CN107226843B - 4-羟基环孢素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种4‑羟基环孢素的制备方法，以环孢霉素A为主要原料化学合成制备4‑羟基环孢素。这种4‑羟基环孢素的制备方法在制备4‑羟基环孢素时，化学合成的速度快、成本低，操作简便，制得的4‑羟基环孢素纯度较高，可以实现4‑羟基环孢素的大量制备。

Description

4-羟基环孢素的制备方法
技术领域
本发明涉及有机合成领域，特别是涉及一种4-羟基环孢素的制备方法。
背景技术
4-羟基环孢素((γ-hydroxylmethylleucine4)-cyclosporin A)最早是由山德士（SANDOZ）制药公司在1991年开发的一种AIDS抑制活性的环孢素免疫活性抑制衍生物。4-羟基环孢素是由环孢素的4位亮氨酸侧链γ位氧化获得的，结构式为
Figure 227984DEST_PATH_IMAGE001
（化合物1）。
4-羟基环孢素为中间体在抗病毒分子的研发中得到广泛应用。如，Scynexis公司研制的抗HCV临床药物分子SCY-635正是在 (γ-hydroxylmethylleucine4)- cyclosporinA的基础上再经过3位修饰得到的。此外，(γ-hydroxylmethylleucine4)- cyclosporin A本身还具有良好的生发作用。
目前已有的4-羟基环孢素的制备方法收率低，需要多步柱层析，纯化困难，很难进行产业化生产。因此急需找到一种可以大量制备4-羟基环孢素的制备方法，以便进行更深入的衍生化研究。
发明内容
基于此，有必要提供一种4-羟基环孢素的制备方法，用于大量制备4-羟基环孢素。
一种4-羟基环孢素的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、-20℃~35℃下将化合物2和第一反应物溶于第一有机溶剂中，接着在-15℃~30℃下加入3-氯-2-甲基丙烯，接着加热至58℃~82℃并充分反应，接着加入水并用酸性调节剂调节pH为7，充分反应后纯化得到化合物3，其中，所述第一反应物选自NaH、KH、K2CO和Cs2CO3中的至少一种，所述酸性调节剂为盐酸、柠檬酸、硫酸或氟硼酸，所述化合物2以及所述化合物3的结构式如下，
化合物2：
Figure 837957DEST_PATH_IMAGE002
,化合物3：
Figure 758770DEST_PATH_IMAGE003
;
步骤二、将所述化合物3溶解于乙醇中，接着加入NaOH溶液或KOH溶液并在回流条件下充分反应，接着除去乙醇并用所述酸性调节剂调节pH至7，回流条件下充分反应，之后再用浓盐酸调节pH至3，纯化后得到化合物4，其中，所述化合物4的结构式如下，
化合物4：
Figure 264838DEST_PATH_IMAGE004
;
步骤三、将所述化合物4溶解于pH为8的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的水溶液中，接着加热至30℃~55℃并加入酰化氨基酸水解酶，充分反应后加入吸附剂并过滤，保留滤液并加入等体积的THF、二氧六环或乙腈，接着降温至-5℃~10℃并加入二碳酸二叔丁酯，用碳酸氢钠调节pH为7.5~8.5后控制反应温度为-5℃~30℃并充分反应，然后除去THF，并用浓盐酸调节pH为3，接着纯化得到化合物5，其中，所述化合物5的结构式如下，
化合物5:
Figure 746635DEST_PATH_IMAGE005
;
步骤四、将所述化合物5、碘甲烷和NaH在干燥的第二有机溶剂中混合并充分反应，接着冷却至-10℃~5℃后纯化，接着加入水合肼并在室温下充分反应，再次纯化得到化合物6，其中，所述化合物6的结构式如下，
化合物6：
Figure 35665DEST_PATH_IMAGE006
;
步骤五、-8℃~4℃下将所述化合物6溶解于第三有机溶剂中并降温至-15℃~-8℃，接着加入第二反应物或第三反应物，控制反应温度为-15℃~-8℃并充分反应，纯化后得到化合物7，其中，所述第二反应物为氯化氢的乙醚溶液和亚硝酸叔丁酯，所述第三反应物为乙酸和亚硝酸钠，所述化合物7的结构式如下，
化合物7：
Figure 919307DEST_PATH_IMAGE007
;
步骤六、将环孢霉素A、吡啶和4-二甲氨基吡啶溶于乙酸酐中，室温下充分反应，接着纯化得到化合物8，其中，环孢霉素A和所述化合物8的结构式如下，
环孢霉素A：
Figure 517648DEST_PATH_IMAGE008
,
化合物8：
Figure 486741DEST_PATH_IMAGE009
;
