CN115141309A - 一种可特异性清除nadph的聚合物、多功能纳米药物及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种可特异性清除NADPH的聚合物、多功能纳米药物及制备方法和应用,所述聚合物结构式为:
Description
技术领域
本发明涉及纳米药物载体技术领域,尤其涉及一种高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物及制备方法、一种CD44/CA IX双靶向性的乳化剂及制备方法、一种可特异性清除肿瘤细胞内NADPH的多功能纳米药物的制备方法及应用。
背景技术
根据国际癌症研究机构(IARC)和美国癌症协会(ACS)的最新数据,乳腺癌已成为全球确诊人数最多的癌症。在不同类型的乳腺癌中,三阴性乳腺癌因其侵袭性强、转移率高、复发率高的特点,导致其晚期五年生存率仅为14%。近年来,随着免疫检查点阻断疗法在临床中取得的巨大成功,使其成为了三阴性乳腺癌的又一主要辅助治疗手段。目前,美国食品药品监督管理局已批准两种抗PD-(L)1药物(派姆单抗和阿特珠单抗)与化疗联合应用于三阴性乳腺癌的新辅助治疗。相关临床结果表明,三阴性乳腺癌PD-L1表达与其治疗效果呈正相关。但由于个体间差异,目前仅有20%的三阴性乳腺癌呈现PD-L1过表达,这极大地限制了该疗法在临床中的进一步应用。同时,严重的免疫抑制性肿瘤微环境(TME)也会进一步限制免疫检查点阻断疗法的疗效。因此,如何扩大PD-(L)1免疫节点阻断疗法的受益人群并缓解其肿瘤微环境的免疫抑制性是提高三阴性乳腺癌免疫治疗效果的关键。
由于细胞代谢过程及产物是肿瘤细胞和免疫细胞维持活力及功能的关键因素之一,因此通过调节肿瘤微环境的代谢过程被认为是改变肿瘤细胞状态并缓解肿瘤免疫抑制性的一种非常有潜力的策略。而在众多肿瘤代谢调节手段中,具有较强靶向性的放疗受到了越来越多的关注。一方面,对于高剂量放疗,它能够有效造成肿瘤细胞DNA损伤以诱导其发生免疫原性细胞死亡(ICD)并上调PD-L1的表达,从而最终将“冷肿瘤”逆转为“热肿瘤”并提高抗PD-L1治疗的响应率。然而,高剂量放疗也会损伤肿瘤组织内已存在的免疫细胞,影响免疫治疗效果。另一方面,当肿瘤组织接受低剂量放疗时,为了缓解由低剂量放疗所引起的氧化应激,免疫细胞会上调磷酸戊糖途径(PPP)以产生更多的抗氧化化合物,如:还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。NADPH不仅能清除活性氧(ROS)以抑制肿瘤相关巨噬细胞(TAM)向具有免疫抑制性的M2型极化,还能驱动其它免疫相关代谢途径的改变。如,NADPH可以直接参与新生CD8+T细胞和M1巨噬细胞中脂肪酸及质膜的合成,从而进一步缓解肿瘤微环境的免疫抑制性。但新生的NADPH也能为快速生长的肿瘤细胞提供脂质合成原料并修复其DNA损伤,从而阻碍其免疫源性死亡及PD-L1表达的增加。由此可见,由于放疗的免疫调节效应与其剂量密切相关,使得放疗难以同时实现肿瘤细胞PD-L1表达量的升高及肿瘤微环境免疫抑制性的缓解,从而严重阻碍了放疗与免疫节点阻断剂联合治疗在三阴性乳腺癌中的临床应用。
因此,亟需开发一种有效的低剂量放疗佐剂在缓解肿瘤免疫抑制微环境的同时,能够靶向清除肿瘤细胞内NADPH并固定放疗过程中的DNA损伤以增加肿瘤表面PD-L1表达,从而最终提高抗PD-L1免疫治疗效率。
发明内容
本发明的目的是克服放疗与免疫节点阻断剂联合治疗三阴性乳腺癌的局限性,提供一种高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物及其制备方法、一种CD44/CA IX双靶向性的乳化剂及其制备方法、利用该聚合物和乳化剂制备可特异性清除肿瘤细胞内NADPH的多功能纳米药物、利用该纳米药物在癌症放射-免疫代谢调节疗法的应用,以解决上述问题。
本发明通过以下技术方案实现:
第一个方面,本发明提供一种高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物,所述高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物的结构式为:
其中,x为1-77的正整数,y为1-55的正整数,z为1-8的正整数。
第二个方面,本发明提供一种上述高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物的制备方法,所述制备方法是以丙烯腈(AN)、丙烯酰胺(AAm)和N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺(NIEAAm)为单体通过自由基聚合反应合成所述高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物。
进一步地,所述制备方法包括以下步骤:
溶解:取丙烯腈、丙烯酰胺及N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺、链转移剂半胱胺盐酸盐、偶氮二异丁腈及溶剂1N,N-二甲基甲酰胺,溶解后得到第一混合液;
除氧:对所述第一混合液进行除氧;
