CN1054131C

CN1054131C - 双水相萃取法提取红霉素的方法

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Publication number: CN1054131C
Application number: CN98104898A
Authority: CN
Inventors: 朱自强; 李勉; 王轶雄; 关怡新; 姚善泾
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 1998-04-08
Filing date: 1998-04-08
Publication date: 2000-07-05
Anticipated expiration: 2018-04-08
Also published as: CN1195028A

Abstract

本发明公开了一种双水相萃取法提取红霉毒的方法。它是向红霉素发酵液中加入一定量的环氧乙烷-环氧丙烷无规共聚物(EOPO)及K₂HPO₄·3H₂O晶体，充分搅拌至溶解，静置或离心分相，形成双水相系统。取出上相，加入一定量醋酸丁酯，将EOPO相中的红霉素萃取至酯相，然后通过成盐，转碱，得到红霉素成品。本发明分相迅速，过程集中，溶剂节省，方法简单，易于掌握，不受环境影响，见效快。

Description

双水相萃取法提取红霉素的方法

本发明涉及抗生素的提取方法，尤其涉及双水相萃取法(ATPE)提取红霉素的方法。

双水相就是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐类溶于同一溶液，由于聚合物溶液间或聚合物与无机盐溶液间具有不相容性，使得当聚合物或无机盐的浓度达到一定值以上时，就会分成互不相溶的两相系统，由于其共同溶剂是水，就称此系统为双水相系统。一般认为憎水性差异是产生相分离的主要推动力。由于聚合物分子的空间位阻作用，相互间无法渗透，具有强烈的相分离倾向，混合时浓度达到一定时，就不能形成单相溶液。常见的用于生物物质分离的聚合物/聚合物系统，有聚乙二醇(PEG)/葡聚糖，聚合物/无机盐系统有PEG/磷酸盐，PEG/硫酸铵等。过去应用价格高昂的葡聚糖大大限制了ATPE技术的工业规模化的进程。

在相当长的时间内，总以为双水相萃取法(ATPE)只能用于生物大分子的分离，并认为生物小分子物质在双水相系统(ATPS)中应趋于均匀分配。然而，自九十年代以来，国际上的研究结果和我们实验室的工作表明，用ATPE技术提取生物小分子，如氨基酸等也可取得较理想的效果。将ATPE技术提取生物小分子是一个崭新的、有着应用前景的领域，在一定程度上代表了ATPE技术的一种新发展趋势。

自五十年代发现红霉素以来，经过几十年的发展，红霉素的生产已经走上了规模化的道路。目前主要的分离工艺有溶媒萃取法、离子交换法及大孔树脂吸附法等。国内普遍采用的为溶媒萃取法，溶媒萃取法又有溶媒反复萃取、溶媒萃取结合中间盐沉淀以及薄膜浓缩结合溶媒萃取三条途径。以上工艺中，以乳酸盐沉淀法得到的成品质量最好，收率也较高，国内平均收率在72％左右，国外在80％左右。

在实际生产中，以上的提取工艺中都有一定的局限性。

用溶媒萃取和乳酸盐中间盐转移法存在以下问题：

1.成本高，溶媒消耗量大，约为8kg/十亿单位。大孔树脂吸附法的溶媒消耗有所降低，但仍需3～4kg/十亿单位。由于国内工艺成本高，难以与国际市场上同类产品竞争，1990年开始有相当数量的红霉素进口，冲击了国内市场。

2.醋酸丁酯不仅价格贵，而且易燃、易爆，车间要求严格，劳保费用高。同时溶媒回收耗能大，废液处理量大。

3.由于发酵液中蛋白质含量高，萃取过程易发生乳化现象，因此需要高速离心萃取机，投资大、设备的运行、维修保养要求高、操作能耗大。

离子交换法由于发酵液中存在大量无机盐离子而影响吸附率，并且树脂在每次吸附后都需用酸碱处理，使之活化。

大孔树脂吸附法中洗脱剂一般为醋酸丁酯，由于其与水互不相溶，不利于吸附操作和吸附剂的再生。

上述几种提取方法中，有一个共同的程序是，都必须对发酵液进行预处理，以除去蛋白质、菌丝体等杂质，减少后续操作的乳化现象。预处理步骤分为加盐、调pH和板框过滤等。对板框过滤，需选用适合的有机絮凝剂，过滤时要加助滤剂，并且板框过滤操作劳动强度大、周期长。这些步骤既费时、又费力、占用场地也较大，是整个工艺中较为薄弱的环节之一。

