CN105581912A

CN105581912A - 具有抗皱作用的缓释脂质体护肤液及其制备方法

Info

Publication number: CN105581912A
Application number: CN201610155875.8A
Authority: CN
Inventors: 江俊达
Original assignee: Wound Front Yard Cosmetics Science And Technology (shanghai) Co Ltd
Current assignee: Wound Front Yard Cosmetics Science And Technology (shanghai) Co Ltd
Priority date: 2016-03-21
Filing date: 2016-03-21
Publication date: 2016-05-18

Abstract

本发明涉及化妆品及其制备技术领域，特别涉及一种具有抗皱作用的缓释脂质体护肤液及其制备方法。该护肤液由pH调节剂和褪黑素100~140重量份、维生素C？300~460重量份、大豆卵磷脂1500~2400重量份、胆固醇300~600重量份、吐温-80？5~15重量份、无水乙醇100~200重量份、Dowicil？200？5~10重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段5~15重量份、去离子水3000~8000重量份采用超声法制成。本发明的缓释脂质体护肤液具有粒径小，均一度高，包封率高和缓释时间长的优点。

Description

具有抗皱作用的缓释脂质体护肤液及其制备方法

技术领域

本发明属于化妆品及其制备技术领域，具体涉及一种具有抗皱作用的缓释脂质体护肤液及其制备方法。

背景技术

皮肤老化是由自然因素或非自然因素造成的皮肤衰老现象。皱纹是皮肤老化的标志之一。通常长期光照、精神应激、药物刺激、氧化损伤、皮肤水分流失等均可导致皱纹产生或增多。

褪黑素和维生素C是目前常用的抗皱活性物质。中国专利文献CN1131021C（申请号00125700.5，申请日2000年10月17日），公开了一种抗皱化妆品，其活性成分之一即为褪黑素。

目前国内外常用的抗皱化妆品多为普通乳膏或乳液，由于皮肤屏障作用的存在尤其是角质层的阻碍，大部分外用化妆品的活性成分尤其是非脂溶性活性成分，难以透过皮肤屏障，导致其吸收效果较差，且极易因水洗等导致成分流失，实际到达皮肤的活性成分较少，造成活性成分的浪费，需要较大的用量才能达到预期效果。

脂质体制剂最初用于药物制剂领域，作为注射给药使用，其主要作用是利用脂质体的粒径不同，实现药物的靶向给药，使药物到达目标病灶，提高药物的疗效，降低不良反应。由于脂质体的外层是由具备双分子层的成膜物质组成，与哺乳动物皮肤屏障结构相似。近年来国内外对脂质体的外用制剂尤其是脂质体护肤品进行了广泛研究。用于护肤品的脂质体主要包括小单室脂质体（粒径20~200nm，在液体状态下稳定性高）、大单室脂质体（粒径200~1000nm，稳定性低）、多室脂质体（1~5μm，可包封亲水和亲脂性成分、多囊脂质体（粒径5~50μm，包封体积大，药物渗漏少），详见王海平、王咏梅、杜喜平论文，题目为护肤化妆品配方中的月旨质体种类选择（《中国化妆品:行业》2010(14):75-78）。目前常用的脂质体材料为卵磷脂、神经酰胺等。其中卵磷脂脂质体稳定性差，神经酰胺是一种制备脂质体的新材料，性质稳定，且有独特的护肤作用，但价格昂贵，实际应用较少（许琛琦，秦德安.SOD-GC脂质体的制备及包封率的测定.日用化学工业.2001，31(1):57-58.）。

目前已发现的脂质体护肤品的优点包括：

1.提高活性成分的稳定性，脂质体包裹活性成分后，可将活性成分与外界不利因素如pH隔离，提高活性成分的稳定性，如维生素A。例如维生素A结构中含有较多的不饱和双键，对光与热稳定性较差，接触空气后易被氧化，维生素A神经酰胺脂质体比较稳定。超氧化物歧化酶、维生素C和维生素E很不稳定，用脂质体包封后，其稳定性大大增强。

2.提高活性成分进入皮肤屏障的效率：由于脂质体与生物膜结构相似，功能性成分在脂质体的携带下经皮透过量增加，脂质体对皮肤的穿透性与传统乳膏剂相比，增加了30%；维A酸脂质体经皮肤局部给药后生物利用度高于其凝胶剂。

3.实现活性成分的缓释：脂质体在体内可缓慢释放功能性成分，以实现缓释目的。如中国专利文献CN1207034A（申请号97191626.8，申请日1997年1月17日）公开了一种含防晒自黑剂的磷脂脂质体，缓释防晒效果可达14天。