步骤七、将所述化合物8和三甲基氧四氟硼酸盐溶于第四有机溶剂中并充分反应，接着加入乙腈和水并充分反应，纯化得到化合物9，其中，三甲基氧四氟硼酸盐和所述化合物9的结构式如下，
三甲基氧四氟硼酸盐：
Figure 313883DEST_PATH_IMAGE010
,
化合物9：
Figure 583190DEST_PATH_IMAGE011
;
步骤八、将所述化合物9、N,N-二异丙基乙胺和硫代异氰酸苯酯溶于第五有机溶剂中并充分反应，接着加入N,N-二甲基乙二胺并充分反应，接着加入甲醇和质量分数为40%~60%的氟硼酸水溶液并充分反应，之后纯化得到化合物10，其中，所述化合物10的结构式如下：
化合物10：
Figure 853896DEST_PATH_IMAGE012
;
步骤九、在温度为-8℃~-12℃的条件下将所述化合物10、所述化合物7和N,N-二异丙基乙胺溶于第六有机溶剂中，接着升温至室温并充分反应，接着纯化得到化合物11，其中，所述化合物11的结构式如下，
化合物11：
Figure 310286DEST_PATH_IMAGE013
;
步骤十、在温度为-20℃~8℃的条件下将所述化合物11和第四反应物溶解在四氢呋喃和水的混合溶液中，充分反应后纯化并在温度为-20℃~8℃的条件下加入二氯甲烷和三氟乙酸，充分反应后再次纯化，并在温度为-20℃~8℃的条件下加入N,N-二异丙基乙胺和BopCl，升温至室温并充分反应，第三次纯化后得到化合物12，其中，所述第四反应物为LiOH、NaOH或KOH，BopCl和所述化合物12的结构式如下，
BopCl：
Figure 941118DEST_PATH_IMAGE014
,
化合物12：
Figure 737036DEST_PATH_IMAGE015
;
步骤十一、将所述化合物12、甲基磺酸和醋酸溶于第七有机溶剂中，控制温度为30℃~50℃并充分反应，纯化后得到化合物13，其中，所述化合物13的结构式如下，
化合物13：
Figure 552545DEST_PATH_IMAGE016
；以及
步骤十二、将所述化合物13和甲醇钠溶于第八有机溶剂中并充分反应，纯化后得到化合物1，所述化合物1即为4-羟基环孢素，其中，所述化合物1的结构式如下，
化合物1：
Figure 886443DEST_PATH_IMAGE001
。
在一个实施例中，步骤一中，所述第一有机溶剂为二甲基甲酰胺、氮甲基吡烙烷酮或THF。
在一个实施例中，步骤三中，所述纯化得到化合物5的操作为：萃取后保留有机相并洗涤，接着浓缩所述有机相并加入乙醚、甲基叔丁基醚或异丙醚，去除析出的化合物4’得到所述化合物5的乙醚溶液，其中，所述化合物4’的结构式如下，
化合物4’：
Figure 648863DEST_PATH_IMAGE017
。
在一个实施例中，步骤四中，所述第二有机溶剂为四氢呋喃、二甲基甲酰胺或体积比为2：1的四氢呋喃和二甲基甲酰胺的混合溶液。
在一个实施例中，步骤五中，所述第三有机溶剂为四氢呋喃、二氧六环或DMF。
在一个实施例中，步骤七中，所述第四有机溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷或氯仿。
在一个实施例中，步骤八中，所述第五有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃或甲苯。
在一个实施例中，步骤九中，所述第六有机溶剂为氯仿、甲苯或二氯甲烷。
在一个实施例中，步骤十一中，所述第七有机溶剂为二氯甲烷、甲苯或二氯乙烷。
在一个实施例中，步骤十二中，所述第八有机溶剂为甲醇。
这种4-羟基环孢素的制备方法在制备4-羟基环孢素时，化学合成的速度快、成本低，操作简便，制得的4-羟基环孢素纯度较高，可以实现4-羟基环孢素的大量制备。
附图说明
图1为实施例1制得的化合物1与标准4-羟基环孢素的比对测试图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明公开了一实施方式的4-羟基环孢素的制备方法，其中，4-羟基环孢素((γ-hydroxylmethylleucine4)-cyclosporin A)的结构式如下：
Figure 33708DEST_PATH_IMAGE001
（本发明中命名为化合物1）。
具体的，4-羟基环孢素的制备方法包括如下步骤：
步骤一、-20℃~35℃（优选为冰浴）下将化合物2和第一反应物溶于第一有机溶剂中，接着在-15℃~30℃（优选为冰浴）下加入3-氯-2-甲基丙烯，接着加热至58℃~62℃（优选为60℃）并充分反应（反应时间优选为2h），接着加入水并用酸性调节剂调节pH为7，充分反应后纯化得到化合物3。
第一反应物选自NaH、KH、K2CO和Cs2CO3中的至少一种.
