CN109758587A - 一种具有乏氧靶向性的多价配体药物偶联物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有乏氧靶向性的多价配体药物偶联物，通过含巯基的乏氧靶向性配体及药物衍生物分子与马来酰亚胺衍生化葡聚糖的连接而成，可实现该相应药物分子对肿瘤组织的乏氧靶向，具有良好的抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明涉及医用高分子材料及药物制剂领域，具体涉及一种具有肿瘤细胞乏氧靶向性的多价配体药物偶联物，该多价配体偶联物是以马来酰亚胺衍生化的葡聚糖作为载体骨架，通过巯基与马来酰亚胺之间特异性的生物正交反应，将多个乏氧靶向性配体以及药物分子通过共轭连接的方式连接至葡聚糖骨架上，实现药物的乏氧靶向性传递。
背景技术
配体药物偶联物作为实现抗肿瘤药物的肿瘤靶向给药方式是近年来的一大研究热点，其中，以叶酸，糖类，碳酸酐酶抑制剂为代表的小分子配体相比于分子量相对较大的单克隆抗体等，通常具有来源广泛，易于合成，成本低廉等特点，适于作为主动靶向配体用于抗肿瘤药物的靶向传递中，目前已有部分小分子配体药物偶联物进入临床阶段。
现有的小分子配体药物偶联物通常因分子量相对较低，易受相连药物分子的影响，使配体与相应受体的亲和能力降低，故而导致小分子配体药物偶联物的整体靶向能力降低，进而降低了药物的抗肿瘤效果。多价配体技术通常可利用体系中存在的多个配体与受体的结合协同作用，增加分子整体与相应受体之间的亲和能力；此外多价配体技术可通过多位点结合作用，具有更好的热力学稳定性；通过立体化稳定作用可降低单一配体结合时所存在的竞争性抑制作用；通过集聚效应，面对非均一性的受体分布能实现较单配体更好的选择性。因此，多价配体技术较单配体而言更有利于抗肿瘤药物的靶向传递。
碳酸酐酶9(CAIX)是一类在多种肿瘤细胞表面均高表达的酶类，通过可逆性调节二氧化碳水化的过程以调节细胞周围环境的pH，是维持肿瘤细胞生存环境的一种极其重要的酶，其存在与肿瘤组织中的乏氧环境有极大关联，是肿瘤乏氧的生物标记物。CA IX抑制剂乙酰唑胺可与CA IX有效结合，可实现抗肿瘤药物的肿瘤靶向传递，同时具有靶向乏氧环境的能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：
小分子配体偶联物通常因所连药物而影响小分子配体与相应受体的亲和能力，故而靶向能力相对减弱。同时，因整体分子量通常小于40kDa，因而在生物体内因肾小球的过滤作用被排泄，故而降低了其在生物体内的抗肿瘤活性。本发明的目的在于获得并提高药物肿瘤靶向能力以提高药物的抗肿瘤活性。
用于解决技术问题的手段：
将具有良好生物稳定性、生物相容性及良好水溶性的马来酰亚胺衍生化葡聚糖作为载体骨架，通过生物正交反应，可实现小分子配体及药物的定量偶联，调节二者之间比例，实现良好的肿瘤细胞靶向能力，并发挥良好的抗肿瘤作用。通过对小分子配体进行修饰，获得了合适的配体靶头部分，通过配体及药物以适当比例与葡聚糖骨架进行偶联，最终获得了具有乏氧靶向能力的多价配体药物偶联物。
实现本发明目的的具体技术方案是：
一种具有乏氧靶向性的多价配体药物偶联物，在马来酰亚胺化葡聚糖上通过生物正交反应连接具有巯基片段的乏氧靶向性配体及抗肿瘤药物分子，并具有以下结构通式：
其中，该药物偶联物的主链结构为分子量为2kDa～200kDa的葡聚糖；
x为该药物偶联物中衍生化葡聚糖上未被取代的葡聚糖单元比例，x＝0.6～1，其单元数为所用葡聚糖的葡萄糖单元总数*x；
p为该药物偶联物中衍生化葡聚糖上与乏氧配体连接的葡聚糖单元比例，p＝0～0.27，其单元数为所用葡聚糖总单元数中葡萄糖单元总数*p；
q为该药物偶联物中衍生化葡聚糖上与抗肿瘤药物分子连接的葡聚糖单元比例，q＝0～0.27，其单元数为所用葡聚糖总单元数中葡萄糖单元总数*q；且x+p+q＝1。
该配体药物偶联物中所使用的马来酰亚胺衍生化葡聚糖具有如下结构：
其中，x代表该马来酰亚胺衍生化葡聚糖上未被取代的葡聚糖单元比例，x＝0.6～1，其单元数为所用葡聚糖的葡萄糖单元总数*x；
y代表该马来酰亚胺衍生化葡聚糖中马来酰亚胺化衍生化葡聚糖单元比例，y＝0～0.4,其单元数为所用葡聚糖的葡萄糖单元总数*y。
该配体药物偶联物中，L所代表的乏氧靶向性配体选自碳酸酐酶9抑制剂或其衍生物。
该配体药物偶联物中所涉及的碳酸酐酶9抑制剂包含：乙酰唑胺或其衍生物。
该配体药物偶联物中所涉及的碳酸酐酶9抑制剂衍生物包含：碳酸酐酶9抑制剂PEG化衍生物，其中PEG长度为1-12个聚乙二醇单元。
该配体药物偶联物中，D所代表的抗肿瘤药物选自具有抗肿瘤活性的喜树碱、紫杉醇及它们的衍生物中的任意一种或两种以上。
该配体药物偶联物中，D所涉及的喜树碱类衍生物为7-乙基-10-羟基喜树碱或依沙替康；所述紫杉醇衍生物为多西他赛或卡巴他赛。
该配体药物偶联物中所涉及的7-乙基-10-羟基喜树碱的巯基衍生物具有以下结构：
其中，L1为二胺类取代基，该二胺类取代基包含：哌嗪基、4-氨基哌嗪基、4-氨甲基哌嗪基和N,N-二甲基乙胺基中任意一种；L2为巯基衍生类羧酸，该巯基衍生类羧酸包含：巯基乙酸、巯基丙酸和N-乙酰半胱氨酸中任意一种；L3包含：甘氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸和6-氨基己酸中任意一种。
该配体药物偶联物中，D所代表的7-乙基-10-羟基喜树碱巯基衍生物优选以下结构：
该配体药物偶联物中，相应乏氧配体的巯基衍生物片段L与抗肿瘤药物巯基衍生物片段D的比例为1:0.5～2。
本发明的有益效果：利用具有良好生物相容性的葡聚糖衍生材料，通过共价键的方式在分子内连接多个具有乏氧靶向性的配体可提高聚合物偶联物的肿瘤乏氧靶向能力，有利于药物的肿瘤细胞靶向传递作用，同时增强药物的抗肿瘤作用能力；生物正交反应的连接方式有利于药物的定量连接，为两种以上药物的联合递送奠定基础。
附图说明
图1为化合物I的1H-NMR谱图；
图2化合物物II的1H-NMR谱图；
图3为本发明配体药物偶联物紫外吸收曲线图；
图4为本发明配体药物偶联物CA-P，CA-G，CA-A的紫外吸收标准曲线图；
图5为本发明配体药物偶联物在PBS中的药物释放量曲线图；
图6为本发明配体药物偶联物在A549细胞上的激光共聚焦成像结果图。
具体实施例方式
本发明的所涉及的具有乏氧靶向性的多价配体药物偶联物制备方法将在如下实施例中更详细叙述，但实施例不构成对本发明的限制。
实施例1
马来酰亚胺衍生化葡聚糖(化合物I)的合成
1.1化合物2的制备
将马来酸酐(20g,0.20mol)，β-丙氨酸(18.2g,0.20mol)溶于140mL醋酸中，加热至回流反应6h。反应完全后，旋去醋酸，所得油状液体经柱层析分离得白色固体15g，收率44.4％。1H-NMR(400MHz,DMSO–d6)δ12.4(s,1H),7.02(d,J＝4.4Hz,2H),3.62(t,J＝7.3Hz,2H),2.53-2.45(m,2H)。
1.2化合物4的制备
将化合物2(1g,5.9mmol)分散于12mL丙酮中，氮气保护下，于-5℃条件下，向反应液中加入TEA(0.9mL,6.5mmol)，反应液澄清后，向其中缓慢滴加5mL氯甲酸异丙酯(0.68mL,6.5mmol)的丙酮溶液，溶液加毕后反应30min，再向其中加入叠氮化钠(0.38g,5.9mmol)，并继续反应2h。反应完全后，将反应液倾入30mL水中，以40mL甲苯分两次萃取，合并有机相后以饱和氯化钠洗，以硅胶过滤后，旋去部分溶剂后，以无水硫酸镁干燥过夜。随后将过滤后所得滤液(化合物3)于氮气保护条件下加热回流1h。反应完全后，旋去溶剂，真空干燥得黄色油状液体0.5g，即为化合物4，收率50.0％。1.3化合物I的制备