反应:除氧后的所述第一混合液在55-75℃下反应20-30h,得到聚(丙烯酰胺-丙烯腈-N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺),所述聚(丙烯酰胺-丙烯腈-N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺)为所述高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物。
其中,丙烯酰胺、丙烯腈、N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺、半胱胺盐酸盐、偶氮二异丁腈及N,N-二甲基甲酰胺均可通过商业购买获得,并可以利用常规技术手段对其进行提纯。
进一步地,在所述高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物的制备方法中,在所述溶解步骤中,所述丙烯酰胺:所述丙烯腈:所述N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺的摩尔比为(60-70):(30-40):(10-30);所述半胱胺盐酸盐与所述偶氮二异丁腈的摩尔比为(5-10):1。
进一步地,所述除氧步骤是:对所述第一混合液密封、放入液氮中冷却,抽真空后解冻,通入氮气,反复三次。
进一步地,所述反应步骤是:除氧后的所述第一混合液放在65℃已预热的油浴中反应24h,冷却停止反应。
进一步地,所述高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物的制备方法还包括在反应后进行纯化,所述纯化步骤包括:将停止反应后地第一混合液在甲醇中重沉淀,离心收集沉淀物;用二甲亚砜溶解所述沉淀物,再向其中加入等量体积的超纯水,然后转移到分子量为800-1200的透析袋中,以超纯水为透析液,透析8-12h;将透析袋中溶液放置在-60℃至-90℃冷冻1天,再冷冻干燥1-3天,得到高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物。
优选地,在所述纯化的步骤中,用二甲亚砜溶解所述沉淀物,再向其中加入等量体积的超纯水,然后转移到分子量为1000的透析袋中,以超纯水为透析液,透析10h;将透析袋中溶液放置在-80℃冷冻1天,再冷冻干燥2天,得到高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物。
第三个方面,本发明提供一种CD44/CA IX双靶向性的乳化剂的结构式为:
其中,n为150,a为1-30的正整数,b为1-45的正整数。第四个方面,本发明提供一种上述CD44/CA IX双靶向性的乳化剂的制备方法,所述制备方法是将十六胺和羧基化的乙酰唑胺分别通过酰胺化和酯化反应连接在经过四丁基硫酸氢铵修饰的透明质酸的侧链以形成所述CD44/CA IX双靶向性的乳化剂。
进一步地,所述制备方法包括以下步骤:
溶解:取经过四丁基硫酸氢铵修饰的透明质酸、十六胺、(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)、N-羟基琥珀酰亚胺及溶剂2二甲基亚砜,溶解后得到第二混合液;
反应:所述第二混合液在30-40℃下反应20-30h;
再溶解:取羧基化乙酰唑胺、(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)、4-二甲氨基吡啶及溶剂2二甲基亚砜加入到反应后的第二混合液,溶解后得到第三混合液;
再反应:所述第三混合液在30-40℃下反应20-30h,得到CD44/CA IX双靶向性的乳化剂的粗产物。
其中,四丁基硫酸氢铵、透明质酸、十六胺、(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)、N-羟基琥珀酰亚胺、乙酰唑胺4-二甲氨基吡啶及二甲基亚砜均可通过商业购买获得,并可以利用常规技术手段对其进行提纯。
进一步地,在所述CD44/CA IX双靶向性的乳化剂的制备方法中,在所述溶解步骤中,所述(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺):所述N-羟基琥珀酰亚胺:所述十六胺:所述四丁基硫酸氢铵修饰的透明质酸的羧基端摩尔比为(0.1-0.3):(0.1-0.3):(0.1-0.3):1。
进一步地,所述反应步骤是:对所述第二混合液放在35℃已预热的油浴中反应24h。
进一步地,在所述CD44/CA IX双靶向性的乳化剂的制备方法中,在所述再溶解步骤中,所述(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺):所述4-二甲氨基吡啶:所述羧基化乙酰唑胺:所述四丁基硫酸氢铵修饰的透明质酸的羟基端的摩尔比为(0.2-0.4):(0.2-0.4):(0.2-0.4):1。
进一步地,所述再反应步骤是:对所述第三混合液放在35℃已预热的油浴中反应24h。
进一步地,所述CD44/CA IX双靶向性的乳化剂的制备方法还包括再反应后进行纯化,所述纯化地步骤包括:向停止反应后的第三混合液,向其中加入等量体积的超纯水,然后转移到分子量为10000-20000的透析袋中,以超纯水为透析液,透析2-4天;再向所述透析后的第三混合溶液,加入氯化钠并搅拌1-3h,再在冷丙酮中沉淀,离心收集沉淀物;用超纯水溶解所述沉淀物,再透析1-3天,在-60℃至-90℃冷冻1天,再冷冻干燥1-3天,得到所述CD44/CA IX双靶向性的乳化剂。