酸性调节剂为盐酸、柠檬酸、硫酸或氟硼酸。优选的，酸性调节剂为盐酸（浓度为0.5mol/L~12mol/L）。
化合物2、3-氯-2-甲基丙烯以及化合物3的结构式如下，
化合物2：
Figure 957802DEST_PATH_IMAGE002
，化合物3：
Figure 388783DEST_PATH_IMAGE003
。
步骤一中，NaH和3-氯-2-甲基丙烯相对于化合物2过量加入，以保证化合物2完全反应。
优选的，化合物2、NaH和3-氯-2-甲基丙烯的摩尔比为1：1.2：1.2。
第一有机溶剂可以为二甲基甲酰胺（DMF）、氮甲基吡烙烷酮或THF。
充分反应后纯化得到化合物3的操作可以为：充分反应后析出的白色固体经过过滤收集并用蒸馏水洗涤，最后真空干燥得到化合物3。
步骤二、将步骤一得到的化合物3溶解于乙醇中，接着加入NaOH溶液（浓度为2mol/L~4mol/L，优选为3mol/L）或KOH溶液（浓度为2mol/L~4mol/L，优选为3mol/L）并在回流条件下充分反应（反应时间优选为2h），接着除去乙醇并用上述酸性调节剂调节pH至7，回流条件下充分反应，之后再用浓盐酸（浓度优选为12mol/L）调节pH至3，纯化后得到化合物4。
化合物4的结构式如下，
化合物4：
Figure 377730DEST_PATH_IMAGE004
。
步骤二中，其他反应物相对于化合物3过量加入，以保证化合物3完全反应。
纯化后得到化合物4的操作为：过滤后保留白色晶体，并在乙醚中重结晶得到化合物4。
步骤三、将步骤二得到的化合物4溶解于pH为8的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的水溶液（浓度为0.05M~1M）中，接着加热至30℃~55℃（优选为40℃）并加入酰化氨基酸水解酶，充分反应后加入吸附剂并过滤，保留滤液并加入等体积的THF、二氧六环或乙腈，接着降温至-5℃~10℃（优选为5℃）并加入二碳酸二叔丁酯，用碳酸氢钠调节pH为7.5~8.5后控制反应温度为-5℃~30℃（优选为10℃）并充分反应，然后除去THF，并用浓盐酸（浓度优选为12mol/L）调节pH为3，接着纯化得到化合物5。
化合物5的结构式如下，
化合物5：
Figure 413819DEST_PATH_IMAGE005
。
步骤三中，其他反应物相对于化合物4过量加入，以保证化合物4完全反应。
吸附剂优选为硅藻土。
步骤三中，反应产物为化合物4’和化合物5，因此，为了得到化合物5，需要在纯化操作中除去化合物4’。
纯化得到化合物5的操作为：萃取（萃取剂优选为乙酸乙酯）后保留有机相并洗涤（优选为用10%的氯化钠溶液洗涤），接着浓缩所述有机相并加入乙醚、甲基叔丁基醚或异丙醚，去除析出的化合物4’得到化合物5的乙醚溶液。
化合物4’的结构式如下，
化合物4’：
Figure 305552DEST_PATH_IMAGE017
。
步骤四、将步骤三得到的化合物5、碘甲烷和NaH在干燥的第二有机溶剂中混合并充分反应（反应时间优选为12h），接着冷却至-10℃~5℃（优选为0℃）后纯化，接着加入水合肼并在室温下充分反应（反应时间优选为6h），再次纯化得到化合物6。
化合物6的结构式如下，
化合物6：
Figure 364775DEST_PATH_IMAGE006
。
步骤四中，其他反应产物均相对于化合物5过量加入，以保证化合物5完全反应。
第二有机溶剂为体积比为2：1的四氢呋喃（THF）和二甲基甲酰胺（DMF）的混合溶液。
冷却至-10℃~5℃后纯化的操作为：冷却至-10℃~5℃后加入柠檬酸，接着萃取（萃取剂优选为乙酸乙酯）并保留有机相，干燥（干燥剂优选为硫酸钠）后浓缩并除去第二有机溶剂。
再次纯化得到化合物6的操作为：用水稀释，接着萃取（萃取剂优选为甲基叔丁基醚）并保留有机相，过滤（优选为采用硅胶过滤）、干燥后得到化合物6。
步骤五、-8℃~4℃（优选为冰浴）下将步骤四得到的化合物6溶解于第三有机溶剂中并降温至-15℃~-8℃（优选为-10℃），接着加入第二反应物或第三反应物，控制反应温度为-15℃~-8℃（优选为-10℃）并充分反应（反应时间优选为1h），纯化后得到化合物7。