本发明的目的是提供一种方法简单、易于掌握、不受环境影响、见效快的双水相萃取法提取红霉素的方法。

为了达到上述目的本发明采取下列措施，它的步骤如下：

a.双水相萃取

取1500ml红霉素发酵液，发酵液浓度为3000～10000u/ml，加入分子量为1000～8000环氧乙烷—环氧丙烷无规共聚物130～190ml，K₂HPO₄·3H₂O晶体300～420g，搅拌至溶解，室温下静置0.1～24小时以上，至分相彻底，红霉素进入上相中；

b.醋酸丁酯反萃

取上相250～370ml，加入31～310ml醋酸丁酯，用5～15％的NaOH调节pH为9.0～11.0，系统升温至20～50℃，静止3～27小时分相或离心分相，红霉素进入上相中；

c.成盐

取酯相155ml，加入总体积0.8％～4％的NaCl于30～60℃水浴搅拌30分钟，降至室温，静置1.5～4.5小时，吸去水层，过滤除不溶性杂质；在搅拌下，缓缓加入预先稀释在醋酸丁酯中的20％乳酸稀释液，加入量按乳酸∶红霉素＝1∶(4～6)w/w计算，加完时pH应为5～7，继续搅拌20分钟以上，过滤，待完全滤完后，再用新鲜的醋酸丁酯洗涤1～3次，在35～55℃温度下干燥4～12小时，得红霉素乳酸盐；

d.将计量的蒸馏水，丙酮混合，搅拌下加入红霉素乳酸盐，其比例为乳酸盐(W)∶蒸馏水(V)∶丙酮(V)＝1∶(30～50)∶(3～5)，过滤后，滤液用5～15％Na₂CO₃溶液，调节pH至9～11搅拌10～50分钟，升温至40～70℃趁热抽滤，得红霉素碱湿品；湿品于30～60℃，500～750mmHg，真空干燥12～36小时，得成品。

本发明的优点：

①分相迅速

在实验中观察到，采用ATPE处理发酵液，约30分钟左右即可分相，且无乳化层，处理时间较传统预处理时间短，缩短了整个工艺周期。

②过程集成

双水相萃取既达到了预处理的目的，又浓缩了料液。表现为，大量的蛋白质、菌丝体在下相(富盐相)中沉淀下来，红霉素进入上相，上相体积较发酵液大为减少，浓缩倍数达到了4以上，充分体现了双水相技术适用于生物产品粗分离的特点。

同时，由下相经过离心分离后，得到蛋白质等副产品，可直接作为饲料，而传统预处理中，由于使用了ZnSO₄，沉淀下来的蛋白质用作饲料会产生Zn²⁺中毒现象，需进一步处理。

③节省溶媒

采用薄膜浓缩工艺，将预处理过的发酵液浓缩到原体积的1/2.5-1/3后，再用醋酸丁酯反萃，醋酸丁酯用量比溶媒法节省30％，本法的浓缩倍数达到了4以上，因此有理由相信，此工艺也可大大节省溶媒用量。

④方法简单，易于掌握，不受环境影响，见效快。

下面结合实施例作详细说明：

双水相萃取法提取红霉素的方法的步骤如下：

a.双水相萃取

取1500ml红霉素发酵液，发酵液浓度为3500～8500u/ml，加入分子量为1000～8000环氧乙烷—环氧丙烷无规共聚物155～170ml，K₂HPO₄·3H₂O晶体340～380g，搅拌至溶解，室温下静置0.5～6小时以上，至分相彻底，红霉素进入上相中；

b.醋酸丁酯反萃

取上相290～330ml，加入62～93ml醋酸丁酯，用8～12％的NaOH调节pH为9.5～10.5，系统升温至30～35℃，静止8～16小时分相或离心分相，红霉素进入上相中；