将葡聚糖(T-40,Mw＝40kDa,1.0g,6.2mmol葡萄糖单元)以10mL无水二甲亚砜溶解为无色透明溶液后，于氮气保护条件下，将化合物4(0.5g，3.0mmol)及0.05mol DBTL加入其中，于室温下反应过夜。反应完全后，将反应液于冰乙醇中重沉淀，过滤后，将所得固体以纯水溶解后透析24h，冻干得白色泡状固体1.2g。
1.4化合物I的接枝比例确定
以D2O为溶剂，其1H-NMR谱图上仅有葡聚糖骨架氢及马来酰亚胺氢存在(图1)。化学位移约5处为葡萄糖单元中1位端氢Ha，6.8处为马来酰亚胺上氢Hm，根据积分比例计算出相应的马来酰亚胺接枝比GR。其中GR＝马来酰亚胺单元数/葡聚糖单元数。
图1中GR＝18％。通过调节化合物4与马来酰亚胺比例可获得不同GR值的马来酰亚胺衍生化葡聚糖。
实施例2
乙酰唑胺衍生化葡聚糖(化合物II)的合成
2.1化合物7的制备
化合物7的合成参照文献《Zhang,H.；Li,X.；Shi,Q.；Li,Y.；Xia,G.；Chen,L；Yang,Z.；Jiang,Z.X.,Highly efficient synthesis of monodisperse poly(ethyleneglycols)and derivatives through macrocyclization of oligo(ethylene glycols).AngewandteChemie,2015,54,3763-3767》合成获得。将四甘醇(13g,67mmol)，TEA(44.75mL,0.32mol)，DMAP(0.41g,3.4mmol)溶于1.8L DCM中，冰水浴下向其中缓慢滴加SOCl2(9.7mL,0.13mol)的DCM溶液80mL，控制反应温度在0-5℃内。滴加完毕后，以300mL饱和氯化钠溶液淬灭反应后，有机相先后以水，饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥后过滤，旋干得棕褐色油状液体。将该油状液体及高碘酸钠(28.7g,0.134mol)以500mL DCM、MeCN、H2O体积比为2:1:2的混合溶液溶解后，冰水浴下向其中加入RuCl3·3H2O(175mg,0.67mmol)后反应30min，转至室温下继续反应1h。反应完全后，以DCM萃取，有机相先后以水，硫代硫酸钠溶液，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后柱分离得白色固体12.0g，收率70.6％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.44(t,J＝5.0Hz,4H),3.80(t,J＝5.0Hz,4H),3.65(d,J＝5.6Hz,4H),3.63–3.60(m,4H)。
2.2化合物8的制备
将四甘醇(33.75g,0.174mol)以10mL THF溶解为无色透明溶液，冰水浴下，向其中加入10mL4N NaOH(aq)，反应30min后，向其中缓慢滴加30mL对甲苯磺酰氯(4.73g,25mmol)的THF溶液，室温下反应过夜。反应完成后，将反应液倾入100mL冰水中，以PE萃取除去杂质后，水相再以DCM萃取，DCM萃取液以饱和氯化钠洗后，以无水硫酸钠干燥，过滤旋干后得无色油状液体后在以四氢呋喃溶解为淡黄色溶液，向其中加入三苯甲基硫醇(8.3g,30mmol)，随后在冰水浴条件下向其中加入NaOH(1.5g,37.5mmol)，室温下反应12h。反应完全后，于冰水浴下向其中加入100mL水稀释反应液，乙酸乙酯萃取后，合并有机相，以饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥后，柱层析分离得淡黄色油状液体7.5g，收率82.4％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.41(d,J＝7.7Hz,6H),7.27(t,J＝7.5Hz,6H),7.20(t,J＝7.2Hz,3H),3.72–3.66(m,2H),3.63(q,J＝7.1Hz,4H),3.59–3.54(m,4H),3.48–3.40(m,2H),3.29(t,J＝6.9Hz,2H),2.43(t,J＝6.9Hz,2H)。
2.3化合物9的制备
氮气保护下，将氢化钠(424mg,10.6mmol)分散于50mL THF中，冰水浴下向其中滴加化合物8(4.0g,8.84mmol)的THF溶液，室温下反应1h后，向其中滴加化合物7(2.4g,9.3mmol)的THF溶液，室温下反应12h。反应完全后向其中加入水(0.32mL,17.7mmol)和浓硫酸(0.5mL,8.84mmol)，室温下反应3h。反应完全后，向反应体系中加入20mL水稀释反应液，乙酸乙酯萃取后，合并有机相并以饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后柱层析分离得淡黄色油状液3.0g，收率54.0％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.41(d,J＝7.4Hz,5H),7.28(d,J＝7.3Hz,5H),7.20(t,J＝7.2Hz,3H),3.74–3.69(m,2H),3.62(dq,J＝11.5,3.8Hz,22H),3.58–3.52(m,2H),3.48–3.40(m,2H),3.30(t,J＝6.9Hz,2H),2.43(t,J＝6.9Hz,2H)。
2.4化合物10的制备
氮气保护下，将氢化钠(288mg,7.2mmol)分散于30mL THF中，冰水浴下向其中滴加化合物9(3.0g,4.8mmol)的THF溶液，室温下反应1h后，向其中滴加化合物7(2.4g,9.3mmol)的THF溶液，室温下反应12h。反应完全后向其中加入水(0.17mL,9.6mmol)和浓硫酸(0.27mL,4.8mmol)，室温下反应3h。反应完全后，向反应体系中加入水稀释反应液，乙酸乙酯萃取后，合并有机相并以饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后柱层析分离得淡黄色油状液3.0g，收率78.1％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45–7.38(m,6H),7.30–7.25(m,6H),7.20(t,J＝7.2Hz,3H),3.73(d,J＝4.1Hz,2H),3.70–3.60(m,38H),3.58–3.53(m,2H),3.48–3.42(m,2H),3.30(t,J＝6.9Hz,2H),2.43(t,J＝6.9Hz,2H),2.20(s,1H)。
2.5化合物13的制备