但脂质体作为一种活性成分载体，其制剂制备也存在诸多技术难点。迄今为止，脂质体制剂的研发仍然是药物制剂和化妆品制剂领域的难题，存在诸多技术难题亟待克服：

1.影响脂质体包封率的因素较多，提高活性成分包封率的技术手段有限：

活性成分的油水分配系数是影响脂质体包封率的因素之一，通常只有LogP低于0.3或高于4.5的活性成分能够较好的包封，介于二者之间的成分需要化学修饰，改变油水分配系数方可提高包封率；分子量大的活性物质更容易获得较高的包封率，小分子活性成分包封后易于渗漏，效果不理想，而分子量过大的药物包封后难易通过脂质体膜释放；脂质体类型也是影响包封率的因素之一，一般大单室脂质体、多室脂质体包封率高，小单室脂质体包封率低，而粒径大的脂质体虽然能获得较高的包封率，其透过皮肤屏障的能力以及耐洗能力也会相应降低。在包封率问题的解决上，目前仅能根据有限的参数、理论依据或经验进行调节，如制备温度等。

包封率是脂质体研究的主要内容，也是脂质体制备的关键因素。影响脂质体包封率的因素较多，又因活性物质理化性质的不同而不同。大部分活性成分的脂质体制备仍然难以实现（于波涛，张志荣，刘文胜.提高脂质体包封率的方法及其研究进展.中国医药工业杂志.2002，33（11）：564-568.）。

2.脂质体透皮吸收缓释效果不理想：

脂质体借助其双分子层特性可以接到活性成分透过皮肤屏障，但对小分子物质的缓释效果并不理想，目前已知的提高小分子物质脂质体制剂缓释效果的方法是在包封之前对活性物质溶液的pH值进行调节。Sankavam和Kim于1993年11月16日提交美国专利申请文件（申请号US08/153657）公开的规律如下：无机酸如盐酸、硝酸、高氯酸调节活性物质溶液的pH值，包封后脂质体缓释效果最优；醋酸、三氟乙酸和三氯乙酸较快；而二元酸如磷酸、硫酸释放速度最快。但采用酸对活性物质溶液的pH值进行调节，对于遇酸不稳定的物质并不适用，且对工艺过程中的金属器具腐蚀作用较强，因此设备损耗严重。

EP0126580B1（申请人VESTARRESEARCHINC，公开日1984年11月28）公开一种将脂质体通过人为设置脂质体内外溶液的渗透压差以维持脂质体内活性物质缓释效果的方法，但该方法实际应用价值并不大。因为用药部位的渗透压属于恒定值，因此脂质体内外液体的渗透压难以维持动态压差，当二者等渗时，活性物质将无法从脂质体释放，因此极易造成活性物质释放不完全，甚至释放过少。中国专利文献CN1096850C（申请号95196186.1，申请日1995年9月13日）对此进行改进，公开了一种通过渗透压和多泡脂质体改善活性成分缓释性能的技术。但其制备需要采用液态CO₂或液态NH₃等，制备条件苛刻。

目前已公开的抗皱脂质体护肤品种，已有褪黑素脂质体和维生素脂质体的制备技术公开，如申请号为93106692.1的中国专利申请文献（公开日1994年12月14日）公开一种含维生素E、C的卵磷脂脂质体，仅解决了活性成分的稳定性问题，未能解决活性成分的缓释和渗漏问题。赵少杰等（赵少杰，叶盛英，欧春凤，郑森鸿.超临界CO₂法制备褪黑素脂质体的工艺优化.农业工程学报.2014，30（3）：251-258.）公开一种褪黑素脂质体的制备方法，其方法为超临界CO₂法，大多数脂质体粒径可以达到100nm以下，但制备工艺复杂，设备昂贵，虽提高了包封率，降低了脂质体平均粒径，但仍未解决体内缓释问题。

细胞膜穿透肽也称为穿膜肽，是一类具有生物膜穿透能力的短肽，目前已发现的穿膜肽包括HIV-1TAT蛋白部分多肽片段、penetratin、VP-22等（吴强，徐翔，梁华平，张明.穿膜肽的结构特点和穿膜机制.生命的科学.2005，2(4)：304.）。

