CN105646672A - 高纯度4-羟基环孢素及其提纯制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种高纯度4-羟基环孢素及其提纯制备方法，包括如下步骤：？4-羟基环孢素的提取；脱色介质脱色；吸附介质富集；高压层析制备；结晶纯化。本发明采用离子交换树脂脱色，大孔吸附树脂富集，高压层析纯化的方法，各阶段选择特定工艺并互相配合取得了良好的技术效果。

Description

高纯度4-羟基环孢素及其提纯制备方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，尤其涉及利用生物转化法制得4-羟基环孢素发酵液后再提取制备高纯度4-羟基环孢素的方法。

背景技术

4-羟基环孢素(简称4-OH环孢素)是新型抗丙肝病毒药物的重要医药中间体，主要针对丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)感染引起的病毒性肝炎。据世界卫生组织统计，目前全球HCV的感染率约为3％，估计约1.8亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约为3.5万例。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至细胞癌(HCC)。一些数据显示，未来20年内与HCV感染相关的死亡率将持续增长，对患者的健康和生命危害极大,已成为严重的社会的公共卫生问题。4-OH环孢素是合成新型抗丙肝病毒药物重要的医药中间体。

4-OH环孢素结构式：

4-OH环孢素发酵产品中的主要杂质是未转化的环孢菌素及其同系物，其去除难度高，经检索未发现有如何去除这些杂质以得到高纯度的4-OH环孢素的相关文献。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种高纯度4-OH环孢素及其提纯制备方法，以达到低成本、高效率的提纯4-OH环孢素。

本发明是这样实现的：

高纯度4-羟基环孢素的提纯制备方法，包括如下步骤：

(1)4-羟基环孢素的提取

向4-羟基环孢素发酵液中加入有机溶剂，常温下浸提2至4小时，滤出菌体得浸提液；

(2)脱色介质脱色

脱色介质装柱，浸提液用脱色柱进行脱色处理，得到脱色液；

(3)吸附介质富集

脱色液用吸附介质进行吸附富集，洗涤剂处理上样后的吸附介质，然后用解析剂进行解析并收集解析液，解析液浓缩后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯相浓缩待用；

(4)高压层析制备

将乙酸乙酯浓缩液进行高压层析制备，用乙腈水混合溶剂洗脱，收集4-羟基环孢素；

(5)结晶纯化

4-羟基环孢素经浓缩，萃取后进行结晶，结晶液放置，直至目测出现晶体析出，抽滤结晶液，用异丙醚洗涤，最后干燥得无色粉末状4-羟基环孢素精粉。

本发明中，步骤(1)中所用有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或多种，所用有机溶剂用量与发酵液体积比为1:1-1:2。

本发明中，步骤(2)中所用脱色介质为阴离子交换树脂D290、RX-01T或RX-02T；步骤(3)中所用吸附介质为大孔吸附树脂HZ830、HZ801或HZ816。

本发明中，步骤(3)中所用洗涤剂依次为45％甲醇—碱(1g/LNaOH)、45％甲醇；所用解析剂为80％-85％甲醇。

本发明中，步骤(4)中所用填料为120A10μmC18。

本发明中，步骤(4)中所用流动相配比为乙腈：水＝50～70：50～30。

本发明中，步骤(4)中所用流动相配比为乙腈：水＝65:35。

本发明中，步骤(5)中所用结晶剂为丙酮：异丙醚＝0～10:100～90。

本发明中，步骤(5)中所用结晶剂为丙酮：异丙醚＝5:95。

本发明中，步骤(5)中4-羟基环孢素的真空干燥温度为40-65℃。

本发明的4-羟基环孢素XRD图如图2所示。

本发明采用离子交换树脂脱色，大孔吸附树脂富集，高压层析纯化的方法，各阶段选择特定工艺并互相配合取得了良好的技术效果。本发明采用阴离子树脂脱色技术，有效去除了浸提液中的色素，为之后的纯化工作降低了难度；采用大孔吸附树脂层析技术，对4-OH环孢素起到了明显的浓缩富集作用，4-OH环孢素的浓度经富集可提高近25倍。采用高压层析技术，大大缩短了工艺周期，现有的常压硅胶层析方法周期长，约为3-5天左右，载样量为0.5％，溶剂使用量约为20倍柱体积，且所使用洗脱剂为混合有机溶剂，不易回收和重复利用；高压层析方法周期短，约为1-2小时左右，载样量为1％，溶剂使用量约为10倍柱体积，所使用溶剂为乙腈、水，易于回收，降低了使用洗脱剂成本，大大节省了生产周期。使用单一有机溶剂及水作为流动相，较常压硅胶层析使用混合有机溶剂易于溶媒的回收，节约了成本。

