CN105585550A - 系列甲基化儿茶素单体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法。包括如下步骤：以一种中国产乌龙茶为原料，经热水提取，干燥得到粗提取物。粗提取物经过大孔树脂A处理之后，得到甲基化儿茶素含量＞20％的组分1。组分1经过Toyopearl？HW-40S树脂处理之后，分别得到纯度大于95％的EGCG3”Me和ECG3”Me；纯化后的EGCG3”Me和ECG3”Me经过高温高压处理后，分别部分异构化为对应的差向异构体GCG3”Me和CG3”Me。处理后的样品溶液，经过半制备高效液相色谱仪进行分离纯化，分别得到EGCG3”Me、ECG3”Me、GCG3”Me和CG3”Me的单体物质。作为一种成本低、效率高、环境友好的制备工艺，本发明易于工业化生产，具有广阔的应用前景。

Description

系列甲基化儿茶素单体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种利用吸附柱层析法以及半制备高效液相色谱仪，纯化茶叶中的甲基化儿茶素成分，制备系列甲基化儿茶素单体的方法。

背景技术

很久以来，茶叶一直受到人们的喜爱。除了脍炙人口的的色、香、味之外，目前流行病学与预防医学研究表明喝茶可以降低患肿瘤和心脑血管等疾病的风险。茶还具有抗氧化、抗炎症、抗过敏和抗肥胖的生理功效。研究发现茶的风味与保健功能正是茶叶所特有的茶多酚等具有生物活性的成分所赋予的。

茶多酚是儿茶素(黄烷醇类)、花色素类(花青素和花白素)、花黄素类(黄酮与黄酮类)等集于茶叶中的一群多酚复合物的总称。其中儿茶素占60-80％，分为酯型儿茶素和游离型儿茶素，酯型儿茶素占儿茶素的70％左右。酚类物质早就被报道具有多种生理活性，尤其是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。近几年研究发现一些特定的乌龙茶中含有另一种儿茶素，即儿茶素的甲基化衍生物，以(-)-表没食子儿茶素3-O(3-O-甲基)没食子酸酯(EGCG3”Me)和(-)-表没食子儿茶素3-O(4-O-甲基)没食子酸酯(EGCG4”Me)为主。目前关于甲基化儿茶素生理功能的研究主要集中在对甲基化EGCG的抗过敏作用的研究方面，尤其是对最常见的花粉过敏症具有显著的预防和抑制作用。在日本，部分富含甲基化EGCG的产品已经进入商业发展阶段，在食品行业，饼干、口香糖、茶饮料等添加甲基化EGCG给食品行业注入了新的卖点，得到了更多消费者的青睐。因此，甲基化儿茶素的研究至关重要，在学术、生物学方面都具有非常重要的意义。

目前，研究报道的甲基化儿茶素的体外合成主要有化学法和生物酶法。但是，化学合成法中需要使用大量有机溶剂和各种基团保护剂，合成反应条件较为苛刻，专一性差，副产物多，因此，化学合成不宜作为甲基化儿茶素的体外合成方法。体外酶法合成虽然专一性强、反应条件温和、安全性高，但目前甲基化儿茶素的体外转化研究均没有对合成反应物进行分离纯化与结构解析，没有实现酶法合成产物的大量制备。

从茶叶中直接提取甲基化儿茶素，由于其来源于天然产物，有着较好的安全性。从食品工业角度看，必须考虑原料充足、方便、易得、无毒性、生产成本低等问题，因此，合理的方法是从茶叶中直接提取甲基化儿茶素。一些中国产乌龙茶中甲基化儿茶素含量较高，结合吸附柱层析法以及半制备高效液相色谱仪，可以制备系列甲基化儿茶素单体。

发明内容

本发明的要解决的技术问题是以中国产乌龙茶作为原料，制备系列甲基化儿茶素单体的方法，能够保证提取的产品纯度高、成本低、效率高、环境友好，且易于实现工业化生产。为解决上述问题，本发明提供了一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，包括如下工艺步骤：

1)茶叶经热水提取，干燥得到粗提取物；

2)采用特定的大孔树脂A处理粗提取物，先用水充分洗脱，去除色素和咖啡碱；

3)接着用80％浓度的乙醇溶液洗脱大孔树脂A，收集洗脱液，经浓缩和干燥，得到甲基化儿茶素含量＞20％的组分1；

4)采用ToyopearlHW-40S树脂处理组分1，用80％浓度的乙醇溶液洗脱，收集不同时间的洗脱液，经浓缩和干燥，分别得到纯度大于95％的EGCG3″Me和ECG3’Me；

5)纯化后的EGCG3”Me和ECG3”Me经过高温高压处理后，分别部分异构化为对应的差向异构体GCG3”Me和CG3”Me；

6)处理后的样品溶液，经过半制备高效液相色谱仪进行分离纯化，经浓缩和干燥，分别得到EGCG3”Me、ECG3”Me、GCG3”Me和CG3”Me的单体物质。

本发明所述工艺提取的甲基化儿茶素单体产品纯度均达到99％以上，大孔吸附树脂的再生性能好，可以再生重复使用，洗脱剂乙醇无毒无害，也可以回收多次利用。本工艺成本低、效率高、环境友好，易于实现工业化生产。

