CN105560180A - 叶酸特异性靶向活化态肝星状细胞的聚合物纳米载体及其药用用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了叶酸特异性靶向活化态肝星状细胞的聚合物纳米载体及其药用用途。在由静息态到肌纤维化样活化态的转型过程中，肝星状细胞中α型叶酸受体的表达显著增强。进一步制备叶酸偶联的聚合物纳米胶束载体，我们成功实现了其对活化态的原代大鼠肝星状细胞及细胞株的特异性靶向。本发明所述的药物纳米载体系统采用聚乙二醇为亲水段材料，确保其对血液循环中蛋白质吸附和细胞粘附的抵抗；以聚己内酯为疏水段材料成核，便于多种疏水性抗纤维化药物及荧光染料的装载。偶联于PEG外壳上的叶酸则保证载体系统对活化态肝星状细胞表面的叶酸受体进行特异性地识别，最终有效地提高药物的利用率并降低其毒副作用。

Description

叶酸特异性靶向活化态肝星状细胞的聚合物纳米载体及其药用用途

技术领域

本发明属于药物输送领域。具体涉及一种靶向活化态肝星状细胞的聚合物纳米载体及其制备和应用。

背景技术

我国是肝纤维化、肝硬化、肝癌等肝脏疾病的高发区，其肝癌发病率和死亡率都超过了全球的50％。肝硬化和肝癌的发病率呈正相关关系，肝纤维化作为肝硬化的前期重要病症，受到越来越多研究者关注。肝纤维化的形成涉及到肝细胞(HC)、肝星状细胞(HSC)、陷窝细胞、库普弗细胞(KC)和肝窦内皮细胞(SLEC)等，而静止态向肌纤维化样活化态转变后的肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)被认为是肝纤维化起始过程的中心环节。随着细胞学和分子生物学的发展和应用，以HSC为靶点来研发抗肝纤维化药物成为肝病治疗领域的热点。已相继有人尝试紫杉醇、姜黄素、NO类等药物来抑制活化态HSC的增殖和ECM的沉积，也有采用RNAi技术针对I型胶原蛋白基因进行沉默的成功报道。

无论是化学药物还是基因药物，它们大多或者水溶性差、药效低下、价格不菲，或者稳定性低、在体内容易被降解；而且其作用的非特异性，常常导致低药效、高毒副作用。这些问题的存在都极大地限制它们在临床中的应用。以纳米载体系统载送药物不仅可解决药物难溶性和稳定性低的问题，还可以通过EPR效应有效地使药物在肝脏部位富集、改善细胞对药物的摄取。近年来已有一些纳米载体药物系统用于肝纤维化、肝硬化和肝癌的诊断和治疗的报道，成功载送了肝脏生长因子(HGF)、NO药物及中草药等至纤维化小鼠肝脏；国内李玉娟等人也研发了以多聚体和脂质体为主的纳米载送颗粒、尝试对肝纤维化和肝癌的治疗。然而，这些纳米粒子载体都不能有效地靶向性作用于活化HSC—这一类主要的导致肝纤维化的细胞；过量的纳米粒子对肝脏形成毒性。与普通药物治疗相比，HSC细胞特异性的靶向药物载体能够延长药物的体循环时间、提高药物在HSC中的富集、而且可降低药物剂量、进一步减少毒副作用，是目前肝纤维化治疗中亟待发展的一类药物载体系统。

目前可特异性作用于HSC药物载体主要有几种：如甘露糖6磷酸人血清白蛋白(M6P-HSA)脂质体，参见：AdrianJ.E.,PoelstraK.,ScherphofG.L.,etal.Interactionoftargetedliposomeswithprimaryculturedhepaticstellatecells:Involvementofmultiplereceptorsystems[J].Journalofhepatology,2006,44(3):560-7；含有RGD序列环肽靶向长循环脂质体(RGD-SSL)，参见：DuS.L.,PanH.,LuW.Y.,etal.CyclicArg-Gly-Asppeptide-labeledliposomesfortargetingdrugtherapyofhepaticfibrosisinrats[J].TheJournalofpharmacologyandexperimentaltherapeutics,2007,322(2):560-8；偶联维生素A的聚合物纳米载体，参见：DuongH.T.,DongZ.,SuL.,etal.Theuseofnanoparticlestodelivernitricoxidetohepaticstellatecellsfortreatingliverfibrosisandportalhypertension[J].Small,2015,11(19):2291-304；偶联识别血小板衍生生长因子受体的环肽共聚物，参见：BansalR.,PrakashJ.,PostE.,etal.Novelengineeredtargetedinterferon-gammablockshepaticfibrogenesisinmice[J].Hepatology,2011,54(2):586-96。这四者都以肝星状细胞表达的受体为靶位点，利用受体配体间的特异性结合实现对HSC的主动靶向。但是，前两种载体所识别的受体均在其他细胞中有所表达，导致载体在靶向肝星状细胞过程中也作用于其它正常细胞；且配体制备过程较为复杂、成本高昂，不利于临床进一步研究和利用。此外，静止态HSC也大量摄取维生素A，因此维生素A修饰的载体系统不具备对活化态HSC的特异性作用。而能特异性识别血小板衍生生长因子受体的环肽共聚物，其合成困难、成本高昂。因此，开发一种特异性靶向活化态HSC的高效、低毒性、低成本的药物载体对肝纤维化的研究和治疗有着积极而重要的意义。