化合物10(3.0g,3.7mmol)和三乙胺(1.03mL,7.4mmol)以DCM溶解后，于冰水浴条件下向其中滴加对甲苯磺酰氯(0.95g,5.0mmol)的DCM溶液，室温下反应12h。反应完全后，以水淬灭反应，DCM萃取，有机相以饱和碳酸氢钠及饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后得无色油状液3.0g。将所得无色油状液以10mL DMF溶解后向其中加入叠氮化钠(305mg,4.7mmol)，加热至80℃反应12h，反应完全后以水稀释反应液，EA萃取，有机相以饱和食盐水洗后以无水硫酸钠干燥，过滤旋干后得化合物12粗品。以10mL THF将粗品溶解后，向其中加入三苯基膦(1.13g,4.32mmol)及2mL水，室温下反应12h。反应完全后，将反应液旋干以柱层析分离得淡黄色油状液体2g，收率67％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.41(d,J＝7.5Hz,6H),7.26(t,J＝7.5Hz,6H),7.19(t,J＝7.2Hz,3H),3.67–3.60(m,34H),3.58–3.50(m,6H),3.46–3.42(m,2H),3.29(t,J＝6.9Hz,2H),2.87(t,J＝5.1Hz,2H),2.42(t,J＝6.9Hz,2H),2.12(s,2H)。
2.6化合物16的制备
将乙酰唑胺(10.0g,45mmol)分散于56mL 4N HCl溶液中，加热至100℃反应4h。反应完全后，将反应液冷却至室温后，在冰水浴条件下向其中加入25mL 9N NaOH(aq)至pH为3，将反应液中析出的固体过滤，干燥得白色固体6.8g，收率84.0％。随后将白色固体与丁二酸酐(6.67g,66.6mmol)以乙腈分散后，加热至回流反应12h。反应完全后抽滤所得固体并以乙腈洗涤，最终得白色固体7g，收率66.2％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.05(s,1H),12.27(s,1H),8.32(s,2H),2.76(t,J＝6.5Hz,2H),2.76(t,J＝6.6Hz,2H)。
2.7化合物17的制备
化合物13(200mg,0.25mmol)与16(105mg,0.38mmol)以10mL DMF溶解后，向其中加入DCC(77.25mg,0.38mmol)，TEA(0.10mL,0.75mmol)后室温下反应12h。反应完全后，以水淬灭反应，乙酸乙酯萃取，合并有机相后以无水硫酸钠干燥，以柱层析色谱分离纯化得160mg白色固体，收率52.4％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.85(s,1H),7.41(d,J＝7.8Hz,6H),7.28(d,J＝7.2Hz,6H),7.21(d,J＝7.1Hz,3H),3.68–3.59(m,34H),3.56(d,J＝4.2Hz,6H),3.51(d,J＝4.4Hz,2H),3.47–3.42(m,2H),3.29(t,J＝6.9Hz,2H),2.98(t,J＝7.4Hz,2H),2.75(t,J＝7.4Hz,2H),2.42(t,J＝6.9Hz,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.6,171.0,165.3,162.6,144.8,129.6,127.9,126.7,70.5,70.5,70.4,70.4,70.1,70.0,69.6,66.6,39.5,32.6,31.6,31.5。
2.8化合物18的制备
化合物17(430mg,0.40mmol)溶于10mL 5％TFA/DCM溶液，加入1mL TES后，室温下反应30min。反应完全后，将反应液旋干，以柱层析色谱分离目标产物，最终得270mg无色油状液体，收率81.6％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.80(s,1H),3.73–3.54(m,44H),3.51(d,J＝3.3Hz,2H),2.99(t,J＝7.0Hz,2H),2.76(t,J＝7.1Hz,2H),2.70(dd,J＝14.6,6.6Hz,2H),1.61(t,J＝8.2Hz,1H).HR-MS(ESI):m/z calcd for C30H57N5NaO15S3[M+H]+:846.2905,found 846.2841。
2.9化合物II的制备
将GR＝18％的化合物I(1.2g,马来酰亚胺单元摩尔数1.12mmol)以20mL水溶解后，向其中加入化合物18(463mg,0.56mmol)，室温下反应2h后直接将反应液冻干，得白色泡状固体1.66g。
图2为其1H-NMR谱图，根据化学位移6.8处马来酰亚胺上氢积分数计算偶联物II中剩余马来酰亚胺接枝比GR＝9％。
实施例3
化合物CA-PT的制备
3.1化合物20的制备
将巯基丙酸(2.44g,23mmol)以甲醇溶解后，于冰水浴下，向其中加入2,2′-二硫二吡啶(7.6g,34.5mmol)，室温下反应3h。反应完全后，将反应液旋干，经柱层析分离的白色固体3.90g，收率79.3％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.61(s,1H),8.49(d,J＝4.9Hz,1H),7.75(d,J＝7.9Hz,1H),7.69(td,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.19–7.11(m,1H),3.05(t,J＝7.0Hz,2H),2.80(t,J＝7.0Hz,2H)。
3.2化合物21的制备
将化合物20(3.44g,16mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(2.0g,17.7mmol)以THF溶解后，冰水浴下，向其中加入DCC(3.6g,17.7mmol)，室温下反应2h。反应完全后，过滤除去反应所产生固体不溶物后，将滤液旋干，以柱层析分离纯化得白色固体3.9g，收率78.0％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.48(d,J＝4.7Hz,1H),7.73–7.61(m,2H),7.21–7.03(m,1H),3.21–3.10(m,2H),3.10–3.00(m,2H),2.82(s,4H)。
3.3化合物23的制备
将SN38(1.0g,2.55mmol)及氯甲酸对硝基苯酯(617mg,3.06mmol)分散于30mL无水THF溶液中，随后在冰水浴条件下，向其中缓慢加入DIEA(0.66mL,3.82mmol)，室温下反应2h。反应完全后，将溶剂旋干，以乙醚洗涤所获得的固体化合物，得1.77g淡黄色固体，即化合物22粗品。将化合物22(1.0g,1.80mmol)以DCM溶解后，向其中加入4-Boc氨甲基哌嗪(502mg,2.34mmol)及DMAP(240mg,1.96mmol)后，与室温下反应2h。反应完全后，以水洗，DCM萃取，有机相先后以饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠水溶液洗，无水硫酸钠干燥后经柱层析分离，得0.8g淡黄色固体，收率70.8％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.21(d,J＝9.2Hz,1H),7.84(d,J＝2.5Hz,1H),7.65(s,1H),7.58(dd,J＝9.2,2.5Hz,1H),7.27(s,2H),5.75(d,J＝16.3Hz,1H),5.31(d,J＝16.3Hz,1H),5.26(s,2H),4.69(s,1H),4.36(dd,J＝39.0,12.7Hz,2H),3.16(dd,J＝15.3,7.6Hz,2H),3.12–2.84(m,4H),1.97–1.79(m,4H),1.46(s,9H),1.41(t,J＝7.7Hz,3H),1.30(dd,J＝20.2,11.5Hz,4H),1.04(t,J＝7.4Hz,3H)。