优选地,在所述纯化的步骤中,用超纯水溶解所述沉淀物,然后转移到分子量为14000的透析袋中,再透析2天,在-80℃冷冻1天,再冷冻干燥2天,得到所述CD44/CA IX双靶向性的乳化剂。
第五个方面,本发明提供一种可特异性清除肿瘤细胞内NADPH的多功能纳米药物的制备方法,包括以下步骤:
溶解:将所述聚合物和PD-L1小分子抑制剂(BMS202)溶于溶剂3二甲基亚砜,得到混合有机溶液,所述聚合物:BMS202的质量比为(40-110):1;将所述乳化剂溶于超纯水,得到含有乳化剂的水溶液;
乳化:向所述混合有机物溶液中加入含有乳化剂的水溶液,搅拌形成乳液,所述混合有机溶液和乳化剂的体积比为(1-2):(1-4);
超声:对所述乳液超声1-5min;
透析:用分子量为2000-5000的透析袋对超声后的所述乳液进行透析8-12h,得到所述可特异性清除肿瘤细胞内NADPH的多功能纳米药物;
其中,所述聚合物是通过高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物的制备方法制得。
其中BMS202是PD-L1小分子抑制剂,可通过商业购买获得。
进一步地,在所述多功能纳米药物的制备方法中,所述溶解步骤中,所述聚合物:BMS202的质量比为50:1;所述乳化步骤中,所述混合有机溶液和所述乳化剂的体积比为1:4;对所述乳液超声2min;所述透析袋的相对分子质量为3500、透析时间为10h。
第六个方面,本发明提供一种可特异性清除肿瘤细胞内NADPH的多功能纳米药物在癌症的放射-免疫代谢调节疗法中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:
(1)本发明合成一种新的聚合物——聚(丙烯酰胺-丙烯腈-N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺),具有多功能性。本发明成功将丙烯酰胺(AAm)、丙烯腈(AN)及和N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺(NIEAAm)合成为无规聚合物,由于丙烯酰胺(AAm)中大量N原子和O原子的存在,容易在分子内或者分子间形成氢键,此外,由于NIEAAm具有氧化性硝基咪唑基团,容易被肿瘤细胞内的NADPH还原成亲水性的氨基咪唑基团。最终使得聚(丙烯酰胺-丙烯腈-N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺)具有高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的功能特点。
(2)本发明合成了一种CD44/CA IX双靶向性的乳化剂。该乳化剂将疏水性的十六胺(HDA)和羧基化的乙酰唑胺(Z-COOH)分别通过酰胺化和酯化反应连接在四丁基硫酸氢铵修饰的透明质酸(HA-TBA)的侧链。由于透明质酸HA能够靶向肿瘤细胞表面CD44受体,乙酰唑胺Z能够靶向肿瘤缺氧标志物碳酸酐酶IX(CA IX),疏水的HDA能够与纳米粒子疏水核锚定,使得乳化剂具有双重靶向肿瘤的功能特点。
(3)本发明利用上述聚合物和乳化剂,构建成一种负载有抑制PD-1/PD-L1相互作用的小分子拮抗剂的可特异性清除肿瘤细胞内NADPH的多功能纳米药物。首先,该纳米载体可通过对肿瘤细胞表面CD44受体及肿瘤缺氧标志物碳酸酐酶IX(CA IX)的双重靶向作用选择性地富集于缺氧肿瘤细胞。由于载体中富含氧化性硝基咪唑基团且硝基还原酶(NTR)在缺氧的肿瘤细胞中存在高表达的情况,因此,即使在利用低剂量放疗上调戊糖磷酸途径(PPP)以重塑肿瘤免疫代谢微环境时,肿瘤细胞内的NADPH也可被特异性清除而维持在较低水平,从而有利于固定放疗过程中肿瘤细胞的DNA损伤以促进肿瘤表面PD-L1的表达及其免疫源性死亡。同时,当载体材料中的硝基咪唑基团被肿瘤细胞内的NADPH还原成亲水性的氨基咪唑基团时,聚合物的相转变温度也会因其亲/疏水性比率升高而自动降低至人体生理温度之下,从而导致纳米药物崩解及PD-L1抑制剂的快速释放,并最终与低剂量放疗联合以改善PD-L1检查点阻断疗法的响应效率及免疫治疗效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同聚合物的氢核磁谱图;
图2为不同聚合物的高临界相转变温度(UCST)测试结果图:a为PAA聚合物;b为PAAN-1聚合物;c为PAAN-2聚合物;
图3为不同乳化剂的氢核磁谱图;
图4为多功能纳米药物的靶向能力,电镜,药物控释和抑制PD-1/PD-L1相互作用能力的评价;a-c,4T1乳腺癌细胞在不同的条件下对HP NPs/C6和HZP NPs/C6摄取情况:a为激光共聚焦扫描显微镜图像,b-c为流式定量分析,d为BMS202@HZP NPs的形态;e-g,不同纳米粒子的特征:e为粒径,f为电位,g为载药量;h为BMS202@HZP NPs在不同的条件下的药物累积释放曲线;i-j,在缺氧条件下,BMS202@HZP NPs释放的BMS202抑制PE-PD-L1抗体与PD-L1受体相互作用情况:i为流式直方图,j为抑制效率;
