WO2018101793A2 - 아미드 유도체 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 이를 포함하는 피부 노화 억제, 주름 개선, 또는 피부 상처 치료용 약학적 또는 화장료 조성물 - Google Patents

아미드 유도체 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 이를 포함하는 피부 노화 억제, 주름 개선, 또는 피부 상처 치료용 약학적 또는 화장료 조성물 Download PDF

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    • C07D263/30—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D263/34—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D263/48—Nitrogen atoms not forming part of a nitro radical

Definitions

  • the skin is a membrane that covers the outside of the body.
  • the most important role of the skin is to act as a defensive barrier that protects the skin from external bacterial invasion and damage while preventing heat and moisture loss from the inside. will be.
  • Wound healing is an essential response to normalize the function and morphology of the damaged tissue (Woodley, DT et al., J. Am. Acad. Dermatol., 12 (2Pt2), 420-). 433, 1985; Orgill D. et al., CRC, 2009). Wounds that occur in the body naturally go through a series of healing processes, which can be divided into inflammation, proliferation, and remodeling / maturation stages. The process is accomplished by the complex organic interactions between the various factors and tissues derived by the fields and cells. Depending on the severity of the wound, it may take longer to heal the wound. The longer the wound, the greater the chance of scarring and the possibility of secondary infection. Therefore, the development of materials for promoting such scar prevention, secondary infection prevention and rapid wound healing has a very important meaning.
  • Sirtuin is a protein deacetylase produced by some tissues of the body, such as the brain, liver, and kidneys.
  • sirtuin 1 (hereinafter referred to as Sirt1) is used for inflammation, oxidative damage, It is importantly involved in diseases such as apoptosis, diabetes and aging.
  • Valente, S. et al., J Med Chem., 59 (4), 1471-1491, 2016; Wang, Y. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 54 (5), 3806-3814, 2013, reported that Sirt1 is capable of healing skin wounds.
  • resveratrol the Sirt1 activator, is used in the healing process.
  • Amide derivative compounds, stereoisomers, derivatives, solvates, or pharmaceutically acceptable salts thereof are provided.
  • a cosmetic composition for anti-aging or skin wrinkle improvement comprising an amide derivative compound, a stereoisomer, derivative, solvate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a method for inhibiting skin aging or skin wrinkle improvement using the same.
  • Amide derivative compounds their stereoisomers, derivatives, solvates, or pharmaceutically acceptable salts thereof, for preventing skin aging, preventing or treating skin wrinkles, or pharmaceutical compositions for treating skin wounds and inhibiting skin aging using the same, skin
  • a method of preventing or treating wrinkles or treating skin wounds is provided.
  • compositions for treating skin wounds comprising an amide derivative compound, stereoisomers, derivatives, solvates, or pharmaceutically acceptable salts thereof, and a method for treating skin wounds using the same.
  • One aspect provides a compound represented by Formula 1, a stereoisomer, derivative, solvate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • R 1 , R 2 , R 4 , and R 5 are independently of each other a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen group, a substituted or unsubstituted C 1 to C 6 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 1 to C 6 alkoxy group, substituted or unsubstituted C 1 to C 3 haloalkyl group, phenyl, or a combination thereof.
  • R 3 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen group, a substituted or unsubstituted C 1 to C 6 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 1 to C 6 alkoxy group, a substituted or unsubstituted C 1 To C 3 haloalkyl group, substituted or unsubstituted C 3 to C 8 heterocycloalkyl group, substituted or unsubstituted C 1 to C 6 amine group, or a combination thereof.
  • At least one of R 2 , R 3 , R 4 , and R 5 may not be hydrogen. At least one of R 2 , R 3 , R 4 , and R 5 is a hydroxy group, a halogen group, a substituted or unsubstituted C 1 to C 6 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 1 to C 6 alkoxy group, a substituted or Unsubstituted C 1 to C 3 haloalkyl group, phenyl, substituted or unsubstituted C 3 to C 8 heterocycloalkyl group, or a combination thereof.
  • R 2 , R 3 , R 4 , and R 5 may be Cl, F, Br, -CF 3 , tert-butyl (t-Bu), methyl, methoxy, tert-butoxy (t -BuO-), phenyl, morpholinophenyl, piperidine, pyrrolidine, piperazine, azepan, dimethylamino, or a combination thereof.
  • substituted refers to the introduction of an atom group instead of a hydrogen atom when one or more hydrogen atoms in the organic compound are substituted with another atom group to form a derivative.
  • Substituents include, for example, a halogen atom, a halogen atom, a C 1 to C 20 alkyl group substituted with a halogen atom (eg CCF 3 , CHCF 2 , CH 2 F, CCl 3, etc.), C 1 to C 20 alkoxy, C 2 to C 20 alkoxyalkyl, hydroxy group, nitro group, cyano group, amino group, amidino group, hydrazine, hydrazone, carboxyl group or salts thereof, sulfonyl group, sulfamoyl group, sulfonic acid group or salt thereof, phosphoric acid or its Salt, or a C 1 to C 20 alkyl group, C 2 to C 20 alkenyl group, C 2 to C 20 alkyl group substituted
  • halogen refers to an atom belonging to group 7 of the periodic table.
  • Halogen atoms include fluorine (F), chlorine (Cl), bromine (Br), iodine (I) and the like.
  • alkyl refers to a fully saturated branched or unbranched (or straight or linear) hydrocarbon.
  • the alkyl is C 1 To C 6 , C 1 To C 5 , C 1 To C 4 , or C 1 To C 3 It may be an alkyl group.
  • Alkyl groups are for example methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl (t-Bu), 1-methylpropyl, n -Pentyl, isopentyl, neopentyl, iso-amyl, and n-hexyl.
  • alkoxy refers to alkyl bonded to an oxygen atom.