附图说明

图1为本发明的4-OH环孢素的提纯工艺路线图。

图2为4-OH环孢素精粉的XRD图。

图3为4-OH环孢素精粉的DSC图。

图4为4-OH环孢素精粉的TGA图。

图5为4-OH环孢素精粉的拉曼光谱图。

图6为4-OH环孢素精粉的红外光谱图。

图7为实施例1制得的4-OH环孢素精粉的的高压液相色谱图。

图8为实施例2制得的4-OH环孢素精粉的的高压液相色谱图。

图9为实施例3制得的4-OH环孢素精粉的的高压液相色谱图。

具体实施方式

本发明所使用高压液相设备为江苏汉邦科技有限公司产品，检测器：NU3000SERIALSUN/VISDETECTOR,输液泵：NP7000SERIALSPUMB，柱：DAC-HB动态轴向压缩柱。

下面结合图1，对本发明进行进一步说明：

本发明第(1)步进行4-OH环孢素的提取：

向4-OH环孢素发酵液中加入有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或多种，优选为甲醇，常温下浸提2至4小时，滤出菌体得浸提液。

本发明第(2)步利用脱色介质脱色：

脱色介质装柱，浸提液用脱色柱进行脱色处理，得到脱色液。

对不同型号树脂进行了4-OH环孢素动态脱色实验，确定了D290、RX-01T和RX-02T脱色效果较好，且对4-OH环孢素无吸附，其中优选RX-02T树脂。

本发明第(3)步利用吸附介质富集：

脱色液用吸附介质进行吸附富集，洗涤剂处理上样后的吸附介质，然后用解析剂进行解析并收集解析液，解析液浓缩后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯相浓缩待用。

对不同型号树脂进行了4-OH环孢素静态吸附-解吸实验，确定了HZ830、HZ801和HZ816的吸附和解吸效果较好，其中优选HZ816树脂。

上样后的树脂洗涤剂依次为45％甲醇—碱(1g/LNaOH)、45％甲醇，经实验验证使用45％甲醇—碱(1g/LNaOH)(向洗涤剂45％甲醇中按1g/L加入NaOH使得每升45％甲醇中含有1gNaOH)作洗涤剂，可以更有效的去除吸附在树脂上的杂质，乙酸乙酯相浓缩后的粗品含量更高，有效降低了后期纯化步骤的压力。

洗涤后的树脂洗脱剂为80％-85％甲醇，优选85％甲醇，洗脱体积约为1.5～2倍柱体积。

本发明第(4)步高压层析制备：

将乙酸乙酯浓缩液进行高压层析制备，用乙腈水混合溶剂洗脱，收集合格的4-OH环孢素。

高压层析选用C18填料，粒径10μm，孔径120A，所用流动相配比为乙腈：水＝50～70：50～30，优选乙腈：水＝65:35，当柱床体积为300ml时，上样液为20ml，4-OH环孢素上样浓度为4×10⁵-5×10⁵μg/ml，优选5×10⁵μg/ml，洗脱流速为50-90ml/min，优选80ml/min，用HPLC检测流出液，收集合格产品。

本发明第(5)步结晶纯化：

合格部分经浓缩，萃取后进行结晶，结晶液放置，直至目测出现晶体析出，抽滤结晶液，用异丙醚洗涤，最后干燥得无色粉末状4-OH环孢素精粉。

洗脱液在50℃-60℃条件下减压浓缩至干，加入少量结晶剂，结晶剂配比为丙酮：异丙醚＝0～10:100～90，优选丙酮：异丙醚＝5:95，置于室温条件下结晶，用异丙醚洗涤后40℃-60℃条件下干燥至恒重。

实施例1

1)取4-OH环孢素发酵液30L，含4-OH环孢素10.2g，加入30L异丙醇浸泡5小时，板框过滤，收集浸提液58L，效价为173μg/ml。

2)将收集到的浸提液，用1LD290树脂作为脱色介质进行脱色，流速为2BV/h，收集脱色液，脱色液明显较上柱前浅。

3)将收集到的脱色液，使用1LHZ816柱进行吸附，上样流速为1BV/h，吸附完毕后检测下柱液效价为1μg/ml，废弃。吸附后的树脂经一步洗涤，洗涤剂为45％甲醇，流速均为1～1.5BV/h，经检测洗柱液均无单位。再用80％异丙醇解析，流速为1BV/h，分段收集解析液。解析液出口单位小于10μg/ml时，解析完成，合并有效部分，进行减压浓缩，真空度0.09Mpa以上，温度控制不超过55℃，加入2L乙酸乙酯进行萃取，4-OH环孢素转入乙酸乙酯相，乙酸乙酯相进行减压浓缩，真空度-0.09Mpa以上，温度控制不超过55℃，浓缩至乙酸乙酯尽干得4-OH环孢素油膏。