图5为多功能纳米药物清除不同细胞内NADPH的能力评价:a为常氧条件下的RAW264.7细胞;b为常氧条件下的4T1细胞;c为缺氧条件下的4T1细胞;
图6为多功能纳米药物的体外治疗效率和免疫调节能力的评价;a-d,细胞毒性评估:a,b为空白纳米粒子HZP NPs,c,d为BMS202和BMS202@HZP NPs;e-h,平板克隆能力评估:e,g为平板克隆实验代表性图像,f,h为平板克隆效率;i-l,CRT的表达情况:i,k为蛋白质印迹图像,j,l为定量分析;m-q,使用transwell系统中的共培养模型进行体外远端肿瘤细胞治疗效果评估:m为示意图,n为IFN-γ的水平,o为TNF-α的水平,p为细胞的存活率,q为用calcein-AM染色的活细胞的图像;
图7为多功能纳米药物的介导的放射-免疫代谢调节疗法的体内效果评价:a为BMS202@HZP NPs介导的低剂量放疗(LDRT)对Balb/c荷瘤小鼠的治疗方案;b为肿瘤组织RNA-seq的火山图;c为肿瘤组织RNA-seq的热图;d-g,在经历10天治疗后,肿瘤组织中的免疫水平的变化:d为DCs,e为CD8+T淋巴细胞,f为CD8+T淋巴细胞/Tregs的比率,g为M1/M2的比率;h为经历10天治疗后,肿瘤切片CD8和GranB的免疫组化染色及CD86和CD206的免疫荧光染色图像;i-j,实验期间,肿瘤的生长情况i为平均生长曲线,j为每只荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线;k为荷瘤小鼠自肿瘤接种之日起的生存曲线;
图8为荷瘤小鼠经历0.9%NaCl和BMS202@HZP NPs治疗后的肿瘤组织的代谢分析:a为PCA分析图;b为OPLS-DA分析图;c为OPLS-DA的S曲线图;d为肿瘤差异代谢物的热图;e为基于差异代谢物的代谢途径富集分析;f为G6PD的酶活水平;g为6PGD的酶活水平;h为NADPH的水平;i为NADPH/NADP+的比率水平;j为BMS202@HZP NPs介导的LDRT通过上调磷酸戊糖途径(PPP)来逆转抑制性的肿瘤微环境(TME)的机制示意图;
图9多功能纳米药物的介导放射-免疫代谢调节疗法诱导的远隔效应和全身性抗肿瘤免疫效果的评价:a为BMS202@HZP NPs介导的低剂量放疗(LDRT)对Balb/c荷瘤小鼠原发性肿瘤和远端肿瘤的治疗方案;b-d,实验期间,原发性肿瘤和远端肿瘤的生长情况:b为原发性肿瘤的平均生长曲线,c为远端肿瘤的平均生长曲线,d为每只荷瘤小鼠的远端肿瘤生长曲线;e-g,在经历21天治疗后,肿瘤组织中的免疫水平的变化:e为CD3+T淋巴细胞,f为CD8+T淋巴细胞,h为TNF-α水平,i为IFN-γ水平,g为经历21天治疗后肿瘤切片的CD8和GranB的免疫组化染色及脾脏组织的CD8和CD20的免疫组化染色图像;j-l,不同治疗后的肺转移情况:j为苦味酸染色后的肺部组织图像,k为肺转移的结节数目,l为肺部切片H&E染色图像;m为BMS202@HZP NPs介导的LDRT诱导强烈的抗肿瘤免疫反应以增强远隔效应抑制远处肿瘤生长和肿瘤转移的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明的是,本发明实施例的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
在以下实施例中所使用到的丙烯酰胺(AAm)、丙烯腈(AN)、N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺(NIEAAm)、链转移剂半胱胺盐酸盐(AET·HCl)、偶氮二异丁腈(AIBN)、二甲基亚砜(DMSO)、透明质酸(HA)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)(EDC)、四丁基硫酸氢铵(TBA)、乙酰唑胺(Z)、三乙胺(TEA)、氯化钠(NaCl)、硝基还原酶(NTR)等试剂均可通过商业购买获得;超纯水可通过超纯水机得到。
实施例1:高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物的制备与性能测试。
本发明提供一种高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物,其制备方法包括以下步骤:
(1)溶解:将AAm、AN、NIEAAm、AET·HCl、AIBN溶解于DMF中,溶解后得到混合溶液。其中AAm:AN:NIEAAm的摩尔比为65:35:(0~30),聚合物的分子量为10000,AET·HCl与AIBN的摩尔比为5:1;
(2)除氧:将步骤(1)中的混合溶液密封、放入液氮中冷却,油泵抽真空15min,解冻,通入氮气,反复三次;
(3)反应:将步骤(2)中的混合溶液在65℃油浴中反应24h后,迅速冷却停止反应;
(4)纯化:将步骤(3)中的混合溶液在甲醇中重沉淀,过滤收集沉淀物;用DMSO复溶沉淀物,再向其中加入等量体积的超纯水,然后转移到分子量为1000的透析袋中,以超纯水为透析液,透析10h;将透析袋中的溶液在-80℃冷冻1天,冷冻干燥机中干燥2天,得到高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物。
