CN105482493B - 一种高纯度花青素的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高纯度花青素的提取方法。该方法分别以紫番茄和龙葵为原料，首先将其打碎匀浆后与pH=1的酸水混合，进行超声提取，过滤，将滤液经大孔树脂吸附并除杂，再用pH=1的酸95%乙醇进行洗脱，得到的洗脱液再经过喷雾干燥机喷雾干燥后得到高度纯化的花青素粉末。本发明解决了植物花青素提取过程中损耗较大、得率低、纯度低的缺点，得到的紫番茄花青素纯度高达54%，得率占鲜重0.48%，而龙葵花青素纯度更是高达56%，得率也高达鲜重的1.3%，弥补了国内市场销售的植物花青素纯度普遍低于24%的缺陷，同时设备操作简单易行，生产过程清洁无害，产品质量稳定，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及天然活性物质提取技术领域，具体涉及一种高纯度花青素的提取方法，以实现植物花青素的高效率提取和纯化。
背景技术
花青素是属于类黄酮化合物一种天然水溶性植物色素，主要是通过与糖结合成的糖苷形式存在于植物细胞液泡中，主要成色成分为花青素类的甲基花青素酰基葡萄糖苷和氰锭酰基葡萄糖苷，正是由于花色苷有酰基和糖基结构，在色素提取时的稳定性有所提高，生理保健技能也有所增强。它能被广泛地应用于保健品、食品和化妆品领域，其在抗氧化、抗突变、抗炎、抗过敏、利尿、解痉、镇咳、降血脂和治疗心脑血管疾病等方面作用也很显著，其功效还包括治疗糖尿病、预防癌症；清除体内有害的自由基；改善睡眠；延缓脑神经衰老和延长寿命。但是，由于花青素在光、热及碱性条件下不稳定，在弱酸条件下稳定，这使得花青素在提取纯化时受到一定条件的限制，这使得花青素的提取纯化研究成为现在新兴前沿的研究课题。
目前较多的花青素提取是在葡萄，蓝莓，紫薯中进行的，本发明利用紫番茄和龙葵作为原料，提取物的花青素含量高，提取的花青素属于天然植物色素，没有化学合成色素的毒性影响，这两种植物种植技术成熟，推广面积大，填补和丰富了我国植物花青素提取领域的空白，同时丰富了花青素相关药物制剂的来源。
目前国内市场上销售的花青素纯度在5-24%左右，而欧洲把纯度大于24%的花青素作为药用，简单的提取纯化工艺纯度很难达到24.00% 以上，而欧洲国家利用他们自己拥有的提取纯化技术，可使提取物的花青素纯度达到36.00%以上。本发明的不同之处在于：从高花青素含量的紫番茄和龙葵中提取的花青素纯度可高达54%以上，龙葵中的花青素纯度更是高达56%以上，品质高于国外进口产品，同时弥补了国内市场花青素纯度普遍低于24%的缺陷，是花青素提取领域一大重要发明，有着巨大的经济和社会效益。
发明内容
针对现在市场上销售的花青素纯度在5-24%左右，且提取得率低，普通的简单提取工艺纯度很难达到花青素药用纯度标准24.00% 以上，本发明所要解决的技术问题是，提供一种高纯度花青素的提取方法，提取纯度高，得率高，稳定性好，杂质少，无污染。
本发明高纯度花青素提取方法，是以紫番茄和龙葵果实为原料，采用先匀浆用酸水进行超声粗提取，再用大孔吸附树脂进行除杂纯化，再通过喷雾干燥的方法，最大程度地将紫番茄和龙葵中的花青素提取出来，最终得到精制的高纯度性质稳定的花青素粉末。
本发明的方案如下：一种高纯度花青素的提取方法，按照以下操作步骤进行：
（1）原料的预处理：将紫番茄或龙葵果，去掉叶柄并洗净，称重后用匀浆机匀浆；
（2）酸水提取：先按一定比例配置酸水提取液，再将步骤（1）中的紫番茄或龙葵匀浆后的果渣用配制好的酸水进行超声提取，之后用纱布过滤，得果渣粗提取液；同时将步骤（1）中果实匀浆后的果汁调节pH后静置一段时间后通过虹吸管吸取上清，将上清液与果渣粗提取液合并，即为花青素的粗提物；
（3）花青素粗提物纯化：将步骤（2）中花青素粗提物按一定速度加入到大孔树脂DM130中，待吸附完全后，先用酸水洗涤树脂除杂，再用酸乙醇进行洗脱，得到纯度更高的洗脱液；