4)将得到的4-OH环孢素油膏用少量乙腈溶解，进行高压层析制备，流动相为50％乙腈，分段收集流出液，经分析检测后收集合格部分。

5)将收集到的检测合格的洗脱液减压浓缩，真空度0.09Mpa以上，温度控制不超过55℃，得到4-OH环孢素浓缩液。加入1L乙酸乙酯进行萃取，4-OH环孢素转入乙酸乙酯相。再将乙酸乙酯相进行减压浓缩，真空度0.09Mpa以上，温度控制不超过55℃，浓缩至乙酸乙酯尽干得4-OH环孢素浓缩物。将得到的4-OH环孢素浓缩物用100ml结晶溶剂(结晶溶剂为丙酮：异丙醚＝10:90)溶解，搅拌状态下放置，直至有晶体析出，过滤结晶液，用异丙醚挖洗，得到湿精粉。湿精粉放入真空烤箱，在50℃，0.09Mpa真空度以上烤粉，烤粉24小时，得到无定形4-OH环孢素精粉。HPLC测定如图7，4-OH环孢素的纯度达到了97％。其XRD图如图2所示，DSC图如图3所示、TGA图如图4所示、拉曼光谱图如图5所示，红外光谱图如图6所示。

实施例2

1)取4-OH环孢素发酵液25L，含4-OH环孢素8.2g，加入20L乙醇浸泡5小时，板框过滤，收集浸提液41L，效价为189μg/ml。

2)将收集到的浸提液，用1LRX-01T树脂作为脱色介质进行脱色，流速为2BV/h，收集脱色液，脱色液明显较上柱前浅。

3)将收集到的脱色液，使用1LHZ816柱进行吸附，上样流速为1BV/h，吸附完毕后检测下柱液效价为1μg/ml，废弃。吸附后的树脂经两步洗涤，洗涤剂1为45％甲醇-碱(1g/LNaOH)，洗涤剂2为45％甲醇，流速均为1～1.5BV/h，经检测洗柱液均无单位。再用82％乙醇解析，流速为1BV/h，分段收集解析液。解析出口单位小于10μg/ml时，解析完成，合并有效部分。将收集到的解吸液，进行减压浓缩，真空度0.09Mpa以上，温度控制不超过55℃，加入2L乙酸乙酯进行萃取，4-OH环孢素转入乙酸乙酯相，乙酸乙酯相进行减压浓缩，真空度0.09Mpa以上，温度控制不超过55℃，浓缩至乙酸乙酯尽干得4-OH环孢素油膏。

4)将得到的4-OH环孢素油膏用少量乙腈溶解，进行高压层析制备，流动相为70％乙腈，分段收集流出液，经分析检测后收集合格部分。

5)将收集到的检测合格的洗脱液减压浓缩，真空度0.09Mpa以上，温度控制不超过55℃，得到4-OH环孢素浓缩液。加入1L乙酸乙酯进行萃取，4-OH环孢素转入乙酸乙酯相。再将乙酸乙酯相进行减压浓缩，真空度0.09Mpa以上，温度控制不超过60℃，浓缩至乙酸乙酯尽干得4-OH环孢素浓缩物。将得到的4-OH环孢素浓缩物用100ml结晶溶剂(结晶溶剂为丙酮：异丙醚＝2:98)溶解，搅拌状态下放置，直至有晶体析出，过滤结晶液，用异丙醚挖洗，得到湿精粉。湿精粉放入真空烤箱，在40-60℃，0.09Mpa真空度以上烤粉，烤粉24小时，得到无定形4-OH环孢素精粉，HPLC测定如图8，4-OH环孢素的纯度达到了98.3％。

