CN1041824C - 从发酵液中提取l-赖氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从发酵液中提取L-赖氨酸的方法,它主要包括用有机或无机絮凝剂除去发酵液中的菌丝体及蛋白质和用草酸除去发酵液中的无机离子;用离子交换树脂进行L-赖氨酸的吸附及其解吸;用吸附剂对解吸液进行脱色,浓缩脱色液和使L-赖氨酸从浓缩液中结晶析出,其特征在于除草酸外,从发酵液中除去无机离子的作用剂还包括三聚磷酸钠,且所述的离子交换是交联度大于12%的树脂,所述的吸附剂是颗粒状活性炭。
Description
本发明涉及赖氨酸的提取方法,更具体地说,涉及从发酵液中提取L-赖氨酸的方法。
众所周知,赖氨酸是人和动物营养的八种必需氨基酸之一,将其作为食品添加剂,可以增加食品的营养价值,提高食物蛋白的利用率;而将其作为饲料添加剂,则可促进动物的生长;此外,赖氨酸还可用于医药上,将L-赖氨酸和其它氨基酸混合配制的复合氨基酸注射液具有营养好,无热原质及过敏物质,使用安全,保存期长等优点。因此,对于赖氨酸的生产,人们业已进行了大量的研究。
目前,赖氨酸大多以淀粉水解糖或糖蜜作为原料,利用细菌发酵产生,并采用离子交换法进行提取,通常以发酵液(不经过滤)直接上柱,经浓缩、脱色、两次结晶而获得成品。工艺流程长,收率较低(65-75%),且原材料消耗多,现有的提取工艺中所要消耗的盐酸,氨水,离子交换树脂等的费用一般要占总成本的50%(冯如星,“发酵科技通讯”13(2),P.99-102(1984),所以,采用合适的方法来提取赖氨酸以降低生产成本是很有必要的。
通常,一个完整的离子交换提取方法应包括下列五个步骤:
1.发酵液预处理;
2.离子交换树脂吸附L-赖氨酸;
3.选用一定的解吸剂洗脱所吸附的L-赖氨酸;
4.对洗脱液进行脱色处理;
5.浓缩脱色液并将其结晶。
发酵液预处理的目的是去除发酵液中所存在的菌丝体,培养基中残余的蛋白质和一些无机离子(如Ca2+,Mg2+等)。第6407号南非专利(1970)中Cameron,C.&Weiss,K.揭示了用非离子型高分子纤维素沉淀剂来分离菌丝体。严希康等人〔“微生物学通报”14(2),P.54-58(1987)〕揭示了用非离子型聚丙烯酰胺和阳离子聚丙烯酰胺来去除发酵液中的菌丝体和蛋白质,均取得了较好的效果。
目前,去除无机离子的方法一般是往发酵液中加入草酸,这样,钙离子和草酸反应可生成草酸钙沉淀。但由于草酸镁的溶解度较大,所以,这种方法不能有效地去除发酵液中的镁离子。
一般说来,经过预处理后的发酵液可直接进行离子交换吸附。目前,生产上一般采用交联度为7-8%的离子交换树脂来吸附赖氨酸,这种树脂对于赖氨酸有较高的吸附量,但其选择性不好,同时会吸附较多的色素,给赖氨酸的精制带来了困难。
此外,目前L-赖氨酸的脱色一般采用粉末状活性炭作为色素吸附剂。该方法是基于活性炭具有较大的比表面积,它可通过物理吸附作用而将色素等杂质吸附于表面上,滤去活性炭后,就可以获得经脱色的L-赖氨酸溶液。这种方法操作较简单,但本发明人通过研究发现采用粉末状活性炭进行脱色,会造成L-赖氨酸较大损失,而且粉末状活性炭的再生较困难,不能重复使用,使生产成本较高。且由于要采用板框压滤机才能除去粉末状活性炭,所以不能连续地进行生产。