（4）高纯度花青素粉末的获得：将花青素洗脱液盛装于容器中，将用酒精冲洗过的进料吸管放置于其中固定好。将洗脱液经过喷雾干燥机吸入后喷雾干燥，得到粉末，刮出称量，收集花青素粉末，避光包装后置于阴凉处保存。
进一步，步骤（1）所述的紫番茄和龙葵果为新采摘鲜果或低温贮藏并解冻的果实。
进一步，步骤（2）中的酸水提取液是pH=1的盐酸水溶液提取液；提取时料液比为1:3，即1kg果实鲜重对应3L pH=1的酸水。
进一步，步骤（2）过滤用的纱布为200目；超声提取条件为温度20-25℃，超声功率500-700W，超声时间每次30min，分三次提取。
进一步，步骤（2）所述的果实匀浆后的果汁需用盐酸调节pH=1，后需静置过夜。
进一步，步骤（3）所述的大孔树脂为DM-130大孔吸附树脂；所述加入粗提取物的速度为0.5-2倍柱体积/h；完全吸附后占树脂体积的1/2-2/3。
进一步，步骤（3）所述的洗涤树脂除杂的酸水为pH=1的盐酸水溶液，直至洗涤液澄清不浑浊为止；所述洗脱时用的酸乙醇为pH=1的95%乙醇溶液；洗脱速度为1-3倍柱体积/h，洗脱至液体基本无紫红色为止。
进一步，步骤（4）所述的利用喷雾干燥机浓缩干燥，乙醇为溶剂时调节喷雾干燥机进风温度为110-120oc，出风温度在60-70oc之间；所述保存方式为置于棕色瓶子或锡纸包装后于阴凉避光处保存。
本发明有益技术效果体现在以下几个方面：
（1）能够利用紫番茄和龙葵果实作为原料，丰富了花青素提取的植物来源，同时避免了化学合成色素的毒害作用。
（2）本发明方法得到的紫番茄和龙葵花青素纯度高，得率高，杂质少，紫番茄提取的花青素纯度高达54%，得率占鲜重0.48%，而龙葵花青素纯度更是高达56%，得率也高达鲜重的1.3%，弥补了国内市场花青素提取物纯度维持在5%-24%的缺陷，极大缓解了国内市场对于高纯度花青素的需求。
（3）大孔吸附树脂DM-130活化方便，且可重复利用，适合大型生产。
（4）酸水提取液，价格低廉，容易获得，洗脱溶剂乙醇可回收重复利用，节省资源，降低成本，同时提取过程中无有毒有害有机溶剂使用，实现了生产过程的无污染。快速的喷雾干燥使得提取的花青素能维持稳定不变性，最大程度保留有效活性成分，该工艺设配及操作过程简单安全，适于大规模工业化生产。
附图说明
图1为实施例1花青素提取物的紫外分光光度计检测图谱；
图2为实施例1花青素提取物的高效液相色谱（HPLC）检测图谱；
图3a为实施例1中花青素峰1 Cyanidin-3-rutinoside-5-glucoside的质谱图谱；
图3b为实施例1中花青素峰1 Cyanidin-3-rutinoside-5-glucoside的二级质谱图谱；
图3c为实施例1中花青素 Delphinidin-3-(cis-coumaroyl)-rutinoside-5-glucoside和
花青素Delphinidin-3-(trans-coumaroyl)-rutinoside-5-glucoside的质谱图谱；
图3d为实施例1中花青素峰4 Petunidin-3-(trans-coumaroyl)-rutinoside-5-glucoside的质谱图谱；
图3e为实施例1中花青素峰5 Petunidin-3-(cis-coumaroyl)-rutinoside-5-glucoside的质谱图谱；
图3f为实施例1中花青素峰6 Petunidin-3-(feruloyl)-rutinoside-5-glucoside的质谱图；
图4为实施例2花青素提取物的紫外分光光度计检测图谱；
图5为实施例2花青素提取物的高效液相色谱（HPLC）检测图谱。
具体实施方式
下面提供的本发明的具体实施方式，可以更好地理解本发明，但本发明实施不局限于以下实施方式，在不脱离本发明原理的前提下可以对本发明做出若干改进，但是这些改进也应视为本发明的保护范围。
实施例1
本实施例的一种高纯度紫番茄花青素的提取方法，其包括下列步骤：
（1）原料的预处理：将低温贮藏并解冻的紫番茄果，去掉叶柄并洗净，称重2.2kg，然后后切块并用榨汁机匀浆。