  • the C 1 C 6 alkoxy group is C 1 To C 6 , C 1 To C 5 , C 1 To C 4 , or C 1 To C 3 alkoxy group.
  • the alkoxy is for example methoxy, ethoxy, propoxy, n-butoxy, tert-butoxy, and 1-methylpropoxy.
  • haloalkyl refers to alkyl in which one or more hydrogen atoms are replaced with halogen atoms.
  • the C 1 To C 3 haloalkyl group may be one in which at least one hydrogen atom is substituted with a halogen atom in a methyl, ethyl, or propyl group.
  • the phenyl refers to an alkyl group derived by removing one atom of hydrogen from benzene.
  • heterocycloalkyl refers to a non-aromatic monocyclic or polycyclic ring comprising carbon, hydrogen and one or more heteroatoms.
  • the hetero atom may be a nitrogen atom (N), an oxygen atom (O), or a sulfur atom (S).
  • the heterocycloalkyl group is, for example, morpholinophenyl, piperidine, pyrrolidine, piperazine, azepan, aziridine, piperazine, morpholine, tetrahydrofuran, and tetrahydropyran.
  • amine group refers to a substituent containing a nitrogen atom.
  • the amine group may be a substituted or unsubstituted amine group.
  • the substituted amine group may be an alkylamine group in which one or more hydrogen atoms are substituted with C 1 to C 6 alkyl groups.
  • the alkylamine group may be, for example, a dimethylamino group.
  • R 3 in Formula 1 represents a hydrogen atom, Cl, F, Br, -CF 3 , tert-butyl, methoxy, tert-butoxy (tert-BuO-; t-BuO-), morpholinophenyl, piperi Dine, pyrrolidine, piperazine, azepan, dimethylamino, or a combination thereof.
  • R 1 in Formula 1 may be a hydrogen atom, Cl, Br, methyl, methoxy, -CF 3 , phenyl, or a combination thereof.
  • R 2 , R 4 , and R 5 in Formula 1 may be each independently a hydrogen atom, Cl, I, F, methoxy, -CF 3 , or a combination thereof.
  • the compound of Formula 1 may be selected from the group consisting of:
  • stereoisomer refers to the same molecular formula and method of linking members but different spatial arrangements between atoms.
  • the stereoisomer may be a diasteromer or an enantiomer.
  • Enantiomers refer to isomers that do not overlap with the mirror image, such as the relationship between left and right hands, and are also called optical isomers. Enantiomers are divided into R (Rectus: clockwise) and S (sinister: counterclockwise) when four or more substituents are different in the chiral central carbon.
  • Diastereomers are stereoisomers that are not enantiomeric and can be divided into cis-trans isomers due to different spatial arrangements of atoms.
  • derivative refers to a compound obtained by substituting a part of the structure of the compound with another atom or group of atoms.
  • solvate refers to a compound solvated in an organic or inorganic solvent.
  • the solvate is, for example, a hydrate.
  • pharmaceutically acceptable salts refers to addition salts of inorganic, organic or metal salts of a compound.
  • the salt may be a pharmaceutically acceptable salt.
  • the pharmaceutically acceptable salt may be a salt which does not cause serious irritation to the organism to which the compound is administered and does not impair the biological activity and the properties of the compound.
  • the inorganic acid salt may be hydrochloride, bromate, phosphate, sulfate, or disulfate.
  • the organic acid salts include formate, acetate, acetate, propionate, lactate, oxalate, tartarate, malate, maleate, citrate, fumarate, besylate, camsylate, edisilate, trichloroacetic acid and trifluoro Acetate, benzoate, gluconate, methanesulfonate, glycolate, succinate, 4-toluenesulfonate, galluxuronate, embonate, glutamate, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, Or aspartate.
  • the metal salt may be calcium salt, sodium salt, magnesium salt, strontium salt, or potassium salt.
  • Another aspect provides a cosmetic composition for anti-aging or skin wrinkle improvement comprising a compound according to one aspect, a stereoisomer, derivative, solvate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the anti-aging refers to preventing or inhibiting skin aging.
  • Skin aging includes endogenous aging over time and exogenous aging by the external environment.
  • the skin aging may include skin wrinkles, blemishes, blemishes, and the like.
  • the skin wrinkles may be fine lines caused by skin deterioration.
  • the skin wrinkles may be due to photoaging, age, facial expression, lack of moisture, or a combination thereof.
  • the photoaging may be skin aging by exposure to ultraviolet light (including UVA, UVB, and UVC).
  • the skin wrinkle improvement may be to inhibit or inhibit the generation of wrinkles on the skin, or to alleviate wrinkles already generated.
  • the composition comprises about 0.000001 wt% to about 10 wt%, about 0.00001 wt% to about 5 wt%, of the compound, stereoisomer, derivative, solvate, or pharmaceutically acceptable salt thereof, based on the total weight of the composition 0.0001% to about 1% by weight, about 0.001% to about 0.1% by weight, or about 0.01% to about 0.1% by weight.
  • the cosmetic composition may be a functional cosmetic, for example, a functional cosmetic for improving skin wrinkles.
  • the cosmetic composition may have the effect of inhibiting collagen degradation, procollagen secretion, promoting Sirtuin 1 (Sirtuin 1; Sirt1) activity, or a combination thereof.
  • Inhibition of collagen degradation may be by inhibition of production, secretion, or activity of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), a collagen degrading enzyme.
  • MMP-1 matrix metalloproteinase-1
  • the procollagen can be synthesized and secreted in the state of procollagen from fibroblasts as a precursor of collagen and then polymerized into collagen extracellularly. Promoting sirtuin 1 activity may be the promotion of sirtuin 1 production, secretion, or activity.
