CN108815118A - 一种用于肿瘤抗炎治疗和化疗的聚合物胶束及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于高分子化学与生物医学工程技术领域，具体公开了一种用于肿瘤抗炎治疗和化疗的聚合物胶束及其制备方法。所述聚合物胶束呈核壳结构，聚己内酯作为胶束的疏水内核可负载紫杉醇或者其它疏水性的药物分子，胶束表面由基质金属蛋白酶敏感的多肽偶联抗炎药物和聚乙二醇共同形成壳层。所述聚合物胶束在实体瘤组织高表达的基质金属蛋白酶的作用下，释放偶联的抗炎药物，实现药物的可控释放，靶向治疗肿瘤局部的炎性反应，可用于肿瘤抗炎治疗和化疗的联合治疗，极大地增强了抗肿瘤效果。

Description

一种用于肿瘤抗炎治疗和化疗的聚合物胶束及其制备方法
技术领域
本发明涉及高分子化学与生物医学工程技术领域，具体地，涉及一种用于肿瘤抗炎治疗和化疗的聚合物胶束及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤呈现高发状态，严重危害着人们的健康和生命。紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是广谱一线化疗药物，临床上主要用于治疗卵巢癌和乳腺癌，对黑色素瘤、结直肠癌、淋巴瘤、头颈部癌、脑胶质瘤和肺癌等也都有一定疗效。PTX存在水溶性差、使用聚氧乙烯氢化蓖麻油(cremophor EL)作增溶剂容易引起过敏反应、配制和给药不方便等缺点。白蛋白稳定的紫杉醇纳米制剂配方是FDA批准的不含cremophor EL的第二类商业化的纳米制剂，但高昂的成本阻碍了其推广应用。尽管研究者进行了大量的尝试，但低成本的不含cremophor EL且水溶性好的PTX纳米配方的开发已迫在眉睫。
进十年来，研究者发现瘤组织中肿瘤细胞并不是独立生长，而是处在一个复杂的“肿瘤微环境”(Tumor Microenvironment，TME)中。该微环境主要包括基质细胞(成纤维细胞、间充质细胞、上皮细胞等)、炎症免疫细胞、血管内皮细胞、趋化因子、细胞因子等。2011年，著名生物学家Weinberg总结了肿瘤的十大生物学特征。其中，促肿瘤炎症，会影响其他生物学特征的开始和发展。肿瘤抗炎治疗是一个复杂的过程，要调节促肿瘤炎症和抑肿瘤炎症之间的平衡。在众多的炎症因子/介质中，环氧合酶，特别是环氧合酶2(COX-2)催化合成的前列腺素2(PGE2)，会促进肿瘤的活性、增殖、转移、血管新生和化疗耐受，也就是说解除PGE2的保护作用或许能够强化肿瘤的的化疗效果。塞来昔布(celecoxib，CXB)等非甾体类抗炎药(non-steroid anti-inflammatory drug，NSAID)作为COX抑制剂，通过抑制前列腺素合成而发挥抗炎性治疗，其高剂量作用时还可通过非COX-2信号通路促进癌细胞的凋亡。
因此，有必要开发一种能够用于肿瘤抗炎治疗和化疗的一体化载体。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于肿瘤抗炎治疗和化疗的一体化载体，所述载体为聚合物胶束，所述聚合物胶束包括疏水内核和壳层，能同时负载抗炎药物和抗肿瘤药物，达到肿瘤抗炎治疗和化疗联合治疗的目的。
本发明的第一个目的是提供一种用于肿瘤抗炎治疗和化疗的聚合物胶束。
本发明的第二个目的是提供上述聚合物胶束的制备方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种三嵌段聚合物聚，所述聚合物为(L-谷氨酸炔丙酯)-聚乙二醇-聚己内酯-乙酰酯(PPLG-PEG-PCL-Ac)，其结构式如式(I)所示：
