具体实施方式
以下,将对本发明进行更详细的说明。
本发明提供了由化学式1表示的氨基吡啶衍生物或其药用可接受盐。
[化学式1]
在化学式1中,R1,R2,和R4可以彼此相同或彼此不同,并且可以选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤素,R3可以是选自C1-C4烷氧基、苄氧基和羟基的一种,而R5可以是选自以下物质的一种,即是由或者不由从卤素、羟基、C1-C12烷氧基、苯氧基、C1-C12烷基氨基、C6-C14芳基和C1-C4烷基的一个或两个取代基取代的C1-C15烷基,由或者不由从卤素、羟基、C1-C12烷氧基、C1-C12烷基氨基、和C1-C4烷基中选取的一个或两个取代基取代的C6-C14芳基;由或者不由C6-C14芳基取代的C2-C12链烯基;C3-C8环烷基;以及C3-C14杂环化合物。
优选地,在化学式1的氨基吡啶衍生物中,R1,R2和R4可以是从氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基中选择的一种,R3可以是从苄氧基和羟基中选择的一种,R5可以是从以下物质选择的一种,即C1-C15烷基,其由或者不由卤素或C1-C4烷基取代,苯基由或者不由卤素、羟基、C1-C4烷氧基或C1-C4烷基取代;C1-C4烷基由或者不由苯基或卤代苯基取代;肉桂;苯氧基;C3-C8环烷基;苯并二茂;萘;以及噻吩。
更优选地,酰氨基吡啶衍生物可以选自N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)酰胺衍生物和N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)酰胺衍生物。
N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)酰胺衍生物可以是选自由以下物质构成的组中的一个,该组包括N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)乙酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)十二烷酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-氯丁酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)异丁酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-3-甲基丁酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)棕榈酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)环己烷甲酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6三甲基吡啶-2-基)-2-苯基乙酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-3-苯基丙酰胺,N-(5-苄氧基-3-,4,6-三甲基吡啶-2-基)苯甲酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-氟苯甲酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-1-萘甲酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)噻吩-2-甲酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2-乙基丁酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2-苯氧基乙酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基-2-基)-2-苯基丁酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2,4,6-三甲基苯甲酰胺,3-苄氧基-N-(5-苄氧基-3,4-,6-三甲基吡啶-2-基)苯甲酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-3,5,5-三甲基己酰胺,N-(5-苄氧基-3,4-,6-甲基吡啶-2-基)-2-(4-氯苯基)乙酰胺,N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2,2-二氯乙酰胺和N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)肉桂酰胺。
N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)酰胺衍生物可以选自由以下物质构成的组的一个,该组包括N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)乙酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)十二烷酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-氯丁酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)异 丁酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-3-甲基丁酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)棕榈酰胺,N-(5-羟基-3,4-,6-三甲基吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)环己烷甲酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2-苯基乙酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-3-苯基丙酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)苯甲酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-氟苯甲酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-1-萘酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)噻吩-2-甲酰胺,2-乙基-N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)丁酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2-苯氧基乙酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2-苯基丁酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2,4,6-三甲基苯甲酰胺,3-羟基-N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)苯甲酰胺,N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-3,5,5-三甲基己酰胺,2-(4-氯苯基)-N-(5-羟基-3-,4,6-三甲基吡啶-2-基)乙酰胺,2,2-二氯-N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)乙酰胺和N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)肉桂酰胺。
氨基吡啶衍生物的药用可接受盐可以是选自由以下物质构成的组的有机酸,该组包括草酸,马来酸,富马酸,苹果酸,酒石酸,柠檬酸,和苯甲酸的,或者可以是由无机酸产生的酸加成盐形式,其选自由盐酸、硫酸、磷酸和氢溴酸构成的组。
根据本发明,化学式1的氨基吡啶衍生物和其药用可接受盐可以根据反应式1表示的制备方法制备。
[反应式1]
更详细地,将亚硫酰氯和二甲基甲酰胺(DMF)加入盐酸吡哆醇,回流搅拌,以便获得化合物1。然后,将少量锌粉加入到反应溶液中,在其中用乙酸悬浮化合物1,回流搅拌混合溶液,以便获得化合物2。然后,将1,3-二溴-5,5-二甲基乙内酰脲(DBDMH)加入到反应溶液,在其中用四氢呋喃(THF)悬浮化合物2,回流搅拌混合溶液,以便获得化合物3。然后,将K2CO3和苄基氯(PhCH2Cl)加入到反应溶液,在其中化合物3溶解于DMF中,以便获得化合物4。随后,将二苯甲酮亚胺加入到反应溶液,该反应溶液中化合物4、NaOtBu、三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd2(dba)3)和2,2'-双(二苯基膦)-1,1'-联萘(BINAP)溶解于甲苯中,回流搅拌混合溶液,以便获得化合物5。然后,将包含少量乙酰氯的甲醇溶液加入到反应溶液中,在其中化合物5溶解于甲醇和THF的混合溶剂中,回流搅拌混合溶液,以便获得化合物6。然后,依次将三乙胺和乙酰氯依次加入到反应溶液中,在其中化合物6溶解于CH2Cl2中,并且搅拌 混合溶液,以便获得化合物7。此外,将Pd/C加入到反应溶液中,在其中化合物7溶解于甲醇,并在氢气氛下搅拌混合溶液,以便获得化合物8。可替代地,将BCl3加入到反应溶液中,在其中化合物7溶解于CH2Cl2BCl3,以便获得化合物8。
另外,本发明提供用于预防或治疗与血管生成相关的药物组合物,该药物组合物包括化学式1的氨基吡啶衍生物或其药用可接受盐作为活性组分。
与血管生成有关的疾病可以是眼科疾病,选自黄斑变性、糖尿病性视网膜病、增殖性玻璃体视网膜病变、未成熟的视网膜病变、青光眼、变性、翼状胬肉、晶状体后纤维增生症、沙眼、排斥角膜移植、角膜溃疡、圆锥形角膜、及眼部炎症。
与血管生成有关的疾病可以选自类风湿性关节炎、骨关节炎,化脓性关节炎、牛皮癣、干燥(Siogren)综合征、异常切粘连、骨病、蛋白尿、腹主动脉瘤、外伤性关节损伤导致的退行性软骨损失、神经系统脱髓鞘、肝硬化、肾小球疾病、胚胎-胎儿膜不成熟破裂、牙周病、动脉粥样硬化、再狭窄、中枢神经系统的炎症性疾病、阿尔茨海默氏病和皮肤老化。
根据本发明,在作为血管生成模型鸡胚绒毛尿囊膜中,氨基吡啶衍生物或其药用可接受的盐通过处理血管生成诱导剂抑制血管生长,例如血管内皮生长因子(VEGF)。因此,根据本发明,氨基吡啶衍生物或其药用可接受盐作为药物对于预防或治疗与血管生成有关的疾病是有用的,例如黄斑变性和关节炎。
另外,本发明提供了一种用于预防或治疗IBD的药物组合物,药物组合物包括由化学式1表示的氨基吡啶衍生物或其药用可接受盐作为活性组分。
IBD可以选自由溃疡性大肠炎、克罗恩病、肠白塞病、出血性直肠 溃疡、和结肠袋炎组成的组。
根据本发明,在IBDs的模型中,氨基吡啶衍生物或其药用可接受盐具有良好的结肠炎抑制作用,并且因此,作为药剂对于预防或治疗IBDs是有用的。
另外,本发明提供了用于预防或治疗癌症疾病的药物组合物,药物组合物包括由化学式1表示的氨基吡啶衍生物或其药用可接受盐作为活性组分。
另外,本发明提供了一种用于预防或抑制癌症的侵入或转移的药物组合物,药物组合物包括由化学式1表示的氨基吡啶衍生物或其药用可接受盐作为活性组分。