第二反应物为浓度为0.1mol/L~0.5mol/L的氯化氢的乙醚溶液和亚硝酸叔丁酯（1~10当量，相对于化合物6），第三反应物为乙酸（2~30当量，相对于化合物6）和亚硝酸钠（1~10当量，相对于化合物6）。
化合物7的结构式如下，
化合物7：
Figure 265734DEST_PATH_IMAGE007
。
步骤五中，其他反应产物均相对于化合物6过量加入，以保证化合物6完全反应。
第三有机溶剂可以为四氢呋喃、二氧六环或DMF。
纯化后得到化合物7的操作为：旋蒸除去第三有机溶剂，剩余物萃取（萃取剂优选为氯仿）后保留有机相，接着分别用冰水和质量百分数为5%的碳酸氢钠溶液洗涤，最后干燥得到化合物7。
步骤六、将环孢霉素A（CsA）、吡啶和4-二甲氨基吡啶溶于乙酸酐中，室温下充分反应（反应时间优选为12h），接着纯化得到化合物8。
环孢霉素A和化合物8的结构式如下，
环孢霉素A：
Figure 890751DEST_PATH_IMAGE008
，
化合物8：
Figure 609177DEST_PATH_IMAGE009
。
步骤六中，其他反应物均相对于环孢霉素A（CsA）过量，以保证环孢霉素A（CsA）完全反应。
纯化得到化合物8的操作为：用1L乙酸乙酯稀释，接着用食盐水、饱和的氯化铵溶液和15%的碳酸氢钠溶液依次洗涤，有机相干燥（优选为用硫酸钠干燥）、浓缩，最后在2-甲基四氢呋喃和甲基叔丁基醚的混合溶液(5/1~1/5 v/v)中重结晶得到的白色固体即为化合物8。
步骤七、将步骤六得到的化合物8和三甲基氧四氟硼酸盐溶于第四有机溶剂中并充分反应（反应时间优选为20h），接着加入乙腈和水并充分反应（反应时间优选为3h），纯化得到化合物9。
三甲基氧四氟硼酸盐和化合物9的结构式如下，
三甲基氧四氟硼酸盐：
Figure 749171DEST_PATH_IMAGE010
，
化合物9：
Figure 657084DEST_PATH_IMAGE018
。
步骤七中，其他反应物均相对于化合物8过量，以保证化合物8完全反应。
第四有机溶剂可以为二氯甲烷、二氯乙烷或氯仿。
纯化得到化合物9的操作为：待分层后保留有机相，有机相用水洗涤（优选为洗涤3次），接着真空浓缩、干燥，最后在体积比为2：1的2-甲基四氢呋喃和甲基叔丁基醚的混合溶液中结晶，得到的白色晶状粉末为化合物9。
步骤八、将步骤七得到的化合物9、N,N-二异丙基乙胺和硫代异氰酸苯酯溶于第五有机溶剂中并充分反应（反应时间优选为100min），接着加入N,N-二甲基乙二胺并充分反应（反应时间优选为1h），接着加入甲醇和质量分数为40%~60%的氟硼酸水溶液（氟硼酸水溶液的质量分数优选为50%）并充分反应（反应时间优选为1h），之后纯化得到化合物10。
化合物10的结构式如下：
化合物10：
Figure 74290DEST_PATH_IMAGE012
。
步骤八中，其他反应物均相对于化合物9过量，以保证化合物9完全反应。
第五有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃或甲苯。
纯化得到化合物10的操作为：加水待分层后保留无机层，无机层用萃取剂（萃取剂优选为二氯甲烷）萃取，保留有机相并浓缩后，最后在体积比为2：1的2-甲基四氢呋喃和甲基叔丁基醚的混合溶液中重结晶，得到的白色泡沫状物质为化合物10。
步骤九、在温度为-8℃~-12℃（优选为-10℃）的条件下将步骤八得到的化合物10、步骤五得到的化合物7和N,N-二异丙基乙胺溶于第六有机溶剂中，接着升温至室温并充分反应（反应时间优选为3h），接着纯化得到化合物11。
化合物11的结构式如下：
化合物11：
Figure 573405DEST_PATH_IMAGE013
。
步骤九中，其他反应物均相对于化合物10过量，以保证化合物10完全反应。
第六有机溶剂可以为氯仿、甲苯或二氯甲烷。
纯化得到化合物11的操作为：旋蒸除去第六有机溶剂，剩余物溶解在乙酸乙酯中，用稀盐酸（浓度为0.5mol/L~2mol/L，优选为1mol/L）和水洗涤有机相，干燥并浓缩后得到化合物11。
