CN105403647B - 一种用液相色谱法分离测定克利贝特中间体有关物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属分析化学领域，本发明公开了一种用液相色谱法分离测定克利贝特中间体[2,2'‑(4,4'‑cyclohexylidenediphenoxy)]‑2,2'‑dimethyl diethyl butyrate及其有关物质的方法，该方法以辛烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的缓冲盐溶液‑有机相为流动相，可以定量测定克利贝特中间体及其有关物质的含量，从而有效控制克利贝特中间体的质量，保证克利贝特终产品的质量可控。本发明方法专属性强，准确度高，操作简便。

Description

一种用液相色谱法分离测定克利贝特中间体有关物质的方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及液相色谱法分离测定克利贝特中间体及其有关物质的方法。
背景技术
克利贝特是一种新型的纤维酸类降脂新药，对各种类型的高脂血症均有效, 既可作为第一线降脂药物，又可在其他降脂药物疗效不佳时使用。克利贝特中间体的化学名为[2,2'-(4,4'-cyclohexylidenediphenoxy)]-2,2'-dimethyl diethyl butyrate，分子式为C32H44O6。克利贝特中间体结构式为：
Figure 10693DEST_PATH_IMAGE001
在合成该化合物的过程中，需要控制一些重要中间体的纯度，以减少副反应的发生和杂质的生成，从而提高终产品的收率和纯度。对于克利贝特中间体的合成主要控制的有关物质为4,4'-(Cyclohexane-1,1-diyl)diphenol，结构式为：
Figure 131096DEST_PATH_IMAGE002
克利贝特中间体中的杂质去除不完全，将会引起副反应的发生和杂质的生成，最终影响药物纯度和质量。因此，实现克利贝特中间体及其有关物质的分离测定，在克利贝特的生产及其质量控制方面具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分析克利贝特中间体化学纯度的方法，从而实现克利贝特中间体与其有关物质的分离和测定，保证克利贝特中间体的纯度，实现克利贝特的质量可控。
本发明所述的用液相色谱法分析克利贝特中间体化学纯度的方法，是采用辛烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的缓冲盐溶液-有机相为流动相。
上述所说的色谱柱以辛烷基硅烷键合硅胶为填料，色谱柱选自Kromasil、Unitary和Alltima等品牌。
上述所说的有机相选自以下化合物：甲醇、乙腈、丙醇、异丙醇、四氢呋喃等，优选乙腈。
上述所说的方法，其流动相缓冲盐溶液-有机相采用梯度洗脱。
上述所说的方法中，缓冲盐溶液选自磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、高氯酸盐，优选为磷酸盐。
其中缓冲盐溶液的浓度为0.01～0.1mol/L，优选浓度为0.03mol/L。
本发明所述的分离测定方法，可按照以下方法实现：
1) 取克利贝特中间体样品适量，用乙腈或流动相溶解样品，配制成每1mL含克利贝特0.1～1.5mg的样品溶液。
2) 设置流动相流速为0.5～1.5mL/min，流动相流速优选为1.0mL/min，检测波长为200～250nm，最佳检测波长为231nm，柱温箱温度为10～40℃，柱温箱温度最佳为25℃。
3)取1)的样品溶液10～50μL，注入液相色谱仪，完成克利贝特中间体与其有关物质的分离测定。其中：
高效液相色谱仪的型号，无特别要求，本发明采用的色谱仪为岛津：LC-20AT泵，SPD-M20A检测器，SIL-20AC自动进样器，CBM-20A控制器，CTO-10AS柱温箱，LCsolution工作站
色谱柱：C8(Alltima，250×4.6mm，5μm)
流动相：A：0.03M磷酸二氢钾缓冲液(pH 2.2)，B：乙腈；按以下梯度进行洗脱：
Figure DEST_PATH_GDA0000906894730000021
流速：1.0mL/min
检测波长：231nm
进样体积：10μL
本发明采用C8(Alltima，250×4.6mm，5μm)色谱柱，能够有效的分离克利贝特中间体及其有关物质。本发明解决了克利贝特中间体及其有关物质的分离测定问题，从而减少了副反应的发生，提高了产物的收率和纯度，保证了克利贝特的质量可控。
附图说明
图1为实施例1时的克利贝特中间体及其有关物质HPLC图；
图2为实施例1时克利贝特中间体HPLC图；
图3为实施例2时的克利贝特中间体及其有关物质HPLC图；
图4为实施例2时的克利贝特中间体的HPLC图；
图5为实施例3时的溶剂HPLC图；
图6为实施例3时的克利贝特中间体及其有关物质HPLC图；
图7为实施例3时的克利贝特中间体的HPLC图。
具体实施方式：
以下实施例用于进一步理解本发明，但不限于本实施的范围。
实施例1
仪器与条件
高效液相色谱仪：岛津：LC-20AT，CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp；
色谱柱：C8（Kromasil，250×4.6 mm，5μm）；
流动相：A：0.03M磷酸二氢钾缓冲液(pH 2.2），B：甲醇；A：B=20：80；
流速：1.0mL/min
检测波长：231nm
进样体积：10μL
实验步骤