3.4化合物24的制备
化合物23(0.2g,0.32mmol)溶于10mL 20％TFA/DCM溶液，室温下反应2h。反应完成后，旋干溶剂以柱层析分离纯化的淡黄色固体170mg，收率100％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.32(s,1H),8.17(d,J＝9.1Hz,1H),7.97(d,J＝2.5Hz,1H),7.90(s,2H),7.65(dd,J＝9.2,2.5Hz,1H),7.32(s,1H),6.53(s,1H),5.44(s,2H),5.33(s,2H),4.18(dd,J＝79.7,11.1Hz,2H),3.18(dd,J＝15.2,7.3Hz,2H),3.14–2.88(m,2H),2.81(s,2H),1.87(dt,J＝21.4,7.0Hz,5H),1.38–1.20(m,6H),0.89(t,J＝7.3Hz,3H)。
3.5化合物25的制备
将化合物24(420mg,0.67mmol)以THF溶液分散后，先后向体系中加入DIEA(0.35mL,2.0mmol)，化合物21(228mg,0.73mmol)，室温下反应12h,反应完全后，将反应液旋干，以柱层析分离得390mg白色固体，收率79.6％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.45(d,J＝4.5Hz,1H),8.18(d,J＝9.2Hz,1H),7.80(d,J＝1.7Hz,1H),7.69–7.59(m,3H),7.55(d,J＝9.2Hz,1H),7.15(t,J＝5.3Hz,1H),6.94(t,J＝5.7Hz,1H),5.73(d,J＝16.3Hz,1H),5.30(t,J＝8.1Hz,2H),5.24(s,2H),4.35(dd,J＝41.7,12.3Hz,2H),3.28(d,J＝20.2Hz,2H),3.13(dt,J＝13.1,6.9Hz,4H),3.05(d,J＝12.4Hz,1H),2.92(dd,J＝26.0,13.3Hz,1H),2.65(t,J＝6.5Hz,2H),1.89(dd,J＝15.8,8.2Hz,4H),1.45–1.27(m,6H),1.02(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.9,171.2,159.3,157.6,153.2,151.5,150.4,150.2,149.5,147.1,146.9,145.1,137.2,131.7,127.5,127.1,125.8,121.2,120.5,118.4,114.4,97.9,72.8,66.3,49.4,45.0,36.3,35.8,35.1,31.6,23.1,14.0,7.8.HR-MS(ESI):m/z calcd for C37H39N5NaO7S2[M+Na]+:752.2183,found 752.2212。
3.6化合物26的制备
将化合物25(500mg,0.7mmol)溶于5mL DMF，向其中加入二硫苏糖醇(210mg,1.4mmol)，室温下反应2h。反应完全后，以30mL水稀释反应液，以DCM/MeOH混合溶液萃取，合并有机相，以无水硫酸钠干燥，以柱层析分离纯化得黄色固体180mg，收率41.5％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.18(d,J＝9.2Hz,1H),7.80(d,J＝2.0Hz,1H),7.64(s,1H),7.55(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H),5.94(s,1H),5.73(d,J＝16.3Hz,1H),5.29(d,J＝16.3Hz,1H),5.23(s,2H),4.36(dd,J＝40.1,12.0Hz,2H),4.09(s,1H),3.27(d,J＝22.2Hz,2H),3.14(dd,J＝15.2,7.5Hz,2H),3.10–3.00(m,1H),2.92(d,J＝12.4Hz,1H),2.85(dd,J＝14.7,6.7Hz,2H),2.53(t,J＝6.6Hz,2H),1.98–1.78(m,6H),1.63(t,J＝8.3Hz,1H),1.40(t,J＝7.6Hz,3H),1.02(t,J＝7.3Hz,3H).MS(ESI)m/z＝621.3[M+H]+。
3.7化合物CA-PT的制备
将化合物II(180mg,马来酰亚胺单元摩尔数69.7μmol)溶于8mL DMSO后，再向其中加入化合物26(47.5mg,76.7μmol)及10μL DIEA，氮气保护下反应6h后，反应基本完全，将反应液以去离子水透析2h后，冻干，所得固体以EtOH洗涤后，复溶，二次冻干，最终得黄色泡状固体。
实施例4
化合物CA-GT的制备
4.1化合物27的制备
将SN38(2.0g,5.1mmol)分散于150mL DCM中，向其中加入Boc2O(1.45g,6.64mmol)，吡啶(12.3mL,0.15mol)，室温下反应过夜。反应完全后以40mL 0.5N HCl(aq)洗涤三次，饱和NaHCO3溶液洗涤，无水Na2SO4干燥后过滤旋干，得淡黄色固体粉末2.56g，收率100％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.22(d,J＝9.2Hz,1H),7.85(d,J＝2.5Hz,1H),7.67(s,1H),7.63(dd,J＝9.2,2.5Hz,1H),5.72(d,J＝16.3Hz,1H),5.29(d,J＝16.3Hz,1H),5.23(d,J＝0.8Hz,2H),4.25(s,1H),3.14(q,J＝7.7Hz,2H),1.94–1.85(m,2H),1.62(s,9H),1.40(t,J＝7.7Hz,3H),1.02(t,J＝7.4Hz,3H)。
4.2化合物28的制备
化合物27(1.0g,2.03mmol)以15mL DCM溶解后，向其中加入N-Boc-甘氨酸(0.710g,4.06mmol)，EDCI(0.465g,2.43mmol)，DMAP(0.372g,3.05mmol)，室温下反应过夜。反应完全后，以DCM萃取，有机相先后以饱和氯化铵溶液，饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥后以柱层析分离纯化得1.2g淡黄色固体，收率90.9％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.17(d,J＝9.2Hz,1H),8.08(d,J＝2.1Hz,1H),7.74(dd,J＝9.2,2.3Hz,1H),7.44(t,J＝6.0Hz,1H),7.22(s,1H),5.52(s,2H),5.32(d,J＝6.9Hz,2H),3.95(dd,J＝17.9,6.0Hz,1H),3.82(dd,J＝17.9,5.9Hz,1H),3.19(dd,J＝14.1,6.6Hz,2H),2.15(td,J＝13.6,7.1Hz,2H),1.54(s,9H),1.43–1.36(m,9H),1.28(t,J＝7.5Hz,3H),0.93(t,J＝7.3Hz,3H)。4.3化合物29的制备