步骤十、在温度为-20℃~8℃的条件下将步骤九得到的化合物11和第四反应物溶解在体积比为10：1~1：3的四氢呋喃和水的混合溶液中，充分反应（反应时间优选为2h）后纯化，并在温度为-20℃~8℃（优选为0℃）的条件下加入体积比为20~5：1（优选为10：1）的二氯甲烷和三氟乙酸，充分反应（反应时间优选为4h）后再次纯化，并在温度为-20℃~8℃的条件下加入N,N-二异丙基乙胺和BopCl，升温至室温并充分反应，第三次纯化后得到化合物12。
第四反应物为LiOH、NaOH或KOH。
BopCl和所述化合物12的结构式如下：
BopCl：
Figure 92373DEST_PATH_IMAGE014
，
化合物12：
Figure 335136DEST_PATH_IMAGE015
。
步骤十中，其他反应物均相对于化合物11过量，以保证化合物11完全反应。
充分反应后纯化的操作为：充分反应后用二氯甲烷稀释并保留有机相，接着分别用1N的盐酸、水和食盐水洗涤有机相，最后浓缩有机相。
充分反应后再次纯化的操作为：充分反应后用二氯甲烷稀释并保留有机相，接着分别用碳酸氢钠饱和溶液以及饱和食盐水洗涤有机相，有机相干燥后浓缩。
第三次纯化后得到化合物12的操作为：用二氯甲烷稀释并保留有机相，接着依次用水、1N的氯化氢溶液、水和饱和食盐水洗涤，有机相干燥浓缩后在体积比为2：1的2-甲基四氢呋喃和甲基叔丁基醚的混合溶液结晶，得到的白色泡沫状物质为化合物12。
步骤十一、将步骤十得到的化合物12、甲基磺酸和醋酸溶于第七有机溶剂中，控制温度为30℃~50℃（优选为40℃）并充分反应（反应时间优选为8h），纯化后得到化合物13。
化合物13的结构式如下：
化合物13：
Figure 934744DEST_PATH_IMAGE016
。
步骤十中，其他反应物均相对于化合物12过量，以保证化合物12完全反应。
第七有机溶剂可以为二氯甲烷、甲苯或二氯乙烷。
纯化后得到化合物13的操作为：用二氯甲烷稀释后保留有机相，接着依次用水、碳酸氢钠溶液、水以及饱和食盐水洗涤有机相，有机相经干燥、浓缩后得到化合物13。
步骤十二、将步骤十一得到的化合物13和甲醇钠溶于第八有机溶剂中并充分反应（反应时间优选为15h），纯化后得到化合物1，化合物1即为4-羟基环孢素。
化合物1（4-羟基环孢素）结构式如下：
化合物1：
Figure 745705DEST_PATH_IMAGE001
。
步骤十中，其他反应物均相对于化合物13过量，以保证化合物13完全反应。
第八有机溶剂为甲醇。
纯化后得到化合物1的操作为：用0.5 N的盐酸将pH调至6左右，浓缩反应液后得到的浓缩物溶解在乙酸乙酯中，接着依次用碳酸氢钠和食盐水洗涤有机相，有机相浓缩后经色谱柱分离纯化，得到化合物1。
这种4-羟基环孢素的制备方法在制备4-羟基环孢素时，化学合成的速度快、成本低，操作简便，制得的4-羟基环孢素纯度较高，可以实现4-羟基环孢素的大量制备。
以下为具体实施例。
具体实施例中用到的药品和仪器均为本领域常规选择。
实施例1
步骤一、将化合物2（乙酰氨基丙二酸二乙酯，217.1g，1.0mol)溶于2.0L DMF中，随后加入NaH（60 wt % 溶在煤油中，48.0 g，1.2 mol)。然后在冰浴下加入3-氯-2-甲基丙烯（108.7 g,117.5 mL，1.2 mol)，在30min内加完。之后将温度加热到60摄氏度，并保持2小时。随后加入水（2.0 L)，再用1.0 mol/L HCl 将溶液的pH值调至7。在室温下，反应12h，析出的白色固体经过过滤收集并用蒸馏水洗涤（2×1L)，最后用真空干燥箱干燥，得到化合物3（247.0g，91%)。
步骤二、将化合物3（108.6g，0.5 mol)溶于0.5L乙醇中，加入0.5L 的3.0 M NaOH的水溶液，反应回流3h，然后除去乙醇，再用浓盐酸（12mol/L）调至pH值为7，回流2h，之后再用浓盐酸（12mol/L）将溶液的pH值调至3，析出的白色固体经过过滤收集，并在乙醚中重结晶得化合物4（71.0g，83%）。