叶酸受体是一种肿瘤细胞表面高表达而正常细胞低表达的糖蛋白，作为其特异性配体的叶酸，具有分子量低、易化学修饰、稳定性好、无免疫原性、和受体亲和性强以及成本低廉等突出优点。因此，叶酸渐渐成为肿瘤靶向的理想配体，近年来在药物靶向输送、癌症治疗等领域引起了广泛的关注。我们研究组发现，与静止的肝星状细胞相比，快速增殖的活化态肝星状细胞中叶酸受体的表达显著增强；和肿瘤组织间质类似，肝纤维化部位由于活化肝星状细胞旺盛的糖酵解而产生大量代谢酸性产物，使肝纤维化细胞间质pH呈弱酸性等。这些生理学上的类似特征启发我们采用偶联叶酸的聚合物纳米胶束实现对活化态HSC进行主动靶向。目前，尚未有特异性靶向肝星状细胞的偶联叶酸配体聚合物纳米载体的相关报道。

发明内容

鉴于现有技术的以上不足，本发明的目的在于，克服现有作用于活化态肝星状细胞药物载体的不足，提供一种新型的、具有特异性靶向活化态肝星状细胞功能的聚合物纳米载体。

为实现上述目的，本发明采用一种叶酸靶向的聚合物纳米载体，其化学结构式如下:

式中，n＝41～50,m＝12～14。所述纳米载体为球形，粒径均匀且平均粒径为50-60nm。

所述叶酸靶向活化态肝星状细胞的聚合物纳米载体为纳米胶束，其亲水段材料为聚乙二醇，其分子量为1800～2200，疏水段材料为聚己内酯，其分子量为1368～1596。

所述纳米胶束粒径较小，分布均匀，具有良好的稳定性和生物相容性，可以有效地靶向肝纤维化部位从而实现富集给药。

本发明的另一目的是将上述聚合物纳米胶束用于特指的药用用途，即：

叶酸靶向活化态肝星状细胞的聚合物纳米胶束的药用用途，在所述聚合物纳米胶束疏水段形成的内核包覆尼罗红等疏水性荧光染料和疏水性抗纤维化药物，进而考察偶联叶酸配体的聚合物纳米载体对活化态肝星状细胞的靶向效果和药物作用，用作肝纤维化的靶向治疗和研究。本发明所述的纳米胶束结构是核壳结构，外壳的亲水段末梢接枝靶向配体，内核的疏水段可包覆疏水性荧光染料及抗纤维化药物。

本发明提供了一种特异作用于活化态肝星状细胞的聚合物纳米载体的制备和应用。我们首次发现，在由静息态到肌纤维化样活化态的转型过程中，肝星状细胞中α型叶酸受体的表达显著增强。进一步制备叶酸偶联的聚合物纳米胶束载体，我们成功实现了其对活化态的原代大鼠肝星状细胞及细胞株的特异性靶向。本发明所述的药物纳米载体系统采用聚乙二醇为亲水段材料，确保其对血液循环中蛋白质吸附和细胞粘附的抵抗；以聚己内酯为疏水段材料成核，便于多种疏水性抗纤维化药物及荧光染料的装载。偶联于PEG外壳上的叶酸则保证载体系统对活化态肝星状细胞表面的叶酸受体进行特异性地识别，最终有效地提高药物的利用率并降低其毒副作用。

附图说明：

图1为本发明所用原代大鼠肝星状细胞(HSC)静息态到活化态mRNA表达量变化。其中:图1(a)为αSMA的mRNA变化量，图1(b)为Collagen1a1的mRNA变化量，图1(c)为FR-α的mRNA变化量。