癌症疾病可以是选自以下组中的一个以下组,该组由肺癌、乳腺癌、膀胱癌、骨癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、直肠癌、咽喉癌、喉癌、食道癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、舌癌、皮肤癌、脑癌、子宫癌、头或颈癌、胆囊癌、口腔癌、结肠癌、肛门癌、中枢神经系统的肿瘤和肝癌组成。
在绒毛尿囊膜模型中的肺癌细胞的接种上,化学式1的氨基吡啶衍生物或其药用可接受盐抑制血管生成和由肿瘤发生引起的肿瘤生长,并且也能抑制组织蛋白酶S的活性,其在癌症的转移和侵入中起重要作用,并且因此作为癌症生长和转移的抑制剂是有用的。
根据本发明,施用化学组合物的施用量和方法可能根据药物组合物的制剂和用法有所不同。
根据本发明,基于药物组合物的总重量,药物组合物可以包括约0.1至约50重量%的氨基吡啶衍生物或其药用可接受盐。
此外,根据本发明,药物组合物还可以包括适当的载体、赋形剂和稀释剂,其通常用在药物组合物的制备中。
载体、赋形剂和稀释剂的示例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、藻酸盐、明 胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
根据本发明,药物组合物可以配制成口服制剂,例如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、悬浮液、乳液、糖浆和气雾剂,或者可以以外用剂,栓剂,无菌可注射溶液的形式配制,每个根据本领域中的典型方法。
当配制时,可以使用典型的稀释剂或赋形剂,例如填充剂,补充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂。用于口服给药的固体口服制剂的示例包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂和胶囊,而且这些固体制剂通过与至少一个赋形剂混合制备,例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖或明胶。
此外,除了简单的赋形剂,可以使用润滑剂,例如硬脂酸镁和滑石。用于口服制剂的液体口服剂示例包括悬浮液、溶液、乳剂和糖浆剂。除了通常使用的简单的稀释剂,例如水或液体石蜡,液体制剂还可以包括各种赋形剂,例如,润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。用于肠胃外给药的制剂的示例包括无菌水溶液,非水性溶剂,悬浮液,乳液,冻干制剂和栓剂。非水溶剂和悬浮剂的示例包括丙二醇,聚乙二醇,植物油,如橄榄油,以及可注射酯如油酸乙酯。栓剂基质的实例包括witepsol,聚乙二醇,吐温61,可可脂,月桂精,和水溶性封片胶(glycerol geletin)。
根据本发明,氨基吡啶衍生物或其药用可接受盐根据患者的年龄,性别或体重可以不同,但例如,可以以约0.001至约100毫克/千克的剂量施用至患者,优选,约0.01至约10毫克/千克,一天一次或一天多次。此外,氨基吡啶衍生物或其药用可接受盐的剂量根据给药途径,疾病的严重性,或患者的性别,体重或年龄增加或减少。因此,该剂量并不解释为以任何方面限制本发明的范围。
药物组合物可以通过多种途径施用至哺乳动物,而哺乳动物的示例包括大鼠,小鼠,牛和人。可以预期所有的给药途径,例如,药物组合 物可以通过口服,直肠或静脉,肌肉,皮下,子宫内或脑室内注射来给药。
根据本发明,氨基吡啶衍生物或其药用可接受盐致死剂量至少为2g/kg的50%(LC50),从而保证稳定性。因此,根据本发明,氨基吡啶衍生物或其药用可接受盐可以应用到药物组合物。
下面,通过以下实施例和对比实施例对本发明进一步解释。然而,应当理解的是,这些实施例例仅是用来具体阐述本公开,并且它们不限于任何形式。
<实施例1>4,5-双(氯甲基)-2-甲基吡啶-3-醇盐酸盐(1)的制备
将30ml亚硫酰氯和0.2毫升DMF(2.583mmol)加入到5克吡哆素盐酸盐(24.31mmol),然后,80℃回流下搅拌混合溶液三小时。在反应溶液冷却至室温后,加入70毫升乙醚,并且在冰浴冷却搅拌混合溶液1小时。对沉淀的固体进行真空过滤,并且用乙醚洗涤过滤的固体,然后进行干燥,从而得到5.5克白色固体,即,化合物1(产率:93%)。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ8.42(s,1H),4.99(s,2H),4.96(s,2H),2.63(s,3H)ppm
<实施例2>2,4,5-三甲基吡啶-3-醇(2)的制备
将8.08克(123.69mmol)锌粉末细分成50毫升乙酸悬浮液,其含有10克(41.23mmol)的化合物1,然后,130℃回流下下搅拌混合溶液两小时。在冷却至室温后,将反应溶液进行真空过滤。然后,使用10M的氢氧化钠溶液调节滤液的PH值到6。用盐饱和滤液,并用EtOAc溶液(100毫升×6)萃取。用饱和盐水洗涤EtOAc溶液,用无水MgSO4干燥,过滤,然后,在减压下浓缩。柱色谱分离(氯仿:甲醇=20:1)纯化残余物,从而得到5.2克(92%)白色固体,即,化合物2。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ8.49(s,1H),7.72(s,1H),2.31(s,3H),2.12(s,3H),2.08(s,3H)ppm
<实施例3>6-溴-2,4,5-三甲基吡啶-3-醇(3)的制备
将2.5g(9.11mmol)的1,3-二溴-5,5-二甲基乙内酰脲(DBDMH)加入到30ml含有2.5g(18.22mmol)化合物2的THF悬浮液中,然后,将混合溶液在室温下搅拌3小时。将反应溶液浓缩后,将残留物用500ml EtOAc溶液和20ml水稀释,然后,水层用EtOAc(100mL x 3)萃取。EtOAc溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:4)纯化,从而得到3.22(80%)浅黄色固体,即,化合物3。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ5.56(br s,1H),2.42(s,3H),2.31(s,3H),2.25(s,3H)ppm
<实施例4>3-(苄氧基)-6-溴-2,4,5-三甲基吡啶(4)的制备
将20.78g(150.04mmol)的K2CO3和5.2ml(45.12mmol)苄基氯依次地加入到15ml含有6.5g(30.08mmol)化合物3的DMF中,且将混合溶液在室温下搅拌12小时。将用700mlEtOAc溶液稀释反应液,然后用水(20mLx10)洗涤。EtOAc溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:20)纯化,从而得到8.9g(97%)白色固体,即,化合物4。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ7.38-7.43(m,5H),4.77(s,2H),2.46(s,3H),2.32(s,3H),2.24(s,3H)ppm
<实施例5>5-(苄氧基)-N-(二苯基亚甲基)-3,4,6三甲基吡啶-2-胺(5)的制备
将1.73ml(9.80mmol)二苯甲酮亚胺加入到30ml含有3g(9.80mmol)化合物4、203mg(0.20mmol)的三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(Pd2(DBA)3)、249mg(0.39mmol)2,2'-双(二苯基膦)-1,1'-联萘(BINAP)和1.36g(13.71mmol)NaOtBu的甲苯溶液中,然后,将混合溶液在120℃回流条件下搅拌12小时。冷却到室温后,将反应液用700ml EtOAc和10ml水稀释。 然后,EtOAc溶液用饱和盐水(30mLx5)洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:4)纯化,从而得到3.28g(83%)黄色固体,即,化合物5。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ7.80(d,J=7.1Hz,2H),7.17-7.48(m,13H),4.69(s,2H),2.29(s,3H),2.03(s,3H),1.91(s,3H)ppm
<实施例6>5-(苄氧基)-3,4,6三甲基吡啶-2-胺(6)的制备
在冰浴条件下将2ml乙酰氯缓慢滴加以溶解到50ml甲醇中。将混合液加入到含有50ml甲醇和5ml THT的化合物5的溶液中,然后,将混合溶液在室温下搅拌12小时。将在压力下浓缩的反应溶液用300ml EtOAc稀释,然后,用饱和碳酸氢钠溶液(20mLx4)洗涤。EtOAc溶液用20ml饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(氯仿:甲醇=20:1)纯化,从而得到992mg(83%)浅黄色固体,即,化合物6。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ7.31-7.45(m,5H),4.68(s,2H),4.25(br s,1H),2.34(s,3H),2.16(s,3H),1.99(s,3H)ppm
<实施例7>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)酰胺衍生物(7a-7Z)的制备
每种N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)酰胺衍生物以图1所示的下列方法制备。
<实施例7-1>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)乙酰胺(7a)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.073ml(0.990mmol)乙酰氯依次加入5ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌8小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残 留物通过柱层析(EtOAc:己烷=2:1)纯化,从而得到184mg(78%)黄色固体,即,化合物7a。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.44(br s,1H),7.30-7.45(m,5H),4.75(s,2H),2.40(s,3H),2.23(s,3H),2.16(s,3H),2.13(s,3H)ppm
<实施例7-2>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)十二烷酰胺(7b)的制备
将0.120ml(0.867mmol)的三乙胺和0.176ml(0.743mmol)十二烷酰氯依次加入5ml含有150mg(0.619mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌5小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:5)纯化,从而得到184mg(70%)白色固体,即,化合物7b。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ7.74(br s,1H),7.35-7.46(m,5H),4.76(s,2H),2.41(s,3H),2.35-2.40(m,2H),2.23(s,3H),2.11(s,3H),1.65-1.77(m,2H),1.25(s,16H),0.86(t,J=6.8Hz,3H)ppm