附图说明

图1为EGCG3”Me的核磁共振氢谱图

图2为ECG3”Me的核磁共振氢谱图

图3为EGCG3”Me、ECG3”Me、GCG3”Me和CG3”Me的HPLC图谱

具体实施方式

1)粗提取物：茶叶经磨碎后，用热水浴浸提40min，液料比20∶1，水浴温度为95℃，浸提之后在40-50℃下进行减压浓缩；

2)大孔树脂A处理：选取大孔树脂A，用pH2.0-3.0的缓冲液平衡，上样液也调整成与缓冲液同样的pH，儿茶素浓度为5mg/mL，上样流速为每小时1-2个柱床体积；

3)乙醇溶液洗脱：先用水冲大孔树脂，至流出液无色为止，再换上80％浓度的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为每小时1-2个柱床体积，收集洗脱液，在40-50℃下减压浓缩，得到甲基化儿茶素含量＞20％的组分1；

4)ToyopearlHW-40S树脂处理：选取的ToyopearlHW-40S树脂上样组分1之后，用80％的乙醇溶液洗脱树脂，流速为每小时1-2个柱床体积，收集不同时间的洗脱液，在40-50℃下减压浓缩，分别得到纯度大于95％的EGCG3”Me和ECG3”Me。

5)高温高压处理：得到的纯度大于95％的EGCG3”Me和ECG3”Me，溶解于适量去离子水，在高温(123℃)以及高压(0.09-0.11Mpa)条件下加热7分钟，使其部分异构化为对应的差向异构体GCG3”Me和CG3”Me。

6)半制备高效液相色谱仪进行分离纯化：得到的EGCG3”Me、ECG3”Me以及对应的差向异构体GCG3”Me和CG3”Me，浓缩后上样至AKTA半制备高效液相色谱仪，用40％的甲醇溶液洗脱色谱柱，流速为2mL/min。收集不同时间的洗脱液，分别得到EGCG3”Me、ECG3”Me、GCG3”Me和CG3”Me的单体物质。

Claims (7)

1.一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，包括如下步骤：

1)茶叶经热水提取，干燥得到粗提取物；

2)采用特定的大孔树脂A处理粗提取物，先用水充分洗脱，去除色素和咖啡碱；

3)接着用80％浓度的乙醇溶液洗脱大孔树脂A，收集洗脱液，经浓缩和干燥，得到甲基化儿茶素含量＞20％的组分1；

4)采用ToyopearlHW-40S树脂处理组分1，用80％浓度的乙醇溶液洗脱，收集不同时间的洗脱液，经浓缩和干燥，分别得到纯度大于95％的EGCG3”Me和ECG3”Me；

5)纯化后的EGCG3”Me和ECG3”Me经过高温高压处理后，分别部分异构化为对应的差向异构体GCG3”Me和CG3”Me；

6)处理后的样品溶液，经过半制备高效液相色谱仪进行分离纯化，经浓缩和干燥，分别得到EGCG3”Me、ECG3”Me、GCG3”Me和CG3”Me的单体物质。

2.根据权利要求1所述的一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，其特征在于步骤1)中茶叶经磨碎后，用热水浴浸提40min，液料比20∶1，水浴温度为95℃，浸提之后在40-50℃下进行减压浓缩。

3.根据权利要求1所述的一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，其特征在于步骤2)中选取对儿茶素存在选择性吸附的大孔树脂A，用pH2.0-3.0的缓冲液平衡，上样液也调整成与缓冲液同样的pH，儿茶素浓度为5mg/mL，上样流速为每小时1-2个柱床体积。

4.根据权利要求1所述的从一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，其特征在于步骤3)先用水冲大孔树脂，至流出液无色为止，再换上80％浓度的乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为每小时1-2个柱床体积，收集洗脱液，在40-50℃下减压浓缩，得到甲基化儿茶素含量＞20％的组分1。

5.根据权利要求1所述的一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，其特征在于步骤4)中选取的ToyopearlHW-40S树脂上样组分1之后，用80％的乙醇溶液洗脱树脂，流速为每小时1-2个柱床体积，收集不同时间的洗脱液，在40-50℃下减压浓缩，分别得到纯度大于95％的EGCG3”Me和ECG3”Me。

6.根据权利要求1所述的一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，其特征在于步骤5)中得到的纯度大于95％的EGCG3”Me和ECG3”Me，溶解于适量去离子水，在高温(123℃)以及高压(0.09-0.11Mpa)条件下加热7分钟，使其部分异构化为对应的差向异构体GCG3”Me和CG3”Me。

7.根据权利要求1所述的一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，其特征在于步骤6)中得到的EGCG3”Me、ECG3”Me以及对应的差向异构体GCG3”Me和CG3”Me，浓缩后上样至半制备高效液相色谱仪，用40％的甲醇溶液洗脱色谱柱，流速为2mL/min，收集不同时间的洗脱液，在40-50℃下减压浓缩，分别得到EGCG3”Me、ECG3”Me、GCG3”Me和CG3”Me的单体物质。