图2为本发明所用FA-PEG-PCL聚合物材料合成路线图。

图3为本发明所用FA-PEG-PCL聚合物材料¹H-NMR图谱。

图4为本发明所用FA-PEG-PCL纳米胶束粒径分布。

图5为本发明所用FA-PEG-PCL纳米胶束透射电镜照片。

图6为本发明所用FA-PEG-PCL纳米胶束临界胶束浓度测量曲线。

图7为本发明所用纳米胶束对HSC-T6细胞毒性实验。

图8为本发明所用HSC-T6细胞摄取包覆尼罗红纳米胶束荧光照片。

图9为本发明所用HSC-T6细胞摄取包覆尼罗红纳米胶束流式细胞仪定量分析。

图10为本发明所用HSC细胞摄取包覆尼罗红纳米胶束荧光照片。

图11为本发明所用HSC细胞摄取包覆尼罗红纳米胶束流式细胞仪定量分析。

具体实施方式

基于开发一种新型、高效、低毒性、低成本并能特异性靶向HSC的药物载体,使之对肝纤维化的治疗具有明确的靶向效果的发明目的,设计了靶向环境和效率、聚合物材料的制备和评价、聚合物纳米胶束的获取实验环节。考虑到尼罗红(NileRed)作为一种独特的疏水性荧光染料，在水溶液中荧光强度非常低，而在疏水环境中会发出强烈荧光，在细胞成像、生物诊断及检测等应用非常广泛。此外，尼罗红在分子量、亲疏水性以及药物稳定性等方面与疏水性药物非常相似，是一种非常理想的荧光标记染料和疏水性药物模型，所以我们采用尼罗红作为荧光染料和疏水性药物模型来验证偶联叶酸配体聚合物纳米载体对活化态肝星状细胞的靶向性和药物作用。并以尼罗红为疏水性药物模型和靶向效果检测标识进行定性和定量评价。将上述内容构成实施例，下面结合各实施例和附图做进一步说明。

实施例1

原代大鼠肝星状细胞(HSC)的分离和培养

采用原位灌注法消化大鼠肝脏，对消化分离得到的原代大鼠肝星状细胞采用高糖DMEM培养基(含15％-20％FBS，1％双抗P/S)置于37℃，5％CO₂细胞孵箱中培养。

实施例2

活化态大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的培养

对HSC-T6细胞进行复苏传代后加入高糖DMEM培养基(含10％FBS，1％双抗P/S)后置于37℃，5％CO₂细胞孵箱中培养。

实施例3

原代大鼠肝星状细胞(HSC)由静息态到活化态αSMA、Collagen1a1、FR-α的mRNA表达量变化分析

采用原位灌注法消化大鼠肝脏，对消化分离得到的原代大鼠肝星状细胞在24孔板中培养7天，其后吸除24孔板培养基，PBS洗两遍并吸弃PBS。采用Axygen试剂盒提取原代大鼠肝星状细胞RNA，使用逆转录试剂盒和QPCR仪将RNA逆转录为cDNA并稀释，其后进行PCR，分析αSMA、Collagen1a1和FR-α的mRNA表达量的变化。mRNA表达量变化如图1(a、b、c)。

实施例4

纳米胶束载体材料FA-PEG-PCL或者PEG-PCL的制备

(1)双端羧基化的聚乙二醇(COOH-PEG-COOH)的制备

将PEG2000、丁二酸酐、氯仿混合，油浴加热至70度反应48h。其后在反应液中加入去离子水萃取，重复两次，有机层用无水硫酸钠干燥过夜，过滤、旋蒸除去氯仿，最后加适量冰乙醚沉淀过滤干燥，得到双端羧基化的聚乙二醇(COOH-PEG-COOH)。

(2)单端羧基化的聚乙二醇(Boc—PEG—COOH)的制备

将双端羧基化PEG、EDC.HCL、DMAP和二氯甲烷混合，反应体系置于冰水浴中，然后向其滴加N-叔丁氧羰基乙二胺的二氯甲烷溶液，冰浴条件下搅拌过夜。旋蒸加冰乙醚沉淀，过滤干燥得到单端羧基化的聚乙二醇(Boc-PEG-COOH)。

(3)二碳酸二叔丁酯保护的聚己内酯(Boc—PCL)的制备

快速称取N-叔丁氧羰基乙二胺、蒸馏纯化的己内酯单体、氯化亚锡置于单颈瓶中，抽真空，40度加热搅拌5h,其后置于140度反应6h。向反应液中加入冰乙醇沉淀过滤，真空干燥得到N-叔丁氧羰基乙二胺聚己内酯(Boc-PCL)。