L-赖氨酸提取工艺的最后一个步骤是将脱色后的L-赖氨酸结晶而得到成品。目前常用的结晶方法有两种:(1)往脱色后(或浓缩后)的L-赖氨酸盐酸盐溶液中加入一定量的乙醇,因为L-赖氨酸的盐酸盐不溶于乙醇,(Muradyan,A.G.,SU.891,643),结晶收率随乙醇加量的增加而增加,当乙醇加量是L-赖氨酸盐酸盐溶液的1倍时,结晶收率可达到90%以上,但随着乙醇加量的增加,则出现晶体纯度下降的问题,不能满足需要。另外,回收乙醇的过程需要增添一些设备而使难以在大规模生产中应用。(2)在水溶液中通过连续二次结晶来获取L-赖氨酸盐酸盐的产品,这种方法的具体过程是:将经脱色的L-赖氨酸盐酸盐浓缩至23Be°,然后将其pH调至4.9,在一定的温度下结晶约10小时,过滤分离出晶体;母液再浓缩至23Be°左右,再按上述过程再结晶一次,如此得到的结晶产品的纯度亦能符合要求。后者已在生产上广泛地被使用,但本发明人通过大量的研究,发现pH=4.9并不是结晶时的最佳pH,在该pH条件下结晶不能获得最大的结晶收率。
本发明的目的是提供一种从发酵液中提取L-赖氨酸的方法,采用该方法,可以高质量和高产量地获得所需的L-赖氨酸产品,并可使生产的成本降低。
本发明的目的是通过如下构思来完成的:一种从发酵液中提取L-赖氨酸的方法,包括用有机或无机絮凝剂去除发酵液中的菌丝体及蛋白质和用草酸除去发酵液中的无机离子,用离子交换树脂进行L-赖氨酸的吸附和解吸,用吸附剂对解吸液进行脱色,浓缩脱色液和使L-赖氨酸从浓缩液中结晶析出,其特征在于除草酸外,从发酵液中除去无机离子的作用剂还包括三聚磷酸钠;且所述的离子交换树脂是交链度大于12%的树脂,所述的吸附剂是颗粒状活性炭。
所述的有机絮凝剂是聚丙烯酰胺或壳聚糖,所述的无机絮凝剂是碱式氯化铝或CaCl2或Na2HPO4。所述草酸的加入量是O.05-0.2%(重量),较佳为0.08-0.12%(重量),所述三聚磷酸钠的加入量是0.1-0.3%(重量),较佳为0.12-0.22%(重量)。
所述的离子交换树脂的交联度较佳为14-16%。所述的颗粒状活性炭的粒径为10-70目,较佳为20-30目。
上述吸附剂还包括缩合型弱酸性离子交换树脂,且颗粒状活性炭和缩合型弱酸性离子交换树脂结合使用进行脱色。所述经浓缩的脱色液的浓度为20-30Be°,较佳为22-25Be°。并采用调节pH的方式使L-赖氨酸从浓缩液中结晶析出,所述的pH最佳为5.5。
本发明的优点和效果是明显的。由于在发酵的预处理中将草酸和三聚磷酸钠结合使用,它们分别与Ca2+和Mg2+(Ca2和Mg2+是L-赖氨酸发酵液中最主要影响离子交换的无机杂质离子)结合而生成难溶的草酸钙沉淀和可溶性的MgNa3P3O10络合物,而不会参与离子交换。过滤除去沉淀后,就可得到杂质量大大减少的发酵滤液,有利于随后的离子交换。另外,由于选用高交联度的离子交换树脂,这类树脂的选择性高于目前所使用的中等交联度的树脂,吸附的色素很少,使所洗脱的L-赖氨酸溶液的质量可以提高,大大有利于后继的脱色步骤,也有利于提高L-赖氨酸的成品质量。
此外,本发明采用颗粒状活性炭作为吸附剂,颗粒状活性炭可以装于交换柱中而进行脱色,这样,就可以使生产连续地进行,缩短了生产周期,而粉末状活性炭达不到这个要求,因为若将粉末状活性炭装填于柱中,流体阻力太大,操作无法进行,所以,采用粉末状活性炭作为吸附剂时,必须用板框压滤机除去活性炭,不能连续化生产。必要时,还可将缩合型弱酸性离子交换树脂与本发明的颗粒状活性炭串级进行脱色,而得到更好的脱色效果。
此外,本发明者通过大量研究发现,将浓缩后的L-赖氨酸溶液的pH调节至5.5左右使L-赖氨酸结晶,可以获得最大的L-赖氨酸结晶收率,比目前生产上所通用的pH=4.9的情况下所获得的L-赖氨酸的结晶收率提高1.5-2%左右,且所得到的L-赖氨酸的纯度可达到99%以上,使产品的质量得以提高,相对地,成本就降低了。
下面,将通过具体实例,进一步详细地描述本发明的优点和效果。实例1:发酵液的预处理