（2）酸水提取：先按1:3（2.2kg番茄鲜重对应6.6L pH=1的盐酸水）的比例配制pH=1的盐酸水溶液提取液，再将步骤（1）中的紫番茄榨汁后的果渣用配制好的酸水进行超声提取，超声温度20-25℃，超声功率500-700W，超声3次，时间每次30min，三次之后用200目纱布过滤，得果渣粗提取液；同时将步骤（1）中紫番茄匀浆后的果汁用的盐酸调节pH=1，静置过夜提取后再用200目纱布过滤，将其滤液与果渣粗提取液合并，即为花青素的粗提物，体积约6L。
（3）粗提物纯化：将步骤（2）中花青素粗提物按0.5-2倍柱体积/h的速度加入到约3.5L的DM130大孔树脂中，待完全吸附约占树脂总体积的1/2-2/3后，先用 pH=1酸水洗涤吸附后的树脂，以除去未被吸附的杂质，待洗下的液体澄清不浑浊时停止洗涤，再用 pH=1的95%乙醇进行洗脱，洗脱速度为1-3倍柱体积/h，直至洗脱下的液体基本没有紫红色为止，得到7L纯度更高的花青素洗脱液。
（4）高纯度花青素粉末的获得：将上述花青素洗脱液盛装于容器中，将用酒精冲洗过的进料吸管放置于容器中固定好，接着打开喷雾干燥机，调节喷雾干燥机进风温度为110-120，出风温度在60-70之间，将洗脱液吸入后喷雾干燥，得到粉末，刮出称量，收集花青素粉末10.6g，置于棕色瓶子或锡纸包装后于阴凉避光处保存。
提取物中花青素纯度计算：先将花青素标准品（Petunidin-3-(cis-coumaroyl)-rutinoside-5-glucoside）溶解于pH=1的0.2mol/l的kcl中，将其配制一定浓度后进行梯度稀释，检测不同浓度梯度在200-700nm处测最大吸光度，得到浓度与吸光度回归直线方程为y = 6.625x ，R2 = 0.9996，再将实例1中的紫番茄花青素提取物也溶解于pH=1的0.2mol/l的kcl中配制成浓度为0.2129mg/ml的溶液,测得实施例1中的紫番茄提取物在200-700nm处最大吸光度如图1所示为0.762，利用上述方程得到紫番茄提取物中的花青素浓度为0.115mg/ml,再通过如下计算得到番茄花青素提取物纯度为（0.115mg/ml）/（0.2129mg/ml）*100%=54%。
利用液相色谱对提取物进行分离，得到6种花青素类物质，如图2所示。最后再利用HPLC-DAD-ESI-MS/MS 联用技术，鉴定出上述6种花青素的质谱图，如图3a、3b、3c、3d、3e、3f所示。鉴定出上述6种花青素的分子式及分子量，最终得到了6种花青素名称，如表1所示。
表1 质谱鉴定实例1中紫番茄花青素提取物中的6种花青素名称及分子量
实施例2
本实施例的一种高纯度龙葵花青素的提取方法，其包括下列步骤：
（1）原料的预处理：将低温贮藏并解冻的的龙葵鲜果，去掉叶柄并洗净，称重后为950g，用榨汁机榨汁，分离开果汁和果渣。
（2）酸水提取：先按1:3（0.95kg番茄鲜重对应2.85L pH=1的盐酸水）的比例配制pH=1的盐酸水溶液提取液，再将步骤（1）中的紫番茄榨汁后的果渣用配制好的酸水进行超声提取，超声温度20-25℃，超声功率500-700W，超声3次，时间每次30min，三次之后用200目纱布过滤，得果渣粗提取液；同时将步骤（1）中紫番茄匀浆后的果汁用的盐酸调节pH=1，静置过夜提取后再用200目纱布过滤，将其滤液与果渣粗提取液合并，即为花青素的粗提物，体积约4L。
（3）粗提物纯化：将步骤（2）中花青素粗提物按0.5-2倍柱体积/h的速度加入到约2L的DM130大孔树脂中，待完全吸附约占树脂总体积的1/2-2/3后，先用 pH=1酸水洗涤吸附后的树脂，以除去未被吸附的杂质，待洗下的液体澄清不浑浊时停止洗涤，再用 pH=1的95%乙醇进行洗脱，洗脱速度为1-3倍柱体积/h，直至洗脱下的液体基本没有紫红色为止，得到6L纯度更高的龙葵花青素洗脱液。
（4）高纯度花青素粉末的获得：将上述花青素洗脱液盛装于容器中，将用酒精冲洗过的进料吸管放置于容器中固定好，接着打开喷雾干燥机，调节喷雾干燥机进风温度为110-120，出风温度在60-70之间，将洗脱液吸入后喷雾干燥，得到粉末，刮出称量粉末为12.42g，收集花青素粉末，置于棕色瓶子或锡纸包装后于阴凉避光处保存。
