CN1048561A - 一种双水相系统提纯酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种用双水相系统提纯酶特别是荧光 素酶的方法。用一种分子量或两种分子量混合的聚 乙二醇和有机酸盐或无机酸盐组成的双水相系统，通 过改变溶液的pH值和改变盐的种类和浓度的方法 提高相分配系数，直接从细胞破碎物中在室温下提取 纯度较高的医药用酶，试剂用酶等。

Description

本发明涉及一种酶的纯化方法，更具体的说是一种用水溶性聚合物和盐组成的双水相系统直接从细胞破碎物中提取酶的方法。

随着酶制剂在医药和其它领域的广泛应用，需要大量纯度高的酶制剂。1977年西德的M.R.Kula等人的西德专利2616584号公开了用聚乙二醇（PEG），葡聚糖，水组成的双水相系统分离纯化了克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella  pneumoniae）产生的异淀粉酶和大肠杆菌产生的氨基酰tRNA合成酶，该方法由于使用的葡聚糖价格贵，实际应用受到限制。用聚乙二醇和水组成的双水相系统成本较低，已用于一些酶的纯化，如H.Hustedt等人报道（Precess  Biochemistry  Ot  129-137，1988）利用PEG/盐双水相系统分离纯化的酶主要有延胡索酸酶，天冬氨酸酶，青霉素酰化酶，苹果酸脱氢酶和甲酸脱氢酶等，所使用的均匀为单一分子量的PEG，对相系统的pH值未加以控制，因此提纯倍数较低。林哲甫等人在中国专利86103207号中公开了“用高聚物盐和水两相系统纯化酶制剂”的方法。该方法亦是使用单一分子量的PEG对系统pH未加控制，且是从工业酶制剂中提取α-淀粉酶，因此在应用上受到一定限制。

本发明的目的在于提供一种设备简单，成本低廉，直接从细胞破碎物中分离纯化纯度较高的酶制剂，如试剂用酶，医药用酶的方法。该方法的步骤包括，用化学或机械的方法将发酵得到的细胞破碎，与水溶性的聚合物聚乙二醇和盐溶液混合，经低速离心进行相分离，除去细胞破碎物沉淀再加入PEG和盐溶液，反复进行相分离4-6次，最后一次相分离用改变盐种类浓度及pH值的方法使酶存在于下相水溶液中，浓缩得到酶制剂。本方法的特征在于用一种或两种混合的PEG和有机酸盐或无机酸盐组成双水相系统，通过改变pH值和盐的种类浓度等方法提高相分配系数，在室温下直接从细胞破碎物中提取酶。

在本发明的一个实施方案中，用机械法或化学法将荧光细菌发酵得到的含荧光素酶的细胞破碎，与PEG和盐溶液混合，可使用分子量在300-2000和4000-6000的两种单一分子量的PEG的混合物按30-60%的比例混合，系统中PEG的总浓度为8-25%，最适浓度为12-18%。混合方式可采用一次混合，也可采用第一次用较低分子量的PEG，经1-2次相系统改变后再按比例加入分子量较高的单一分子量PEG，形成混合的PEG与盐的系统。系统中的盐为水溶性高的无机酸盐或有机酸盐，如硫酸盐，磷酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐等，所用的阳离子可以是Na⁺K⁺，NH⁺ ₄，Mg²⁺，Zn²⁺。盐的种类和浓度会影响酶和杂蛋白在两相中的分配系数，所用的盐浓度为7-25%，最适浓度为10-18%。经充分混合后，室温下低速离心（1000-4000g 5分钟）进行相分离，酶存在于PEG上相中，用分液漏斗将下相除去。PEG上相再加入50%浓度pH3-8的盐溶液和充分混合后再次如上述方法进行相分离，共进行4-6次相分离，最后一次相分离用改变盐种类浓度和pH方法使酶从PEG相进入下相（水相），以便从上相中回收PEG，将含酶的下相，经浓缩直接制成干粉或直接用作医药用酶，试剂用酶。

荧光素酶的活性测定用J.W.Hashings等描述的化学还原黄素单核苷酸法（Methods in Enjymolosy Vol 57 1978）蛋白质含量用紫外分光光度计法测定（A₂₈₀）。

按上述方法提纯的荧光素酶，酶活可达2.5-5×10⁹mv/mg，酶分离纯化总收率为50-70%。纯化倍数为8-16倍。

本方法不仅可用于荧光素酶的提纯，亦可用于其它酶，如甲酸脱氢酶、醇脱氢酶等酶的提纯。

实施例1

取76ml发光细菌的细胞破碎物（湿细胞含量40%），与25.2ml浓度50%，pH8.5的磷酸钾溶液混合，加入分子量1000的PEG18克，混合离心上相移入烧杯，再加入13ml，50%，pH8.5的磷酸钾溶液，混合离心后取出上相约57ml，加入63ml蒸馏水和18.72克硫酸铵，溶解离心，取上相约58ml，与26ml蒸馏水，36ml50%pH8.5的磷酸钾溶液混合，离心后取上相，约55ml，加入29ml蒸馏水和36mlpH6.0，50%的磷酸钠溶液，离心后酶分布于下相中，取出下相，测定荧光素酶的活性，总收率为72%，纯化倍数14。

