不但使偶联物在水溶液中可自组装为纳米粒子，进而通过EPR效应来被动靶向于肿瘤部位，同时有望提高载药量、药物溶解度、延长体内循环时间、改善生物利用度等。

4、本发明通过在PEG两端同时引入E选择素多肽配体，使药物能更好的主动靶向于肿瘤部位新生血管，降低药物对正常组织毒性。另外，药物可同时对肿瘤新生血管及临近的肿瘤细胞发挥杀伤作用，有望获得更好地治疗效果。

5、本发明中E选择素多肽配体除了发挥肿瘤靶向作用以外，还可以抑制肿瘤细胞与血管内皮细胞之间的黏附作用，进而抑制肿瘤细胞的转移。

附图说明

图1为化合物6的MALDI-TOF图谱；

图2为化合物6在氘代二甲基亚砜中的核磁氢谱图；

图3为化合物6在重水中的核磁氢谱图；

具体的实施方式

为了理解本发明，下面结合实例对本发明作进一步说明：下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。

本发明的目的在于以PEG为载体，在其两端同时偶联上E选择素多肽配体和疏水性抗肿瘤药物，提供一种不同于传统的以PEG或mPEG为载体的新型抗肿瘤药物靶向递送系统。该系统可通过其结构上的两亲性在水溶液中自组装为纳米胶束，从而通过EPR效应实现被动靶向于肿瘤部位；同时利用E选择素配体将药物主动靶向于肿瘤新生血管，因为E选择素特异性的高表达于肿瘤新生血管内皮细胞。另一方面偶联物到达肿瘤部位后，本发明所设计的连接桥可被肿瘤细胞微环境中高浓度的谷胱甘肽(GSH)切断，释放出原药从而杀伤肿瘤新生血管内皮细胞和临近的肿瘤细胞，而E选择素配体还可通过与肿瘤细胞竞争结合E选择素从而阻断或抑制肿瘤细胞的迁移。

一种PEG两端同时偶联E选择素肽配体和抗肿瘤药物的偶联物，其特征在于：所述偶联物为E选择素多肽配体-聚乙二醇-抗肿瘤药物，其中E选择素多肽配体为IELLQAR、IDLMQAR、DITWDQLWDLMK、DITWDELWKIMN、RNMSWLELWEHMK、DLWDWVVGKPAG等序列多肽及其这些多肽的反序肽、环肽、D构型多肽等，所述抗肿瘤药物包括：喜树碱、羟基喜树碱或SN-38，PEG-E 选择素肽配体的偶联物与喜树碱类抗肿瘤药物的偶联位点包括喜树碱类药物的 10位或20位羟基。

采用经典固相Fmoc策略，使用2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl ChlorideResin)合成E选择素配体IELLQAR，并在其一端增加半胱氨酸(C)作为连接位点，获得八肽NH₂-CIELLQAR-COOH。

偶联物VI和IX的合成方法基本一致，目标偶联物之一的结构示意：

在VI的一些实施方式中，所述制备方法包括以下步骤：

试剂：(a)DMAP，acetone，1,4-dioxane；(b)DMF，DIEA；(c)Phenol, 1,2-Ethanedithiol,Thioanisole,H₂O,TFA.

试剂：(a)MeOH；(b)EDCI,DMAP,DMF,DCM；(c)MeOH,DCM.

⑴化合物1的合成

称取2g(0.33mmol)聚乙二醇6000，溶于20ml无水1,4-二氧六环中；加入1.7g(6.6mmol)N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(悬浮)；5ml无水丙酮溶DMAP 0.8 g(6.7mmol)；搅拌下，将DMAP缓慢滴入体系中，随后体系变澄清。氩气保护下，室温反应20h，体系变浑浊，TLC监测反应完全。抽滤，减压浓缩溶剂，二氯甲烷稀释，0.5N HCl萃洗3次，饱和碳酸氢钠溶液洗1次，饱和食盐水洗2 次，无水硫酸钠干燥，减压旋干有机相；乙酸乙酯热溶(50℃)，恢复至室温后加入等体积乙醚重结晶，抽滤得固体，重复三次，真空干燥得1.9g白色固体，产率90.7％。

⑵化合物2的合成

称取660mg(0.38mmol)RAQLLEIC-NH₂，溶于3ml DMF中，加入160μl (0.97mmol)DIEA，搅拌15min；600mg(0.095mmol)化合物1溶于2ml DMF中，将其缓慢加入体系中；氩气保护下，35℃反应5h，TLC监测反应完全。Toyopearl HW-40F凝胶柱分离纯化，乙醚重结晶，真空干燥得600mg淡黄色固体。

(1)⑶化合物3的合成

裂解液的配制:

苯酚:乙二硫醇:苯甲硫醚:水:三氟乙酸＝5：5：2.5：5：82.5(V/V)

称取300mg(0.03mmol)化合物2，加入5ml裂解液，34℃反应5h。将反应液直接倒入25ml冷乙醚中，冷藏30min。离心，所得固体用乙醚洗3次，氩气吹干，得灰白色固体230mg。

(2)⑷化合物4的合成

称取4.4g(20mmol)2,2'-二硫二吡啶，溶于20ml甲醇中；将1.1ml(13mmol) 巯基丙酸滴加到2,2'-二硫二吡啶溶液中，滴加完后室温继续反应4h，TLC监测反应完全。减压旋干体系，乙酸乙酯稀释，加水萃洗8次，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，收集有机相，加硅胶拌样，用石油醚:乙酸乙酯＝5:1-1:1， 200-300目硅胶柱层析纯化，得1.5g，产率55％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):10.54(s,1H),8.47(t,J＝1.2Hz,1H), 7.65(m,2H),7.16-7.12(dd,1H),3.05(t,J＝6.8Hz,2H),2.79(t,J＝6.8Hz,2H).