<实施例7-3>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-氯丁酰胺(7c)的制备
将0.688ml(2.475mmol)的三乙胺和1.155ml(2.887mmol)4-氯丁酰氯依次加入100ml含有500mg(2.063mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌5小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:1)纯化,从而得到102mg(14%)白色固体,即,化合物7c。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.37(br s,1H),7.33-7.44(m,5H), 4.76(s,2H),3.63(t,J=6.3Hz,2H),2.59(t,J=7.1Hz,2H),2.41(s,3H),2.23(s,3H),2.16(t,J=6.8Hz,2H),2.11(s,3H)ppm
<实施例7-4>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)异丁酰胺(7d)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和107mg(0.990mmol)异丁酰氯依次加入100ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌5小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:3)纯化,从而得到177mg(72%)白色固体,即,化合物7d。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.51(br s,1H),7.34-7.47(m,5H),4.75(s,2H),2.56-2.67(m,1H),2.41(s,3H),2.24(s,3H),2.09(s,3H),1.25(s,3H),1.22(s,3H)ppm
<实施例7-5>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-3-甲基丁酰胺(7e)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.124ml(0.990mmol)异戊酰氯顺序地加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌5小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:3)纯化,从而得到197mg(73%)白色固体,即,化合物7e。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.59(br s,1H),7.31-7.45(m,5H),4.74(s,2H),2.40(s,3H),2.24-2.25(m,6H),2.12(s,3H),1.00(d,J=6.3Hz,6H)ppm
<实施例7-6>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)棕榈酰胺(7f)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.123ml(0.990mmol)棕榈酰氯依次加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌10小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:3)纯化,从而得到207mg(77%)白焦糖相,即,化合物7f。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ7.90(br s,1H),7.30-7.45(m,5H),4.74(s,2H),2.40(s,3H),2.22(s,3H),2.04(s,3H),1.32(s,9H)ppm
<实施例7-7>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺(7g)的制备
将0.091ml(0.654mmol)的三乙胺和0.069ml(0.560mmol)环戊烷碳酰氯顺序地加入10ml含有113mg(0.467mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌4小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:3)纯化,从而得到148mg(93%)黄色固体,即,化合物7g。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.71(br s,1H),7.34-7.45(m,5H),4.74(s,2H),2.73-2.85(m,1H),2.40(s,3H),2.23(s,3H),2.09(s,3H),1.55-1.90(m,8H)ppm
<实施例7-8>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)环己烷羧酰胺(7h)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.132ml(0.990mmol)环己酰 氯顺序地加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,混合溶液在室温下搅拌5小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:1)纯化,从而得到103mg(35%)白色固体,即,化合物7h。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.00(br s,1H),7.33-7.45(m,5H),4.75(s,2H),2.40(s,3H),2.29-2.35(m,1H),2.23(s,3H),2.08(s,3H),1.94-2.00(m,2H),1.78-1.81(m,2H),1.46-1.61(m,2H),1.19-1.38(m,4H)ppm
<实施例7-9>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2-苯基乙酰胺(7i)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.134ml(0.990mmol)苯乙酰氯依次加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌5小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:1)纯化,从而得到190mg(64%)白色固体,即,化合物7i。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.08(br s,1H),7.26-7.44(m,10H),4.72(s,2H),3.74(s,2H),2.36(s,3H),2.20(s,3H),2.04(s,3H)ppm
<实施例7-10>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-3-苯基丙酰胺(7j)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.147ml(0.990mmol)苯乙酰氯依次加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌8小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然 后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:3)纯化,从而得到310mg(99%)白色固体,即,化合物7j。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.33(br s,1H),7.14-7.44(m,10H),4.74(s,2H),3.02(t,J=7.2Hz,2H),2.70(t,J=8.2Hz,2H),2.38(s,3H),2.22(s,3H),2.03(s,3H)ppm
<实施例7-11>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)苯甲酰胺(7k)的制备
将0.136ml(0.965mmol)的三乙胺和0.096ml(0.827mmol)苯甲酰氯顺序地加入10ml含有167mg(0.689mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌12小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:5)纯化,从而得到206mg(86%)白焦糖相,即,化合物7k。
<实施例7-12>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-氟苯甲酰胺(7l)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.119ml(0.990mmol)4-氟苯甲酰氯依次加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌5小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:5)纯化,从而得到218mg(72%)白色固体,即,化合物7l。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.86(br s,1H),7.93-7.98(m,2H), 7.31-7.46(m,5H),7.06-7.13(m,2H),4.76(s,2H),2.39(s,3H),2.27(s,3H),2.17(s,3H)ppm
<实施例7-13>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(7m)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.135ml(0.990mmol)4-甲氧基苯甲酰氯顺序地加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌4小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:3)纯化,从而得到220mg(71%)白色固体,即,化合物7m。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.61(br s,1H),7.91(dd,J=6.8,1.9Hz,2H),7.31-7.46(m,5H),6.91(dd,J=6.9,1.9Hz,2H),4.75(s,2H),3.83(s,3H),2.40(s,3H),2.26(s,3H),2.16(s,3H)ppm