  • the cosmetic composition may include components generally used in cosmetics, in addition to the compound, stereoisomers, derivatives, solvates, or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the cosmetic composition may include, for example, general auxiliary components such as emulsifiers, thickeners, emulsions, surfactants, lubricants, alcohols, water-soluble polymers, gelling agents, stabilizers, vitamins, inorganic salts, emulsifiers, and flavoring agents.
  • the ingredients may be selected according to the dosage form or the purpose of use within a range that does not impair the inherent effects of the cosmetic.
  • the cosmetic composition may further include any one or more of retinoic acid, TGF, protein from animal placenta, betulin, and chlorella extract as anti-aging or wrinkle improving ingredients known in the art.
  • the formulation of the cosmetic composition may be prepared in any formulation commonly prepared in the art.
  • Formulation of the cosmetic composition is, for example, lotion, external ointment, cream, foam, softening water, latex, foundation, makeup base, essence, color cosmetics, soap, liquid detergent, bathing agent, sunscreen cream, sunscreen oil, skin It can be selected from the group consisting of adhesive patches and skin adhesive gels.
  • the cosmetic composition may be used daily and may also be used for an undetermined period of time.
  • the amount, frequency of use and duration of use may be adjusted according to the age, skin condition or skin type of the user, and the concentration of the amide derivative compound.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for inhibiting skin aging, preventing or treating skin wrinkles, or treating skin wounds, comprising a compound according to one aspect, a stereoisomer, derivative, solvate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof .
  • the compounds, stereoisomers, derivatives, solvates, pharmaceutically acceptable salts, skin aging, and skin wrinkles are as described above.
  • the skin wound refers to damage or injury to the skin.
  • the skin wound may be selected from the group consisting of abrasions, bruises, lacerations, cuts, wounds, cuts, bedsores, burns, frostbite, skin ulcers and chemical wounds.
  • prevention refers to any action that delays the onset of skin aging, skin wrinkles, or skin wounds by administration of the pharmaceutical composition.
  • treatment refers to any action by which administration of the pharmaceutical composition improves or beneficially alters the symptoms of skin aging, skin wrinkles, or skin wounds.
  • the pharmaceutical composition may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier is used in the sense including excipients, diluents or adjuvants.
  • the carrier is, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pi It may be selected from the group consisting of rolidone, water, saline, buffers such as PBS, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the composition may include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, flavors, emulsifiers, preservatives, or combinations thereof.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, and such solid form preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose and the like. Or it is prepared by mixing lactose and gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use may include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used as suspensions, solvents, emulsions, and syrups. have.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in any formulation according to conventional methods.
  • the compositions may be formulated, for example, in oral dosage forms (eg, powders, tablets, capsules, syrups, pills, or granules), or parenteral formulations (eg, injections).
  • the compositions may be prepared in systemic or topical formulations.
  • the pharmaceutical composition may be used as an external preparation for skin and applied to the skin.
  • the pharmaceutical composition may be a formulation of a liquid, ointment, cream, lotion, spray, patch, gel, or aerosol.
  • a fatty substance organic solvent, solubilizer, thickening and gelling agent, emollient, suspending agent, stabilizer, foaming agent, fragrance, surfactant, water, ionic or nonionic type.
  • the pharmaceutical composition may further comprise an agent for increasing transdermal absorption, for example dimethylsulfoxide, dimethylacetamide, dimethylformamide, surfactant, azone, alcohol, acetone, propylene glycol, or polyethylene glycol.
  • the pharmaceutical composition may further include other active ingredients having an effect of inhibiting skin aging, preventing or treating skin wrinkles, or treating skin wounds.
  • the pharmaceutical composition may further include, for example, any one or more of retinoic acid, TGF, protein from animal placenta, betulin, and chlorella extract.
  • the pharmaceutical composition may include an effective amount of a compound represented by Formula 1, a stereoisomer, a derivative thereof, a solvate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to an aspect.
  • the term “effective amount” refers to an amount sufficient to exert the effect of prophylaxis or treatment when administered to a subject in need thereof.
  • the effective amount may be appropriately selected by those skilled in the art according to the cell or individual to be selected. Factors including the severity of the disease, the age, weight, health, sex of the patient, sensitivity to the patient's drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, drugs used in combination or concurrently with the composition used and other medical fields Can be determined according to well-known factors.
  • the effective amount can be about 0.5 ⁇ g to about 2 g, about 1 ⁇ g to about 1 g, about 10 ⁇ g to about 500 mg, about 100 ⁇ g to about 100 mg, or about 1 mg to about 50 mg per pharmaceutical composition. have. Dosing may include administering the recommended dose once daily, or in divided doses.
  • the pharmaceutical compositions may be administered in a conventional manner via the oral, transdermal, subcutaneous, rectal, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, topical, or intradermal routes.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be, for example, about 0.001 mg / kg to about 100 mg / kg, about 0.01 mg / kg to about 10 mg / kg, or about 0.1 mg / kg to about 1 mg / on an adult basis. may be in the range of kg.
  • the administration is once a day, twice to 24 times a day, once to two times a day, once to six times a week, once to ten times a week, once to 15 times a week , Once to three times a week, or once to twelve times a year.
  • Another aspect provides a method of inhibiting skin aging or improving skin wrinkles comprising administering a cosmetic composition according to one aspect to a subject.
  • the cosmetic composition, skin aging inhibition, and skin wrinkle improvement are as described above.
  • the subject may be a mammal, for example human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat or cat.
  • the subject may have a skin aging or skin wrinkles, or a severe subject.
  • Another aspect provides a method for inhibiting skin aging, preventing or treating skin wrinkles, or treating skin wounds, comprising administering a pharmaceutical composition according to one aspect to a subject.
  • the pharmaceutical composition, skin aging, skin wrinkles, prevention, and treatment are as described above.
  • the method of administration may be oral or parenteral administration.
  • the method of administration may be, for example, oral, transdermal, subcutaneous, rectal, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, topical, intranasal, intraratal, or intradermal routes.