提取物中花青素纯度计算：先将花青素标准品（Petunidin-3-(cis-coumaroyl)-rutinoside-5-glucoside）溶解于pH=1的0.2mol/l的kcl中，将其配制一定浓度后进行梯度稀释，检测不同浓度梯度在200-700nm处测最大吸光度，得到浓度与吸光度回归直线方程为y = 6.625x ，R2 = 0.9996，再将实例2中的龙葵花青素提取物也溶解于pH=1的0.2mol/l的kcl中配制成浓度为0.2378mg/ml的溶液,测得实施例2中的龙葵提取物在200-700nm处最大吸光度如图4所示为0.883，利用上述方程得到龙葵提取物中的花青素浓度为0.1332mg/ml,再通过如下计算得到番茄花青素提取物纯度为（0.1332mg/ml）/（0.2378mg/ml）*100%=56%。再利用液相色谱对提取物进行分离，得到6种花青素类物质，如图5所示。
本发明在实际应用中，紫番茄提取的花青素纯度高达54%，得率占鲜重0.48%，而龙葵花青素纯度更是高达56%，得率也高达鲜重的1.3%，弥补了国内市场花青素提取物纯度维持在5%-24%的缺陷，极大缓解了国内市场对于高纯度花青素的需求。
尽管上文对本发明的具体实施方式给予了详细描述和说明，但是应该指明的是，我们可以依据本发明的构想对上述实施方式进行各种等效改变和修改，其所产生的功能作用仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种高纯度花青素的提取方法，其特征在于，按照以下操作步骤进行：
（1）原料的预处理：将紫番茄，去掉叶柄并洗净，称重后用匀浆机匀浆；
（2）酸水提取：先按一定比例配置酸水提取液，再将步骤（1）中的紫番茄匀浆后的果渣用配制好的酸水进行超声提取，之后用纱布过滤，得果渣粗提取液；同时将步骤（1）中果实匀浆后的果汁调节pH后静置一段时间，然后通过虹吸管吸取上清，将上清液与果渣粗提取液合并，即为花青素的粗提物；
（3）花青素粗提物纯化：将步骤（2）中花青素粗提物按一定速度加入到大孔树脂DM130中，待吸附完全后，先用酸水洗涤树脂除杂，再用酸乙醇进行洗脱，得到纯度更高的洗脱液；
（4）高纯度花青素粉末的获得：将花青素洗脱液盛装于容器中，将用酒精冲洗过的进料吸管放置于其中固定好；将洗脱液经过喷雾干燥机吸入后喷雾干燥，得到粉末，刮出称量，收集花青素粉末，避光包装后置于阴凉处保存；
所述步骤（3）所述的大孔树脂为DM-130大孔吸附树脂；所述加入粗提取物的速度为0.5-2倍柱体积/h；完全吸附后占树脂体积的1/2-2/3；
所述步骤（3）所述的洗涤树脂除杂的酸水为pH=1的盐酸水溶液，直至洗涤液澄清不浑浊为止；所述洗脱时用的酸乙醇为pH=1的95%乙醇溶液；洗脱速度为1-3倍柱体积/h，洗脱至液体基本无紫红色为止。
2.根据权利要求1所述的高纯度花青素的提取方法，其特征在于，步骤（1）所述的紫番茄为新采摘鲜果或低温贮藏并解冻的果实。
3.根据权利要求1所述的高纯度花青素提取方法，其特征在于，步骤（2）中的酸水提取液是pH=1的盐酸水溶液提取液；提取时料液比为1:3，即1kg果实鲜重对应3L pH=1的酸水。
4.根据权利要求1或3所述的高纯度花青素提取方法，其特征在于，步骤（2）过滤用的纱布为200目；超声提取条件为温度20-25℃，超声功率500-700W，超声时间每次30min，分三次提取。
5.根据权利要求1所述的高纯度花青素提取方法，其特征在于，步骤（2）所述的果实匀浆后的果汁需用盐酸调节pH=1，后需静置过夜。
6.根据权利要求1所述的高纯度花青素提取方法，其特征在于，步骤（4）所述的利用喷雾干燥机浓缩干燥，乙醇为溶剂时调节喷雾干燥机进风温度为110-120℃，出风温度在60-70℃之间；所述保存方式为置于棕色瓶子或锡纸包装后于阴凉避光处保存。
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