取克利贝特中间体及其有关物质适量，分别用乙腈溶解样品，配制成含克利贝特中间体及其有关物质约1.0mg/mL的样品溶液。取上述克利贝特中间体及其有关物质溶液适量，配制成系统适用性溶液；按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图1~2，图1中保留时间为29.865min的色谱峰为克利贝特中间体，其余色谱峰为克利贝特中间体各有关物质的色谱峰；图2中保留时间为29.835min的色谱峰为克利贝特中间体。
实施例2
仪器与条件
高效液相色谱仪：岛津：LC-20AT，CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp；
色谱柱：C8（Alltima，250×4.6 mm，5μm）；
流动相：A：0.03M磷酸二氢钾缓冲液(pH 2.2）；B：乙腈；按以下梯度进行洗脱：
T(min) 0 10 10.01 35 35.01 45
B% 70 70 85 85 70 70
流速：1.0mL/min
检测波长：231nm
进样体积：10μL
实验步骤
取克利贝特中间体及其有关物质适量，分别用乙腈溶解样品，配制成含克利贝特中间体及其有关物质约1.0mg/mL的样品溶液。取上述克利贝特中间体及其有关物质溶液适量，配制成系统适用性溶液；按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图3~4，图3中保留时间为26.820min的色谱峰为克利贝特中间体，其余色谱峰为克利贝特中间体各有关物质的色谱峰；图4中保留时间为26.916min的色谱峰为克利贝特中间体。
实施例3
仪器与条件
高效液相色谱仪：岛津：LC-20AT，CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp；
色谱柱：C8（Alltima，250×4.6 mm，5μm）；
流动相：A：0.03M磷酸二氢钾缓冲液(pH 2.2）；B：乙腈；按以下梯度进行洗脱：
T(min) 0 7 37 50 50.01 60
B% 59 59 78 78 59 59
流速：1.0mL/min
检测波长：231nm
进样体积：10μL
实验步骤
取克利贝特中间体有关物质适量，分别用乙腈溶解样品，配制成含克利贝特中间体及其有关物质约1.0mg/mL的样品溶液；取上述克利贝特中间体及其有关物质溶液适量，配制成系统适用性溶液；另取乙腈适量作为空白溶剂。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图5~7，图5为溶剂色谱图；图6中保留时间为33.517min的色谱峰为克利贝特中间体，其余色谱峰为克利贝特各有关物质的色谱峰，由图可以看出，克利贝特与其有关物质能够达到基线分离，符合中国药典的要求；图7中保留时间为33.532min的色谱峰为克利贝特中间体，可以看出在该条件下克利贝特中间体与其有关物质可以完全分离。
对上述克利贝特中间体及其有关物质分析方法的以下项目进行了验证。
系统适用性试验
根据上述实施例3确定的色谱条件，用克利贝特中间体和各有关物质的混合物来分析此色谱条件是否符合要求。由图6可见此条件下各个有关物质与主峰之间分离度符合要求，峰纯度和单点阀值均符合要求。
溶液稳定性
将克利贝特中间体与其各有关物质的混合物，分别于0、2、4、6、8、12、18、24小时进样，考察样品定量测定时溶液的稳定性，由结果可见，本溶液在24小时内稳定。
Figure DEST_PATH_GDA0000906894730000051
耐用性
为了进一步验证方法的稳定性，我们将流速、柱温、缓冲盐pH和色谱柱型号这些条件进行相应的微调，以考察色谱条件的耐用性。
结果表明，流速变化在±0.2ml/min范围内，柱温变化在±5℃范围内，色谱峰型没有变化，仅保留时间有相应的前移和后移。缓冲液pH变化对出峰时间也无明显改变。色谱柱换做Apollo和Kromasil后各物质保留时间和分离度无明显变化。方法耐用性良好。

Claims (5)

1.一种液相色谱法分离测定克利贝特中间体有关物质的方法，其特征在于：方法分离测定的检测对象主要有：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
采用如下色谱条件完成克利贝特中间体及有关物质的测定：色谱柱填料为辛烷基硅烷键合硅胶；流动相：A：0.03mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，pH2.2；B：乙腈；洗脱梯度为
Figure DEST_PATH_IMAGE003
或
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
2.根据权利要求1所述的分离测定方法，色谱柱选自品牌为Kromasil、Unitary和Alltima的色谱柱。
3.根据权利要求1所述的分离测定方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
1）取克利贝特中间体样品适量，分别用乙腈或流动相溶解样品，配制成每1mL含克利贝特中间体及其有关物质0.1～1.5mg的样品溶液；
2）设置流动相流速为0.5～1.5mL/min，检测波长为200～250nm，柱温箱温度为10～40℃；
3）取1）的样品溶液10～50μL，注入液相色谱仪，完成克利贝特中间体及其有关物质的分离测定。
4.根据权利要求3所述的分离测定方法，步骤2）所说的流动相流速优选1.0mL/min。
5.根据权利要求3所述的分离测定方法，步骤2）所说的检测波长优选231nm。
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