  • the composition may be administered systemically or locally, and may be administered alone or in combination with other pharmaceutically active compounds.
  • Preferred dosages of the pharmaceutical compositions depend on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the dosage is, for example, in the range of about 0.001 mg / kg to about 100 mg / kg, about 0.01 mg / kg to about 10 mg / kg, or about 0.1 mg / kg to about 1 mg / kg on an adult basis.
  • the administration is once a day, twice to 24 times a day, once to two times a day, once to six times a week, once to ten times a week, once to 15 times a week , Once to three times a week, or once to twelve times a year.
  • compositions for treating skin wounds comprising a compound represented by a formula selected from the following group, stereoisomers, derivatives, solvates, or pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • stereoisomers, derivatives, and solvates, pharmaceutically acceptable salts, skin wounds, treatments, and pharmaceutical compositions are as described above.
  • Another aspect provides a method of treating skin wounds comprising administering to the subject a pharmaceutical composition for treating skin wounds according to one aspect.
  • the skin wound, treatment, pharmaceutical composition, subject, and administration are as described above.
  • an amide derivative compound, a stereoisomer thereof, a derivative, a solvate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a use thereof according to the present invention have excellent effects of increasing the expression of Sirt1, and can cause skin wounds by activation of Sirt1. Since the healing effect and skin aging inhibitory effect is excellent, it can be usefully used as a pharmaceutical composition for skin wound, skin aging inhibition or wrinkle improvement. In addition, it may be usefully used to improve anti-aging or skin wrinkles by decreasing the amount of MMP-1 and increasing the amount of procollagen type I and increasing the amount of Sirt1 and the activity in dermal fibroblasts induced by UV irradiation. .
  • 1 is a graph showing cell viability for HaCaT and NHDF cells when compound 49 is treated.
  • Figure 2 shows the results of confirming the expression level of Sirt1 for NHDF (FIGS. 2A and 2B) and HaCaT (FIGS. 2C and 2D) cells when compound 49 was treated.
  • Figure 3 is a wound healing analysis results confirming that the expression of Sirt1 in HaCaT cells is effective for skin wound healing.
  • FIG. 4 shows wound healing assay results for NHDF (FIGS. 4A and 4B) and HaCaT (FIGS. 4C and 4D) cells when Compound 49 was treated.
  • Figure 5 is a result of confirming the wound healing effect by applying compound 49 topically daily to the skin of wounded mice for 10 days.
  • FIG. 6 shows daily application of Compound 49 to skin of wounded mice daily for 10 days, after which epidermal cells were isolated to confirm tissue staining (FIGS. 6A-6C) and epidermis, dermal regeneration and granulation tissue formation (FIGS. 6D and 6E). The result is.
  • 9A and 9B are graphs showing the amount of MMP-1 secretion (pg / mL) and the amount of procollagen type I (ng / mL) according to the concentrations of compounds 11 and 37 in fibroblasts induced by UV irradiation, respectively. .
  • 10A and 10B are graphs showing the expression level and activity (percentage (%) of normal) of Sirt1 according to the concentration of compounds 11 and 37 in fibroblasts induced by UV irradiation, respectively.
  • Compound 1 of the present invention added 4-chlorocinnamic acid (1eq, 100mg) and 2-aminopyridine (1.2eq, 62mg) to pyridine (0.3M, 1.7ml), as shown in Scheme 2 below. Then, the temperature was lowered to ⁇ 15 ° C. and phosphorus oxychloride (1.2eq, 0.06 ml was slowly added dropwise, and then the temperature was raised to room temperature and stirred for 1 hour.
  • Compound B (phosphoryl acetic acid) was obtained after hydrolysis by adding 1N NaOH to compound A under ethanol solvent conditions. Thereafter, Compound B was added with EDCI (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) and NHS (N-hydroxysuccinimide) under methylene chloride solvent to obtain a highly reactive Compound C. Thereafter, Compound C, which is an intermediate obtained in the above process, may be selected from an amine ( or ) And condensation reaction at 0.85 equivalent and TLC confirming that the amine disappeared, and then treated with Girard's reagent T to obtain Compound D ( or ) Was obtained. Compound D obtained in the above process was treated with 1.5 equivalents of aldehyde and t-BuOK in tetrahydrofuran (THF) solvent conditions to obtain compounds 28 to 30 and 36 to 41 of the present invention.
  • THF tetrahydrofuran
  • compound 6 or 32 (1eq, 200 mg) of the present invention was added to toluene (3 mL), followed by lawesson's reagent (1.1eq, 304 mg). Mix and stir at 60 ° C. for 2 hours. Distilled water was added to the reactants obtained through the above process to terminate the reaction, followed by extraction with ether, magnesium sulfate, and dehydration. The concentrate was subjected to a column under hexane: ethyl acetate (10: 1) to give compounds 27 and 43.
  • HaCaT cells Kerean Cell Line Bank, Seoul National University, Korea
  • Raw 264.7 cells American Type Culture Collection, USA
  • NHDF normal human dermal fibroblast cells
  • FBS fetal bovine serum
  • PS penicillin-streptomycin
  • MTT assay was performed to determine the cell viability of the amide derivative compound as described in Example 1.2 for HaCaT cells or NHDF cells.
  • Example 2.1 1 ⁇ 10 5 of HaCaT cells or NHDF cells cultured in Example 2.1 were inoculated into 6-well plates and cultured for 24 hours. Thereafter, the cells were replaced with 2 ml of serum-free DMEM medium containing 49 of the present invention (1, 5 or 10 ⁇ M each) dissolved in DMSO, and further cultured for 24 hours. After the incubation, 2 ml of 500 ⁇ g / ml MTT reagent was added to the cells treated with the compound and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • the amide derivative compound of the present invention when the amide derivative compound of the present invention is treated to HaCaT cells or NHDF cells, it does not show cytotoxicity and thus may be useful as a composition for treating skin wounds, inhibiting skin aging, or improving wrinkles. You can check it.