步骤三、将化合物4（17.1 g, 100.0 mmol）溶于pH 8.0、浓度为0.1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的水溶液中，将温度调至40 ℃，加入酰化氨基酸水解酶（L-aminoacylase，0.86 g, 3 units/g substrate），反应5h。加入26g硅藻土，过滤。向滤液中加入等体积的THF，并将温度冷却至5 ℃。随后加入二碳酸二叔丁酯（Boc2O，13.1g，60.0 mol），用碳酸氢钠将pH控制为8。反应温度控制在10℃下搅拌反应4h，然后除去THF。接着用浓盐酸（12mol/L）将水相酸化至pH为3，用乙酸乙酯萃取3次，每次300mL。将乙酸乙酯层的有机相合并，并用10%的氯化钠溶液洗涤，浓缩并加入乙醚，去除析出的化合物4’得到化合物5的乙醚溶液，去除乙醚得到亮黄色的油状产物化合物5（10.8g, 47%, >99% ee）。
步骤四、将化合物5（10.8 g， 4.7 mmol）和碘甲烷（1.8 mL， 28.5 mmol)溶于干燥的THF-DMF（2:1, 15mL)中，加入氢化钠（60 wt %，564mg，14.1 mmol)。反应过夜，再将冷至0℃，加入柠檬酸（12mL)，并用乙酸乙酯萃取三次，每次100mL。合并有机相，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩除去四氢呋喃和乙酸乙酯。再加入水合肼（90%，2.6mL，溶于10 mL DMF)。再将反应在室温下搅拌6小时。用100mL水稀释和甲基叔丁基醚萃取（2´ 100 mL)。合并有机相，经硅胶过滤，干燥，得到化合物6（8.9 g，74%)。
步骤五、在冰浴中，将化合物6 (0.57 g, 2.2 mmol)溶解在四氢呋喃(5 mL)中，温度降到-10℃。加入氯化氢的乙醚溶液(14.0M，0.8 mL)和亚硝酸叔丁酯(0.38 mL, 3.0mmol)。将反应液在零下10℃中搅拌60分钟，直至溶液变澄清。然后，经旋蒸除去溶剂，剩余物用氯仿萃取，接着用冰水和5%的碳酸氢钠溶液，冰水洗涤，最后干燥得到化合物7。
步骤六、将环孢霉素A（CsA, 24.0 g，20.0 mmol)溶于80 mL乙酸酐中，加入80mL吡啶和4-二甲氨基吡啶(DMPA, 4-N,N-dimethylaminopyride, 0.8 g, 6.5 mmol)。将反应置于室温并搅拌过夜，接着用1L乙酸乙酯稀释。再用食盐水，饱和的氯化铵溶液和质量分数为15%的碳酸氢钠溶液依次洗涤。有机相用硫酸钠干燥，过滤，在真空下浓缩。在2-甲基四氢呋喃（100 mL)和甲基叔丁基醚（50mL）的混合溶液中重结晶得到的白色固体为化合物8（乙酰基-环孢霉素A，23.2 g，93%）。
步骤七、将化合物8 (37.4 g, 30 mmol)溶于二氯甲烷(300 mL)，加入三甲基氧四氟硼酸盐(13.3 g, 90 mmol)。反应20小时后加入乙腈和水，再反应3小时，分层，有机相用水洗涤3次，每次用100mL。接着，将反应液经真空浓缩、干燥。然后在2-甲基四氢呋喃（100mL)和甲基叔丁基醚（50mL）的混合溶液中结晶得到的白色晶状粉末为化合物9(29.9 g,73%)。
步骤八、将化合物9(13.7 g, 10.0 mmol)溶于二氯甲烷(100 mL)中，加入N,N-二异丙基乙胺(6.6 mL, 40 mmol)和硫代异氰酸苯酯(4.1 g, 30 mmol)，反应搅拌100分钟，加入N,N-二甲基乙二胺(2.3 mL, 25 mmol)，接着搅拌60分钟，然后加入甲醇(60 mL)和50%的氟硼酸水溶液(2.3 g, 13 mmol)。反应搅拌1小时。然后，加入水(50 mL)，分层，无机层用二氯甲烷萃取2次。合并有机相，浓缩后，在2-甲基四氢呋喃（50 mL)和甲基叔丁基醚（25mL）的混合溶液中重结晶，得到的白色泡沫状物质为化合物10 (11.2 g, 91%)。
步骤九、将化合物10(2.47 g, 2.0 mmol)溶解在氯仿(10 mL)中。随后在零下10℃加入化合物7和N,N-二异丙基乙胺，再将温度恢复到室温，搅拌3小时。经旋蒸除去溶剂，剩余物溶解在乙酸乙酯中，用稀盐酸（1mol/L）和水洗涤有机相，干燥并浓缩后得到化合物11(2.6 g , 95%)。