L-赖氨酸发酵中,含有相当数量的有机和无机杂质,有机杂质主要是菌丝体和蛋白质,无机杂质主要是Ca2+和Mg2+。这些杂质会影响离子交换的进行,所以,对发酵液进行预处理以尽可能除去杂质是十分必要的。
L-赖氨酸发酵液中的有机杂质一般是采用高分子絮凝剂来除去的,其中以采用聚丙烯酰胺絮凝剂的效果为好,以100ml L-赖氨酸发酵液中加入1.2-1.5ml 0.2%的聚丙烯酰胺絮凝剂的比例进行操作,在合适的pH(如pH=6.0)下,所得到的上清液吸光值较小(即杂质含量少),且絮凝物的量较多。
L-赖氨酸发酵液中的Ca2+可以通过加入草酸形成难溶的草酸钙沉淀而去除,而Mg2+则可通过加入三聚磷酸钠而形成三聚磷酸钠镁的络合物(邬行彦等编,《抗生素生产工艺学》,化学工业出版社,(1982))。草酸的加入量为0.05-0.2%(重量),较佳为0.08-0.12%(重量),三聚磷酸钠的加入量为0.1-0.3%(重量),较佳为0.12-0.22%(重量)。
一般说,可先用草酸和三聚磷酸钠去除发酵液中的Ca2+和Mg2+离子,然后将溶液的pH调节至6.0,加入聚丙烯酰胺絮凝剂,必要时,还可加入少许膨润土(它可提高絮凝剂对于蛋白质和菌丝体的絮凝效果),再加入少许硅藻土助滤,然后抽滤即可得到经预处理的L-赖氨酸发酵液。
实例2:对吸附L-赖氨酸的离子交换树脂的选择,吸附及洗脱过程
目前L-赖氨酸生产上所采用的离子交换树脂是交联度为7-8%的树脂,这类树脂对L-赖氨酸的吸附量较大,但同时,它也对色素具有较大的吸附能力,即对L-赖氨酸的吸附选择性不好,由此,给随后的L-赖氨酸脱色和精制带来了困难。
本发明者选择各种交联度的树脂进行了其对L-赖氨酸的吸附和洗脱的试验。首先将一定量(如10ml)的离子交换树脂抽干并装填入一定规格(如10×100mm)的离子交换柱中,然后将pH调节至2.0的经预处理的发酵液通入,通入的空间速度s.v.为1/20min-1左右,至吸附饱和(用731型分光光度计检测),然后用过量的7%NH4OH洗脱,s.v.=1/40min-1。采用下式(Ⅰ)和(Ⅱ)分别计算各种树脂对于L-赖氨酸的动态总交换容量及解吸(洗脱)百分率: 其中:Q=总交换容量(mg/ml树脂)
C1=L-赖氨酸发酵液的初始浓度(mg/ml)
C2=残液浓度(mg/ml)
V′=所通过的L-赖氨酸发酵液的体积(ml)
V″=解吸液的体积(ml)其它符号的意义同上。
所得到的结果列于下面表1中。
表1.各种树脂对于L-赖氨酸的
动态交换容量及其解吸率
树脂 总交换容量Q(mg/ml) 解吸率(%)
Dowex 50wx1 37.0 98.7
Dowex 50wx2 49.4 99.5
Dowex 50wx4 67.5 99.6732(交联度为7) 115.0 98.4
Dowex 50wx8 118.0 98.3
Dowex 50wx12 136.0 97.6
强酸1×14.5 149.0 98.9
Dowex 50wx16 137.0 96.5
*所采用的L-赖氨酸发酵液的浓度为2.79%,原液及解吸液的浓度均用731型分光光度计检测。
从表中数据可以看到,Dowex50wx12,1×14.5,Dowex50wx16三种高交链度的树脂的总交换容量和解吸率均较好,且在实验中,本发明人发现,用7%的NH4OH解吸后,这三种树脂的颜色恢复原状,而其它树脂的颜色则较深,这可能是由于这三种树脂的交联度高,色素不能进入树脂内部。这证明高交联度的树脂对于L-赖氨酸具有较好的选择性。实例3:L-赖氨酸解吸液的脱色处理
目前生产上一般采用粉末状活性炭进行L-赖氨酸解吸液的脱色处理,采用这种方法进行脱色时,L-赖氨酸的损失较大,且粉末状活性炭难以再生,导致了生产成本较高,又由于必须采用板框过滤除去粉末状活性炭,所以,不能进行连续操作。