<实施例7-14>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺(7n)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.197ml(0.990mmol)4-叔丁基苯甲酰氯顺序地加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌3小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:5)纯化,从而得到218mg(66%)白色固体,即,化合物7n。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.96(br s,1H),7.89(dd,J=6.7,1.7Hz,2H),7.31-7.47(m,7H),4.76(s,2H),2.40(s,3H),2.26(s,3H),2.17(s,3H),1.32(s,9H)ppm
<实施例7-15>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺(7o)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和186mg(0.990mmol)胡椒酸酰氯(piperonyloylchloride)依次加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌5小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:5)纯化,从而得到233mg(73%)白色固体,即,化合物7o。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.86(br s,1H),7.31-7.52(m,7H),6.80(d,J=8.1Hz,1H),6.00(s,2H),4.75(s,2H),2.39(s,3H),2.25(s,3H),2.14(s,3H)ppm
<实施例7-16>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-1-萘甲酰胺(7p)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.153ml(0.990mmol)1-萘酰氯顺序地加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌2小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:5)纯化,从而得到170mg(60%)白色固体,即,化合物7p。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.69(br s,1H),8.49-8.53(m,1H),7.83-7.95(m,3H),7.31-7.58(m,8H),4.76(s,2H),2.35(s,3H),2.28-2.29(m,6H)ppm
<实施例7-17>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)噻吩-2-甲酰胺(7q)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.109ml(0.990mmol)2-噻吩碳酰氯依次加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌5小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:5)纯化,从而得到188mg(64%)黄焦糖相,即,化合物7q。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ7.74(dd,J=3.7,1.0Hz,1H),7.33-7.49(m,6H),7.05(dd,J=4.9,3.7Hz,1H),4.76(s,2H),2.40(s,3H),2.25(s,3H),2.18(s,3H)ppm
<实施例7-18>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2-乙基丁酰胺(7r)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.140ml(0.990mmol)2-乙基丁酰氯依次加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌3小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:2)纯化,从而得到215mg(76%)白色固体,即,化合物7r。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ7.77(br s,1H),7.30-7.46(m,5H),4.74(s,2H),2.40(s,3H),2.22(s,3H),2.15-2.18(m,1H),2.10(s,3H),1.68-1.83(m,2H),1.49-1.65(m,2H),0.98(t,J=7.4Hz,3H)ppm
<实施例7-19>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2-苯氧基乙酰胺(7s)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.140ml(0.990mmol)苯氧基乙酰氯依次加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中, 然后,将混合溶液在室温下搅拌2小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:2)纯化,从而得到263mg(85%)白色固体,即,化合物7s。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.53(br s,1H),7.29-7.47(m,7H),6.94-7.05(m,3H),4.76(s,2H),4.64(s,2H),2.44(s,3H),2.25(s,3H),2.12(s,3H)ppm
<实施例7-20>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2-苯基丁酰胺(7t)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.169ml(0.990mmol)2-苯基丁酰氯依次加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌5小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:3)纯化,从而得到248mg(77%)黄色的糖稀相,即,化合物7t。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ7.90(br s,1H),7.20-7.45(m,10H),4.72(s,2H),3.45(t,J=7.4Hz,1H),2.34(s,3H),2.16-2.27(m,4H),1.94(s,3H),1.74-1.89(m,1H),0.88(t,J=7.3Hz,3H)ppm
<实施例7-21>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2,4,6-三甲基苯甲酰胺(7u)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.168ml(0.990mmol)2,4,6-三甲基苯甲酰氯依次加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌12小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml 水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:4)纯化,从而得到104mg(33%)白色固体,即,化合物7u。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ7.56(br s,1H),7.32-7.48(m,5H),6.85(s,2H),4.76(s,2H),2.41(s,9H),2.27(s,9H)ppm
<实施例7-22>3-苄氧基-N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)苯甲酰胺(7v)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和260mg(0.990mmol)3-苄氧基苯甲酰氯依次加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌3小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:3)纯化,从而得到276mg(74%)白色固体,即,化合物7v。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.46(br s,1H),7.31-7.57(m,13H),7.13(dd,J=7.8,2.4Hz,1H),5.08(s,2H),4.75(s,2H),2.42(s,3H),2.27(s,3H),2.17(s,3H)ppm
<实施例7-23>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-3,5,5-三甲基己酰胺(7w)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.192ml(0.990mmol)3,5,5-三甲基己酰氯依次加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌3小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:2)纯化,从而得到268mg(85%)黄色固体,即,化合物7w。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.47(br s,1H),7.30-7.46(m,5H),4.74(s,2H),2.35-2.48(m,4H),2.23(s,3H),2.15-2.19(m,2H),2.12(s,3H),1.30(dd,JJ=14.0,3.4Hz,1H),1.12(dd,JJ=14.0,6.2Hz,1H),1.04(d,J=6.1Hz,3H),0.90(s,9H)ppm
<实施例7-24>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2-(4-氯苯基)乙酰胺(7x)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.149ml(0.990mmol)4-氯苯乙酰氯依次加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌2小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:1)纯化,从而得到235mg(72%)象牙固体,即,化合物7x。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.29(br s,1H),7.21-7.44(m,9H),4.74(s,2H),3.68(s,2H),2.36(s,3H),2.21(s,3H),2.04(s,3H)ppm