在上述制备方法中,步骤(1)中所述AAm:AN:NIEAAm的最佳摩尔比为65:35:20。
称取本实施例制备的不同单体比例构建的聚合物,分别用氘代二甲亚砜溶解,并使用核磁共振谱仪观察其特征峰,以评价聚合物的合成情况。如图1所示,a,b峰为聚合物咪唑环上的氢特征峰,c,d峰为NIEAAm单体的亚甲基上的氢特征峰,e,f峰为聚合物骨架亚甲基上的氢特征峰,g峰为AAm单体的氨基上的氢特征峰,表明已合成不同单体比例构建的聚合物。其中聚(丙烯酰胺-丙烯腈)(PAA)的单体摩尔比为AAm:AN:NIEAAm=65:35:0,聚(丙烯酰胺-丙烯腈-N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺)-1(PAAN-1)的单体摩尔比为AAm:AN:NIEAAm=65:35:10,聚(丙烯酰胺-丙烯腈-N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺)-2(PAAN-2)的单体摩尔比为AAm:AN:NIEAAm=65:35:20,聚(丙烯酰胺-丙烯腈-N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺)-3(PAAN-3)的单体摩尔比为AAm:AN:NIEAAm=65:35:30。PAA中,x为91,y为66,z为0;PAAN-1中,x为83,y为60,z为4;PAAN-2中x为76,y为55,z为8;PAAN-3中,x为70,y为51,z为11。
通过浊度法评价本实施例的不同单体比例构建的聚合物的高临界相转变温度(UCST)的自调节性。将聚合物分散在含有NADPH和NTR的PBS溶液中,在37℃的氮气保护下孵育0h、12h、24h,随后用波长为650nm的变温紫外光谱仪测其透射率。其中单体的摩尔比例为AAm:AN:NIEAAm=65:35:30的聚合物PAAN-3由于疏水基团NIEAAm的比例过高,导致其无法在PBS溶液分散,故未测得其UCST。如图2所示,结果表明其余不同单体比例构建的聚合物的UCST自调节性不同,其中单体的摩尔比例为AAm:AN:NIEAAm=65:35:20的聚合物PAAN-2的UCST变化最大,说明其UCST的自调节性最强,故此比例为最优比,以下实施例以该最优比制备的聚合物为基础进行试验。
实施例2:一种CD44/CA IX双靶向性的乳化剂的制备与表征。
本发明提供一种CD44/CA IX双靶向性的乳化剂,其制备方法包括以下步骤:
(1)溶解:将TBA修饰的HA(HA-TBA)、HDA、EDC和NHS溶解于DMSO中,溶解后得到混合溶液;其中EDC:NHS:HDA:HA-TBA的羧基端的摩尔比为0.2:0.2:0.2:1;
(2)反应:将步骤(1)中的混合溶液在35℃、300rpm的条件下反应24h后,取出一部分混合溶液(CD44单靶向性的乳化剂粗产物)作为对照,剩余的混合溶液进行下一步反应;
(3)再溶解:将羧基化的Z(Z-COOH)、EDC、DMAP溶解于DMSO,随后加入到步骤(2)中剩余的混合溶液。其中EDC:Z-DMAP:Z-COOH:HA-TBA的羟基端的摩尔比为0.3:0.3:0.3:1;
(4)再反应:将步骤(3)中的混合溶液在35℃、300rpm的条件下反应24h后,停止反应,得到CD44/CA IX双靶向性的乳化剂的粗产物;
(5)纯化:向步骤(2)和(4)中的乳化剂的粗产物中分别加入等量体积的超纯水,然后转移到分子量为14000的透析袋中,以超纯水为透析液,透析3天;再分别向透析后的混合溶液,加入NaCl并搅拌2h,再沉淀至冷丙酮中,离心收集沉淀物;用超纯水溶解沉淀物,再继续透析2天,将透析液放置在-80℃冷冻1天,再冷冻干燥2天,分别得到CD44单靶向性乳化剂(HA-HDA)和CD44/CA IX双靶向性的乳化剂(HA-HDA-Z)。
称取本实施例制备的两种乳化剂,分别用氘代水溶解,并使用核磁共振谱仪观察其特征峰,以评价乳化剂的合成情况。如图3所示,a峰为HDA上亚甲基的氢特征峰,b峰为HA上甲基的氢特征峰,c峰为Z-COOH上的亚甲基的氢特征峰,表明已合成CD44单靶向性乳化剂(HA-HDA)和CD44/CA IX双靶向性的乳化剂(HA-HDA-Z)。所得HA-HDA-Z中n为150,a为30,b为45。
实施例3:可特异性清除肿瘤细胞内NADPH的多功能纳米药物的制备和性能评价。
本实施例提供一种可特异性清除肿瘤细胞内NADPH的多功能纳米药物,其制备方法包括以下步骤:
(1)溶解:将PAAN-2和BMS202共同溶于DMSO溶液中;将HA-HDA-Z和HA-HDA分别溶于超纯水溶液中;其中,PAAN-2浓度为20mg/mL,BMS202浓度为5mg/mL,HA-HDA-Z和HA-HDA浓度为1mg/mL,PAAN-2与BMS202的质量比为50:1。
(2)乳化:以体积比DMSO:超纯水=1:4混合步骤(1)中的两种溶液。
(3)通过超声波破碎仪,将步骤(2)中的混合溶液探头超声,超声3s,停3s,持续时间为2min;
(4)将步骤(3)中的溶液置于分子量为3500的透析袋中,以超纯水为透析液透析10h,得到可特异性清除肿瘤细胞内NADPH的多功能纳米药物;CD44单靶向纳米药物为BMS202@HP NPs,CD44/CA IX双靶向纳米药物为BMS202@HZP NPs。