由于穿膜肽具有良好的穿膜性，目前已被用于对药物分子及药物辅料的共价修饰，以实现药物分子或药物制剂的靶向给药或透皮给药。典型的，在脂质体制剂领域，穿膜肽已被用于共价修饰脂质体膜材，通过化学共价键与膜材如胆固醇结合，以提高脂质体的穿膜能力。如蔺伟等（蔺伟，李庭，杜金瑞.RGD与细胞穿膜肽共修饰miRNA脂质体的构建及抗肿瘤研究.中华肿瘤防治杂志.2015，22（3）:179-188.）采用RGD和TAT两种穿膜肽共同对脂质体进行共价修饰，制备了miRNA脂质体，提高了其肿瘤靶向性。张莉等（张莉，唐洁，尹愈佳，覃瑶，刘亚圆，何勤.基于胆固醇上不同连接方式修饰的穿膜肽脂质体的对比研究.2012，27(5):490～493.）分别研究了TAT通过聚乙二醇以醚键和酯键两种方式与胆固醇相连后，对脂质体的影响，结果表明，醚键修饰的胆固醇衍生物材料所制备的连接TAT的脂质体相较于酯键连接者，有较好的体内外摄取效果。但上述穿膜肽仅通过共价连接于脂质体材料方可实现靶向性和细胞膜穿透性。而穿膜肽本身不存在直接与脂质体成共价键的基团，需要聚乙二醇(PEG)或DPSE-PEG等作为中间连接臂，才能实现与脂质体材料的共价结合。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的之一是提供一种具有抗皱作用的缓释脂质体护肤液。

为实现上述的目的，本发明采用的技术方案为：

一种具有抗皱作用的缓释脂质体护肤液，由pH调节剂和下列重量比的成分制成：褪黑素100~140重量份、维生素C300~460重量份、大豆卵磷脂1500~2400重量份、胆固醇300~600重量份、吐温-805~15重量份、无水乙醇100~200重量份、Dowicil2005~10重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段5~15重量份、去离子水3000~8000重量份；所述脂质体护肤液中脂质体的平均粒径为20~150nm；所述具有抗皱作用的缓释脂质体护肤液通过如下步骤制得：取处方量褪黑素、吐温-80和处方量4/25~8/25的去离子水，制成配液A；取处方量维生素C和处方量4/25~8/25的去离子水，制成配液B；取处方量大豆卵磷脂、胆固醇、无水乙醇、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段和处方量6/25~9/25的去离子水，制成配液C；将配液A和配液C混合，4000~8000rpm搅拌20min，制成配液D；将配液C和配液D混合，50℃~60℃超声，超声功率为200W，超声20min，制成配液E；将处方量Dowicil200和余量去离子水加入配液E，搅拌混合，加入pH调节剂调pH为6~7即得。

作为本发明的一个优选方案，所述缓释脂质体护肤液由pH调节剂和下列重量比的成分制成：褪黑素120重量份、维生素C380重量份、大豆卵磷脂1800重量份、胆固醇400重量份、吐温-808重量份、无水乙醇140重量份、Dowicil2008重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段14重量份、去离子水5000重量份；

所述脂质体护肤液中脂质体的平均粒径为80~100nm。

作为本发明的另一优选方案，所述缓释脂质体护肤液由pH调节剂和下列重量比的成分制成：褪黑素135重量份、维生素C450重量份、大豆卵磷脂1700重量份、胆固醇500重量份、吐温-8012重量份、无水乙醇170重量份、Dowicil2009重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段12重量份、去离子水6000重量份；

所述脂质体护肤液中脂质体的平均粒径为120~140nm。作为本发明的又一优选方案，所述缓释脂质体护肤液由pH调节剂和下列重量比的成分制成：褪黑素115重量份、维生素C320重量份、大豆卵磷脂2000重量份、胆固醇320重量份、吐温-8014重量份、无水乙醇190重量份、Dowicil2006重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段9重量份、去离子水7500重量份；

所述脂质体护肤液中脂质体的平均粒径为100~120nm。上述缓释脂质体护肤液中的pH调节剂为碳酸氢钠、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种，优选的pH调节剂为碳酸氢钠。

本发明的另一方面还提供了上述缓释脂质体护肤液的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，取处方量褪黑素、吐温-80和处方量4/25~8/25的去离子水，制成配液A；

步骤二，取处方量维生素C和处方量4/25~8/25的去离子水，制成配液B；

步骤三，取处方量大豆卵磷脂、胆固醇、无水乙醇、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段和处方量6/25~9/25的去离子水，制成配液C；