<实施例7-25>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2,2-二氯乙酰胺(7y)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和0.097ml(0.990mmol)二氯乙酰氯顺序地加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在室温下搅拌4小时。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:3)纯化,从而得到217mg(74%)白色固体,即,化合物7y。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ9.53(br s,1H),7.31-7.44(m,5H),6.10(br s,1H),4.77(s,2H),2.42(s,3H),2.25(s,3H),2.14(s,3H)ppm
<实施例7-26>N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)肉桂酰胺(7z)的制备
将0.161ml(1.155mmol)的三乙胺和142mg(0.833mmol)肉桂酰氯顺序地加入10ml含有200mg(0.825mmol)化合物6的CH2Cl2中,然后,将混合溶液在冰冻条件下搅拌30分钟。将反应溶液用100ml CH2Cl2稀释,然后,用10ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次,再用10ml水洗涤两次。CH2Cl2溶液用饱和盐水洗涤,并用无水MgSO4干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过柱层析(EtOAc:己烷=1:3)纯化,从而得到211mg(69%)白色固体,即,化合物7z。
1H-NMR(250MHz,CHCl3-d)δ8.37(br s,1H),7.72(d,J=16Hz,1H),7.33-7.51(m,10H),6.67(d,J=16Hz,1H),4.77(s,2H),2.43(s,3H),2.25(s,3H),2.17(s,3H)ppm
<实施例8>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)酰胺衍生物(8a到8z)的制备
每种N-(5-苄氧基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)酰胺衍生物以图2所示的下列方法制备。
<实施例8-1>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)乙酰胺(8a)的制备
将33mg10%的Pd/C添加到5ml包含164mg(0.577mmol)化合物7a的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌4小时。然后,将反应溶液过滤并在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到105mg(94%)的浅黄色固体,即化合物8a。
1H-NMR(250MHz,CH3OH-d4)δ2.30(s,3H),2.15(s,3H),2.08(s,3H),2.05(s,3H)ppm
<实施例8-2>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)十二烷酰胺(8b) 的制备
将25mg10%Pd/C添加到5ml包含130mg(0.306mmol)化合物7b的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌10小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到77mg(75%)的浅黄色固体,即化合物8b。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ9.60(s,1H),2.28(s,3H),2.15-2.26(m,2H),2.11(s,3H),1.94(s,3H),1.44-1.54(m,2H),1.23(s,16H),0.85(t,J=5.5Hz,3H)ppm
<实施例8-3>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-氯丁酰胺(8c)的制备
将21mg10%Pd/C添加到5ml包含102mg(0.294mmol)化合物7c的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌4小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到75mg(99%)的黄色固体,即化合物8c。
1H-NMR(250MHz,CH3OH-d4)δ3.64(t,J=6.3Hz,2H),2.55(t,J=7.2Hz,2H),2.33(s,3H),2.18(s,3H),2.12(t,J=7.0Hz,2H),2.07(s,3H)ppm
<实施例8-4>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)异丁酰胺(8d)的制备
将31mg10%Pd/C添加到5ml包含155mg(0.496mmol)化合物7d的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下在室温搅拌3小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到95mg(86%)的白色固体,即化合物8d。
1H-NMR(250MHz,CH3OH-d4)δ2.55-2.72(m,1H),2.33(s,3H),2.18 (s,3H),2.05(s,3H),1.22(s,3H),1.19(s,3H)ppm
<实施例8-5>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-3-甲基丁酰胺(8e)的制备
将34mg10%Pd/C添加到5ml包含170mg(0.520mmol)化合物7e的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌4小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到102mg(82%)的白色固体,即化合物8e。
1H-NMR(250MHz,CH3OH-d4)δ2.33(s,3H),2.20-2.25(m,2H),2.18(s,3H),2.12-2.15(m,1H),2.07(s,3H),1.02(s,3H),1.00(s,3H)ppm
<实施例8-6>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)新戊酰胺(8f)的制备
将32mg10%Pd/C添加到5ml包含160mg(0.490mmol)化合物7f的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌10小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到80mg(69%)的白色固体,即化合物8f。
1H-NMR(250MHz,CH3OH-d4)δ2.38(s,3H),2.23(s,3H),2.08(s,3H),1.30(s,9H)ppm
<实施例8-7>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)环戊烷甲酰胺(8g)的制备
将20mg10%Pd/C添加到5ml包含108mg(0.319mmol)化合物7g的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下在室温搅拌10小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到66mg(83%)的白色固体,即化合物8g。
1H-NMR(250MHz,CH3OH-d4)δ2.77-2.86(m,1H),2.33(s,3H),2.19(s,3H),2.06(s,3H),1.61-1.96(m,8H)ppm
<实施例8-8>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)环己烷甲酰胺(8h)的制备
将15mg10%Pd/C添加到10ml包含73mg(0.207mmol)化合物7h的甲醇-四氢呋喃中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌4小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到54mg(99%)的白色固体,即化合物8h。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ9.43(s,1H),2.28(s,3H),2.11(s,3H),1.92(s,3H),1.62-1.81(m,4H),1.13-1.46(m,6H)ppm
<实施例8-9>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2-苯基乙酰胺(8i)的制备
将28mg10%Pd/C添加到5ml包含141mg(0.393mmol)化合物7i的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下在室温搅拌10小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到37mg(35%)的白色固体,即化合物8i。
1H-NMR(250MHz,CH3OH-d4)δ7.16-7.36(m,5H),3.63(s,2H),2.29(s,3H),2.11(s,3H),1.91(s,3H)ppm
<实施例8-10>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-3-苯基丙酰胺(8j)的制备
将58mg10%Pd/C添加到10ml包含291mg(0.779mmol)化合物7j的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下在室温搅拌4小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到186mg(84%) 的白色固体,即化合物8j。
1H-NMR(250MHz,CH3OH-d4)δ7.11-7.25(m,5H),2.98(t,J=7.3Hz,2H),2.68(t,J=7.9Hz,2H),2.33(s,3H),2.15(s,3H),1.89(s,3H)ppm
<实施例8-11>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)苯甲酰胺(8k)的制备
将37mg10%Pd/C添加到10ml包含186mg(0539mmol)化合物7k的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌4小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。通过柱层析将残留物纯化(EtOAC:己烷=1:1),然后将其在一定压力下压缩。将残留物再次在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到86mg(62%)的白色固体,即化合物8k。
1H-NMR(250MHz,CH3OH-d4)δ7.93-7.97(m,2H),7.44-7.59(m,3H),2.36(s,3H),2.21(s,3H),2.13(s,3H)ppm
<实施例8-12>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-氟苯甲酰胺(8l)的制备