可特异性清除肿瘤细胞内NADPH的多功能纳米药物的性能评价:
使用流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)评价多功能纳米药物在常氧和低氧下对4T1细胞的靶向能力。将香豆素6(C6)作为荧光探针,CD44单靶向纳米粒子HP NPs作为对照,游离的HA和Z作为竞争抑制。如图4a-c所示,与CD44单靶向的HP NPs/C6、预孵育游离HA或Z的HZP NPs/C6相比,HZP NPs/C6在缺氧的4T1细胞中积累得更多,表明HZP NPs在缺氧条件下更具有靶向4T1细胞的优势,故以下实施例主要以该较优配方制备的多功能纳米药物为基础进行试验。
使用透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)评价多功能纳米药物的形貌与表征。如图4d-f所示,表明BMS202@HP NPs具有规则的球体形貌,粒径大约为222.2nm,表面电荷为-35.4mV。
使用高效液相色谱仪(HPLC)评价多功能纳米药物的载药能力和药物控释能力。如图4g所示,BMS202@HZP NPs对BMS202的载药量为54.5%,表明多功能纳米药物有较强的载药能力。如图4h所示,BMS202@HZP NPs在含有NADPH和NTR的缺氧条件孵育144h后,检测到80.3%的药物释放,表明BMS202@HZP NPs能够有效地控释药物。
使用流式细胞仪评价功能纳米药物抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。将PE-PD-L1抗体作为结合PD-L1蛋白的荧光抗体,仅接受缺氧处理的4T1细胞作为对照。如图4i-j所示,与对照组相比,BMS202@HZP NPs预处理的4T1细胞的荧光强度明显降低,表明BMS202@HZPNPs能够有效地抑制PD-1/PD-L1相互作用。
实施例4:多功能纳米药物特异性清除肿瘤细胞内NADPH的能力评价。
将4T1细胞和RAW264.7巨噬细胞分别与多功能纳米药物在常氧和低氧条件下共孵育6h,然后用0或2Gy的X射线辐照,再继续孵育12h后,收集细胞测定细胞内NADPH/NADP+比率,以评价该纳米药物特异性清除肿瘤细胞内NADPH的能力。
如图5a所示,当用空白HZP NPs和BMS202@HZP NPs处理RAW264.7巨噬细胞时,与未进行任何处理的巨噬细胞相比,NADPH/NADP+比率仍保持在较高水平。然而,如图5b-c所示,当用空白HZP NPs和BMS202@HZP NPs与4T1细胞一起共培养,4T1细胞的NADPH/NADP+比率在常氧和缺氧条件下明显降低。因此,这表明BMS202@HZP NPs具有选择性清除4T1细胞内的NADPH的能力。
实施例5:多功能纳米药物的体外治疗效率和免疫调节能力的评价。
将4T1细胞分别与不同浓度的游离BMS202、HZP NPs和BMS202@HZP NP在常氧和低氧条件下共孵育6h,然后用0或2Gy的X射线辐照,再继续孵育不同的时长。
当孵育24h后,用MTT处理细胞,以评价该纳米药物对4T1细胞的杀伤能力。如图6a-d所示,随着BMS202和硝基咪唑浓度的增加,BMS202@HZP NPs对4T1细胞的细胞毒性也逐渐增加。当增加了2Gy的X射线辐照后,该药物对4T1细胞的细胞毒性进一步增大,表明BMS202@HZP NPs能够增敏低剂量的放疗(LDRT),对4T1细胞的生长具有较强的抑制作用。
当孵育7天后,用结晶紫处理细胞,以评价该纳米药物对4T1细胞的辐射增敏作用。如图6e-h所示,用BMS202@HZP NPs介导的LDRT处理的4T1细胞,在常氧和缺氧下分别仅形成约30.8%和57.1%的克隆,表明BMS202@HZP NPs具有清除肿瘤细胞内NADPH以使低剂量放疗敏感的能力。
当孵育24h后,用蛋白印迹法测定细胞的钙网蛋白(CRT)的表达,以评价该纳米药物诱导癌细胞免疫原性细胞死亡(ICD)的能力。如图6i-l所示,BMS202@HZP NPs介导的LDRT处理的4T1细胞的CRT表达最强,表明BMS202@HZP NPs介导的LDRT可以有效地诱导4T1细胞免疫原性死亡。
使用孔径为0.4μm的transwell建立双层细胞模型评价BMS202@HZP NPs的体外免疫调节能力。将由PBMC和4T1细胞组成的混合细胞接种到transwell的上室中,将4T1细胞接种在下室。然后用不同的纳米药物处理上室细胞6小时,并用0或2Gy的X射线辐照,然后继续孵育24h,用calcein-AM染色下室中的活4T1细胞并使用倒置显微镜(Olympus IX53)拍照。同时,还收集下室的上清液用于ELISA法测定TNF-α和IFN-γ。如图6m-q所示,与其他处理组相比,BMS202@HZP NPs介导的LDRT处理后的4T1细胞产生的免疫因子TNF-α和IFN-γ最多,细胞存活率最低,表明BMS202@HZP NPs介导的LDRT具有强烈的免疫调节能力并可以有效地杀伤转移性的4T1细胞。
实施例6:多功能纳米药物介导的放射-免疫代谢调节疗法的体内效果评价。