优选地，所述PPLG、PEG和PCL的聚合度分别为30、40和44。
本发明所述三嵌段聚合物PPLG-PEG-PCL-Ac的PPLG嵌段的侧基是炔基，可用于点击反应；所述三嵌段聚合物可在水中自组装形成核-壳形胶束，用于装载治疗药物。
因此，所述三嵌段聚合物在制备载药纳米胶束中的应用亦在本发明保护范围内。
具体地，所述三嵌段聚合物的制备方法包括如下步骤：
S1.以ε-己内酯和烯丙基聚乙二醇为原料，在催化剂和无水无氧条件下经聚合反应制得两嵌段共聚物APEG-PCL-OH；
S2.以APEG-PCL-OH和乙酰氯为原料，加入三乙胺，制得APEG-PCL-Ac；
S3.以APEG-PCL-Ac、巯基乙胺盐酸盐和偶氮二异丁腈为原料，制得HCl·NH2-PEG-PCL-Ac；
S4.以L-谷氨酸、丙炔醇为原料，加催化剂制得L-PLG；再以L-PLG为原料，加入三光气，制得PLG-NCA；
S5.以HCl·NH2-PEG-PCL-Ac和PLG-NCA为原料，经开环聚合得到三嵌段聚合物PPLG-PEG-PCL-Ac。
优选地，S1中所述催化剂为辛酸亚锡。
优选地，S4中所述催化剂为浓缩酸。
一种用于肿瘤抗炎治疗和化疗的聚合物胶束，所述聚合物胶束包括疏水内核和壳层；所述疏水内核为聚己内酯，其上负载疏水性抗肿瘤药物；胶束表面由基质金属蛋白酶敏感的多肽偶联抗炎药物和聚乙二醇共同形成壳层。
本发明所述聚合物胶束呈核壳结构，聚己内酯作为胶束的疏水内核可负载紫杉醇或者其它疏水性的药物分子，基质金属蛋白酶敏感的多肽偶联抗炎药物和聚乙二醇共同作为胶束的壳层。所述聚合物胶束在实体瘤组织高表达的基质金属蛋白酶的作用下，释放偶联的抗炎药物，实现药物的可控释放，靶向治疗肿瘤局部的炎性反应，可用于肿瘤抗炎治疗和化疗的联合治疗，极大地增强了抗肿瘤效果。
优选地，所述疏水性抗肿瘤药物为紫杉醇。
优选地，所述聚乙二醇的分子量为1kDa。
优选地，所述抗炎药物为塞来昔布。
具体地，所述用于肿瘤抗炎治疗和化疗的聚合物胶束的结构式如式(II)所示：
优选地，所述抗炎药物占聚合物胶束质量的5.0～11.0％，所述疏水性抗肿瘤药物占聚合物胶束质量的4.0～8.0％。
优选地，所述聚合物胶束的粒径为100～150nm。
同时，本发明还请求保护所述用于肿瘤抗炎治疗和化疗的聚合物胶束在制备肿瘤治疗药物中的应用。
具体地，所述聚合物胶束为通过点击反应将偶联有抗炎药物的MMP-2酶敏感多肽连接在三嵌段聚合物PPLG-PEG-PCL-Ac PPLG嵌段的炔基上，再将该聚合物和疏水性药物在水中自组装形成负载抗炎药物和包裹疏水性药物的聚合物胶束。
具体地，包括如下步骤：
S1.以ε-己内酯和烯丙基聚乙二醇为原料，在催化剂和无水无氧条件下经聚合反应制得两嵌段共聚物APEG-PCL-OH(烯丙基聚乙二醇-聚己内酯)；
S2.以APEG-PCL-OH和乙酰氯为原料，加入三乙胺，制得APEG-PCL-Ac(烯丙基聚乙二醇-聚己内酯-乙酰酯)；
S3.以APEG-PCL-Ac、巯基乙胺盐酸盐和偶氮二异丁腈为原料，制得HCl·NH2-PEG-PCL-Ac；
S4.以L-谷氨酸、丙炔醇为原料，加催化剂制得L-PLG；再以L-PLG为原料，加入三光气，制得PLG-NCA；
S5.以HCl·NH2-PEG-PCL-Ac和PLG-NCA为原料，经开环聚合得到三嵌段聚合物PPLG-PEG-PCL-Ac；所述三嵌段聚合物的特点是PPLG嵌段的侧基是炔基，可用于点击反应；