化合物28(1.2g,1.85mmol)溶于10mL 20％TFA/DCM溶液，室温下反应2h。反应完成后，旋干溶剂后以柱层析分离纯化的淡黄色固体0.95g，收率95％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.49(s,1H),8.17–7.91(m,1H),7.44(dd,J＝6.4,2.5Hz,2H),7.18(s,1H),5.54(s,2H),5.31(d,J＝4.8Hz,2H),4.34(d,J＝18.0Hz,1H),4.10(d,J＝18.0Hz,2H),3.10(dt,J＝14.1,7.1Hz,2H),2.25–2.11(m,2H),1.30(t,J＝7.5Hz,3H),0.95(t,J＝7.3Hz,3H)。
4.4化合物30的制备
化合物29(500mg,0.91mmol)以DCM分散于DCM中，向其中加入DIEA(0.16mL,0.91mmol)及化合物21(312mg,1.0mmol)后于室温条件下反应过夜。反应完全后，将反应液旋干，以柱层析方式纯化得淡黄色固体320mg，收率54.4％，熔点185-187℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.34(s,1H),8.56(t,J＝5.9Hz,1H),8.41(d,J＝4.3Hz,1H),8.03(d,J＝8.9Hz,1H),7.79–7.69(m,2H),7.45–7.38(m,2H),7.18(dd,J＝8.5,3.2Hz,1H),7.05(s,1H),5.49(s,2H),5.27(s,2H),4.19(dd,J＝17.9,5.9Hz,1H),4.02(dd,J＝17.9,5.8Hz,1H),3.12–2.98(m,4H),2.61–2.53(m,2H),2.20–2.09(m,2H),1.29(t,J＝7.6Hz,3H),0.91(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.4,168.9,167.1,159.0,156.8,156.5,149.5,148.6,146.9,145.1,143.6,142.7,137.7,131.5,128.2,127.9,122.4,121.0,119.0,117.9,104.8,94.3,79.1,76.2,66.3,49.4,34.1,33.7,30.3,22.2,13.3,7.5.HR-MS(ESI):m/z calcd for C32H30N4NaO7S2[M+Na]+:669.1448,found 669.1446。
4.5化合物31的制备
将化合物30(320mg,0.5mmol)溶于3mL DMF，向其中加入二硫苏糖醇(154mg,1.0mmol)，室温下反应2h。反应完全后，以10mL水稀释反应液，以DCM/MeOH混合溶液萃取，合并有机相，以无水硫酸钠干燥，以柱层析分离纯化得黄色固体180mg，收率66.9％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.32(d,J＝7.5Hz,1H),8.49(t,J＝5.2Hz,1H),8.04(d,J＝8.3Hz,1H),7.42(d,J＝8.7Hz,2H),7.25(s,1H),7.05(s,1H),6.49(s,1H),5.45(d,J＝25.0Hz,2H),5.29(s,2H),4.17(dd,J＝17.6,5.7Hz,1H),4.01(dd,J＝17.8,5.8Hz,1H),3.09(dd,J＝14.6,7.2Hz,2H),2.66(d,J＝4.2Hz,2H),2.47–2.31(m,2H),2.14(dd,J＝13.9,6.4Hz,2H),1.29(t,J＝6.0Hz,3H),0.95–0.83(m,3H).MS(ESI)m/z＝537.9[M+H]+。
4.6化合物CA-GT的制备
将化合物II(350mg,马来酰亚胺单元摩尔数135μmol)溶于8mL DMSO后，再向其中加入化合物31(80mg,149μmol)及10μL DIEA，氮气保护下反应6h后，反应基本完全，将反应液以去离子水透析2h后，冻干，所得固体以乙醇洗涤后，复溶，二次冻干，最终得黄色泡状固体。
实施例5
化合物CA-AT的制备
5.1化合物32的制备
化合物27(1.0g,2.03mmol)与β-丙氨酸(0.77g,4.06mmol)，EDCI(467mg,2.43mmol)，DMAP(371.5mg,3.0mmol)以DCM溶解后，室温下反应12h。反应完全后，反应液以DCM稀释后，以饱和氯化铵水溶液、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，以柱层析分离纯化得淡黄色固体1.18g，收率87.7％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.23(d,J＝9.2Hz,1H),7.90(d,J＝2.2Hz,1H),7.68(dd,J＝9.2,2.3Hz,1H),7.27(s,1H),7.18(s,1H),5.71(d,J＝17.2Hz,1H),5.41(d,J＝17.2Hz,1H),5.23(d,J＝20.7Hz,2H),3.48(d,J＝5.3Hz,1H),3.40(dt,J＝12.8,6.6Hz,1H),3.16(q,J＝7.6Hz,2H),2.83–2.61(m,2H),2.33–2.10(m,2H),1.62(s,9H),1.45(dd,J＝17.3,10.3Hz,3H),1.39(s,9H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H)。
5.2化合物33的制备
化合物32(1.2g,1.85mmol)溶于10mL 20％TFA/DCM溶液，室温下反应2h。反应完成后，旋干溶剂以柱层析分离纯化的淡黄色固体0.95g，收率95％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.45(s,1H),8.02(d,J＝9.8Hz,1H),7.84(s,3H),7.43(d,J＝7.0Hz,2H),7.04(s,1H),5.51(s,2H),5.30(d,J＝2.7Hz,2H),3.14–3.07(m,2H),3.07–3.00(m,2H),2.94(dd,J＝12.1,6.7Hz,2H),2.18(q,J＝7.2Hz,2H),1.29(t,J＝7.5Hz,3H),0.92(t,J＝7.3Hz,3H)。
5.3化合物34的制备