  • Sirt1 is a protein that deacetylates the K382 moiety of p53. If the activity of Sirt1 in the cell is increased (increasing the Sirt1 deacetylase activity and the Sirt1 activity is the same meaning), the activity of p53 Using the report of falling (Molecular Cell, 28, 277-290, 2007) confirmed the activity of p53 in the cell. That is, by measuring the activity of p53 by using luciferase transfection, a method of predicting the activity of Sirt1 was used. Specifically, it was performed with reference to Korean Patent No. 10-1548605.
  • HEK293 cells were 70% filled with monolayer (confluency), washed with PBS, treated with 0.25% trypsin for 1 minute at room temperature, and recovered the cells by adding DMEM, and centrifuged at 2,500 rpm for 5 minutes. The supernatant was then removed to obtain cell precipitate. The cells were then mixed well with DMEM medium. Next, 3 ⁇ l of lipofectamine (life Technologies, Inc) was added to 100 ⁇ l of serum-free medium, mixed slowly, and allowed to stand at room temperature for 15 minutes, followed by 3.0 ⁇ g of p53-Luc (p53-luciferase vector).
  • lipofectamine life Technologies, Inc
  • the mixture was slowly added dropwise to the serum deficient medium over 30 seconds using a fine needle tube containing an empty vector and left for another 15 minutes at room temperature.
  • Lipofectamine, a mixture of each vector (or DNA-plasmid), and HEK293 cells were slowly mixed, incubated at room temperature for 20 minutes in suspension, and then aliquoted in a 60 mm culture vessel and incubated in a CO 2 incubator for 24 hours. Then, the next day, compounds 1 to 49 were added at a concentration of 10 and 20 ⁇ g / ml, respectively, and then cultured for another 24 hours, where resveratrol was used as a control.
  • the cultured HEK293 cells were washed twice with PBS, 500 ⁇ l of extract solution was added to each culture vessel, and the cells were disrupted and centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes. The supernatant (cell extract) obtained at this time was used to measure the activity of luciferase and ⁇ -galactosidase.
  • Luciferase activity was obtained from supernatant (cell extract) extracted from 100 ⁇ l of cells, 100 ⁇ l of 20 nM D-luciferin and 300 ⁇ l of reaction solution (20 mM glycin, 12.5 mM MgSO 4 , 3 mM EGTA, 15 mM potassium phosphate, 1 mM DTT). , 1 mM ATP) was measured by a luminometer. Luciferase activity was corrected by measuring ⁇ -galatosidase activity to correct gene injection efficiency.
  • the activity of ⁇ -galactosidase was determined using 30 ⁇ l of cell extract, 66 ⁇ l of ONPT (4 mg / ml), and 204 ⁇ l of reaction solution (0.1 M sodium phosphate, 1 mM MgCl 2 , 45 mM ⁇ -mercaptoethanol, pH 7.5). After reacting in a thermostat, the absorbance was measured using a spectrophotometer.
  • the amide derivative of the present invention was at least 7700 times greater than the resveratrol of the positive control EC 50 value, it was confirmed that the effect of increasing the enzyme activity of Sirt1 is remarkably excellent.
  • HaCaT cells or NHDF cells cultured as described in Example 2.1 were 80% filled with monolayers, washed twice with PBS and then dissolved in DMSO with 1, 5 or 10 ⁇ M. Treated by diluting with serum free medium as much as possible and incubating for 24 hours. The cultured cells were recovered and lysed with lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 50 mM Tris-Cl) to obtain a protein. Protein concentration was measured by Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, CA, USA) using BSA (bovine serum albumin) as a standard.
  • lysis buffer 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 50 mM Tris-Cl
  • HaCaT cells cultured as described in Example 2.1 were inoculated into a 96-well plate, so that Sirt1 siRNA or scramble RNA was brought to a final concentration of 100 nM in a serum-free medium containing 1.4-1.5% lipofectamine.
  • the cells were lysed and the same volume of serum-free medium was mixed and treated with the inoculated HaCaT cells, followed by transfection.
  • NHDF cells or HaCaT cells are cultured in a single layer, scratched, and lysed in serum-free medium in the same manner as the above procedure.
  • Compound 49 was incubated for 24 hours with 1, 5 or 10 ⁇ M treatment, at which time the untreated group was run in the same procedure. Thereafter, the scratched portion of the cell was checked every 4 hours and shown in FIG. 4.
  • SKH-1 hairless mice (5-weeks-old, Shizuoka Laboratory Animal Center, Japan) were subjected to 65% humidity conditions and 12 hour intervals at 23 ° C. Adapted to nightly maintenance conditions, all procedures of animal testing were conducted with guidelines approved by the Animal Care and Use Committee of Gachon University (Gachon University, Cancer and Diabetes Institute, LCDI-2013-0022).
  • a skin sample (including the central region of the wound) to which the compound of the present invention was applied topically to the wound site was fixed with 10% formalin and then washed with xylene before being dehydrated with ethanol. Thereafter, the samples were fixed with paraffin wax, cut into 5 ⁇ m thicknesses, subjected to H & E (hematoxylin and eosin) and Masson's trichrome staining, and then wound sites (compounds of the present invention) using an optical microscope (Light microscope, Olympus, Japan). 5 days and 10 days after the topical application) is shown in Figures 6A-6C.
  • epidermal regeneration and granulation refer to Table 4 below, and epidermal and dermal regeneration were used by the 3-point scoring method, and granulation tissue formation was measured by the 4-point scoring method, and then shown in FIGS. 6D and 6E. It was.