步骤四，将配液A和配液C混合，6000rpm搅拌20min，制成配液D；

步骤五，将配液C和配液D混合，30℃~50℃超声，超声功率为200W，超声20min，制成配液E；

步骤六，将处方量Dowicil200和余量去离子水加入配液E，搅拌混合，加入pH调节剂调pH为6~7即得。

优选地，所述步骤一中去离子水用量为处方量的6/25；

所述步骤二中去离子水用量为处方量的6/25；

所述步骤三中去离子水用量为处方量的8/25;

所述步骤四中搅拌速度为6000rpm；

所述步骤五超声温度为56℃。

优选地，所述步骤一中去离子水用量为处方量的6/25；

所述步骤二中去离子水用量为处方量的7/25；

所述步骤三中去离子水用量为处方量的8/25;

所述步骤四中搅拌速度为7000rpm；

所述步骤五超声温度为58℃。

优选地，所述步骤一中去离子水用量为处方量的5/25；

所述步骤二中去离子水用量为处方量的7/25；

所述步骤三中去离子水用量为处方量的9/25;

所述步骤四中搅拌速度为7500rpm；

所述步骤五超声温度为54℃。

本发明的技术方案中所述的褪黑素又称为褪黑激素、美拉酮宁、抑黑素、松果腺素，英文名为melatonin，CAS号为73-31-4，市售可得，这是本领域技术人员所公知的。

本发明的技术方案中所述的Dowicil200为常用防腐剂之一，CAS号为51229-78-8，市售可得，这是本领域技术人员所公知的。

本发明的技术方案中所述的HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段取自HIV-1-TAT蛋白第47-57氨基酸构成的多肽片段，氨基酸序列为YGRKKRRQRRR，CAS号为191936-91-1，常用作药物穿透皮肤或细胞膜的引导片段，市售可得，这是本领域技术人员所公知的。

本发明的发明人经过大量研究发现，褪黑素和维生素C的外用脂质体，由于药物分子量小等原因，难以实现理想的缓释效果，药物释放较快，且脂质体包封率不理想。在实验研究中，发明人惊奇的发现，HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段能够提高褪黑素和维生素C大豆卵磷脂脂质体的包封率，提高脂质体载药量，显著降低脂质体粒径，并在体内外延缓褪黑素和维生素C从脂质体向外部介质的释放速度，从而实现理想的缓释效果，缓释效果可维持4周甚至更长。从而减少含褪黑素和维生素C的抗皱护肤品的使用频率，方便使用。且本发明的HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段通过与脂质体材料的物理混合而非共价修饰即可实现上述提高缓释和提高脂质体包封率、显著降低脂质体粒径的技术效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的解释。应当理解的是，以下实施例仅用于解释本发明，而不是限制本发明的保护范围。

实施例1抗皱缓释脂质体护肤液的制备

褪黑素120重量份

维生素C380重量份

大豆卵磷脂1800重量份

胆固醇400重量份

吐温-808重量份

无水乙醇140重量份

Dowicil2008重量份

HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段14重量份

去离子水5000重量份

碳酸氢钠适量（用于调节终产品pH）

制备工艺如下：

1)取处方量褪黑素、吐温-80和处方量6/25的去离子水，制成配液A；

2)取处方量维生素C和处方量6/25的去离子水，制成配液B；

3)取处方量大豆卵磷脂、胆固醇、无水乙醇、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段和处方量8/25的去离子水，制成配液C；