步骤十、将化合物11(2.6 g, 1.9 mmol)溶解在体积比为2：1的四氢呋喃和水的混合溶液中，在0℃中，加入氢氧化锂(385 mg, 9.5 mmol)，反应搅拌2小时。然后用二氯甲烷稀释，分别用1.0 N的盐酸、水和食盐水洗涤。有机相浓缩后在0℃下加入20 mL二氯甲烷和5mL的三氟乙酸。反应搅拌4小时，用二氯甲烷稀释后，用碳酸氢钠饱和以及饱和食盐水洗涤有机相。有机相干燥后浓缩后在0℃下加入N,N-二异丙基乙胺(4.8 mL, 9.5 mmol)和BopCl(967mg, 3.8 mmol)。将温度调至室温，反应搅拌5小时，用二氯甲烷稀释，依次用水、1.0 N的氯化氢溶液、水和饱和食盐水洗涤。有机相干燥浓缩后在2-甲基四氢呋喃（6.67mL)和甲基叔丁基醚（3.33mL）的混合溶液结晶，得到的白色泡沫状物质为化合物12 (1.18 g,62%)。
步骤十一、将化合物12(248 mg, 0.2mmol)溶解在二氯甲烷(2 mL)中，加入甲基磺酸(MSA, 13 uL, 0.2 mmol)和醋酸(114 uL, 2.0 mmol)。反应在40℃搅拌8小时，用二氯甲烷稀释，依次用水、碳酸氢钠溶液、水以及饱和食盐水洗涤有机相。有机相经干燥、浓缩后得到化合物13 (244 mg, 95%)。
步骤十二、将化合物13 (128 mg, 0.1 mmol)溶于甲醇(5 mL)中，加入甲醇钠的甲醇溶液(0.5 M, 0.5 mL)。搅拌15小时后用0.5 N的盐酸将pH调至6左右，反应液浓缩后，浓缩物溶解在50 mL的乙酸乙酯中，用碳酸氢钠和食盐水洗涤。有机相浓缩后经色谱柱分离纯化，得到目的产物（97mg，80%）。
对得到的化合物1与标准4-羟基环孢素比对测试，结果如图1所示。
由图1可以看出，实施例1制得的化合物1即为4-羟基环孢素（γ-hydroxylmethylleucine4)- cyclosporin A）。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.一种4-羟基环孢素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、-20℃～35℃下将化合物2和第一反应物溶于第一有机溶剂中，接着在-15℃～30℃下加入3-氯-2-甲基丙烯，接着加热至58℃～82℃并充分反应，接着加入水并用酸性调节剂调节pH为7，充分反应后纯化得到化合物3，其中，所述第一反应物选自NaH、KH、K2CO和Cs2CO3中的至少一种，所述酸性调节剂为盐酸、柠檬酸、硫酸或氟硼酸，所述化合物2以及所述化合物3的结构式如下，
化合物2：
Figure FDA0002313867000000011
化合物3：
Figure FDA0002313867000000012
步骤二、将所述化合物3溶解于乙醇中，接着加入NaOH溶液或KOH溶液并在回流条件下充分反应，接着除去乙醇并用所述酸性调节剂调节pH至7，回流条件下充分反应，之后再用浓盐酸调节pH至3，纯化后得到化合物4，其中，所述化合物4的结构式如下，
化合物4：
Figure FDA0002313867000000013
步骤三、将所述化合物4溶解于pH为8的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的水溶液中，接着加热至30℃～55℃并加入酰化氨基酸水解酶，充分反应后加入吸附剂并过滤，保留滤液并加入等体积的THF、二氧六环或乙腈，接着降温至-5℃～10℃并加入二碳酸二叔丁酯，用碳酸氢钠调节pH为7.5～8.5后控制反应温度为-5℃～30℃并充分反应，然后除去THF、二氧六环或乙腈，并用浓盐酸调节pH为3，接着纯化得到化合物5，其中，所述化合物5的结构式如下，
化合物5：
Figure FDA0002313867000000014
步骤四、将所述化合物5、碘甲烷和NaH在干燥的第二有机溶剂中混合并充分反应，接着冷却至-10℃～5℃后纯化，接着加入水合肼并在室温下充分反应，再次纯化得到化合物6，其中，所述化合物6的结构式如下，
化合物6：
Figure FDA0002313867000000021
步骤五、-8℃～4℃下将所述化合物6溶解于第三有机溶剂中并降温至-15℃～-8℃，接着加入第二反应物或第三反应物，控制反应温度为-15℃～-8℃并充分反应，纯化后得到化合物7，其中，所述第二反应物为氯化氢的乙醚溶液和亚硝酸叔丁酯，所述第三反应物为乙酸和亚硝酸钠，所述化合物7的结构式如下，