S6.以塞来昔布(CXB)、丁二酸酐和DMAP为原料，制得塞来昔布酰胺丁酸(CXB-SA)；
S7.以CXB-SA、Fmoc-Lys(N3)-OH和常规的Fmoc保护的氨基酸为原料，经多肽固相合成法将抗炎药物或琥珀酸偶联到多肽上，制得CXB-GGPLGLAGG-Lys(N3)-NH2或SA-GGPLGLAGG-Lys(N3)-NH2；所述SA-GGPLGLAGG-Lys(N3)-NH2不偶联药物分子，SA表示多肽末端琥珀酸修饰；其中，GGPLGLAGG为MMP-2酶敏感多肽。
S8.以CXB-GGPLGLAGG-Lys(N3)-NH2或SA-GGPLGLAGG-Lys(N3)-NH2、mPEG-N3和PPLG-PEG-PCL-Ac为原料，经过Cu(I)AAC反应将CXB-GGPLGLAGG-Lys(N3)-NH2或SA-GGPLGLAGG-Lys(N3)-NH2、mPEG-N3偶联到聚合物侧基上，制得聚合物[PPLG-g-(CXB-peptide&mPEG)]-PEG-PCL-Ac，简述为(PCxbP)。不偶联CXB的聚合物[PPLG-g-(SA-peptide&mPEG)]-PEG-PCL-Ac，简述为(PSaP)。
S9.将嵌段聚合物PCxbP或PSaP、疏水性药物溶于DMF和THF中，超声下滴入水中，透析，超滤浓缩，制得PCxbP胶束、PCxbP-PTX胶束或PSaP-PTX胶束。
优选地，S7中还包括高效液相色谱纯化步骤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所提供的聚合物胶束，呈核壳结构，聚己内酯作为胶束的疏水内核可负载紫杉醇或者其它疏水性的药物分子，基质金属蛋白酶敏感的多肽偶联抗炎药物塞来昔布和聚乙二醇共同作为胶束的壳层。所述聚合物胶束在实体瘤组织高表达的基质金属蛋白酶的作用下，释放偶联的抗炎药物，实现药物的可控释放，靶向治疗肿瘤局部的炎性反应，显著增强肿瘤靶向性，提高药物的药效和利用率，降低对正常组织、细胞的损害，从而减轻毒副作用，提高化疗效果。所述聚合物胶束可用于肿瘤抗炎治疗和化疗的联合治疗，极大地增强了抗肿瘤效果。
附图说明
图1为聚合物[PPLG-g-(CXB-peptide&mPEG)]-PEG-PCL-Ac，即PCxbP的合成路线示意图。
图2为三嵌段聚合物PPLG-PEG-PCL-Ac的核磁共振图谱。
图3为聚合物(PPLG-g-CXB-peptide)-PEG-PCL-Ac和PCxbP的核磁共振氢谱图。
图4为聚合物PPLG-PEG-PCL-Ac、(PPLG-g-CXB-peptide)-PEG-PCL-Ac和PCxbP的红外谱图。
图5为PCxbP-PTX胶束在10nM MMP-2条件下0h和4h时的粒径分布图。
图6为PCxbP-PTX胶束在10nM MMP-2条件下0h和4h时的TEM图。
图7为CXB和PTX的累积释放示意图；其中，A为PCxbP-PTX胶束在10nM MMP-2条件下，CXB的累积释放示意图；B为pH5.0条件下PTX的累积释放示意图。
图8为不同浓度CXB(偶联在PCxbP胶束上)对PGE2合成的抑制结果。
图9为HT-1080肿瘤细胞与PsaP-PTX胶束或PCxbP-PTX胶束共孵育后的细胞存活百分率。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种用于肿瘤抗炎治疗和化疗的聚合物胶束及其制备方法，所述聚合物胶束的合成路线过程如图1所示，包括如下步骤：
1、两嵌段共聚物烯丙基聚乙二醇-聚己内酯(APEG-PCL-OH)的合成