将38mg10%Pd/C添加到10ml包含180mg(0.493mmol)化合物7l的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下在室温搅拌10小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到135mg(99%)的白色固体,即化合物8l。
1H-NMR(250MHz,CH3OH-d4)δ7.99-8.05(m,2H),7.18-7.25(m,2H),2.37(s,3H),2.22(s,3H),2.13(s,3H)ppm
<实施例8-13>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(8m)的制备
将40mg10%Pd/C添加到10ml包含200mg(0.531mmol)化合物7m的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌10小时。将反应溶液 过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到151mg(99%)的白色固体,即化合物8m。
1H-NMR(250MHz,CH3OH-d4)δ7.93-7.96(m,2H),6.99-7.03(m,2H),3.85(s,3H),2.37(s,3H),2.23(s,3H),2.13(s,3H)ppm
<实施例8-14>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺(8n)的制备
将40mg10%Pd/C添加到10ml包含205mg(0.509mmol)化合物7n的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌10小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到157mg(99%)的白色固体,即化合物8n。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ7.94(d,J=8.3Hz,2H),7.52(d,J=8.4Hz,2H),2.37(s,3H),2.19(s,3H),2.03(s,3H),1.31(s,9H)ppm
<实施例8-15>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺(8n)的制备
将44mg10%Pd/C添加到10ml包含222mg(0.568mmol)化合物7o的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌10小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到170mg(99%)的白色固体,即化合物8o。
1H-NMR(250MHz,CH3OH-d4)δ7.55(dd,J=8.1,1.8Hz,1H),7.40(d,J=1.2Hz 1H),6.89(d,J=8.1Hz,1H),6.03(s,2H),2.36(s,3H),2.23(s,3H),2.12(s,3H)ppm
<实施例8-16>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-1-萘甲酰胺(8p)的制备
将22mg10%Pd/C添加到5ml包含110mg(0.277mmol)化合物7p的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌10小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到104mg(99%)的白色固体,即化合物8p。
1H-NMR(250MHz,CH3OH-d4)δ8.31-8.35(m,1H),7.95-7.96(m,1H),7.86-7.89(m,2H),7.47-7.53(m,3H),2.42(s,3H),2.25(s,3H),2.23(s,3H)ppm
<实施例8-17>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)噻吩-2-甲酰胺(8q)的制备
将0.91ml(0.91mmol)的1M BCl3逐滴添加到10ml包含160mg(0.454mmol)化合物7q和201mg(1.362mmol)五甲基苯的CH2Cl2中,然后将混合溶液在冰浴条件下冷却再搅拌30分钟。将1ml CHCl3/MeOH(9:1)添加到反应溶液中,然后将混合液在室温下搅拌1小时。将反应溶液在一定压力下浓缩,然后通过柱层析纯化残留物(CHCl3:MeOH=9:1),从而得到115mg(96%)的黄色固体,即化合物8q。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ10.2(s,1H),8.56(s,1H),7.98(d,J=3.1Hz,1H),7.80(d,J=4.5Hz,1H),7.17-7.21(m,1H),2.33(s,3H),2.16(s,3H),2.02(s,3H)ppm
<实施例8-18>2-乙基-N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)丁酰胺(8r)的制备
将30mg10%Pd/C添加到10ml包含150mg(0.441mmol)化合物7r的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌5小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到110mg(99%)的白色固体,即化合物8r。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ9.55(s,1H),2.29(s,3H),2.16-2.25(m,1H),2.12(s,3H),1.97(s,3H),1.33-1.64(m,4H),0.90(t,J=7.4Hz,6H)ppm
<实施例8-19>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2-苯氧基乙酰胺(8s)的制备
将30mg10%Pd/C添加到10ml包含150mg(0.398mmol)化合物7s的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌5小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到120mg(99%)的白色固体,即化合物8s。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ9.79(s,1H),7.27-7.35(m,2H),6.94-7.02(m,3H),4.66(s,2H),2.30(s,3H),2.13(s,3H),1.97(s,3H)ppm
<实施例8-20>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2-苯基丁酰胺(8t)的制备
将35mg10%Pd/C添加到10ml包含176mg(0.453mmol)化合物7t的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下室温搅拌4小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到135mg(99%)的黄色固体,即,化合物8t。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ9.81(s,3H),8.44(s,1H),7.19-7.40(m,5H),3.57(dd,J=8.6,6.5Hz,1H),2.26(s,3H),2.09(s,3H),1.97-2.06(m,1H),1.80(s,3H),1.61-1.72(m,1H),0.88(t,J=7.3Hz,3H)ppm
<实施例8-21>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-2,4,6-三甲基苯甲酰胺(8u)的制备
将19mg10%Pd/C添加到10ml包含94mg(0.242mmol)化合物7u的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下在室温搅拌7小时。将反应溶 液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到72mg(99%)的白色固体,即化合物8u。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ9.82(s,1H),6.88(s,2H),2.33(s,9H),2.25(s,3H),2.16(s,3H),2.15(s,3H)ppm
<实施例8-22>3-羟基-N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)苯甲酰胺(8v)的制备
将30mg10%Pd/C添加到10ml包含150mg(0.33mmol)化合物7v的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下在室温搅拌3小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到42mg(47%)的白色固体,即化合物8v。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ10.02(s,1H),7.24-7.43(m,3H),6.95(dd,J=7.6,2.1Hz,1H),2.32(s,3H),2.16(s,3H),2.00(s,3H)ppm
<实施例8-23>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)-3,5,5-三甲基己酰胺(8w)的制备
将37mg10%Pd/C添加到12ml包含186mg(0.48mmol)化合物7w的甲醇中,然后将混合溶液在氢气环境下在室温搅拌4小时。将反应溶液过滤,且滤液在一定压力下浓缩。将残留物在甲醇中溶解,使用注射过滤器(AdvantecTM JP050AN)过滤,然后浓缩,从而得到130mg(93%)的黄色固体,即化合物8w。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ9.52(s,1H),2.28(s,3H),2.18-2.25(m,1H),2.11(s,3H),2.04-2.09(m,2H),1.96(s,3H),1.31(dd,J=13.8,3.0Hz,1H),1.07(dd,J=13.9,6.2Hz,1H),0.97(d,J=6.1Hz,3H),0.89(s,9H)ppm
<实施例8-24>2-(4-氯苯基)-N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基) 乙酰胺(8x)的制备
将0.66ml(0.66mmol)的1M BCl3逐滴添加到5ml包含130mg(0.329mmol)化合物7x和146mg(0.987mmol)五甲基苯的CH2Cl2中,然后将混合溶液在冰浴冷却搅拌2小时。将1mlCHCl3/MeOH(9:1)添加到反应溶液中,然后将混合液在室温下搅拌1小时。将反应溶液在一定压力下浓缩,然后通过柱层析纯化残留物(CHCl3:MeOH=9:1),从而得到94mg(94%)的白色固体,即化合物8x。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ9.85(br s,1H),8.46(s,1H),7.32-7.40(m,4H),3.59(s,2H),2.29(s,3H),2.10(s,3H),1.87(s,3H)ppm