(4)单端氨基化聚己内酯(NH₂—PCL)的制备

称取N-叔丁氧羰基己内酯溶于二氯甲烷，加入三氟乙酸并搅拌2h,旋蒸除去三氟乙酸，加饱和碳酸氢钠水调至pH为中性，过滤并用去离子水洗两次，有机层用无水硫酸钠干燥过夜，过滤，旋蒸除去二氯甲烷，加冰乙醇沉淀过滤，真空干燥得到单端氨基化聚己内酯(NH₂-PCL)。

(5)二碳酸二叔丁酯封端的聚乙二醇—聚己内酯(PEG—PCL)的制备

称取Boc—PEG—COOH、NH₂—PCL、EDC.HCL、DMAP溶于二氯甲烷并搅拌过夜。其后将反应液旋干，加适量冰乙醚沉淀过滤，真空干燥72h得到产物二碳酸二叔丁酯保护的聚乙二醇—聚己内酯(PEG—PCL)。

(6)单端氨基化的聚乙二醇—聚己内酯(NH₂—PEG—PCL)的制备

称取Boc—PEG—PCL溶于二氯甲烷，加入三氟乙酸并搅拌2h,旋蒸除去三氟乙酸，加饱和碳酸氢钠水调至pH为中性，过滤并用水洗两次，有机层用无水硫酸钠干燥过夜，过滤，旋蒸除去二氯甲烷，加适量冰乙醚沉淀过滤，干燥得到单端氨基化的聚乙二醇—聚己内酯(NH₂—PEG—PCL)。

(7)偶联叶酸的聚乙二醇—聚己内酯(FA—PEG—PCL)的制备

称取叶酸、EDC.HCL、NHS溶于DMSO，避光过夜反应，其后向其中加入NH₂—PEG—PCL反应48h。其后将产物置于透析袋中(MW＝1000)中避光透析48h，冷冻干燥得到淡黄色固体FA-PEG-PCL。

上述具体合成步骤见图2。

实施例5

聚合物纳米胶束的制备

称取5mg聚合物材料完全溶解于5mL四氢呋喃(THF)中，利用注射器将其缓慢滴加至适量搅拌速度的去离子水中，然后置于通风橱中待四氢呋喃完全挥发后，收集样品待用。

实施例6

聚合物纳米胶束载体材料结构的表征

所制备的聚合物纳米胶束载体材料结构的表征采用¹H-NMR分析，将适量待测样品溶于氘代DMSO中，以四甲基硅烷为内标，通过核磁共振谱仪检测各样品中氢质子的位移，核磁测试结果见图3。

实施例7

聚合物纳米胶束粒径测试

制备浓度为1mg/ml的FA-PEG-PCL纳米胶束，通过动态光散射仪进行测试，粒径测试结果见图4。

实施例8

聚合物纳米胶束形貌观察

制备浓度为1mg/ml的FA-PEG-PCL纳米胶束，滴加一滴浓度为1mg/ml的胶束溶液至碳膜铜网正面，保持60s后，用滤纸洗掉多余液体，滴加一滴2.5wt％的磷钨酸水溶液负染60s，吸掉多余染料，待液体挥干后进行投射电子显微镜观察，投射电镜照片见图5。

实施例9

聚合物纳米胶束临界胶束浓度(CMC)的测试

称取适量的芘，配置成芘的甲醇溶液，移取50μl至一系列25ml的容量瓶中，待甲醇挥发完全后，容量瓶定容配置成一系列不同浓度的胶束溶液，浓度从8×10^-5mol/L到1×10^-1mol/L。采用荧光分光光度计测定芘的激发光谱，固定发射波长为390nm，峰宽为6nm，激发波长分别为339nm和333nm，按I333/I339-lgC作图，突变点即为胶束的CMC，经计算CMC＝1.55×10^-3mg/ml，CMC测试结果见图6。

实施例10

聚合物纳米胶束毒性实验

将大鼠肝纤维化细胞(HSC-T6)以5×10³/孔接种于96孔板上，于37℃，5％CO₂细胞孵箱中贴壁生长24h后，加入浓度范围从10μg/mL至500μg/mL的FA-PEG-PCL和PEG-PCL纳米胶束溶液继续培养24h，加入CCK-8试剂，用酶标仪检测吸光度值，测试结果见图7。