称取1.8g的Allyl-PEG-OH(Mw 1.8kDa，1mmol)加入50mL反应瓶中，70℃真空干燥2h，加入1滴辛酸亚锡Sn(Oct)2继续干燥0.5h，再加入干燥的4.5g己内酯和15mL无水甲苯。在N2下110℃搅拌反应18h，沉淀在过量的乙醚中，抽滤，干燥得白色粉末状产物5.7g，产率91％。其组成为APEG1.8k-PCL4k-OH。
2、APEG-PCL-Ac聚合物的合成
将2.9g APEG-PCL-OH(Mw 5.8kDa，0.5mmol)溶于15mL无水的CH2Cl2，在N2保护下加入0.36mL乙酰氯(5mmol)，然后冰水浴下滴入含有0.34mL TEA(2.5mmol)的10mL CH2Cl2溶液。滴完后恢复至室温，搅拌12h，转移到透析袋(MWCO:3.5kDa)中，用甲醇透析1.5d，离心得到固体，乙醚洗涤后，真空干燥得到白色粉末2.75g，产率95％；即得APEG-PCL-Ac。
3、HCl·NH2-PEG-PCL-Ac合成
将APEG-PCL-Ac(1.45g，0.25mmol)溶于10mL DMF中，加入205mg AIBN(1.25mmol，5equiv)和568mg 2-氨基乙基硫醇盐酸盐(5mmol，20equiv)，N2鼓泡20min除去氧气后，65℃搅拌反应24h。反应完后恢复至室温，将反应液装入透析袋中(MWCO:3.5kDa)，甲醇透析除去小分子杂质，将透析袋里面的乳状液沉淀在乙醚中得白色粉末，离心，真空干燥得到白色粉末1.3g，产率85％；既得HCl·NH2-PEG-PCL-Ac。
4、PLG-NCA单体的合成
(1)合成γ-炔丙基-L-谷氨酸酯(PLG)：
将40mL炔丙醇加入到500mL单口瓶中，冰水浴冷却，搅拌下缓慢滴入16mL浓硫酸。滴加完后，加入40g L-谷氨酸，室温下反应12h后(溶液呈浅红色)，55～60℃反应5h。反应完后恢复至室温，加入100mL 95％乙醇，滴加约41mL浓氨水(25％，w/v)至体系pH约为6～8，4℃放置过夜，抽滤，用95％乙醇充分洗涤。白色滤饼用乙醇/水(1/3，v/v)重结晶两次，抽干得到白色片状粉末6g，产率24％；即得L-PLG。
(2)合成γ-炔丙基-L-谷氨酸酯环内酸酐(PLG-NCA)单体：
将2.2g L-PLG和20mL新蒸的乙酸乙酯分别加入到干燥的两口瓶中，油浴加热至80℃，滴加含有1.5g三光气的10mL乙酸乙酯溶液，搅拌回流，反应约1.5h后溶液变澄清。冷却至室温后，-40℃冷却0.5h。将反应液转移至100mL的分液漏斗中，分别用冰水浴预冷的饱和NaHCO3(2×30mL)和饱和NaCl洗涤(2×30mL)，分液，MgSO4干燥，过滤，浓缩，沉淀在新蒸的石油醚中，密封，4℃冷藏5h后，恢复至室温，产物为底物的无色透明液体，倾倒出上层液体。加入5mL新蒸的乙酸乙酯到底物无色液体中，再加入新蒸的石油醚沉淀一次，方法同上。真空干燥，得2.0g无色透明液体，产率80％；即得PLG-NCA单体。
5、三嵌段聚合物PPLG-PEG-PCL-Ac的合成
两嵌段聚合物HCl·NH2-PEG-PCL-Ac引发PLG-NCA开环聚合得到三嵌段聚合物PPLG-PEG-PCL-Ac。
具体操作步骤如下：称取步骤3制得的HCl·NH2-PEG-PCL-Ac(0.6g，Mw 6kDa，0.1mmol)到干燥的Schlenk瓶中，在N2气氛下，加入5mL无水DMF溶解上述聚合物。称取步骤4制得的PLG-NCA(0.74g，3.5mmol)溶于2mL无水CH2Cl2后，加入到上述聚合物溶液中，密封。冰水浴下反应1h后，逐渐恢复至室温，继续反应3d。沉淀在冷乙醚中，离心，乙醚洗涤，真空干燥，得到白色产物1.0g，产率88％。PPLG、PEG和PCL的聚合度分别为30、40和44。所述三嵌段聚合物PPLG-PEG-PCL-Ac的NMR(1H NMR spectra of PPLG-PEG-PCL-Ac)分析结果如图2所示。