4)将配液A和配液C混合，6000rpm搅拌20min，制成配液D；

5)将配液C和配液D混合，56℃超声，超声功率为200W，超声20min，制成配液E；

6)将处方量Dowicil200和余量去离子水加入配液E，搅拌混合，加入pH调节剂调pH为6~7即得。

Ｈ-1600Ⅳ型透射电子显微镜购（日本Ｈitachi公司）下观察脂质体形态及粒径，护肤液中脂质体形态呈卵圆形，形态均一，平均粒径为89±9nm。

实施例2抗皱缓释脂质体护肤液的制备

褪黑素135重量份

维生素C450重量份

大豆卵磷脂1700重量份

胆固醇500重量份

吐温-8012重量份

无水乙醇170重量份

Dowicil2009重量份

HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段12重量份

去离子水6000重量份

碳酸氢钠适量（用于调节终产品pH）

制备工艺如下：

2)取处方量维生素C和处方量7/25的去离子水，制成配液B；

4)将配液A和配液C混合，7000rpm搅拌20min，制成配液D；

5)将配液C和配液D混合，58℃超声，超声功率为200W，超声20min，制成配液E；

Ｈ-1600Ⅳ型透射电子显微镜购（日本Ｈitachi公司）下观察脂质体形态及粒径，护肤液中脂质体形态呈卵圆形，形态均一，平均粒径为127±6nm。

实施例3抗皱缓释脂质体护肤液的制备

褪黑素115重量份

维生素C320重量份

大豆卵磷脂2000重量份

胆固醇320重量份

吐温-8014重量份

无水乙醇190重量份

Dowicil2006重量份

HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段9重量份

去离子水7500重量份

碳酸氢钠适量（用于调节终产品pH）

制备工艺如下：

1)取处方量褪黑素、吐温-80和处方量5/25的去离子水，制成配液A；

2)取处方量维生素C和处方量7/25的去离子水，制成配液B；

3)取处方量大豆卵磷脂、胆固醇、无水乙醇、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段和处方量9/25的去离子水，制成配液C；

4)将配液A和配液C混合，7500rpm搅拌20min，制成配液D；

5)将配液C和配液D混合，54℃超声，超声功率为200W，超声20min，制成配液E；

Ｈ-1600Ⅳ型透射电子显微镜购（日本Ｈitachi公司）下观察脂质体形态及粒径，护肤液中脂质体形态呈卵圆形，形态均一，平均粒径为109±4nm。

实施例4抗皱缓释脂质体护肤液的制备

褪黑素104重量份

维生素C309重量份

大豆卵磷脂2300重量份

胆固醇570重量份

吐温-806重量份

无水乙醇120重量份

Dowicil2007重量份

HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段6重量份

去离子水7200重量份

碳酸氢钠适量（用于调节终产品pH）

制备工艺如下：

1)取处方量褪黑素、吐温-80和处方量8/25的去离子水，制成配液A；

2)取处方量维生素C和处方量8/25的去离子水，制成配液B；

3)取处方量大豆卵磷脂、胆固醇、无水乙醇、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段和处方量6/25的去离子水，制成配液C；

4)将配液A和配液C混合，5300rpm搅拌20min，制成配液D；

5)将配液C和配液D混合，51℃超声，超声功率为200W，超声20min，制成配液E；

Ｈ-1600Ⅳ型透射电子显微镜购（日本Ｈitachi公司）下观察脂质体形态及粒径，护肤液中脂质体形态呈卵圆形，形态均一，平均粒径为145±2nm。

实施例5抗皱缓释脂质体护肤液的制备

褪黑素100重量份

维生素C300重量份

大豆卵磷脂1500重量份

胆固醇300重量份

吐温-805重量份

无水乙醇100重量份

Dowicil2005重量份

HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段5重量份

去离子水3000重量份

磷酸盐缓冲液适量（用于调节终产品pH）

制备工艺如下：

1)取处方量褪黑素、吐温-80和处方量4/25的去离子水，制成配液A；

2)取处方量维生素C和处方量4/25的去离子水，制成配液B；

4)将配液A和配液C混合，4000rpm搅拌20min，制成配液D；

5)将配液C和配液D混合，50℃超声，超声功率为200W，超声20min，制成配液E；

Ｈ-1600Ⅳ型透射电子显微镜购（日本Ｈitachi公司）下观察脂质体形态及粒径，护肤液中脂质体形态呈卵圆形，形态均一，平均粒径为70±32nm。

实施例6抗皱缓释脂质体护肤液的制备

褪黑素140重量份

维生素C460重量份

大豆卵磷脂2400重量份

胆固醇600重量份

吐温-8015重量份

无水乙醇200重量份

Dowicil20010重量份

HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段15重量份

去离子水800重量份

磷酸盐缓冲液（用于调节终产品pH）

制备工艺如下：

2)取处方量维生素C和处方量8/25的去离子水，制成配液B；

4)将配液A和配液C混合，8000rpm搅拌20min，制成配液D；

5)将配液C和配液D混合，60℃超声，超声功率为200W，超声20min，制成配液E；

Ｈ-1600Ⅳ型透射电子显微镜购（日本Ｈitachi公司）下观察脂质体形态及粒径，护肤液中脂质体形态呈卵圆形，形态均一，平均粒径为142±7nm。

实施例7抗皱缓释脂质体护肤液的包封率研究

为验证不同组方及制备方法所得抗皱缓释脂质体护肤液的包封率，本研究制备了以下对比例：

对比例1：与实施例1相似，区别在于组方不含HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段；制备方法同组方1，区别在于步骤3）不加入HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段。

对比例2：与实施例1相似，区别在于组方中HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段用量为3重量份，制备方法同组方1。

对比例3：与实施例1相似，区别在于组方中HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段用量为16重量份，制备方法同组方1。