<实施例8-25>2,2-二氯-N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)乙酰胺(8y)的制备
将0.91ml(0.91mmol)的1M BCl3逐滴添加到7ml包含161mg(0.456mmol)化合物7y和203mg(1.367mmol)五甲基苯的CH2Cl2中,然后将混合溶液在冰浴冷却搅拌1小时。将1mlCHCl3/MeOH(9:1)添加到反应溶液中,然后将混合液在室温下搅拌1小时。将反应溶液在一定压力下浓缩,然后通过柱层析纯化残留物(CHCl3:MeOH=9:1),从而得到110mg(92%)的白色固体,即化合物8y。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ10.34(br s,1H),8.64(br s,1H),6.60(s,1H),2.31(s,3H),2.14(s,3H),1.98(s,3H)ppm
<实施例8-26>N-(5-羟基-3,4,6-三甲基吡啶-2-基)肉桂酰胺(8z)的制备
将0.75ml(0.75mmol)的1M BCl3逐滴添加到7ml包含140mg(0.376mmol)化合物7z和167mg(1.127mmol)五甲基苯的CH2Cl2中,然后将混合溶液在冰浴冷却搅拌2小时。将1mlCHCl3/MeOH(9:1)添加到反应溶液中,然后将混合液在室温下搅拌1小时。将反应溶液在一定压力下浓缩,然后通过柱层析纯化残留物(CHCl3:MeOH=9:1),从而得到45mg (42%)的黄色固体,即化合物8z。
1H-NMR(250MHz,DMSO-d6)δ10.34(br s,1H),8.64(br s,1H),6.60(s,1H),2.31(s,3H),2.14(s,3H),1.98(s,3H)ppm
<实验例1>通过CAM分析评价血管生成的抑制作用
为通过体内实验来确认血管生成的抑制作用,进行绒毛尿囊膜(CAM)分析(参考Nguyen M等,Microvascular Res.,47,pp31-40,1994)。鸡的受精卵在维持温度为37℃、相对湿度为55%的条件下培养。在培养的第十天,使用注射针(Green Cross Medical Corp,韩国)在空气囊部分制作第一小孔,然后,在受精卵平坦部分制作第二孔以在其上制作窗口。空气通过第一孔排出,即,空气囊部分,因此CAM从受精卵的壳分离。然后,使用砂轮(Multipro 395JA,Dremel,墨西哥)来切割空气囊部分,从而在其上制作窗口。接着,沃特曼(Whatman)过滤盘#1(沃特曼公司,美国)经3mg/ml的醋酸可的松处理、干燥,然后通过浓度为20ng/CAM的VEGF润湿。通过窗口将过滤盘置于血管上,然后每种根据上述实施例制备的化合物在DMSO中溶解,并用PBS稀释,然后处理为各种浓度。化合物经处理3天后,过滤盘置于其上的CAM部分被分离,并用PBS洗涤。使用Stemi SV6立体显微镜(Carl Zeiss,德国)和Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics;Silver Spring,MD,USA)捕获CAM部分的图像,以测量血管的数量并分析从其得到的数据。
因此,如下面表1所示,可以确认的是,在VEGF上血管生成的增长通过本发明的化合物(每个CAM用0.01mnol的每种化合物处理)处理后下降。此外,大多数情况下观察到良好的血管生成抑制作用。此外,如表3所示,CAM经每种浓度的化合物8a、8b和8g处理后计算ID50,结果如下:1.7pg/CAM(8.7fmol/CAM),5.0pg/CAM(14.9fmol/CAM),and 0.9pg/CAM(3.6fmol/CAM)。
[表1]
#:P<0.05相比于VEGF处理组。
<实验例2>测量HUVEC细胞中活性氧(ROS)清除作用
为了测量VEGF诱导的HUVEC细胞中ROS的清除作用,使用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)。在细胞中存在ROS的情况下,DCF-DA被氧化成荧光的DCF,且相应地显示出绿色荧光。DCF-DA以浓度1x105分到8孔板中,每个孔中涂覆有0.2%的明胶,DCF-DA培养24小时。同时,对化合物8a和8b预处理3小时,经VEGF诱导15分钟,然后用PBS(pH7.4)清洗3次。然后,10μM的DCF-DA置于EBM-2培养基在暗室中处理30分钟。然后,再次用PBS清洗DCF-DA三次,然后使用荧光显微镜测量细胞内荧光强度。
因此,如图4所示,与细胞经过VEGF诱导的实例相比,化合物8a和8b经过处理的实例在细胞内荧光强度显示出显著下降。
<实验例3>测量由黄斑变性风险因素诱导的ROS的清除作用
根据与实验例2相似的方式,例如4-羟基(4-HNE)或血管紧张素II(Ang II)等黄斑变性的风险因子经成人视网膜色素上皮19(ARPE-19)细胞系处理,以便观察化合物8a和8b中ROS的清除作用。
结果如图5和6所示,可以确认的是,与对照组相比,化合物8a和8b经处理的实例表现出荧光强度明显的下降。
由于ROS的出现,例如4-HNE或AngⅡ的黄斑变性的风险因子引起ARPE细胞内的细胞损伤,并最终可能导致玻璃(Bruch)膜的损伤和血管生成,导致黄斑变性和失明。基于实验数据,可以确认的是,化合物8a和8b强烈地抑制4-HNE和AngⅡ上ROS的生成,即,化合物8a和8b对黄斑变性具有治疗效果。
<实验例4>在HT-29肠上皮细胞内氨基吡啶衍生物对单核肠上皮细胞粘附的抑制作用
HT-29细胞在24孔板上以2x10个细胞/cm2的浓度培养,同时,每种浓度的氨基吡啶化合物8a到8z在无血清、仅有1%PS补充的培养基中预处理1小时。接着,10ng/ml的TNF-α经处理因而使反应在37℃进 行3小时。反应完成后,去除HT-29细胞的培养基,然后用PBS清洗一次HT-29细胞。之后,经处理并与10μg/mL的BCECF-AM在37℃下反应30分钟的U937细胞可与HT-29细胞在37℃下反应1小时。然后,为去除未粘附到HT-29细胞上的U937细胞,将已反应的细胞用PBS清洗两次。在细胞溶解方面,0.1M的Tris中0.1%Triton X-100可与所述细胞在室温下反应30分钟,然后,通过使用Fluostar optima酶标仪(BMG Labtechnologies,德国)测量其荧光对所述细胞进行量化。
因此,在下面的表2中,示出氨基吡啶化合物8a到8z对TNF-α诱导的来自人上皮细胞(即,HT-29)和单核细胞(即,U937)粘附的抑制作用。此处,*表示与经TNF-α处理的大鼠实例相比,P值小于0.05的实例。如图2所示,可以确认的是,氨基吡啶化合物8a到8z抑制经TNF-α诱导肠上皮细胞和U937细胞之间的粘附。
[表2]
基于上述结果,可以确定的是,当氨基吡啶衍生物8a到8z抑制炎症细胞的粘附时,如与炎症细胞移动和癌症侵袭密切相关的嗜中性粒细胞和淋巴细胞,炎症反应也可被抑制。
<实验例5>使用经2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的炎症性肠疾病模型的氨基吡啶衍生物的肠炎的抑制作用
为观察本发明的化合物对结肠炎的缓解作用,经TNBS诱导并具有结肠炎的动物模型用于该实验。此处使用的动物为购自SamtacoBio Korea的7到8周的Sprague Dawlay品种。购买之后,在用于实验之前,用典型固体饲料将所述动物稳定化2天。实验过程中,为动物自由地提供饲料和水,并使动物停留在维持笼子温度大约为25±1℃且相对湿度大约为50±10%的环境中。笼子配备有自动照明系统以调节12小时的明暗周期。
对于实验组,根据随机区组设计使用5组(即,一组对照,一组仅施用TNBS,一组施用TNBS+300mg/kg的5-ASA组合,一组施用TNBS+0.1mg/kg的8a和8j组合,和一组施用TNBS+1.0mg/kg的8a和8j组合),其中每组由6只平均重量大约为180±10g的大鼠组成。大鼠已禁食24小时经乙醚(Et2O)麻醉,然后,使用连接有聚乙烯导管的1ml注射器经肛门将0.8ml3%的TNBS缓慢注射进入结肠灌肠,其中,TNBS用50%(v/v)乙醇稀释。为防止3%的TNBS从肛门泄露,将大鼠上下翻转并静置60分钟。
对于对照组,仅媒介物(50%(v/v)乙醇)以与其他实验组制备相同的方式注入对照组大鼠。为检测药物效果,禁食24小时后,从TNBS治疗的第二天到第五天在某一时间一天一次为大鼠施用药物,即,0.1mg/kg或1.0mg/kg的化合物8a和8j。对于对照实验材料,作为用于IBDs最知名的治疗剂的柳氮磺胺吡啶的活性代谢物5-ASA用作阳性对照组。
所有大鼠在施用TNBS的第七天被解剖。溃疡和结肠炎的可视严重程度由没有参加实验的两名研究员评估。收获大鼠大肠后,以1cm的尺寸切割从肛门5到6cm距离的组织,然后在组织中进行肠重量和过氧化物酶(MPO)活化的测量,并执行活检。此外,通过使用数字质量流量计可观察到所有实验中所用动物从禁食步骤、TNBS施用和药物施用的重量的变化。考虑到实验室动物的管理和使用,根据岭南大学(Yeungnam University)实验动物资源的机构准则执行动物实验。
图7到10示出氨基吡啶化合物8a和8j对TNBS诱导的大鼠的结肠炎的作用。图7示出每天记录的大鼠从施用测试物质的第一天到第六天的重量变化,图8示出经肉眼观察的大肠情况的视图,图9是示出大肠重量的视图,且图10是示出MPO活性测量的视图。此处,*表示与大鼠 既未经药物、也未经TNBS处理的实例相比,P值小于0.05的实例,而且#表示与大鼠经TNBS处理的实例相比,P值小于0.05的实例。
如图7所示,在大鼠重量范围从约180g到190g、具有结肠炎并通过使用3%TNBS引起肠道炎症的动物模型中,重量变化在某一时间定期观察5天。基于还未经TNBS处理的大鼠的重量,可以确认的是,经媒介物处理的对照组大鼠的重量持续增加,且经TNBS处理的组大鼠的重量持续减少,但在第五天略有回升。然而,TNBS处理的组恢复的重量仍然明显小于正常组中大鼠的重量。经300mg/kg 5-ASA处理的阳性组中大鼠的重量在第三天缓慢恢复,最终,阳性组中的大鼠具有比仅施用TNBS的组中大鼠更重的重量。经TNBS处理并施用1.0mg/kg的化合物8a的组中的大鼠与只用TNBS处理的组的大鼠相比,在第三天呈现重量上的快速增长,从而与经5-ASA处理的组相比,最终表现出优秀的重量恢复。在为大鼠施用1.0mg/kg化合物8j的实例中,明显的重量恢复和增长的重量在第二天立刻显出,从而非常接近正常组中大鼠的重量。
图8示出完成5天的药物施用后获得并用肉眼观察的大肠的情况。此处,可以观察到的是,与经媒介物处理的正常组的大鼠的大肠相比,经TNBS处理的组中大鼠的大肠已经肿胀和发红,此外,表现出阑尾肿胀、充血和粘连。在经5-ASA(100mg/kg)处理的阳性对照组中,可以确定的是,与仅经TNBS处理的组相比,肉眼观察到的症状和其他器官或红肿的大肠之间的粘连得到抑制。即,施用化合物8a和8j(1.0mg/kg)的组表现出对肿胀和充血良好的抑制作用。
此外,图9示出获得大鼠大肠之后测量的组织重量,且可以确定的是,与经媒介物处理的正常组相比,仅经TNBS处理的组在具有肿胀的肠重量上有明显增加。在经5-ASA(100mg/kg)处理的阳性对照组中,可以确定的是,肠重量与经TNBS处理的组的肠重量相比明显下降。还可以观察到的是,在经化合物8a和8j(1.0mg/kg)处理的组中,肠重量明显 下降。
图10是表示MPO活性的图表,其中MPO是主要存在于嗜中性粒细胞中的酶。组织中MPO的激活是入侵的嗜中性粒细胞的指标,即,MPO的激活是炎症性疾病的指标,根据炎性结肠炎和它们之间的粘连表明肠中的损坏水平。