6、塞来昔布酰胺丁酸CXB-SA的合成
将9.53g塞来昔布(25mmol)、7.5g丁二酸酐(75mmol)和0.61g 4-二甲氨基吡啶(DMAP,5mmol)溶于20mL无水DMF，N2下密封，65℃下反应18h。TLC监测反应基本完全后(展开剂为CH2Cl2/MeOH/CH3COOH＝170/10/1，V/V/V，产物Rf＝0.25)，沉淀在50mL 0.01M盐酸中，搅拌30min。用乙酸乙酯溶解并萃取产物(50mL×3)，用饱和NaCl溶液洗涤乙酸乙酯层(30mL×3)至水层呈弱酸性。Mg2SO4干燥，浓缩。快速SiO2色谱柱分离后(洗脱剂：CH2Cl2/MeOH/CH3COOH＝500/10/1)浓缩干燥得白色粘稠产物。用甲醇/水(1/1，V/V，1g CXB-SA约9mL甲醇)进一步重结晶得白色结晶粉末9.35g，产率78％。
7、CXB-GGPLGLAGG-Lys(N3)-NH2的合成
该多肽为MMP-2的底物，合成步骤如下：称取一定量的Rink Amide树脂于多肽固相合成柱中，分别用DCM和DMF洗涤树脂。称取树脂取代度3倍当量的Fmoc-Lys(N3)-OH于50mL离心管中，用DMF溶解，加入树脂取代度3.4倍当量的活化剂(HOBT和HBTU)以及6倍当量的DIEA在室温下搅拌反应2小时后，转移该DMF溶液到多肽固相合成柱，继续搅拌4～6h。用DMF溶剂洗涤树脂，除去过量氨基酸以及缩合剂等。加入20％piperidine/DMF溶液到合成柱中，搅拌30min，充分脱去Fmoc保护基后，用DMF洗涤树脂数次。如此循环重复，将需要的氨基酸和CXB药物分子链接到树脂上。最后加入20mL体积比为95％TFA、2.5％TIS和2.5％H2O，反应1.5小时，收集滤液及甲醇洗涤液，旋蒸浓缩后滴加到冷乙醚中得到白色沉淀，抽滤洗涤得到浅黄色固体粉末。粗产品用HPLC(流动相为65％0.1％TFA乙腈-35％0.1％H2O，v/v)纯化得到白色粉末。
8、最终聚合物[PPLG-g-(CXB-peptide&mPEG)]-PEG-PCL-Ac，即PCxbP的合成
称取步骤5制备得到的121mg PPLG-PEG-PCL-Ac(含有0.3mmol alkyne)、131mgCXB-Peptide-Azides(0.10mmol)和3mg CuSO4·5H2O到15mL的Schlenk瓶，加入4mL DMF溶解。冻融循环2次基本除去氧气置换成N2后，加入15mg维生素C钠(NaAsc)，再冻融1次，密封，30℃反应12h。然后加入500mg mPEG1k-N3(0.5mmol)和15mg NaAsc，搅拌溶解，冻融一次除去氧气，30℃反应12h。反应完后加入100mg DOWEX HCR W2resins，搅拌12h，吸附螯合铜离子，过滤除去树脂。往滤液中加入30μL PMDTEA螯合残余的铜离子，滤液转移至透析袋(MWCO:3.5kDa)中，甲醇透析2d，去离子水透析1d，20krpm/min离心得到固体，冻干得白色产物103mg，产率82％。
9、制备载药胶束
将50mg聚合物溶于2mL DMF和8mL THF的混合溶液中，加入5mg PTX后，超声下滴入到50mL水中，用5mM PBS(pH为7.4)的水溶液透析(MWCO:14kDa)除去有机溶剂和游离的药物，超滤浓缩至10mL，得到负载PTX的胶束。