对比例4：与实施例3相似，区别在于组方不含HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段；制备方法同组方3，区别在于步骤3）不加入HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段。

对比例5：与实施例3相似，区别在于组方中HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段用量为4重量份，制备方法同组方3。

对比例6：与实施例3相似，区别在于组方中HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段用量为20重量份，制备方法通组方3。

实验选用实施例1、实施例3及对比例1-6的抗皱缓释脂质体护肤液进行对比研究。

褪黑素的包封率测定方法（参考文献方法测定：赵少杰，叶盛英，欧春凤，郑森鸿.超临界CO₂法制备褪黑素脂质体的工艺优化.农业工程学报.2014，30（3）：251-258.）：取1mL抗皱缓释脂质体护肤液，加10mL甲醇破乳，精密量取破乳后溶液1mL于10mL容量瓶，用pH值7.4磷酸盐缓冲液定容。空白脂质体同法操作为空白，在278nm测定吸光度A1得到药物含量（W1）。量取1mL抗皱缓释脂质体护肤液，置离心管中，加入1mL鱼精蛋白溶液（10mg/mL），用微型吸管混匀，静置3min后，向混合物中加9mLpH值7.4磷酸盐缓冲液稀释。然后室温置于台式离心机中，10000rpm离心20min后，取上清液1mL，pH值7.4磷酸盐缓冲液定容。空白脂质体同法操作为空白，在278nm测定吸光度A2代入标准曲线方程，计算未包封药物含量（W2）。脂质体包埋率的计算公式：包封率=(W1-W2)/W1×100%

维生素C的含量测定方法（参考文献方法测定：赵少杰，叶盛英，欧春凤，郑森鸿.超临界CO₂法制备褪黑素脂质体的工艺优化.农业工程学报.2014，30（3）：251-258；梁玉增，鲍浪.包埋V_E和V_C的卵磷脂脂质体的合成.日用化学工业.1994年第4期，第7-10页）：取20mL抗皱缓释脂质体护肤液，加200mL甲醇破乳，精密量取破乳后溶液20mL于200mL容量瓶，用pH值7.4磷酸盐缓冲液定容。空白脂质体同法操作为空白，在244nm测定吸光度A1得到药物含量（W1）。量取20mL抗皱缓释脂质体护肤液，通过SephadexG50色谱柱，收集脂质体部分，加10倍体积甲醇破乳，pH值7.4磷酸盐缓冲液定容。空白脂质体同法操作为空白，在244nm测定吸光度A2得到包封药物含量（W2）。脂质体包埋率的计算公式：包封率=W2/W1×100%。实验结果见下表1：

表1

由上表可见，HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段用量对含褪黑素和维生素C的抗皱缓释脂质体的包封率影响至关重要，用量低于或高于一定比例，脂质体包封率均次于不含HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段的脂质体。

实施例8抗皱缓释脂质体护肤液的粒径研究

采用Ｈ-1600Ⅳ型透射电子显微镜购（日本Ｈitachi公司）观察实施例1-3及对比例1-6

的粒径。实施例1-3所得脂质体的粒径分别见实施例1-3。对比例1-6所得脂质体的粒径见下表2（数值以平均值±标准差表示，单位为nm，400倍放大条件下，随机取6个视野位置，计算视野内脂质体粒径，计算平均值和标准差）：

表2

由上表可见，HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段用量对含褪黑素和维生素C的抗皱缓释脂质体的粒径及粒径差异影响显著，用量低于或高于一定比例，脂质体粒径差异均一性不含HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段相似，导致粒径差别过大，进而对药物吸收和质量控制造成差异。

实施例9抗皱缓释脂质体护肤液的体外释放度实验

SPF级雄性昆明小鼠，体重18~22g。用棉球沾8%硫化钠水溶液(含7%淀粉、4%蔗糖、5%甘油、1%硼砂)将动物背毛充分润湿，毛根变色后用纸巾沿同一方向将被毛抹去，温水洗净皮肤表面，处死动物，取下无损伤背部皮肤，去除皮下脂肪，用生理盐水洗净并浸泡于生理盐水中，4℃保存，24h内使用。

取动物离体皮肤夹在透皮扩散试验仪供给池与接受池之间(扩散池面积2.92cm²)，供给池一侧分别加入实施例1、2和对比例1-6所制备的抗皱缓释脂质体护肤液，接受池含pH7.4的磷酸盐缓冲液，搅拌转速500rpm，32℃恒温搅拌。分别于2、8、16、32h及第4、8、16、32天取样测定接受池中褪黑素和维生素C的含量，计算取样时间点（含取样时间点）之前的药物累积释放量，通过与供给池中样品药物含量的比值，计算药物累积释放率。褪黑素和维生素C的含量测定方法同实施例7，采用吸光度法测定。褪黑素的体外累积释放度实验结果见下表3（体外累积释放度以%表示，n=6）：