鉴于活性炭本身具有较大的比表面积,是一种良好的色素吸附剂,本发明者通过大量的实验,发现可采用颗粒状的活性炭来代替粉末状的活性炭,这样,就可实现连续化操作,因为可将颗粒状活性炭装填于柱中进行脱色(与粉末状活性炭相比较,颗粒状活性炭的流体阻力要小得多),颗粒状活性炭的粒径一般为10-70目,较佳为20-30目。
将10ml颗粒状活性炭装入Φ20×200mm的柱中,通入L-赖氨酸的解吸液,s.v.为1/50min-1,得到颗粒状活性炭对于色素的吸附曲线,如图1所示。从图1中可以看到,颗粒状活性炭对于色素具有较大的吸附能力。
再用0.5N NaOH解吸所吸附的色素,得到图2所示的结果(s.v.=1/50min-1。从图2中可以观察到,色素的洗脱峰集中,无拖尾现象,这说明颗粒状活性炭的再生问题可以得以解决。因此,生产成本可以相应地降低。
必要时,可将缩合型弱酸性树脂与颗粒状活性炭串级进行L-赖氨酸溶液的脱色,这样,可以获得更好的脱色效果,进一步提高产品的质量。缩合型弱酸性树脂的再生也可采用0.5N左右的NaOH。实施例4:L-赖氨酸的浓缩和结晶
将经脱色处理的L-赖氨酸溶液置于旋转蒸发器内减压浓缩至一定的程度,一般为20-30Be°,较佳为22-25Be°。
取12只150ml的烧杯,各放入25ml经浓缩的L-赖氨酸溶液,在10℃下,用HCl分别调节各个烧杯中的L-赖氨酸浓缩液的pH,观察在不同的pH条件下产生的晶体的数量。
结果表明,在pH=5.5的条件下所得到的L-赖氨酸晶体量大于pH=4.9的条件中所得到的量。由此可以看到,pH5.5是L-赖氨酸结晶的最佳pH。在该pH条件下,L-赖氨酸(盐酸盐)在水溶液中的溶解度最小。
实验发现,pH5.5时的结晶收率比pH4.9时平均高出1.5%。且pH5.5条件下所得到的晶体的纯度可达到99.8%。
在pH5.5下结晶较好,是有根据的。因为赖氨酸的pK1=2.18,pK2=8.9,而在
时,赖氨酸单盐酸盐的浓度最大。
具体的方法是:将经浓缩的L-赖氨酸溶液的pH调至5.5,然后在一定的温度下,较佳为10℃下结晶,约10小时后,过滤分离出晶体。所得到L-赖氨酸的结晶收率可以达到92%左右,符合生产的要求,而无须二次结晶,从而进一步降低了生产成本和减轻了劳动强度。实例5:采用本发明的方法生产L-赖氨酸的过程
分别按0.1%和0.17%(重量)的比例将草酸和三聚磷酸钠加入L-赖氨酸发酵液中,然后调节发酵液的pH至6.0,视需要在搅拌条件下,加入0.2%(重量)的膨润土;或在搅拌条件下,以1-1.5ml/100ml发酵液的比例加入浓度为0.2%(重量)的聚丙烯酰胺絮凝剂,待大量絮凝物出现后,再加入1.0%(重量)的硅藻土作为助滤剂,在600mmHg的真空度下抽滤,弃去滤渣。
然后,用6NHCl将经预处理后的L-赖氨酸溶液的pH调至2.0。放置待用。
在一个Φ85×1200mm的离子交换柱中装入1×14.5的NH4 +树脂(这种树脂的价格便宜,可用于大规模生产),树脂装置为约3000ml。然后将上述溶液上柱进行离子交换吸附(s.v.=1/40min-1);当流出液浓度与上柱时发酵液的浓度相同时,停止通入发酵液。然后,用无盐水冲洗树脂,再用7.0%的NH4OH进行解吸(SV=1/90min-1);当洗脱液的pH达到8.5左右时,开始收集洗脱液,至柱中流出来的液体中L-赖氨酸的量很少时,停止收集洗脱液。然后,将解吸液置于旋转蒸发器中蒸发除去氨。再将解吸液的pH调节至4.5左右,放置待用。