实施例11

包覆尼罗红聚合物纳米胶束的制备

称取5mg聚合物材料和适量尼罗红(聚合物材料与尼罗红的质量比为1：10～1:100)完全溶解于5mL四氢呋喃中，利用注射器将其缓慢滴加至适量搅拌速度的蒸馏水中，然后置于通风橱中待有机溶剂完全挥发后，转移到透析袋(MW＝1000)在去离子水中透析48h，再将所制备的聚合物纳米胶束过滤，收集样品待用。

实施例12

HSC-T6细胞摄取包覆尼罗红聚合物纳米胶束荧光显微镜观察

将HSC-T6细胞以5×10⁴/孔接种于24孔板上，于37℃，5％CO₂细胞孵箱中贴壁生长24h后，加入包覆尼罗红聚合物纳米胶束继续培养2h，用PBS洗两次，加入2.5％的戊二醛固定0.5h,用PBS洗两次，加入DAPI(1:600，V/V)约5min，再吸走DAPI，清洗两次后加适量PBS避光保存，利用荧光显微镜观察HSC-T6细胞摄取包覆尼罗红的叶酸靶向纳米胶束(FA-PEG-PCL)及包覆尼罗红的无叶酸靶向纳米胶束(PEG-PCL)荧光分布，荧光照片结果见图8。

实施例13

HSC-T6细胞摄取包覆尼罗红聚合物纳米胶束定量分析

将HSC-T6细胞以5×10⁵/孔接种于6孔板上，于37℃，5％CO₂细胞孵箱中贴壁生长24h后，加入包覆尼罗红聚合物纳米胶束继续培养2h，用PBS洗两次，加入300μl胰酶消化下贴壁细胞，然后加一定量培养基终止消化，将细胞离心收集于流式管，利用流式细胞仪检测HSC-T6细胞摄取包覆尼罗红的叶酸靶向纳米胶束(FA-PEG-PCL)及包覆尼罗红的无叶酸靶向纳米胶束(PEG-PCL)荧光强度，流式细胞仪数据见图9。

实施例14

HSC细胞摄取包覆尼罗红聚合物纳米胶束荧光显微镜观察

采用原位灌注法消化大鼠肝脏，对消化分离得到的原代大鼠肝星状细胞(HSC)接种于24孔板上，于37℃，5％CO₂细胞孵箱中贴壁生长7天后，加入包覆尼罗红聚合物纳米胶束继续培养2h，用PBS洗两次，加入2.5％的戊二醛固定0.5h,用PBS洗两次，加入DAPI(1:600，V/V)约5min，再吸走DAPI，清洗两次后加适量PBS避光保存，利用荧光显微镜观察HSC细胞摄取包覆尼罗红的叶酸靶向纳米胶束(FA-PEG-PCL)及包覆尼罗红的无叶酸靶向纳米胶束(PEG-PCL)荧光分布，荧光照片结果见图10。

实施例15

HSC细胞摄取包覆尼罗红聚合物纳米胶束定量分析

采用原位灌注法消化大鼠肝脏，对消化分离得到的原代大鼠肝星状细胞(HSC)接种于6孔板上，于37℃，5％CO₂细胞孵箱中贴壁生长7天后，加入包覆尼罗红聚合物纳米胶束继续培养2h，用PBS洗两次，加入300μl胰酶消化下贴壁细胞，然后加一定量培养基终止消化，将细胞离心收集于流式管，利用流式细胞仪检测HSC细胞摄取包覆尼罗红的叶酸靶向纳米胶束(FA-PEG-PCL)及包覆尼罗红的无叶酸靶向纳米胶束(PEG-PCL)荧光强度，流式细胞仪数据见图11。

Claims (4)

1.一种叶酸靶向活化态肝星状细胞的聚合物纳米载体，其化学结构式如下:

式中，n＝41～50,m＝12～14；

所述纳米载体为球形，粒径均匀且平均粒径为50-60nm。

2.根据权利要求1所述的叶酸靶向活化态肝星状细胞的聚合物纳米载体为纳米胶束，其特征在于，所述纳米胶束亲水段材料为聚乙二醇，其分子量为1800～2200，疏水段材料为聚己内酯，其分子量为1368～1596。

3.权利要求1或2所述的叶酸靶向活化态肝星状细胞的聚合物纳米胶束的药用用途，其特征在于，用作以叶酸作为靶向性配体的靶向活化态肝星状细胞的药物载体系统。

4.根据权利要求3所述的药用用途，其特征在于，在所述聚合物纳米胶束内核的疏水段包覆疏水性抗纤维化药剂。