c.成盐

取酯相155ml，加入总体积1.5％～2.5％的NaCl于40～50℃水浴搅拌30分钟，降至室温，静置2.5～3.5小时，吸去水层，过滤除不溶性杂质；在搅拌下，缓缓加入预先稀释在醋酸丁酯中的20％乳酸稀释液，加入量按乳酸∶红霉素＝1∶(4.8～5.2)w/w计算，加完时pH应为5.5～6.5，继续搅拌20分钟以上，过滤，待完全滤完后，再用新鲜的醋酸丁酯洗涤1～3次，在40～50℃温度下干燥5～7小时，得红霉素乳酸盐；

d将计量的蒸馏水，丙酮混合，搅拌下加入红霉素乳酸盐，其比例为乳酸盐(W)∶蒸馏水(V)∶丙酮(V)＝1∶(35～45)∶(3.5～4.5)，过滤后，滤液用8～12％Na₂CO₃溶液，调节pH至9.5～10.5搅拌25～35分钟，升温至50～60℃，趁热抽滤，得红霉素碱湿品；湿品于40～50℃，670～730mmHg，真空干燥20～28小时，得成品。

本发明的基础在于发现红霉素在EOPO/K₂HP0₄系统中分配的极大不对称性

表1给出了红霉素在EOPO(1∶1)(4200)/K₂HPO₄ATPS的分配数据。红霉素是强憎水性物质，根据相似相溶原则，红霉素对EOPO具有某种亲和性，使红霉素能较易溶解在富含EOPO的上相中。而红霉素发酵液中的杂质，如还原糖分配在下相，几乎不影响红霉素的分配和回收杂蛋白的分配系数在2-5左右，红霉素对杂蛋白的分离因子约在10以上。红霉素的萃取率在77.82-96.17％之间，收率在64.40-87.63％之间。

表3.1红霉素纯品在EOPO(1∶1)(4200)/K₂HP0₄双水相系统中的分配序总组成上相组成下相组成 TLL 相体积萃取率收率号％wt ％wt ％wt ％wt 上相下相相比 K G ％％

EOPO 盐 EOPO 盐 EOPO 盐 ml ml1 13.50 6.00 30.56 1.71 1.03 9.11 30.44 4.00 5.30 0.75 4.65 3.49 77.82 64.402 14.52 7.00 33.00 1.48 0.53 11.12 33.87 4.00 5.20 0.77 6.56 0.51 83.46 66 763 15.49 7.99 40.37 1.08 0.28 12.53 41.69 4.00 5.20 0.77 10.30 7.93 88.85 76.74 16.51 8.99 43.41 0.86 0.21 14.45 45.29 3.60 5.60 0.64 39.10 25.05 96.17 87.63

表中：

TLL = \sqrt{{(W_{t, 1} - W_{b, 1})}^{2} + {(W_{t, 2} - W_{b, 2})}^{2}}

相比： R＝V_t/V_b

分配系数：K＝C_t/C_b

分配率G： G＝K(V_t/V_b)

萃取率： n＝m_t/m_t+m_b＝RK/(1+RK)

收率： Y_t＝m_t/m_total式中：V_t，V_b-上相，下相的体积；C_t，C_b-红霉素在上，下相中的浓度；

M_t，M_b-红霉素在上，下相中的质量；M_total-系统中红霉素的总量。

实施例：

双水相萃取法提取红霉素的方法的步骤如下：

a.双水相萃取

取1500ml红霉素发酵液，发酵液浓度为3921u/ml，加入分子量为1000～8000环氧乙烷—环氧丙烷无规共聚物162ml，K₂HPO₄·3H₂O晶体360g，搅拌至溶解，室温下静置2小时以上，至分相彻底，红霉素进入上相中；

b.醋酸丁酯反萃

取上相310ml，加入70ml醋酸丁酯，用10％的NaOH调节pH为10，系统升温至32℃，静止12小时分相或离心分相，红霉素进入上相中；

c.成盐

取酯相155ml，加入总体积1.5％～2.5％的NaCl于45℃水浴搅拌30分钟，降至室温，静置2.5～3.5小时，吸去水层，过滤除不溶性杂质；在搅拌下，缓缓加入预先稀释在醋酸丁酯中的20％乳酸稀释液，加入量按乳酸∶红霉素＝1∶5w/w计算，加完时pH应为6.0，继续搅拌20分钟以上，过滤，待完全滤完后，再用新鲜的醋酸丁酯洗涤1～3次，在45℃温度下干燥6小时，得红霉素乳酸盐；

d.将计量的蒸馏水，丙酮混合，搅拌下加入红霉素乳酸盐，其比例为乳酸盐(W)∶蒸馏水(V)∶丙酮(V)＝1∶40∶4，过滤后，滤液用10％Na₂CO₃溶液，调节pH至10.0，搅拌30分钟，升温至55℃趁热抽滤，得红霉素碱湿品；湿品于45℃，700mmHg，真空干燥24小时，得成品。生物效价920u/mg，总收率71.2％。