  • NHDF Normal human dermal fibroblasts
  • NHDF cells inoculated in the 100 mm culture dish reached a cell density of about 80%, the cells were washed twice with phosphate buffered saline (PBS). Subsequently, ultraviolet rays of 144 mJ / cm 2 dose were irradiated to the prepared cells using an ultraviolet irradiation device (Bio-Link BLX-312; Vilber Lourmat GmbH, France). After UV irradiation, cells were washed three times with PBS and exchanged with medium containing no serum, and then immediately treated with compounds 11 and 37 at concentrations of 5 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively.
  • PBS phosphate buffered saline
  • cell viability was analyzed by MTT assay.
  • the prepared cells were incubated for about 72 hours and then treated with 100 ⁇ l of 1 mg / ml MTT reagent. Absorbance was measured at a wavelength of 570 nm using an ELISA reader (Molecular Devices E09090; San Francisco, CA, USA), and cell viability according to the concentration of the compound is shown in FIG. 8.
  • MMP-1 Matrix metalloproteinase-1
  • NHDF cells were irradiated with UV light, treated with Compounds 11 and 37, and then incubated for about 72 hours. Afterwards, the conditioned medium is recovered from each well and using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Human Total MMP-1 kit, R & D Systems, R & D Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA). The secretion amount of MMP-1 was analyzed. The experiment was repeated three times, and the amount of MMP-1 secretion was shown in FIG. 9A.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Dermal collagen type I is synthesized in fibroblasts into procollagen and then secreted extracellularly, and the extracellular secreted procollagen is known to be produced by cutting and cross-liking to form collagen fibers. Therefore, it was confirmed whether compounds 11 and 37 have a secretory activity of procollagen type I.
  • NHDF cells were irradiated with ultraviolet light, treated with compounds 11 and 37 and incubated for about 72 hours. Thereafter, the recovered cell culture solution was analyzed for the amount of procollagen type I secretion using an ELISA kit (Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan). The experiment was repeated three times, and the secretion amount of procollagen type I is shown in Fig. 9B.
  • the amount of procollagen type I secretion in UVDF-irradiated NHDF cells was decreased by UV irradiation.
  • Compounds 11 and 37 significantly increased the amount of procollagen type I secretion in UV-irradiated NHDF cells.
  • compounds 11 and 37 were found to increase the amount of procollagen type I secretion in photoaging induced cells due to ultraviolet irradiation.
  • Example 3.3 Cells cultured as described in Example 3.3 (1) were recovered.
  • the recovered cells were lysis buffer (150 mM NaCl, 1% (v / v) NP-40, 0.5% (w / v) sodium deoxycholate, 0.1% (w / v) sodium dodecyl sulfate, 50 mM Tris -Cl) to give the protein.
  • Protein concentration was measured by Bio-Rad protein assay (Bio-Rad, CA, USA) using BSA (bovine serum albumin) as a standard.
  • Proteins were obtained from cells cultured as described in Example 3.4 (1).
  • Sirt1 activity was measured by SIRT1 Direct Fluorescent Screening Assay Kit (Cayman, USA).
  • Resveratrol As a comparative group, Resveratrol (Sigma-aldrich), known to increase Sirt1 activity, was used at a concentration of 10 ⁇ M or 50 ⁇ M. The experiment was conducted according to the kit manufacturer's instructions, and the Sirt1 activity was measured by performing three replicates. The measured Sirt1 activity is shown in Figure 10b.
  • the activity of Sirt1 was increased in a concentration dependent manner by Compound 37 compared to resveratrol.
  • Compound 37 was found to significantly increase the activity of Sirt1 in UV-irradiated NHDF cells.
  • a hydrophilic ointment was prepared in a conventional manner according to the composition shown in Table 5 below.
  • a flexible lotion was prepared in a conventional manner according to the composition shown in Table 7 below.

Abstract

일 양상에 따른 아미드 유도체 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 이의 용도를 제공한다. 이에 따르면, Sirt1의 발현을 증가시키는 효과가 우수하고, Sirt1의 활성화에 의한 피부 상처 치유 효과 및 피부 노화 억제 효과가 우수하므로, 피부 상처, 피부 노화 억제 또는 주름 개선용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 자외선 조사에 의해 유도된 피부 섬유아세포에서 MMP-1의 분비량 감소 및 프로콜라겐 타입 I의 분비량 증가, 및 Sirt1 분비량 및 활성 증가에 의해 항노화 또는 피부 주름을 개선하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

아미드 유도체 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 이를 포함하는 피부 노화 억제, 주름 개선, 또는 피부 상처 치료용 약학적 또는 화장료 조성물
아미드 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이를 포함하는 피부 노화 억제, 주름 개선, 또는 피부 상처 치료용 약학적 또는 화장료 조성물, 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.
피부는 신체 외부를 덮고 있는 하나의 막으로, 피부의 가장 중요한 역할은 외부의 세균 침입과 손상으로부터 피부를 보호하는 방어장벽(defense barrier)의 역할을 함과 동시에 내부로부터의 열과 수분 손실을 방지하는 것이다.
또한, 인체를 외부의 각종 위협으로부터 보호하는 기능을 하는 피부는, 항상 다양한 외부자극과 접하기 때문에 다른 기관들에 비해 상처(wound)가 일어나기 쉽다. 이때, 상처 치유(wound healing)는 손상 받은 조직의 기능과 형태적 특성을 다시 정상화시키기 위한 필수적인 반응이다(Woodley, D. T. et al., J. Am. Acad. Dermatol., 12(2Pt2), 420-433, 1985; Orgill D. et al., CRC, 2009). 신체에 발생하는 상처는 자연적으로 일련의 치유 과정을 거치게 되는데, 상처의 치유 과정은 염증(inflammation)단계, 증식(proliferation)단계, 성숙(remodeling/maturation)단계로 구분할 수 있으며, 각 과정에서 나타나는 세포들과 세포들에 의해 유래되는 각종 인자들 및 조직 간의 복잡한 유기적인 상호작용으로 그 과정이 이루어진다. 상처의 정도에 따라 상처를 치유하는 데까지 소요되는 시간이 길어질 수 있는데, 시간이 길어질수록 흉터가 생길 확률이 높아지고, 2차 감염의 우려까지 나올 수 있다. 따라서, 이러한 흉터 방지, 2차 감염 방지 및 신속한 상처 치유를 촉진시키기 위한 물질의 개발은 매우 중요한 의미를 갖고 있다.