为测量MPO的活性,使用MPO分析。大肠组织用冷的PBS清洗,并测量其重量。然后,为每10mg组织重量加入200μL裂解缓冲液(pH7.4,200mM NaCl,5mM EDTA,10mM Tris,10%甘油),然后,组织均化器(Bio homogenizer M133,BIOSPEC PRODUCTS Inc.USA)在均质化方面使用30秒钟。均质化的样品进行两次离心(1500xg),每次15分钟。由此得到的上清液通过使用MPO ELISA试剂盒(HK210,Hycult Biotechnology,荷兰)来用于测量MPO的活性。将100μL上清液加入到96井板中以允许反应在室温下进行1小时,其中每个井涂覆有抗小鼠MPO抗体,随后用PBS清洗三次。此处,将100μL重构示踪剂加入其中以使反应在室温下进行1小时,随后重复清洗三次。然后,将100μL链霉亲和素过氧化物酶缀合物加入其中以使反应在室温下进行1小时,随后清洗。然后,将100μL TMB底物溶液加入其中以允许反应进行30分钟。然后,将100μL静态溶液加入其中以停止反应,然后在450nm波长测定吸光度。MPO的活性是指1μM的过氧化氢在水中在25℃一分钟内减少的水平,也指计算为1ml大肠组织匀浆包含的MPO的量的水平。此处,*表示与大鼠既未经药物、也未经TNBS处理的实例相比,P值小于0.05的实例,而且#表示与大鼠经TNBS处理的实例相比,P值小于0.05的实例。
如图10所示,可以确定的是,与对照组的MPO的活性相比,仅经TNBS处理的组表现出MPO的活性明显增加,且施用5-ASA(100mg/kg)的组与对照组的MPO的活性相比,表现出MPO的活性明显下降。此外, 可观察到的是,经化合物8a(1.0mg/kg)处理的组与仅经TNBS处理的MPO的活性相比,表现出较低的MPO活性,从而与经5-ASA(100mg/kg)处理的组相比,在大肠组织上表现出良好的抑制MPO活性的效果。
<实验例6>肿瘤引起的血管生成和肿瘤生长的抑制效果的评价
为了确认在体内实验中对血管生成的抑制作用,进行了CAM分析(参考Nguyen M等,Microvascular Res.,47,pp31-40,1994)。将鸡受精卵于温度为37℃、相对湿度55%的条件下培养。在培养的第9天,用皮下注射针(Green Cross Medical Corp.,韩国)在气囊部位制作第一小孔,在受精卵平整部位制作第二孔以在其上形成窗口。通过第一孔将空气排出,即,气囊部分,相应地,从受精卵壳上分离出CAM。然后,用砂轮(Multipro 395JA,Dremel,墨西哥)将气囊部分切掉,从而在其上形成窗口。同时将A549肺癌细胞与基底膜基质按1:1比例混合,然后分别用化合物8a,8b和8g处理该混合物,随后以1.5×106个细胞/CAM的浓度接种。
接种5天后,将其上形成肿瘤的CAM部分分离,然后用PBS清洗。用Stemi SV6立体式显微镜(Carl Zeiss,德国)和Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics;Silver Spring,MD,美国)对CAM部分进行图像拍摄,以测量血管数目并分析其上数据。
因此,如下面图表3和图.11所示,可以确定的是,化合物8a,8b和8g(在各自密度下)可以抑制肿瘤形成过程中的血管生成和肿瘤生长。
[表3]
*:与媒介物处理组相比,P<0.05。
<实验例7>组织蛋白酶抑制剂对乳腺癌细胞侵袭的抑制效果的评价
为了检测在例如MDA-MB-231的转移性乳腺癌细胞侵袭过程中发挥的重要作用的组织蛋白酶的种类,使用包括组织蛋白酶B,D,K,L和S的抑制剂对乳腺癌细胞侵袭的抑制效果进行评价。
通过使用装配有孔径大小为8μm的孔尺寸过滤器的插入皿(BD FALCON,Bedford,美国)进行侵袭试验。插入皿(transwell insert)上部用20μl的基底膜基质(1mg/ml)涂覆,而其底部用30μlⅠ型胶原(0.5mg/ml)涂覆。将MDA-MB-231细胞(5×105个细胞/100μl)加入插入室中,然后也向其加入每种抑制剂。为了减少细胞的侵袭,在底室的每个井中加入了含有5%FBS的培养基,使其在37℃细胞培养箱中进行反应。18小时后,通过使用棉签除去插入室中的溶液,细胞被保留,膜底部的细胞用甲醇固定并用苏木精和伊红染色。通过显微镜观察在膜上存在的细胞,并在200倍下选择5个视场进行细胞计数。
因此,如下面表4所示,用组织蛋白酶B抑制剂(CA-074Me)、组织蛋白酶K抑制剂(Odanacatib)和组织蛋白酶S抑制剂(Z-FL-COCHO)处理的MDA-MB-231细胞与未经抑制剂处理的细胞相比,表现出细胞侵袭下降。特别地,组织蛋白酶S抑制剂处理后的MDA-MB-231细胞在抑制细胞侵袭方面表现出最优的效果(参照图12)。因此,可以确定的是,组织蛋白酶S在乳腺癌细胞侵袭过程中起了重要的作用。
[表4]
*:通过抑制剂减少的细胞数量百分比±标准差
#:与5%FBS处理组相比P<0.05
<实验例8>氨基吡啶衍生物对MBA-MB-231细胞侵袭的抑制效果评价
根据实验例7中同样的方式,评价上述实例中合成的氨基吡啶衍生物对如MDA-MB-231的乳腺癌细胞侵袭的抑制效果。在此,为了对比,评价如6-氨基-2,4,5-三甲基-3-羟基吡啶(BJ-1101)和6-二苯胺基-2,4,5-三甲基-3-羟基吡啶(BJ-1201)的各种氨基吡啶衍生物对如MDA-MB-231 的乳腺癌细胞侵袭的抑制作用。
[BJ-1101]
[BJ-1201]
因此,如下面表5所示,可以确定的是,例如BJ-1101和BJ-1201的氨基吡啶衍生物对如MDA-MB-231的乳腺癌细胞的侵袭并没有抑制作用,而化合物8l和8q对如MDA-MB-231的乳腺癌细胞的侵袭具有抑制作用。
[表5]
*:通过化合物所减少的细胞数量百分比±标准差
#:与5%FBS处理组相比,P<0.05
<实验例9>氨基吡啶衍生物对组织蛋白酶S表达的抑制作用的评价
为了评价当上述实例中合成的氨基吡啶衍生物经MDA-MB-231细胞处理时,所述氨基吡啶衍生物是否对组织蛋白酶S的基因表达有影响,按如下方式进行了反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)实验。
将本发明中的每种化合物分别经如MDA-MB-231的乳腺癌细胞(1×105细胞/cm2)处理,然后在细胞培养箱中37℃下培养24小时。然后,用Trizole试剂提取其全部mRNA。培养24小时后,去掉培养基,每井中加入1ml的Trizole试剂,然后将细胞悬浮液转移到1.5mL试管中。在每个样品中加入200μl的氯仿之后,将样品在4℃以12,000g离心15min。取500μl上清液转移到新的试管中。每个样品加入500μl异丙醇后将样品在4℃以12,000g离心15min。从每个样品中去除其上清液,沉淀干燥后,用75%乙醇洗涤样品以清洗mRNA。然后,将提取出的mRNA用不含RNA酶的水溶解,随后在55℃下加热10min。
RNA定量后,用GoScriptTM反转录系统(普洛麦格公司(Promega Corporation),麦迪逊(Madison),威斯康辛州(WI),美国)合成cDNA。在此,PCR实验通过使用TaKaRa TaqTM(Takara bio Inc.,志贺(Shiga), 日本)进行,其中引物组组织蛋白酶S由具有SEQ ID NO:1的正向引物(顺次序:5'-GCA GTG GCA CAG TTG CAT AA-3')和具有SEQ ID NO:2(逆次序:5'-AGC ACC ACA AGA ACC CAT GT-3')的反向引物组成。PCR产物进行琼脂糖电泳后,用溴化乙锭(0.5μg/ml)对PCR产物进行染色,从而通过使用凝胶图像系统(UVP,剑桥Cambridge,英国)得到的其图像。此处,用3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)对PCR产物进行定量分析。此处使用的GAPDH引物由具有SEQ ID NO:3的正向引物(顺次序:5'-GGT GAA GGT CGG AGT CAA CG-3')和具有SEQ ID NO:4(逆次序:5'-CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC-3')的反向引物组成。
因此,如表6所示,可以确定的是,对MDA-MB-231细胞的侵袭没有抑制作用的BJ-1101和BJ-1201对减弱组织蛋白酶S的基因表达也无作用。另外,可以确定的是,对癌细胞侵袭抑制作用最强的化合物8q也具有最强的减少组织蛋白酶S基因表达的作用。因此,可以确定的是,对MDA-MB-231细胞侵袭的抑制作用和对组织蛋白酶S基因表达的抑制作用彼此相关。
[表6]
*:基于未经化合物处理的PCR条带(对照组),通过化合物所减少的细胞数量百分比±标准差
<实验例10>对可以抑制乳腺癌细胞(如,MDA-MB-231)中组织蛋白酶S表达的化合物的筛选
如前面实验例所述,可以确定的是,组织蛋白酶S在如MDA-MB-231的乳腺癌细胞的侵袭中有着重要作用。此外,为了筛选其他可以抑制乳腺癌细胞新陈代谢的氨基吡啶衍生物,对组织蛋白酶S基因表达的抑制效果通过与实验例9相同的方式处理1μM的每种化合物来评价。
因此,如表7所示,化合物8a,8b,和8g对组织蛋白酶S的基因表达具有抑制作用,也就是说,这些化合物具有50%甚至更高的抑制率。因此,可以确定的是,这些化合物对转移性乳腺癌细胞的侵袭具有非常良好的抑制作用。
[表7]
*:基于未经化合物处理的PCR条带(对照组),通过化合物所减少的细胞数量百分比±标准差
<实施例11>毒性试验
在雄性Balb/c小鼠上,化合物8a用0.5%的甲基纤维素溶液按0.5g/kg,1g/kg,and2g/kg的剂量制成悬浮液。在此,仅通过单剂口服进行试验,然后对小鼠的存活率和重量观察7天。
如此给药后,观察实验动物的死亡率、临床症状和体重变化。将实验动物进行血液学和血液生化检验,并进行尸检观察腹部器官和胸部器官是否有异常。
因此,可以确定的是,所有实验动物并没有特别的临床症状和死亡,并且在体重、血液检测、血液生化检测和尸检方面没有发现毒性变化。
在上文,本发明中的化合物在2g/kg剂量下对小鼠没有表现出任何有毒的变化,因此,可以确定的是,因为口服半数致死量(LD50)至少是2g/kg,所以本发明中的化合物是安全物质。
下文中,结合制备实施例描述了包括根据本发明的化合物8a的组合物的制备方法。但是,应当理解,这些实施例仅限于对本发明公开内容的具体陈述,不限形式。
<制备实例1>粉剂制备
20mg化合物8a,100mg乳糖和10mg滑石粉混合,密封备用。
<制备实例2>片剂制备
20mg化合物8a,100mg玉米淀粉,100mg乳糖和2mg硬脂酸镁混合,然后用制备片剂的常规工艺方法压成片。
<制备实例3>胶囊制备
10mg化合物8a,100mg玉米淀粉,100mg乳糖和2mg硬脂酸镁根 据常规工艺方法混合,然后将混合物装在明胶胶囊中制成胶囊。
<制备实例4>注射剂制备
10mg化合物8a和适量的注射用无菌蒸馏水和pH调节剂混合,然后将混合物根据制备注射剂的常规工艺方法,按2mL每安培瓶准备。
<制备实例5>药膏制备
10mg化合物8a,250mg PEG-4000,650mg PEG-400,10mg白凡士林,1.44mg甲基ρ-羟苯酸酯,0.18mg丙基ρ-羟苯酸酯,与剩余部分纯化水混合,然后将混合物按照制备药膏的常规工艺方法制成药膏。
应当认识到,所述示例性实施方式在此仅作为思想的一种描述而不具有限定目的。每个示例性实施方式中对其特征或功能的描述应被默认为同样适用于其他示例性实施方式中相似的特征或功能。
当一个或多个示例性实施方式的特征以所引用图片作为描述的时候,应当被理解为:那些在形式和细节上通过常规技术手段对其进行的替换和变化并不脱离随附权利要求书所界定的实质和范围。