化合物33(327mg,0.95mmol)以DCM分散于DCM中，向其中加入DIEA(0.5mL,2.85mmol)及化合物21(327mg,1.05mmol)后于室温条件下反应过夜。反应完全后，将反应液旋干后以柱层析方式纯化得淡黄色固体510mg，收率81.3％，熔点210-212℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.30(s,1H),8.41(d,J＝4.0Hz,1H),8.10(t,J＝4.8Hz,1H),8.00(d,J＝9.3Hz,1H),7.74(t,J＝7.7Hz,1H),7.60(d,J＝8.1Hz,1H),7.37(d,J＝7.8Hz,2H),7.24–7.16(m,1H),6.97(s,1H),5.48(s,2H),5.24(s,2H),3.33–3.18(m,2H),3.12–3.00(m,2H),2.90(t,J＝6.8Hz,2H),2.81–2.62(m,2H),2.55–2.62(m,2H),2.15(dd,J＝14.1,6.8Hz,2H),1.28(t,J＝7.4Hz,3H),0.91(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.5,170.0,167.3,159.1,156.7,156.5,149.4,148.5,146.9,145.3,143.6,142.7,137.6,131.4,128.2,127.9,122.4,121.0,118.8,117.8,104.8,93.9,79.1,75.9,66.3,49.4,34.5,34.0,33.2,30.3,22.2,13.3,7.5.HR-MS(ESI):m/z calcd for C33H33N4O7S2[M+H]+:661.1791,found 661.1763。
5.4化合物35的制备
将化合物34(320mg,0.5mmol)溶于3mL DMF，向其中加入二硫苏糖醇(154mg,1.0mmol)，室温下反应2h。反应完全后，以10mL水稀释反应液，以DCM/MeOH混合溶液萃取，合并有机相，以无水Na2SO4干燥，以柱层析分离纯化得黄色固体180mg，收率65.3％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.31(s,1H),8.06–7.97(m,2H),7.44–7.34(m,2H),6.98(s,1H),5.49(s,2H),5.25(d,J＝3.7Hz,2H),3.34–3.18(m,2H),3.06(q,J＝7.1Hz,2H),2.73(qd,J＝16.6,8.4Hz,2H),2.66–2.52(m,2H),2.47–2.28(m,2H),2.21–2.06(m,2H),1.28(t,J＝7.4Hz,3H),0.92(t,J＝7.3Hz,3H).HR-MS(ESI):m/z calcd for C28H30N3O7S[M+H]+:552.1804,found 552.1790。
5.5化合物CA-AT的制备
将化合物II(300mg,马来酰亚胺单元摩尔数115μmol)溶于8mL DMSO后，再向其中加入化合物35(70mg,127μmol)及10μL DIEA，氮气保护下反应6h后，反应基本完全，将反应液以去离子水透析2h后，冻干，所得固体以EtOH洗涤后，复溶，二次冻干，最终得黄色泡状固体。
实施例6
化合物CA-P的制备
6.1化合物36的制备
将化合物2(161mg,0.95mmol)分散于10mL DCM，向其中加入HATU(433mg,1.14mmol)，DIEA(0.5mL,2.85mmol)后反应15min，再向其中加入化合物24(600mg,0.95mmol)，室温下反应过夜。反应完全后，以DCM稀释反应液，有机相以水、饱和氯化钠洗后，以无水硫酸钠干燥，经柱层析色谱分离纯化后得500mg黄色固体，收率76.8％，熔点176-178℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.19(d,J＝9.1Hz,1H),7.82(d,J＝1.8Hz,1H),7.63(s,1H),7.57(dd,J＝9.1,1.9Hz,1H),6.72(s,2H),5.90(t,J＝5.5Hz,1H),5.74(d,J＝16.3Hz,1H),5.30(d,J＝16.3Hz,1H),5.25(s,2H),4.35(dd,J＝41.2,12.3Hz,2H),3.94(s,1H),3.86(t,J＝7.1Hz,2H),3.24(s,1H),3.15(dd,J＝15.1,7.4Hz,3H),3.06(t,J＝12.5Hz,1H),2.91(dd,J＝25.1,13.3Hz,1H),2.57(t,J＝7.1Hz,2H),1.97–1.85(m,2H),1.80(s,3H),1.74(s,1H),1.40(t,J＝7.6Hz,3H),1.03(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.9,170.5,169.8,157.6,153.2,151.5,150.4,150.2,147.2,147.0,145.1,134.3,131.8,127.5,127.1,125.8,118.4,114.4,97.9,72.8,66.3,49.4,44.8,44.6,44.2,36.1,34.8,34.3,31.6,29.9,29.5,23.2,14.0,7.9.HR-MS(ESI):m/z calcd for C36H37N5NaO9[M+Na]+:706.2483,found 706.2529。
6.2化合物CA-P的制备
将化合物18(100mg,120μmol)与化合物36(83mg,120μmol)溶于10mL DCM中，向其中加入20μL DIEA后，在氮气保护下，室温反应2h。反应完成后，将反应液旋干，以柱层析分离纯化目标产物，最终得黄色固体85mg，收率46.4％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.00(s,1H),8.17(d,J＝9.1Hz,1H),8.04(t,J＝5.6Hz,1H),7.99(d,J＝10.7Hz,2H),7.66(d,J＝9.4Hz,1H),7.33(s,1H),6.53(s,1H),5.44(s,2H),5.34(s,2H),4.25(d,J＝11.1Hz,1H),4.14–3.98(m,3H),3.61(dd,J＝14.7,7.2Hz,4H),3.50(s,38H),3.40(d,J＝5.8Hz,2H),3.17(dd,J＝14.5,9.4Hz,6H),3.11–2.93(m,4H),2.84(dt,J＝13.2,8.7Hz,2H),2.73(t,J＝6.7Hz,2H),2.54(d,J＝3.9Hz,1H),2.47(s,2H),2.36(t,J＝7.4Hz,2H),1.87(tt,J＝14.0,7.2Hz,2H),1.30(t,J＝7.5Hz,3H),1.27-1.15(m,3H),0.88(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ176.5,174.8,172.5,171.9,170.7,169.3,164.1,161.3,156.8,152.7,151.6,150.0,146.2,145.9,145.2,130.9,128.4,127.0,126.0,118.9,114.9,96.5,72.3,69.8,69.7,69.7,69.7,69.5,69.5,69.0,65.2,49.5,48.6,43.8,36.0,35.4,35.1,32.9,30.2,29.4,22.2,13.8,7.7.HR-MS(ESI):m/z calcdfor C66H95N10O24S3[M+H]+:1507.5683,found1507.5691。
实施例7
化合物CA-G的制备
7.1化合物37的制备