表3

由上表可见，HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段用量对抗皱缓释脂质体的褪黑素缓释效果有显著影响，用量过低则褪黑素缓释效果低于不含HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段的脂质体；用量过高则褪黑素缓释效果与不含HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段的脂质体类似。其中实施例1和实施例3的脂质体褪黑素缓释可维持32天。

维生素C的a体外累积释放度实验结果见下表4（体外累积释放度以%表示，n=6）：

表4

由上表可见，HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段用量对抗皱缓释脂质体的维生素C缓释效果有显著影响，用量过低或过高则维生素C缓释效果均低于不含HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段的脂质体。其中实施例1和实施例3的脂质体维生素C缓释可维持32天。

实施例10抗皱缓释脂质体护肤液的安全性性实验

新西兰家兔，雄性，体重2.2~3.1kg，取18只家兔随机分为三组。动物背部脊柱左侧去毛（面积4×4cm²）分别涂抹实施例1-3制备的抗皱缓释脂质体2ml。第1和第15天各涂1次，观察涂抹后各组动物的皮肤反应（红斑、水肿等），观察者首次给药后4周，每日观察一次。

两组动物给药部位皮肤均未见肉眼可见的刺激反应。

实施例11抗皱缓释脂质体护肤液的耐冲洗实验

取实施例1-3制备的抗皱缓释脂质体护肤液各0.5ml，分别采用实施例7的方法测定包封及游离褪黑素和维生素C的量。

BALB/c裸鼠，雄性，体重14~16g，取18只裸鼠随机分为三组。脊柱左侧（面积1×1cm²）分别涂抹实施例1-3制备的，抗皱缓释脂质体护肤液0.5ml。于涂抹后第4、8、12h用蒸馏水冲洗涂药部位，收集冲洗液收集于容器。分别采用实施例7的方法测定冲洗液中包封及游离褪黑素和维生素C的量。三次冲洗所得冲洗液中褪黑素和维生素C的量分别合并计算，计算冲洗过程中有效成分的损失率。计算公式如下：褪黑素或维生素C的冲洗损失率=冲洗液中褪黑素或维生素C的量/0.5ml抗皱缓释脂质体护肤液中褪黑素或维生素C的量×100%。

实验结果显示，抗皱缓释脂质体护肤液皮肤给药后，褪黑素和维生素C的冲洗损失率分别为2.7±0.8%(n=6)和5.8±1.5%(n=6)。上述实验说明，实施例1-3制备的，抗皱缓释脂质体护肤液皮肤涂抹给药后可快速进入皮肤或吸附于皮肤表面，经水冲洗后，损失率极低。提示，上述护肤液涂抹后，可耐受日常面部清洁造成的有效成分流失。

实施例12抗皱缓释脂质体护肤液的抗皱效果研究

BALB/c裸鼠，雄性，体重14~16g，取96只裸鼠随机分为6组。A组为正常组，不造模，皮肤涂抹蒸馏水。B组为模型组，每日颈背部皮下注射D-半乳糖（100mg/kg），并采用长波长（365nm，照射强度259.5J/cm²）和短波长光照（254nm，照射强度6.7/cm²），造模持续6周。造模其间，皮肤涂抹蒸馏水。C-H组为给药组，造模方法同B组，造模期间，分别于第1、12日在裸鼠脊柱左侧和右侧（面积各为1×1cm²）涂抹实施例1-3及对比例1-3制备的抗皱缓释脂质体护肤液1ml（每侧0.5ml）。

各组动物于第30、42日各处死6只，取背部皮肤1~2g，生理盐水漂洗，祛除皮下脂肪和结缔组织，滤纸吸干，称重，剪碎后加入生理盐水研磨，3500rpm离心15min，取上清液采用超氧化物歧化酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所)、丙二醛测定试剂盒（南京建成生物工程研究所)测定皮肤组织中超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量。结果见下表5：

表5

*p＜0.05与模型组相比。

由上表可见，实施例1-3制备的抗皱缓释脂质体护肤液经皮给药后对光照和化学刺激导致的皮肤衰老模型具有显著的改善作用，首次后给药后30、42天，皮肤SOD仍显著高于模型组，MDA仍显著低于模型组；对比例1-3制备的抗皱缓释脂质体护肤液对光照和化学刺激导致的皮肤衰老模型无明显改善作用。说明实施例1-3制备的抗皱缓释脂质体护肤液具有长效抗皱作用。而对比例1-3制备的抗皱缓释脂质体护肤液药效难以持续至给药后30日。