实施例2
一种用于肿瘤抗炎治疗和化疗的聚合物胶束及其制备方法，步骤1～6及步骤9与实施例1相同，不同之处在于聚合物上未偶联抗炎药物分子CXB。其余步骤如下：
7、SA-GGPLGLAGG-Lys(N3)-NH2的合成
该多肽为MMP-2的底物，合成步骤如下：称取一定量的Rink Amide树脂于多肽固相合成柱中，分别用DCM和DMF洗涤树脂。称取树脂取代度3倍当量的Fmoc-Lys(N3)-OH于50mL离心管中，用DMF溶解，加入树脂取代度3.4倍当量的活化剂(HOBT和HBTU)以及6倍当量的DIEA在室温下搅拌反应2小时后，转移该DMF溶液到多肽固相合成柱，继续搅拌4～6h。用DMF溶剂洗涤树脂，除去过量氨基酸以及缩合剂等。加入20％piperidine/DMF溶液到合成柱中，搅拌30min，充分脱去Fmoc保护基后，用DMF洗涤树脂数次。如此循环重复，将需要的氨基酸链接到树脂上。接着加入丁二酸酐与多肽末端的氨基反应，生成琥珀酸(SA)修饰的多肽。最后加入20mL体积比为95％TFA、2.5％TIS和2.5％H2O，反应1.5小时，收集滤液及甲醇洗涤液，旋蒸浓缩后滴加到冷乙醚中得到白色沉淀，抽滤洗涤得到浅黄色固体粉末。粗产品用HPLC(流动相为65％0.1％TFA乙腈-35％0.1％H2O，v/v)纯化得到白色粉末。
8、最终聚合物[PPLG-g-(SA-peptide&mPEG)]-PEG-PCL-Ac，即PSaP的合成
称取121mg PPLG-PEG-PCL-Ac(含有0.3mmol alkyne)、95mg SA-peptide-Azides(0.10mmol)和3mg CuSO4·5H2O到15mL的Schlenk瓶，加入4mL DMF溶解。冻融循环2次基本除去氧气置换成N2后，加入15mg维生素C钠(NaAsc)，再冻融1次，密封，30℃反应12h。然后加入500mg mPEG1k-N3(0.5mmol)和15mg NaAsc，搅拌溶解，冻融一次除去氧气，30℃反应12h。反应完后加入100mg DOWEX HCR W2resins，搅拌12h，吸附螯合铜离子，过滤除去树脂。往滤液中加入30μL PMDTEA螯合残余的铜离子，滤液转移至透析袋(MWCO:3.5kDa)中，甲醇透析2d，去离子水透析1d，20krpm/min离心得到固体，冻干得白色产物93mg，产率80％，得到的聚合物即为PSaP。
实施例3
一种用于肿瘤抗炎治疗和化疗的聚合物胶束及其制备方法，步骤1～7及步骤9与实施例1相同，不同之处在于[PPLG-g-(CXB-peptide&mPEG)]-PEG-PCL-Ac聚合物中CXB-peptide与mPEG的比例不同，调节CXB所占的质量分数。其余步骤如下：
8、最终聚合物[PPLG-g-(CXB-peptide&mPEG)]-PEG-PCL-Ac，即PCxbP的合成
称取121mg PPLG-PEG-PCL-Ac(含有0.3mmol alkyne)、65mg Peptide-Azides(0.05mmol)和3mg CuSO4·5H2O到15mL的Schlenk瓶，加入4mL DMF溶解。冻融循环2次基本除去氧气置换成N2后，加入15mg维生素C钠(NaAsc)，再冻融1次，密封，30℃反应12h。然后加入500mg mPEG1k-N3(0.5mmol)和15mg NaAsc，搅拌溶解，冻融一次除去氧气，30℃反应12h。反应完后加入100mg DOWEX HCR W2resins，搅拌12h，吸附螯合铜离子，过滤除去树脂。往滤液中加入30μL PMDTEA螯合残余的铜离子，滤液转移至透析袋(MWCO:3.5kDa)中，甲醇透析2d，去离子水透析1d，20krpm/min离心得到固体，冻干得白色产物100mg，产率81％。