인간의 피부는 끊임없이 변화를 겪게 되며, 그 중 가장 대표적인 것이 노화에 의한 피부의 기능 저하 및 시각적인 아름다움의 감소이다. 피부의 노화는 크게 유전적 요소에 따른 내적 노화와 태양광선 등의 외부 환경적 요소에 따른 외적 노화로 구분된다. 이러한 외적 노화는 피부의 주름을 형성시키며, 대표적인 주름 형성의 인자로서 활성 산소, 자외선 및 콜라겐의 생합성 감소 등을 들 수 있다(Danielle, H. W., Ann Intern Med., 75(6), 873-880, 1971; Grove, G. L. et al., J Am Acad Dermatol., 21(3 Pt 2), 631-637, 1989). 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 피부 내 콜라겐의 합성 촉진에 의해 콜라겐 대사가 활발해지면 진피 매트릭스의 성분이 증가 되어 주름개선, 탄력증진, 피부강화 등의 효과가 있는 것으로 밝혀지고 있다. 콜라겐 합성을 촉진하기 위해 종래에 사용한 물질로는, 레티노이드(retinoid), TGF-β(trans-forming growth factor), 베툴린산(betulic acid), 클로렐라 추출물 등이 알려졌으나, 레티노인산의 경우 불안정하고 피부적용시 자극 등에 의한 안정성 문제로 사용량의 제한이 있으며, 클로렐라 추출물 등은 효과가 미미하여 실질적으로 피부의 콜라겐 합성 촉진으로 인한 피부 기능 개선효과를 기대할 수 없다. 최근 새롭게 등장한 주름치료 방법으로서 초음파 치료 및 피부 스케일링, 레이저박피술, 보툴리눔톡신 주사, 레스틸렌 주사 등이 있으나, 시술 비용 및 지속성면에서 큰 효과를 발휘하지 못하고 있는 실정이다. 따라서 생체에서 콜라겐 합성 촉진 효과가 매우 우수한 촉진제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
시르투인(sirtuin)은 뇌, 간, 신장 등 신체의 일부 조직에서 만들어지는 단백질 탈아세틸화효소(protein deacetylase)로서, 특히, 시르투인1(이하, Sirt1)의 경우, 염증, 산화 손상, 세포자살, 당뇨병 및 노화와 같은 질병에 중요하게 관여하고 있다. 최근, 선행문헌 [Valente, S. et al., J Med Chem., 59(4), 1471-1491, 2016; Wang, Y. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 54(5), 3806-3814, 2013]에서는 Sirt1이 피부 상처 치유가 가능함을 보고하였으며, 특히, Sirt1 활성화제인 레스베라트롤(resveratrol)은 치유 과정에서 긍정적인 영향을 나타내는 것임을 선행문헌 [Zeytin, K. et al., Acta Orthop Traumatol Turc., 48(3), 355-362, 2014; Casarin, R. C. et al., Int J Oral Maxillofac Surg., 43(7), 900-906, 2014]에서 확인하였다. 또한, 선행문헌 [Han, J. G., 2015; Kim, J. et al., Mol Cell Endocrinol., 412, 216-225, 2015; Serravallo, M. et al., Arch Dermatol Res., 305(4), 269-282, 2013; Sung, B. et al., Exp Ther Med., 9(5), 1819-1826, 2015]에는 Sirt1의 활성화는 항산화 및 콜라겐 생성에 도움을 주어 주름 개선에 효과가 있는 항노화 소재로서 사용가능함을 개시하였다.
따라서, Sirt1을 활성화하여 피부 상처 치료, 피부 노화 및 주름 개선 효과가 있는 화합물을 발굴할 필요가 있다.
아미드 유도체 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
아미드 유도체 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 항노화 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 및 이를 이용한 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선 방법을 제공한다.
아미드 유도체 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 피부 노화 억제, 피부 주름 예방 또는 치료, 또는 피부 상처 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 피부 노화 억제, 피부 주름 예방 또는 치료, 또는 피부 상처 치료 방법을 제공한다.
아미드 유도체 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 피부 상처 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 피부 상처 치료 방법을 제공한다.
일 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000001
.
상기 화학식 1에서, R1, R2, R4, 및 R5는 서로 독립적으로 수소 원자, 히드록시기, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C6의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C6의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C3의 할로알킬기, 페닐, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 화학식 1에서, R3은 수소 원자, 히드록시기, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C6의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C6의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C3의 할로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C8의 헤테로시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C6 아민기, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 화학식 1에서, R2, R3, R4, 및 R5 중 하나 이상은 수소가 아닐 수 있다. R2, R3, R4, 및 R5 중 하나 이상은 히드록시기, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C6의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C6의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C3의 할로알킬기, 페닐, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C8의 헤테로시클로알킬기, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, R2, R3, R4, 및 R5 중 하나 이상은 Cl, F, Br, -CF3, 터트-부틸(t-Bu), 메틸, 메톡시, 터트-부톡시(t-BuO-), 페닐, 모르폴리노페닐, 피페리딘, 피롤리딘, 피페라진, 아제판, 디메틸아미노, 또는 이들의 조합이다.