另取一根Φ40×60mm的离子交换柱,往其中装入500ml颗粒状活性炭(粒径为30-60目),然后将上述洗脱液通入进行脱色(s.v.=1/20min-1)[视具体情况,还可用缩合型弱酸性树脂(如122#树脂)进一步脱色],将所收集的脱色液置于旋转蒸发器中,在60℃,740mmHg下浓缩至约23Be°,在同样的温度下将浓缩液的pH调节至5.5,在搅拌下自然冷却,最好在10℃下结晶,4小时后,分离出晶体,即为所获得的L-赖氨酸成品。
比较采用本发明的方法生产L-赖氨酸和采用已有技术的方法生产L-赖氨酸的结果,发现本发明的方法可以获得更好的结果,具体数据列于下面的表3和表4中。
表3已有技术的方法生产L-赖氨酸
实验号 | 1 | 2 | 3 |
发酵液量(ml) | 12000 | 12000 | 12000 |
发酵液浓度(%) | 2.80 | 2.80 | 2.80 |
发酵液中L-赖氨酸(盐酸盐)的量(g) | 336.00 | 336.00 | 336.00 |
结晶得到的L-赖氨酸(盐酸盐)的量(g) | 269.47 | 267.12 | 271.15 |
收率(%) | 80.2 | 79.5 | 80.7 |
平均收率(%) | 80.1 |
表4本发明的方法生产L-赖氨酸
实验号 | 1 | 2 | 3 |
发酵液量(ml) | 12000 | 12000 | 12000 |
发酵液浓度(%) | 2.80 | 2.80 | 2.80 |
发酵液中L-赖氨酸(盐酸盐)的量(g) | 336.00 | 336.00 | 336.00 |
结晶得到的L-赖氨酸(盐酸盐)的量(g) | 286.67 | 284.36 | 285.62 |
收率(%) | 85.3 | 84.6 | 85.0 |
平均收率(%) | 85.0 |
由上可见,本发明的优点和效果是明显的。
本发明的上述实例只是为了帮助该领域的技术人员理解和实施本发明,可以理解,在不违背本发明的宗旨和范围内,是可以作出多种修改的。
Claims (11)
1.一种从发酵液中提取L-赖氨酸的方法,包括用有机或无机絮凝剂除去发酵液中的菌丝体及蛋白质和草酸除去发酵液中的无机离子,草酸的加入量是0.05-0.2%(重量);用离子交换树脂进行L-赖氨酸的吸附及其解吸;用吸附剂对解吸液进行脱色,浓缩脱色液和使L-赖氨酸从浓缩液中结晶析出,其特征在于除草酸外,从发酵液中除去无机离子的作用剂还包括三聚磷酸钠,三聚磷酸钠的加入量是0.1-0.3%(重量),且所述的离子交换树脂是交联度为14-16%的树脂,所述的吸附剂是粒径为10-70目的颗粒状活性炭。
2.如权利要求1所述的方法,其特征还在于所述的有机絮凝剂是聚丙烯酰胺或壳聚糖,所述的无机絮凝剂是碱式氯化铝或CaCl2或Na2HPO4。
3.如权利要求1所述的方法,其特征还在于所述的草酸的加入量是0.08-0.12%(重量)。
4.如权利要求1所述的方法,其特征还在于所述的三聚磷酸钠的加入量是0.12-0.22%(重量)。
5.如权利要求1所述的方法,其特征还在于所述的颗粒状活性炭的粒径为20-30目。
6.如权利要求1或5所述的方法,其特征在于所述的吸附剂还包括缩合型弱酸性树脂。
7.如权利要求1所述的方法,其特征还在于所述的颗粒状活性炭和缩合型弱酸性树脂串联进行脱色。
8.如权利要求1所述的方法,其特征还在于所浓缩的脱色液的浓度为20-30Be°。
9.如权利要求8所述的方法,其特征还在于所浓缩的脱色液的浓度为22-25Be°。
10.如权利要求1所述的方法,其特征还在于采用调节pH的方式使L-赖氨酸从浓缩液中结晶析出。
11.如权利要求1或10所述的方法,其特征还在于使L-赖氨酸从浓缩液中结晶析出的pH为5.5。
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