实施例3

1)取4-OH环孢素发酵液28L，含4-OH环孢素9.8g，加入25L甲醇浸泡5小时，板框过滤，收集浸提液50L，效价为185μg/ml。

2)将收集到的浸提液，用1LRX-02T树脂作为脱色介质进行脱色，流速为2BV/h，收集脱色液，脱色液明显较上柱前浅。

3)将收集到的脱色液，使用1LHZ816柱进行吸附，上样流速为1BV/h，吸附完毕后检测下柱液效价为3μg/ml，废弃。吸附后的树脂经两步洗涤，洗涤剂1为45％甲醇-碱(1g/LNaOH)，洗涤剂2为45％甲醇，流速均为1～1.5BV/h，经检测洗柱液均无单位。再用80％-85％甲醇解析，流速为1BV/h，分段收集解析液。解析出口单位小于10μg/ml时，解析完成，合并有效部分。将收集到的解吸液，进行减压浓缩，真空度0.09Mpa以上，温度控制不超过55℃，加入2L乙酸乙酯进行萃取，4-OH环孢素转入乙酸乙酯相，乙酸乙酯相进行减压浓缩，真空度-0.09Mpa以上，温度控制不超过55℃，浓缩至乙酸乙酯尽干得4-OH环孢素油膏。

4)将得到的4-OH环孢素油膏用少量乙腈溶解，进行高压层析制备，流动相为65％乙腈，分段收集流出液，经分析检测后收集合格部分。

5)将收集到的检测合格的洗脱液减压浓缩，真空度0.09Mpa以上，温度控制不超过55℃，得到4-OH环孢素浓缩液。加入1L乙酸乙酯进行萃取，4-OH环孢素转入乙酸乙酯相。再将乙酸乙酯相进行减压浓缩，真空度0.09Mpa以上，温度控制不超过55℃，浓缩至乙酸乙酯尽干得4-OH环孢素浓缩物。将得到的4-OH环孢素浓缩物用80ml结晶溶剂(结晶溶剂为丙酮：异丙醚＝5:95)溶解，搅拌状态下放置，直至有晶体析出，过滤结晶液，用异丙醚挖洗，得到湿精粉。湿精粉放入真空烤箱，在40-60℃，0.09Mpa真空度以上烤粉，烤粉24小时，得到无定形4-OH环孢素精粉，HPLC测定如图9，4-OH环孢素的纯度达到了99.2％。

Claims (10)

1.高纯度4-羟基环孢素的提纯制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）4-羟基环孢素的提取

向4-羟基环孢素发酵液中加入有机溶剂，常温下浸提2至4小时，滤出菌体得浸提液；

（2）脱色介质脱色

脱色介质装柱，浸提液用脱色柱进行脱色处理，得到脱色液；

（3）吸附介质富集

脱色液用吸附介质进行吸附富集，洗涤剂处理上样后的吸附介质，然后用解析剂进行解析并收集解析液，解析液浓缩后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯相浓缩待用；

（4）高压层析制备

将乙酸乙酯浓缩液进行高压层析制备，用乙腈水混合溶剂洗脱，收集4-羟基环孢素；

（5）结晶纯化

所得4-羟基环孢素经浓缩，萃取后进行结晶，结晶液放置，直至目测出现晶体析出，抽滤结晶液，用异丙醚洗涤，最后干燥得无色粉末状4-羟基环孢素精粉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所用洗涤剂依次为45%甲醇—碱（1g/LNaOH）、45%甲醇；所用解析剂为80%-85%甲醇。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中所用填料为120A10μmC18。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中所用流动相配比为乙腈：水=50~70：50~30。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中所用流动相配比为乙腈：水=65:35。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)中所用结晶剂为丙酮：异丙醚=0~10:100~90。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)中所用结晶剂为丙酮：异丙醚=5:95。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)中4-羟基环孢素的真空干燥温度为40-65℃。

9.4-羟基环孢素，其特征在于其XRD图如图2所示。

10.4-羟基环孢素，其特征在于制备方法包括以下步骤：

（1）4-羟基环孢素的提取

向4-羟基环孢素发酵液中加入有机溶剂，常温下浸提2至4小时，滤出菌体得浸提液；

（2）脱色介质脱色

脱色介质装柱，浸提液用脱色柱进行脱色处理，得到脱色液；

（3）吸附介质富集

脱色液用吸附介质进行吸附富集，洗涤剂处理上样后的吸附介质，然后用解析剂进行解析并收集解析液，解析液浓缩后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯相浓缩待用；

（4）高压层析制备

将乙酸乙酯浓缩液进行高压层析制备，用乙腈水混合溶剂洗脱，收集4-羟基环孢素；

（5）结晶纯化

所得4-羟基环孢素经浓缩，萃取后进行结晶，结晶液放置，直至目测出现晶体析出，抽滤结晶液，用异丙醚洗涤，最后干燥得无色粉末状4-羟基环孢素精粉。