如图7a所示,建立Balb/c小鼠的单侧荷瘤模型,当肿瘤长至约150mm3时,将小鼠随机分为5组:(1)0.9%NaCl;(2)0.9%NaCl+2Gy LDRT;(3)BMS202@HP NPs;(4)BMS202@HZPNPs;(5)BMS202@HZP NPs+2Gy LDRT。在第1、4和7天向Balb/c小鼠尾静脉注射不同的药物制剂。在注射后24小时,将肿瘤暴露于2Gy的X射线下。在整个实验期间监测肿瘤大小和存活率。此外,在第10天,每组处死部分小鼠,收集肿瘤以评估免疫反应。
使用RNA测序、流式细胞术、免疫组化(IHC)和免疫荧光(IHP)分别检测肿瘤组织,以评价多功能纳米药物的在体内的免疫反应。如图7b-c所示,与0.9%NaCl处理的肿瘤相比,BMS202@HZP NPs介导的LDRT诱导了肿瘤中731个基因的显著变化。其中,有关T细胞增殖和活化以及巨噬细胞(TAM)极化为M1表型的基因表达明显上升,有关TAM极化为M2表型的基因表达明显下降。如图7d-h所示,与其他组别相比,BMS202@HZP NPs介导的LDRT提高了树突状细胞(DCs)的成熟、CD8+T细胞的浸润、M1表型的极化和颗粒酶B(Gran B)的产生。这表明BMS202@HZP NPs介导的LDRT能够增强体内的免疫反应,逆转免疫抑制性的肿瘤微环境。
在整个实验期间监测肿瘤大小和存活率评价多功能纳米药物的体内治疗效率,如图7i-k所示,与其他组别相比,接受BMS202@HZP NPs介导的LDRT治疗的小鼠具有最强的抑制肿瘤生长和延长小鼠存活率的能力,表明BMS202@HZP NPs介导的LDRT具有最强的抑瘤效果。
使用代谢组学分析肿瘤组织,以评价多功能纳米药物的在体内的免疫机制。如图8a-c所示,BMS202@HZP NPs介导的LDRT组与0.9%NaCl组相比,代谢图谱发生了显著的变化。此外,对这两组的肿瘤差异代谢物进行热图和代谢通路分析,如图8d-e所示,磷酸戊糖途径(PPP)的差异是最大的。由此,测量了与PPP相关的酶和化合物的活性和水平,如图8f-i所示,与0.9%NaCl组相比,BMS202@HZP NPs介导的LDRT的G6PD和6PGD的活性分别增加了2.4和2.3倍,NADPH水平和NADPH/NADP+比率也分别提高了1.5倍和1.8倍。由于BMS202@HZPNPs可以选择性地靶向4T1细胞并通过硝基咪唑组清除其细胞内NADPH。因此,如图8j所示,这些结果表明在BMS202@HZPNPs介导的LDRT治疗后,肿瘤微环境(TME)中的PPP增强,同时产生了更多的NADPH,以此促进免疫细胞的分裂与活化,进一步诱导体内的抗肿瘤免疫反应。
实施例7:多功能纳米药物介导的放射-免疫代谢调节疗法的远隔效应和全身性抗肿瘤免疫效果的评价。
如图9a所示,建立Balb/c小鼠的双侧荷瘤模型,将1×106个4T1细胞皮下注射在Balb/c小鼠的右侧作为原发性肿瘤。7天后,将1×104个4T1细胞注射到Balb/c小鼠左侧作为远端肿瘤。当原发性肿瘤生长至约150mm3时,将小鼠随机分为5组,治疗方法和实施例6中的一致。在整个实验期间监测原发性和远端肿瘤的体积。实验结束时,分别收集原发和远处肿瘤、脾脏和血浆进行免疫反应分析。此外,还收获肺以进一步评估抗肺转移功效。
在整个实验期间监测原发性和远端肿瘤的体积评价多功能纳米药物的体内治疗效率,如图9b-d所示,与其他组别相比,接受BMS202@HZP NPs介导的LDRT治疗的小鼠具有最强的抑制原发性和远端肿瘤生长的能力,表明由BMS202@HZP NPs介导的LDRT诱导的远隔效应能够有效地抑制远处肿瘤组织的生长。
使用流式细胞术、酶联免疫吸附试验(Elisa)和IHC试验分别检测远端肿瘤、血浆和脾脏组织,以评价多功能纳米药物全身性的免疫反应。如图9e-g所示,与其他组别相比,BMS202@HZP NPs介导的LDRT提高了远端肿瘤组织中CD3+T细胞和CD8+T细胞的浸润和GranB的产生,增加了血浆中TNF-α和IFN-γ的水平,提高了脾脏组织中CD8+T细胞和CD20+T细胞的浸润。这表明BMS202@HZP NPs介导的LDRT能够增强远隔效应,诱发全身性的抗肿瘤免疫反应。
此外,收获不同治疗后的肺并用苦味酸染色和苏木精--伊红染色法(H&E)分别染色,以进一步评估该疗法抑制4T1细胞肺转移的治疗效果。如图9j-k所示,与其他组别相比,BMS202@HZP NPs介导的LDRT抑制肺转移的效果最强,该疗法下的肺转移结节仅有6.8个,表明这种协同治疗策略还可以抑制肿瘤向肺部的转移。
如图9m所示,表明BMS202@HZP NPs介导的LDRT可诱导强烈的抗肿瘤免疫反应,以增强远隔效应并抑制远处肿瘤生长和肿瘤的转移。
本发明提供了新型高临界相转变温度自调节型且可选择性清除肿瘤细胞内NADPH的聚合物,并将其构建成一种具有缺氧靶向性并负载有抑制PD-1/PD-L1相互作用的小分子拮抗剂(BMS202)的多功能纳米药物(BMS202@HZP NPs),从而将PD-L1免疫节点阻断疗法与低剂量放疗联合用于治疗三阴性乳腺癌。该纳米药物除了能利用肿瘤缺氧条件实现BMS202的控制释放,还能介导低剂量放疗上调肿瘤微环境中的戊糖磷酸途径并特异性地清除肿瘤细胞内的NADPH,进而在增敏低剂量放疗的同时缓解肿瘤微环境的免疫抑制剂。此外,由该纳米药物介导的低剂量放疗还能够通过有效上调肿瘤细胞表面PD-L1的表达,从而进一步提高了PD-L 1免疫节点阻断疗法的响应性效率。因此,由该纳米药物介导的放射-免疫代谢调节疗法有望为一种极具潜力的治疗策略用于实现三阴性乳腺癌(TNBC)PD-L1检查点阻断疗法治疗效率的有效提高。