将化合物2(93mg,0.55mmol)分散于10mL DCM，向其中加入HATU(251mg,0.66mmol)，DIEA(212.8mg,1.65mmol)后反应15min，再向其中加入化合物29(300mg,0.55mmol)，室温下反应过夜。反应完全后，以DCM稀释反应液，有机相以水、饱和氯化钠洗后，以无水硫酸钠干燥，经柱层析色谱分离纯化后得220mg黄色固体，收率66.7％，熔点195-196℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.35(s,1H),8.53(t,J＝5.8Hz,1H),8.03(d,J＝8.9Hz,1H),7.41(d,J＝8.6Hz,2H),7.04(s,1H),6.96(s,2H),5.49(s,2H),5.38–5.17(m,2H),4.07(ddd,J＝67.2,17.9,5.8Hz,2H),3.59(t,J＝7.5Hz,2H),3.08(dd,J＝14.3,6.8Hz,2H),2.41(t,J＝7.4Hz,2H),2.21–2.07(m,2H),1.29(t,J＝7.4Hz,3H),0.92(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.7,169.9,168.9,167.1,156.8,156.5,148.6,146.9,145.1,143.6,142.8,134.5,131.4,128.2,127.9,122.4,117.9,104.7,94.2,76.2,66.3,49.4,33.7,33.3,30.3,22.2,13.3,7.5.HR-MS(ESI):m/z calcd for C31H28N4NaO9 +[M+Na]+:623.1748,found 623.1758。
7.2化合物CA-G的制备
将化合物18(100mg,0.12mmol)与化合物37(73mg,0.12mmol)溶于20mL DCM与MeOH混合溶液中，向其中加入20μL DIEA后，在氮气保护下，室温反应2h。反应完成后，将反应液旋干，以柱层析分离纯化目标产物，最终得黄色粘稠物150mg，收率86.7％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.02(s,1H),10.33(s,1H),8.54(s,1H),8.08–7.92(m,2H),7.41(d,J＝8.8Hz,2H),7.04(s,1H),5.49(s,2H),5.28(s,2H),4.13(dd,J＝13.3,8.1Hz,2H),4.05–3.95(m,2H),3.59(d,J＝6.4Hz,4H),3.49(d,J＝3.5Hz,38H),3.40(t,J＝5.8Hz,2H),3.24–3.15(m,6H),3.10(dd,J＝17.2,8.6Hz,3H),2.97–2.87(m,1H),2.83–2.77(m,1H),2.74(t,J＝6.6Hz,2H),2.43–2.34(m,2H),2.24–2.07(m,2H),1.29(t,J＝7.4Hz,3H),0.92(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO DMSO-d6)δ176.4,174.7,171.8,170.7,169.7,168.9,167.1,164.1,161.1,156.8,156.5,148.6,146.9,145.1,143.6,142.8,131.5,128.2,127.9,122.4,117.9,104.7,94.2,76.3,69.7,69.6,69.5,69.5,69.0,66.3,49.4,48.6,36.0,34.7,32.3,30.3,30.2,30.2,30.2,29.3,22.2,13.3,7.5.HR-MS(ESI):m/z calcdfor C61H86N9O24S3[M+H]+:1424.4948,found 1424.5017。
实施例8
化合物CA-A的制备
8.1化合物38的制备
将化合物2(72mg,0.43mol)分散于10mL DCM中，向其中加入HATU(176mg,0.46mmol)，DIEA(0.19mL,1.07mmol)，化合物33(200mg,0.36mmol)后，室温下反应12h，反应完全后以水稀释反应液，DCM萃取，有机相以饱和氯化铵水溶液、饱和食盐水洗后，以无水Na2SO4干燥，过滤旋干后以柱层析分离纯化，得淡黄色固体135mg，收率61.0％，熔点203-205℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.28(s,1H),8.12(t,J＝5.3Hz,1H),7.91(d,J＝9.8Hz,1H),7.35(d,J＝7.2Hz,2H),6.99(s,1H),6.83(s,2H),5.49(s,2H),5.26(s,2H),3.56–3.45(m,1H),3.43–3.35(m,1H),3.30–3.24(m,1H),3.17(d,J＝5.3Hz,1H),3.07(dd,J＝14.6,7.0Hz,2H),2.82–2.70(m,1H),2.65(dt,J＝16.9,5.9Hz,1H),2.30(ddd,J＝14.5,8.4,6.2Hz,1H),2.24–2.09(m,3H),1.29(t,J＝7.5Hz,3H),0.91(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.5,170.4,169.6,167.3,156.7,156.6,148.6,146.9,145.3,143.5,142.7,134.1,131.3,128.2,127.9,122.4,117.9,104.8,93.9,75.9,66.4,49.4,34.2,34.1,34.1,33.0,30.3,22.2,13.3,7.5.HR-MS(ESI):m/z calcd for C32H31N4O9[M+H]+:615.2091,found 615.2086。
8.2化合物CA-A的制备
将化合物38(80.5mg,98μmol)与化合物18(60mg,98μmol)溶于20mL DCM中，向其中加入20μL DIEA后，在氮气保护下，室温反应2h。反应完成后，将反应液旋干，以柱层析分离纯化目标产物，最终得黄色固体80mg，收率57.1％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.03(s,1H),10.34(s,1H),8.11(s,1H),7.99(t,J＝7.6Hz,2H),7.40(d,J＝6.8Hz,2H),6.99(s,1H),5.49(s,2H),5.27(s,2H),4.11(s,1H),3.90(td,J＝10.1,4.0Hz,1H),3.59(s,3H),3.50(s,41H),3.30–3.23(m,1H),3.19(dd,J＝12.6,4.3Hz,5H),3.08(dd,J＝14.3,6.7Hz,2H),3.05–2.98(m,1H),2.93(dt,J＝10.5,5.9Hz,1H),2.80(dd,J＝13.1,6.5Hz,1H),2.74(t,J＝6.6Hz,3H),2.66(dd,J＝16.9,6.3Hz,1H),2.46–2.38(m,1H),2.35–2.27(m,1H),2.23(dd,J＝14.2,6.9Hz,1H),2.15(dd,J＝15.2,7.7Hz,2H),1.29(t,J＝7.4Hz,3H),0.92(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ176.3,176.2,174.6,171.8,170.7,170.5,169.5,167.3,164.1,161.2,156.8,156.6,148.6,146.9,145.4,143.5,142.8,128.2,127.9,122.4,117.8,104.8,93.9,75.9,69.7,69.7,69.6,69.6,69.5,69.0,66.3,66.3,49.4,48.6,35.8,35.1,34.3,33.0,30.2,29.4,22.2,13.3,7.5.HR-MS(ESI):m/z calcdfor C62H88N9O24S3[M+H]+:1438.5104,found 1438.5144。