实施例2

取100ml发光细菌细胞破碎物（湿细胞含量40%），加入分子量为2000的PEG18.63克，搅拌溶解后加入12.42克硫酸铵，溶解离心，取出上清液，再加入6.21克硫酸铵，搅拌溶解后离心分相，取出上相约51ml，加入33ml蒸馏水和36ml50%PH8.5的磷酸钾溶液，混合分相，取上相约44ml，加入74ml蒸馏水和18.72克硫酸铵，溶解分相，取出上相约48ml，与22ml蒸馏水和30mlpH8.5，50%的磷酸钾溶液混合，分相，取上相约41ml，与23ml蒸馏水及27mlpH4.0，50%磷酸钠溶液混合，分出下相，测定酶活和蛋白质，总收率75%纯化倍数为16.7倍。

实施例3

取100ml发光细菌细胞破碎物（含湿细胞30%）加入12.3克分子量为1000的PEG和6.3克分子量为6000的PEG，搅拌溶解后加入13.6克硫酸铵，溶解离心，取上清加入7.45克硫酸铵，溶解分相，取上相43ml，与77ml蒸馏水混合，加入25.23克硫酸铵，溶解分相，取上相约36ml，与30ml蒸馏水和34mlpH5.0，50%的磷酸钠溶液混合，离心分相，得下相69.5ml，测定酶活和蛋白质含量。总收率为69%，纯化倍数为15倍。

实施例4

取100ml发光细菌细胞破碎物（含湿细胞40%）加入分子量为1600的PEG15克，溶解后加入13.6克硫酸铵，搅拌溶解离心，取上清液92ml左右，加入7.45克硫酸铵，溶解分相，取上相约43ml，加41ml蒸馏水和36mlpH8.0，50%磷酸钾溶液，混合，分相，得上相约43ml，再加入77ml蒸馏水和分子量为4000的PEG6.33克，搅拌溶解，再加入25.23克硫酸铵，继续搅拌，离心分相，取上相约34ml，与36ml蒸馏水及30mlpH8.0，50%磷酸钾溶液混合，离心后取下相69.5ml，测定荧光素酶活性和蛋白质含量。酶的总收率为70%，纯化13倍。

实施例5

取100ml发光细菌细胞破碎物（湿细胞含量30%）与19.25克分子量为1600的PEG混合，搅拌溶解，加入13.66克硫酸铵，溶解分相，得上相约48ml，与72ml蒸馏水，18.72克硫酸铵混合，分相，取上相，加30ml蒸馏水，9.63克分子量为6000的PEG，溶解后加入22.46克硫酸铵，溶解分相，将上相约62ml，再加入48ml蒸馏水及9.17克硫酸铵，搅拌溶解分出下相，测定荧光素酶活性和蛋白质含量，总收率为65%，纯化倍数为13。

实施例6

用于其他酶

按实施例4从酵母细胞破碎物（湿细胞含量50%）中提取甲酸脱氢酶，其总收率为71%，纯化21倍。

Claims (7)

1、一种纯化酶，特别是荧光素酶的方法，该法包括用机械或化学的方法将发酵得到的细胞破碎，与水溶性聚合物聚乙二醇(PEG)和盐溶液混合，低速离心进行相分离，除去细胞破碎物沉淀再加入PEG和盐溶液，反复进行相反离4-6次，最后一次相分离用改变盐种类，盐浓度和pH值的方法使酶存在于下相水溶液中，经浓缩得到酶制剂，该方法的特征在于：

a、用一种分子量或两种分子量混合的水溶性聚合物和有机酸盐或无机酸盐组成的双水相系统，

b、通过改变pH值提高相分配系数，

c、通过改变盐的种类和浓度提高相分配系数，

d、于室温下直接从细胞破碎物中提取酶。

2、根据权利要求1的方法其特征在于双水相系统中所用的水溶性聚合物PEG可以用单一分子量的，分子量在300-2000范围内，也可以用分子量范围分别在300-2000和4000-6000的两种单一分子量的PEG的混合物。

3、根据权利要求1或2的方法，其特征在于使用两种分子量的PEG混合物时，其混合的比例分别为30-60%，混合方式可以一次混合，也可以先使用分子量较低的单一分子量的PEG，经1-2次相分离后，再加入30-60%的分子量较高的（4000-6000），形成混合的PEG一盐系统。系统中PEG总浓度为8-25%，最适浓度为12-18%。

4、根据权利要求1的方法，其特征在于所使用的盐为水溶性高的无机酸盐或有机酸盐，特别是多元酸形成的盐，如硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐，琥珀酸盐等，阳离子可以是Na⁺，K⁺，NH⁺ ₄，Mg²⁺，Zn²⁺，使用的盐浓度为7-25%，最适浓度为10-18%。

5、根据权利要求1的方法，其特征在于全部分离纯化可在室温进行。

6、根据权利要求1的方法，其特征在于本方法经4-6次连续相组成的改变，酶分离纯化的总收率为50-70%，纯化倍数为8-16倍，所得产品可用于试剂和医药。

7、根据权利要求1的方法，该方法可用于荧光素酶及其它一些酶的提取，如甲酸脱氢酶等。