Claims (10)
2.一种权利要求1所述的可特异性清除NADPH的聚合物的制备方法,其特征在于,以丙烯腈、丙烯酰胺和N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺为单体,通过自由基聚合反应合成所述聚合物,包括以下步骤:
溶解:将丙烯腈、丙烯酰胺及N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺、半胱胺盐酸盐和偶氮二异丁腈溶解于溶剂1中,得到第一混合液;
除氧:对所述第一混合液进行除氧;
反应:除氧后的所述第一混合液进行自由基聚合反应,得到所述可特异性清除NADPH的聚合物。
3.根据权利要求2所述的可特异性清除NADPH的聚合物的制备方法,其特征在于,在所述溶解步骤中,烯酰胺、丙烯腈和N-(2-(2-硝基咪唑)乙基)丙烯酰胺的摩尔比为65:35:(10-30);半胱胺盐酸盐与所述偶氮二异丁腈的摩尔比为(5-10):1;
所述制备方法还包括在反应后进行纯化,所述纯化的步骤包括:将停止反应后的第一混合液在甲醇中重沉淀,离心收集沉淀物;用二甲亚砜溶解所述沉淀物,再向其中加入水,然后转移到透析袋中,以水为透析液透析;将透析袋中溶液先冷冻后再冷冻干燥,得到所述聚合物。
5.一种权利要求4所述的CD44/CA IX双靶向性的乳化剂的制备方法,其特征在于,将十六胺和羧基化的乙酰唑胺分别通过酰胺化和酯化反应连接在经过四丁基硫酸氢铵修饰的透明质酸的侧链上,以形成所述CD44/CA IX双靶向性的乳化剂。
6.根据权利要求5所述的CD44/CA IX双靶向性的乳化剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
溶解:取经过四丁基硫酸氢铵修饰的透明质酸、十六胺、(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和N-羟基琥珀酰亚胺溶于溶剂2,得到第二混合液;
反应:所述第二混合液在30-40℃下反应20-30h;
再溶解:取羧基化乙酰唑胺、(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)、4-二甲氨基吡啶及溶剂2加入到反应后的第二混合液,溶解后得到第三混合液;
再反应:所述第三混合液在30-40℃下反应20-30h,得到CD44/CA IX双靶向性的乳化剂。
7.根据权利要求6所述的CD44/CA IX双靶向性的乳化剂的制备方法,其特征在于,在所述溶解步骤中,(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)、N-羟基琥珀酰亚胺、十六胺和四丁基硫酸氢铵修饰的透明质酸的羧基端摩尔比为(0.1-0.3):(0.1-0.3):(0.1-0.3):1;在所述再溶解步骤中,(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)、4-二甲氨基吡啶、羧基化乙酰唑胺和四丁基硫酸氢铵修饰的透明质酸的羟基端的摩尔比为(0.2-0.4):(0.2-0.4):(0.2-0.4):1;
所述制备方法还包括反应后进行纯化,所述纯化的步骤包括:向停止反应后的第三混合液加入水,然后转移到透析袋中,以水为透析液进行透析;再向所述透析后的第三混合溶液加入氯化钠并搅拌,再在冷丙酮中沉淀,离心收集沉淀物;用水溶解所述沉淀物,再透析,冷冻,冷冻干燥,得到所述CD44/CA IX双靶向性的乳化剂。
8.一种可特异性清除NADPH的多功能纳米药物,其特征在于,包括权利要求1所述的聚合物,权利要求4所述的乳化剂,以及PD-L1小分子抑制剂。
9.一种权利要求8所述的可特异性清除NADPH的多功能纳米药物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
溶解:将所述聚合物和PD-L1小分子抑制剂溶于溶剂3,得到混合有机溶液,所述聚合物和PD-L1小分子抑制剂的质量比为(40-110):1;将所述乳化剂溶于水,得到含有乳化剂的水溶液;
乳化:向所述混合有机物溶液中加入含有乳化剂的水溶液,搅拌形成乳液;
超声:对所述乳液超声;
透析:对超声后的所述乳液进行透析,得到所述多功能纳米药物。
10.权利要求1所述的聚合物或权利要求4所述的乳化剂或权利要求8所述的可特异性清除NADPH的多功能纳米药物在制备用于三阴性乳腺癌的放射-免疫代谢调节疗法的药品中的应用。
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Title |
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YING WANG ET AL.: "Immunogenic-cell-killing and immunosuppression-inhibiting nanomedicine" * |
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CN115141309B (zh) | 2023-05-16 |
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