实施例9
偶联物相对分子量测定
将偶联物以DMSO溶解配置成5mM母液，将其分别稀释为37.5μM，25μM，18.75μM，12.5μM，6.25μM，以紫外风光光度计在200-800nm范围内测定其吸光度曲线，并计算多价配体药物偶联物的相应分子量。图3为紫外吸收曲线图，其中CA-PT，CA-P的最大吸收波长为365nm，CA-GT，CA-G，CA-AT，CA-A的最大吸收波长为370nm；图4为CA-P，CA-G，CA-A的标准曲线；表1为CA-PT，CA-GT，CA-AT的计算相对分子量及相应配体药物比例，其中偶联物中的配体/药物比例均接近于1:1。
表1偶联物计算分子量
实施例10
偶联物的稳定性及降解能力评价
10.1将偶联物CA-PT,CA-GT,CA-AT以DMSO溶解后配制成10mg/mL的DMSO溶液，将1mL以PBS稀释为1mg/mL样品液后置于分子量为2000D的透析袋中，并将之放于10mL PBS的外液中透析，于37℃摇床中孵育。于不同时间点取PBS外液1mL，并向体系中补加1mL PBS溶液。以HPLC测定透析液中药物含量。
10.2将化合物CA-P，CA-G,CA-A以DMSO溶解后配制成5mM的母液，分别以PBS稀释成50μM的测试液，置于37℃摇床中孵育。于不同时间点取样50μL，以50μL乙腈稀释，混合均匀后取50μL样品以HPLC测定其中的药物浓度。
图5为偶联物在PBS中的药物释放量曲线，与单配体化合物CA-P，CA-G，CA-A相比，多价配体偶联物的稳定性均明显增加。
实施例11
偶联物肿瘤细胞靶向能力评价
将偶联物在A549细胞中分别在常氧及乏氧条件下孵育8和24h，吸去培养液后，以PBS清洗细胞，并以4％多聚甲醛固定并洗涤，在405nm激发波长下，观察细胞荧光强度以确定药物对肿瘤细胞的靶向能力。结果如图6所示，常氧条件下，所有偶联物孵育的细胞均表现出较伊立替康所孵育细胞更强的荧光强度，即细胞摄取能力增加；多价配体药物偶联物CA-PT，CA-GT，CA-AT所孵育的细胞表现出较单配体药物偶联物CA-P，CA-G，CA-A所孵育细胞更强的荧光强度，表明多价配体体系表现出优于单配体药物偶联物的肿瘤细胞靶向能力；相比于常氧条件下，乏氧条件下偶联物所孵育的细胞荧光强度增强，表明乏氧条件下，偶联物的靶向能力增强。
图6A为偶联物CA-PT，CA-P及伊立替康盐酸盐在HCT116细胞中激光共聚焦成像结果，
图6B为偶联物CA-GT，CA-G，CA-AT，CA-A在HCT116细胞中激光共聚焦成像结果。
实施例12
偶联物抗肿瘤细胞增殖活性评价
将化合物CA-PT，CA-GT，CA-AT，CA-P，CA-G，CA-A与伊立替康盐酸盐，SN-38在人肾癌细胞769-P，人结肠癌细胞HCT-116，人肝癌细胞HepG2，人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231，人胰腺癌细胞MIA-PACA-2共7种细胞株中分别孵育72h，用MTT法测定细胞相对活力，结果如表2所示，化合物CA-PT及CA-P表现出与伊立替康相当的体外抗肿瘤活性，且CA-PT的体外抗肿瘤活性优于CA-P；化合物CA-GT，CA-G表现出与SN38相当的体外抗肿瘤活性，且CA-GT的体外抗肿瘤活性优于CA-G，多价配体药物偶联物表现出优于单配体药物偶联物的体外抗肿瘤活性。
表2偶联物抗肿瘤细胞增殖活性评价
Claims (9)
1.一种具有乏氧靶向性的多价配体药物偶联物，其特征在于，该药物偶联物具有以下结构通式：
其中，该药物偶联物的主链结构为分子量为2kDa～200kDa的葡聚糖；
L代表乏氧配体的巯基衍生物片段；
D代表抗肿瘤药物的巯基衍生物片段；
x为该药物偶联物中衍生化葡聚糖上未被取代的葡聚糖单元比例，x＝0.6～1，其单元数为所用葡聚糖的葡萄糖单元总数*x；
p为该药物偶联物中衍生化葡聚糖上与乏氧配体连接的葡聚糖单元比例，p＝0～0.27，其单元数为所用葡聚糖总单元数中葡萄糖单元总数*p；
q为该药物偶联物中衍生化葡聚糖上与抗肿瘤药物分子连接的葡聚糖单元比例，q＝0～0.27，其单元数为所用葡聚糖总单元数中葡萄糖单元总数*q；且x+p+q＝1。
2.根据权利要求1所述的多价配体药物偶联物，其特征在于，该药物偶联物由马来酰亚胺衍生化葡聚糖通过生物正交反应连接具有巯基片段的乏氧靶向性配体及抗肿瘤药物分子获得；所述马来酰亚胺衍生化葡聚糖具有如下结构：
其中，x代表该马来酰亚胺衍生化葡聚糖上未被取代的葡聚糖单元比例，x＝0.6～1，其单元数为所用葡聚糖的葡萄糖单元总数*x；
y代表该马来酰亚胺衍生化葡聚糖中马来酰亚胺化衍生化葡聚糖单元比例，y＝0～0.4，其单元数为所用葡聚糖的葡萄糖单元总数*y。
3.根据权利要求1所述的多价配体药物偶联物，其特征在于，L代表的乏氧配体的巯基衍生物片段选自碳酸酐酶9抑制剂或其衍生物。
4.根据权利要求3所述的多价配体药物偶联物，其特征在于，所述碳酸酐酶9抑制剂为乙酰唑胺或其衍生物。
5.根据权利要求4所述的多价配体药物偶联物，其特征在于，所述乙酰唑胺或其衍生物为乙酰唑胺的PEG化衍生物，其中，PEG长度为1～12个聚乙二醇单元。
6.根据权利要求1所述的多价配体药物偶联物，其特征在于，D代表抗肿瘤药物的巯基衍生物，其中抗肿瘤药物为喜树碱、紫杉醇及其衍生物中的任意一种或几种混合。
7.根据权利要求6所述的多价配体药物偶联物，其特征在于，所述喜树碱衍生物为7-乙基-10-羟基喜树碱或依沙替康；所述紫杉醇衍生物为多西他赛或卡巴他赛。
8.根据权利要求7所述的多价配体药物偶联物，其特征在于，所述7-乙基-10-羟基喜树碱的巯基衍生物具有以下结构：
其中，L1为二胺类取代基；
L2为巯基衍生类羧酸；
L3为甘氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸和6-氨基己酸中任意一种；
所述二胺类取代基为哌嗪基、4-氨基哌嗪基、4-氨甲基哌嗪基和N,N-二甲基乙胺基中任意一种；
所述巯基衍生类羧酸为巯基乙酸、巯基丙酸和N-乙酰半胱氨酸中任意一种；L3为甘氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸和6-氨基己酸中任意一种。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的多价配体药物偶联物，其特征在于，所述乏氧配体的巯基衍生物片段L与抗肿瘤药物巯基衍生物片段D的比例为1:0.5～2。
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