Claims

1.一种具有抗皱作用的缓释脂质体护肤液，其特征在于，所述缓释脂质体护肤液由pH调节剂和下列重量比的成分制成：褪黑素100~140重量份、维生素C300~460重量份、大豆卵磷脂1500~2400重量份、胆固醇300~600重量份、吐温-805~15重量份、无水乙醇100~200重量份、Dowicil2005~10重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段5~15重量份、去离子水3000~8000重量份；所述脂质体护肤液中脂质体的平均粒径为20~150nm；

所述具有抗皱作用的缓释脂质体护肤液通过如下步骤制得：取处方量褪黑素、吐温-80和处方量4/25~8/25的去离子水，制成配液A；取处方量维生素C和处方量4/25~8/25的去离子水，制成配液B；取处方量大豆卵磷脂、胆固醇、无水乙醇、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段和处方量6/25~9/25的去离子水，制成配液C；将配液A和配液C混合，4000~8000rpm搅拌20min，制成配液D；将配液C和配液D混合，50℃~60℃超声，超声功率为200W，超声20min，制成配液E；将处方量Dowicil200和余量去离子水加入配液E，搅拌混合，加入pH调节剂调pH为6~7即得。

2.根据权利要求1所述的缓释脂质体护肤液，其特征在于，所述缓释脂质体护肤液由pH调节剂和下列重量比的成分制成：褪黑素120重量份、维生素C380重量份、大豆卵磷脂1800重量份、胆固醇400重量份、吐温-808重量份、无水乙醇140重量份、Dowicil2008重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段14重量份、去离子水5000重量份；所述脂质体护肤液中脂质体的平均粒径为80~100nm。

3.根据权利要求1所述的缓释脂质体护肤液，其特征在于，所述缓释脂质体护肤液由pH调节剂和下列重量比的成分制成：褪黑素135重量份、维生素C450重量份、大豆卵磷脂1700重量份、胆固醇500重量份、吐温-8012重量份、无水乙醇170重量份、Dowicil2009重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段12重量份、去离子水6000重量份；所述脂质体护肤液中脂质体的平均粒径为120~140nm。

4.根据权利要求1所述的缓释脂质体护肤液，其特征在于，所述缓释脂质体护肤液由pH调节剂和下列重量比的成分制成：褪黑素115重量份、维生素C320重量份、大豆卵磷脂2000重量份、胆固醇320重量份、吐温-8014重量份、无水乙醇190重量份、Dowicil2006重量份、HIV-1-TAT蛋白47-57多肽片段9重量份、去离子水7500重量份；所述脂质体护肤液中脂质体的平均粒径为100~120nm。

5.根据权利要求1至4所述的缓释脂质体护肤液，其特征在于，所述缓释脂质体护肤液中的pH调节剂为碳酸氢钠、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种。

6.一种具有抗皱作用的缓释脂质体护肤液的制备方法，其特征在于，其包括：

步骤四，将配液A和配液C混合，4000~8000rpm搅拌20min，制成配液D；

步骤五，将配液C和配液D混合，50℃~60℃超声，超声功率为200W，超声20min，制成配液E；

7.根据权利要求6所述的具有抗皱作用的缓释脂质体护肤液的制备方法，其特征在于：

所述步骤一中去离子水用量为处方量的6/25；

所述步骤二中去离子水用量为处方量的6/25；

所述步骤三中去离子水用量为处方量的8/25;

所述步骤四中搅拌速度为6000rpm；

所述步骤五超声温度为56℃。

8.根据权利要求6所述的具有抗皱作用的缓释脂质体护肤液的制备方法，其特征在于：

所述步骤一中去离子水用量为处方量的6/25；

所述步骤二中去离子水用量为处方量的7/25；

所述步骤三中去离子水用量为处方量的8/25;

所述步骤四中搅拌速度为7000rpm；

所述步骤五超声温度为58℃。

9.根据权利要求6所述的具有抗皱作用的缓释脂质体护肤液的制备方法，其特征在于：

所述步骤一中去离子水用量为处方量的5/25；

所述步骤二中去离子水用量为处方量的7/25；

所述步骤三中去离子水用量为处方量的9/25;

所述步骤四中搅拌速度为7500rpm；

所述步骤五超声温度为54℃。