Claims

1.一种双水相萃取法提取红霉素的方法，其特征在于它的步骤如下：

a.双水相萃取

取1500ml红霉素发酵液，发酵液浓度为3000～10000u/ml，加入分子量为1000～8000的环氧乙烷—环氧丙烷无规共聚物130～190ml，K₂HPO₄·3H₂O晶体300～420g，搅拌至溶解，室温下静置0.1～24小时以上，至分相彻底，红霉素进入上相中；

b.醋酸丁酯反萃

c.成盐

取酯相155ml，加入总体积0.8％～4％的NaCl于30～60℃水浴搅拌30分钟，降至室温，静置1.5～4.5小时，吸去水层，过滤除不溶性杂质；在搅拌下，缓缓加入预先稀释在醋酸丁酯中的20％乳酸稀释液，加入量按乳酸∶红霉素＝1∶4～6w/w计算，加完时pH应为5～7，继续搅拌20分钟以上，过滤，待完全滤完后，再用新鲜的醋酸丁酯洗涤1～3次，在35～55℃温度下干燥4～12小时，得红霉素乳酸盐；

d.将计量的蒸馏水，丙酮混合，搅拌下加入红霉素乳酸盐，其比例为乳酸盐(W)∶蒸馏水(V)∶丙酮(V)＝1∶30～50∶3～5，过滤后，滤液用5～15％Na₂CO₃溶液，调节pH至9～11，搅拌10～50分钟，升温至40～70℃趁热抽滤，得红霉素碱湿品；湿品于30～60℃，500～750mmHg，真空干燥12～36小时，得成品。

2.根据权利要求1所述的一种双水相萃取法提取红霉素的方法，其特征在于它的步骤如下

a.双水相萃取

b.醋酸丁酯反萃

c成盐

取酯相155ml，加入总体积1.5％～2.5％的NaCl于40～50℃水浴搅拌30分钟，降至室温，静置2.5～3.5小时，吸去水层，过滤除不溶性杂质；在搅拌下，缓缓加入预先稀释在醋酸丁酯中的20％乳酸稀释液，加入量按乳酸∶红霉素＝1∶4.8～5.2w/w计算，加完时pH应为5.5～6.5，继续搅拌20分钟以上过滤，待完全滤完后，再用新鲜的醋酸丁酯洗涤1～3次，在40～50℃温度下干燥5～7小时，得红霉素乳酸盐；

d.将计量的蒸馏水，丙酮混合，搅拌下加入红霉素乳酸盐，其比例为乳酸盐(W)∶蒸馏水(V)∶丙酮(V)＝1∶35～45∶3.5～4.5，过滤后，滤液用8～12％Na₂CO₃溶液，调节pH至9.5～10.5，搅拌25～35分钟，升温至50～60℃趁热抽滤，得红霉素碱湿品；湿品于40～50℃，670～730mmHg，真空干燥20～28小时，得成品。

3.根据权利要求1或2所述的一种双水相萃取法提取红霉素的方法，其特征在于它的步骤如下：

a.双水相萃取

b.醋酸丁酯反萃

取上相310ml，加入70ml醋酸丁酯，用10％的NaOH调节pH为10，系统升温至32℃，静止12小时分相或离心分相，红霉素进入上相中，

c.成盐

d.将计量的蒸馏水，丙酮混合，搅拌下加入红霉素乳酸盐，其比例为乳酸盐(W)∶蒸馏水(V)∶丙酮(V)＝1∶40∶4，过滤后，滤液用10％Na₂CO₃溶液，调节pH至10.0，搅拌30分钟，升温至55℃趁热抽滤，得红霉素碱湿品；湿品于45℃，700mmHg，真空干燥24小时，得成品。