⑸化合物5的合成

称取0.3g(0.8mmol)10-羟基喜树碱，溶于10ml N,N-二甲基甲酰胺中；依次加入0.27g(1.2mmol)化合物4，0.17g(1.4mmol)4-二甲氨基吡啶；称取0.3g (1.6mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于10ml二氯甲烷中，冰浴下将其缓慢滴加到体系中，继续冰浴30min后恢复室温反应2小时。用二氯甲烷稀释反应液，饱和氯化铵溶液萃洗3次，饱和碳酸氢钠溶液洗1洗，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，收集有机相，加硅胶拌样，用二氯甲烷: 甲醇＝75:1，200-300目硅胶柱层析纯化，再用石油醚重结晶得0.3g白色粉末,产率68％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.69(s,1H),8.54-8.49(m,1H),8.22 (d,J＝9.1Hz,1H),7.90(d,J＝2.5Hz,1H),7.87–7.80(m,2H),7.69-7.64(m,1H), 7.36(s,1H),7.30-7.25(m,1H),6.57(s,1H),5.44(s,2H),5.30(s,2H),3.24(t,J＝ 7.0Hz,2H),3.13(t,J＝6.4Hz,2H),1.94–1.81(m,2H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H).

⑹化合物6的合成

称取34.8mg(0.062mmol)化合物5，溶于1ml二氯甲烷中；称取120mg(0.015 mmol)化合物3，溶于2ml甲醇中，并将其滴加入体系中。高效液相监测反应过程，3h后反应完全。用二氯甲烷和甲醇稀释体系后倒入100ml的反应瓶中，减压旋干溶剂后加乙酸乙酯萃洗，少量多次的重复；检测萃洗液，直至254nm下无吸收为止。真空干燥，加水溶解，冻干得60mg淡黄色固体。HPLC检测纯度为98％。MALDI-TOF结果显示与理论分子量范围相符，图谱如图1所示。

化合物6的核磁氢谱如图2和图3所示，可以发现，在水溶液中，HCPT的信号消失，这是因为这类化合物为两亲性结构，在水溶液中，该结构可自聚为纳米胶束，将疏水性结构包裹于内部。该结果与我们前期对PEG与HCPT偶联物的研究结果一致。PEG与HCPT的偶联物同样存在该现象。

Claims

1.一种PEG两端同时偶联E选择素肽配体和抗肿瘤药物的偶联物，其特征在于：包括E选择素肽配体、聚乙二醇、疏水性抗肿瘤药物形成的偶联药物，所述E选择素多肽配体为IELLQAR、IDLMQAR、DITWDQLWDLMK、DITWDELWKIMN、RNMSWLELWEHMK、DLWDWVVGKPAG等序列多肽及其这些多肽的反序肽、环肽、D构型多肽，所述抗肿瘤药物包括：喜树碱、羟基喜树碱或SN-38，PEG-E选择素肽配体的偶联物与喜树碱类抗肿瘤药物的偶联位点包括喜树碱类药物的10位或20位羟基。

2.一种PEG两端同时偶联E选择素肽配体和抗肿瘤药物的偶联物，其特征在于：结构式如下

其中，PP为E选择素肽配体；m＝50-1200，n＝1-3，R选自烷基，烷氧基，或者芳基。

3.一种PEG两端同时偶联E选择素肽配体和抗肿瘤药物的偶联物，其特征在于：结构式如下

其中，PP为E选择素肽配体；m＝50-1200，C1与C2原子形成5-7元环，R选自烷基，烷氧基，或者芳基。

4.一种PEG两端同时偶联E选择素肽配体和抗肿瘤药物的偶联物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

其中，PP为E选择素肽配体，R选自烷基，烷氧基，或者芳基，n＝1-3，m＝50-1200。

5.一种PEG两端同时偶联E选择素肽配体和抗肿瘤药物的偶联物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

其中，PP为E选择素肽配体，R选自烷基，烷氧基，或者芳基，m＝50-1000。

6.根据权利要求4或5所述的抗肿瘤药物偶联物的制备方法，其特征在于：所述PEG分子量从2000～50000，所述PP为IELLQAR、IDLMQAR、DITWDQLWDLMK、DITWDELWKIMN、RNMSWLELWEHMK、DLWDWVVGKPAG等序列多肽及其这些多肽的反序肽、环肽、D构型多肽，所述抗肿瘤药物包括：喜树碱、羟基喜树碱、SN-38等疏水性药物，R选自烷基，烷氧基，或者芳基，PEG-E选择素肽配体的偶联物与喜树碱类抗肿瘤药物的偶联位点包括喜树碱类药物的10位或20位羟基。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述方法还包括中间体化合物III的合成方法为

8.权利要求1或2或3所述的抗肿瘤药物偶联物作为靶向药物递送系统的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述靶向药物递送系统为抗肿瘤药物递送系统。

10.权利要求1或2或3所述的抗肿瘤药物偶联物作为制备治疗或抑制或抗肿瘤转移的药物的应用。