该实施例得到的聚合物胶束中CXB药物分子的质量分数小于实施例1。还可通过改变CXB-peptide-N3/mPEG1k-N3的投料比，合成如下系列比例的聚合物[CXB-peptidePeptide/mPEG1k ratios＝30:0，20:10，10:20]，调控CXB所占的质量分数。
实施例4
一种用于肿瘤抗炎治疗和化疗的聚合物胶束及其制备方法，步骤1～8与实施例1相同，不同之处在于调节化疗药物PTX占胶束的质量分数。其余步骤如下：
9、制备载药胶束
将50mg聚合物溶于2mL DMF和8mL THF的混合溶液中，加入2.5mg PTX后，超声下滴入到50mL水中，用5mM PBS(pH为7.4)的水溶液透析(MWCO:14kDa)除去有机溶剂和游离的药物，超滤浓缩至10mL，得到负载PTX的胶束。其中PTX的质量分数小于实施例1。
实施例5聚合物的结构分析和聚合物胶束的形貌表征
取实施例1各步产物约8mg溶于适量氘代溶剂，用1H-NMR 400MHz核磁共振波谱仪进行测试，检测反应前后聚合物结构上1H化学位移的变化，结果如图3所示。红外光谱IR：Nicolet/Nexus 670外光谱仪，样品均为KBr压片，扫描范围为500～4000cm-1，结果如图4所示，IR谱图中炔烃的红外吸收峰逐渐消失，表明通过Cu(I)AAC成功合成了最终的聚合物。
按照上述方法制备了三种聚合物胶束样品，包括：PCxbP胶束、PSaP-PTX胶束、PCxbP-PTX胶束，用Zeta电位及粒度测定仪(DLS)检测聚合物胶束的粒径，入射激光波长λ＝532nm，入射角θ＝175°，温度为25℃，粒径值取三次测量值的平均值。结果表明：PCxbP胶束的粒径约130nm(PDI＝0.098)，PSaP-PTX胶束的粒径约115nm，PCxbP-PTX胶束的粒径约为140nm(PDI＝0.103)，PDI是指纳米粒子的多分散系数，所述的三种纳米粒子均具有很小的PDI值，表明纳米粒子尺寸分布均匀。
用透射电镜(TEM)观察聚合物胶束的形貌，操作步骤如下：取2μL样品(0.2mg/mL)滴在纯碳膜铜网上，在室温下晾干，用3％的醋酸铀染色1min。用透射电镜在120kV下观察。
实施例6聚合物胶束的性能检测
1、MMP-2响应性检测
为证明实施例1制备的聚合物胶束具有MMP-2响应性，将聚合物胶束置于10nMMMP-2的条件中处理4h后，再用DLS或者TEM观察其形貌，采用3％磷钨酸(pH 7.4)染色1min。
DLS结果如图5所示，DLS测得10nM MMP-2下0h时PCxbP-PTX胶束的粒径约140nm(PDI＝0.107)，4h后粒径减小至约110nm(PDI＝0.203)，这是因为释放了表层的抗炎药物CXB，胶束的粒径减小。TEM结果如图6所示，基本与DLS结果(图5)一致。
此外，在10nM MMP-2条件下，CXB能够有效释放(如图7A所示)，说明聚合物胶束具有很好的MMP-2酶响应性。图7B结果表明，胶束内核包裹的化疗药物PTX在pH5.0(细胞溶酶体环境)条件下能够有效释放，可用于肿瘤的化疗。
2、抗炎效果的检测