化合物7：
Figure FDA0002313867000000022
步骤六、将环孢霉素A、吡啶和4-二甲氨基吡啶溶于乙酸酐中，室温下充分反应，接着纯化得到化合物8，其中，环孢霉素A和所述化合物8的结构式如下，
环孢霉素A：
Figure FDA0002313867000000023
化合物8：
Figure FDA0002313867000000031
步骤七、将所述化合物8和三甲基氧四氟硼酸盐溶于第四有机溶剂中并充分反应，接着加入乙腈和水并充分反应，纯化得到化合物9，其中，三甲基氧四氟硼酸盐和所述化合物9的结构式如下，
三甲基氧四氟硼酸盐：
Figure FDA0002313867000000032
化合物9：
Figure FDA0002313867000000033
步骤八、将所述化合物9、N,N-二异丙基乙胺和硫代异氰酸苯酯溶于第五有机溶剂中并充分反应，接着加入N,N-二甲基乙二胺并充分反应，接着加入甲醇和质量分数为40％～60％的氟硼酸水溶液并充分反应，之后纯化得到化合物10，其中，所述化合物10的结构式如下：
化合物10：
Figure FDA0002313867000000041
步骤九、在温度为-8℃～-12℃的条件下将所述化合物10、所述化合物7和N,N-二异丙基乙胺溶于第六有机溶剂中，接着升温至室温并充分反应，接着纯化得到化合物11，其中，所述化合物11的结构式如下，
化合物11：
Figure FDA0002313867000000042
步骤十、在温度为-20℃～8℃的条件下将所述化合物11和第四反应物溶解在四氢呋喃和水的混合溶液中，充分反应后纯化并在温度为-20℃～8℃的条件下加入二氯甲烷和三氟乙酸，充分反应后再次纯化，并在温度为-20℃～8℃的条件下加入N,N-二异丙基乙胺和BopCl，升温至室温并充分反应，纯化后得到化合物12，其中，所述第四反应物为LiOH、NaOH或KOH，BopCl和所述化合物12的结构式如下，
BopCl：
Figure FDA0002313867000000043
化合物12：
Figure FDA0002313867000000051
步骤十一、将所述化合物12、甲基磺酸和醋酸溶于第七有机溶剂中，控制温度为30℃～50℃并充分反应，纯化后得到化合物13，其中，所述化合物13的结构式如下，
化合物13：
Figure FDA0002313867000000052
以及
步骤十二、将所述化合物13和甲醇钠溶于第八有机溶剂中并充分反应，纯化后得到化合物1，所述化合物1即为4-羟基环孢素，其中，所述化合物1的结构式如下，
化合物1：
Figure FDA0002313867000000061
其中，步骤一中，所述第一有机溶剂为二甲基甲酰胺、氮甲基吡烙烷酮或THF；步骤四中，所述第二有机溶剂为四氢呋喃、二甲基甲酰胺或体积比为2：1的四氢呋喃和二甲基甲酰胺的混合溶液；步骤五中，所述第三有机溶剂为四氢呋喃、二氧六环或DMF；步骤七中，所述第四有机溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷或氯仿；步骤八中，所述第五有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃或甲苯；步骤九中，所述第六有机溶剂为氯仿、甲苯或二氯甲烷；步骤十一中，所述第七有机溶剂为二氯甲烷、甲苯或二氯乙烷；步骤十二中，所述第八有机溶剂为甲醇。
2.根据权利要求1所述的4-羟基环孢素的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述纯化得到化合物5的操作为：萃取后保留有机相并洗涤，接着浓缩所述有机相并加入乙醚、甲基叔丁基醚或异丙醚，去除析出的化合物4’得到所述化合物5的乙醚溶液，其中，所述化合物4’的结构式如下，
化合物4’：
Figure FDA0002313867000000062
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