通过酶联免疫吸附(ELISA)测定聚合物胶束(PCxbP)抑制前列腺素2(PGE2)的合成，从而评估抗炎效果。把Raw 264.7巨噬细胞接种于96孔板，在100μL DMEM(含10％FBS)培养基中培养12h。用脂多糖LPS诱导8h后，每孔加入不同体积的PCxbP胶束(用10nM MMP-2预处理4h)，继续培养24h，检测上清液中PGE2的合成。结果如图8所示，说明MMP-2酶切聚合物胶束中的多肽后，释放的CXB能够抑制PGE2的合成，具有抗炎的效果。
3、肿瘤细胞毒性试验
通过四唑盐比色法(MTT)检测纳米药物对肿瘤细胞的杀伤作用。把HT-1080细胞以1×103/孔的数量接种于96孔板。在100μL DMEM(含10％FBS)培养基中培养12h，每孔加入不同体积的PCxbP-PTX胶束或者PSaP-PTX胶束，在37℃下培养48h。进行MTT分析时，将原有培养基弃去，更换为新鲜的150μL DMEM，并加入MTT溶液(5mg/mL)50μL，37℃继续孵育4h后，弃去培养孔中的上清液，每个孔加入150μL DMSO，震荡5min，用酶联免疫检测仪检测570nm处的吸光度值，计算细胞增殖率。细胞存活率＝对照组值吸光度/实验组值吸光度×100％。
结果如图9所示，PCxbP-PTX、PSaP-PTX中PTX的IC50值分别为31.8、83.6ng/mL。说明抗炎药物CXB能增加细胞对PTX化疗的敏感度，具有潜在的联合治疗肿瘤效果。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种三嵌段聚合物，其特征在于，所述聚合物为(L-谷氨酸炔丙酯)-聚乙二醇-聚己内酯-乙酰酯，其结构式如式(I)所示：
。
2.权利要求1所述三嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.以ε-己内酯和烯丙基聚乙二醇为原料，在催化剂和无水无氧条件下经聚合反应制得两嵌段共聚物APEG-PCL-OH；
S2.以APEG-PCL-OH和乙酰氯为原料，加入三乙胺，制得APEG-PCL-Ac；
S3.以APEG-PCL-Ac、巯基乙胺盐酸盐和偶氮二异丁腈为原料，制得HCl·NH2-PEG-PCL-Ac；
S4.以L-谷氨酸、丙炔醇为原料，加催化剂制得L-PLG；再以L-PLG为原料，加入三光气，制得PLG-NCA；
S5.以HCl·NH2-PEG-PCL-Ac和PLG-NCA为原料，经开环聚合得到三嵌段聚合物PPLG-PEG-PCL-Ac。
3.权利要求1所述的三嵌段聚合物在制备载药纳米胶束中的应用。
4.一种用于肿瘤抗炎治疗和化疗的聚合物胶束，其特征在于，所述聚合物胶束包括疏水内核和壳层；所述疏水内核为聚己内酯，其上负载疏水性抗肿瘤药物；胶束表面由基质金属蛋白酶敏感的多肽偶联抗炎药物和聚乙二醇共同形成壳层。
5.根据权利要求4所述聚合物胶束，其特征在于，所述疏水性抗肿瘤药物为紫杉醇。
6.根据权利要求4所述聚合物胶束，其特征在于，所述抗炎药物为塞来昔布。
7.根据权利要求4所述聚合物胶束，其特征在于，所述抗炎药物占聚合物胶束质量的5.0～11.0％，所述疏水性抗肿瘤药物占聚合物胶束质量的4.0～8.0％。
8.根据权利要求4所述聚合物胶束，其特征在于，所述聚合物胶束的粒径为100～150nm。
9.权利要求4～8任一项所述聚合物胶束的制备方法，其特征在于，通过点击反应将偶联有抗炎药物的MMP-2酶敏感多肽连接在权利要求1所述三嵌段聚合物PPLG嵌段的炔基上，再将该聚合物和疏水性药物在水中自组装形成负载抗炎药物和包裹疏水性药物的聚合物胶束。
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