상기 "치환"은 유기 화합물 중의 하나 이상의 수소 원자를 다른 원자단으로 치환하여 유도체를 형성한 경우 수소 원자 대신에 도입되는 것을 말하고, "치환기"는 도입된 원자단을 말한다. 치환기는 예를 들면, 할로겐 원자, 할로겐 원자, 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 C20의 알킬기(예: CCF3, CHCF2, CH2F, CCl3 등), C1 내지 C20의 알콕시, C2 내지 C20의 알콕시알킬, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아미노기, 아미디노기, 히드라진, 히드라존, 카르복실기나 그의 염, 술포닐기, 술파모일(sulfamoyl)기, 술폰산기나 그의 염, 인산이나 그의 염, 또는 C1 내지 C20 알킬기, C2 내지 C20 알케닐기, C2 내지 C20 알키닐기, C1 내지 C20 헤테로알킬기, C6 내지 C20 아릴기, C6 내지 C20 아릴알킬기, C6 내지 C20 헤테로아릴기, C7 내지 C20헤테로아릴알킬기, C6 내지 C20 헤테로아릴옥시기, 및 C6 내지 C20 헤테로아릴옥시알킬기 또는 C6 내지 C20 헤테로아릴알킬기일 수 있다.
상기 용어 "할로겐" 원자는 주기율표의 7족에 속하는 원자를 말한다. 할로겐 원자는 불소(F), 염소(Cl), 브롬(Br), 및 요오드(I) 등을 포함한다.
상기 용어 "알킬"은 완전 포화된 분지형 또는 비분지형 (또는, 직쇄 또는 선형) 탄화수소를 말한다. 상기 알킬은 C1 내지 C6, C1 내지 C5, C1 내지 C4, 또는 C1 내지 C3인 알킬기일 수 있다. 알킬기는 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 이소부틸, 터트-부틸(tert-butyl; t-Bu)), 1-메틸프로필, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, iso-아밀, 및 n-헥실이다.
상기 용어 "알콕시"는 산소 원자에 결합된 알킬을 말한다. 상기 C1 내지 C6의 알콕시기는 C1 내지 C6, C1 내지 C5, C1 내지 C4, 또는 C1 내지 C3인 알콕시기일 수 있다. 상기 알콕시는 예를 들어 메톡시, 에톡시, 프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시, 및 1-메틸프로폭시이다.
상기 용어 "할로알킬"은 하나 이상의 수소 원자가 할로겐 원자로 치환된 알킬을 말한다. 상기 C1 내지 C3의 할로알킬기는 메틸, 에틸, 또는 프로길기에서 하나 이상의 수소 원자가 할로겐 원자로 치환된 것일 수 있다. 상기 C1 내지 C3의 할로알킬기는 예를 들어, -CF3일 수 있다.
상기 페닐은 벤젠에서 수소 1 원자를 제거함으로써 유도된 알킬기를 말한다.
상기 용어 "헤테로시클로알킬"기는 탄소, 수소 및 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비-방향족 모노고리기(monocyclic) 또는 폴리시클릭(polycyclic) 고리를 말한다. 상기 헤테로원자는 질소 원자(N), 산소 원자(O), 또는 황 원자(S)일 수 있다. 상기 헤테로시클로알킬기는 예를 들어 모르폴리노페닐, 피페리딘, 피롤리딘, 피페라진, 아제판, 아지리딘, 피페라진, 몰포린, 테트라히드로퓨란, 및 테트라히드로피란이다.
상기 용어 "아민"기는 질소 원자를 함유하는 치환기를 말한다. 상기 아민기는 치환 또는 비치환된 아민기일 수 있다. 상기 치환된 아민기는 하나 이상의 수소 원자가 C1 내지 C6의 알킬기로 치환된 알킬아민기일 수 있다. 상기 알킬아민기는 예를 들어 디메틸아미노기일 수 있다.
상기 화학식 1 중 R3은 수소 원자, Cl, F, Br, -CF3, 터트-부틸, 메톡시, 터트-부톡시(tert-BuO-; t-BuO-), 모르폴리노페닐, 피페리딘, 피롤리딘, 피페라진, 아제판, 디메틸아미노, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 화학식 1 중 R1은 수소 원자, Cl, Br, 메틸, 메톡시, -CF3, 페닐, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 화학식 1 중 R2, R4, 및 R5는 서로 독립적으로 수소 원자, Cl, I, F, 메톡시, -CF3, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
Figure PCTKR2017014019-appb-I000002
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000003
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000004
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000005
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000006
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000007
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000008
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000009
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000010
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상기 용어 "입체이성질체(stereoisomer)"는 분자식 및 구성원자의 연결 방법도 같으나 원자 사이의 공간적 배치가 다른 것을 말한다. 상기 입체이성질체는 부분입체 이성질체(diasteromer) 또는 거울상 이성질체(enantiomer)일 수 있다. 거울상이성질체는 왼손과 오른손의 관계처럼 그 거울상과 겹쳐지지 않는 이성질체를 말하고, 광학 이성질체(optical isomer)라고도 한다. 거울상 이성질체는 키랄 중심 탄소에 4개 이상의 치환기가 서로 다른 경우 R(Rectus: 시계방향) 및 S(sinister: 반시계 방향)로 구분한다. 부분입체이성질체는 거울상 관계가 아닌 입체 이성질체를 말하고, 원자의 공간 배열이 달라 생기 시스(cis)-트랜스(trans) 이성질체로 나뉠 수 있다.
상기 용어 "유도체(derivative)"는 상기 화합물의 구조 일부를 다른 원자나 원자단으로 치환하여 얻어지는 화합물을 말한다.
상기 용어 "용매화물(solvate)"는 유기 또는 무기 용매에 용매화된 화합물을 말한다. 상기 용매화물은 예를 들어, 수화물이다.
상기 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 화합물의 무기산염, 유기산염, 또는 금속염의 부가염을 말한다. 상기 염은 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 염일 수 있다. 상기 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염, 또는 이황산염일 수 있다. 상기 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 또는 아스파르트산염일 수 있다. 상기 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염, 또는 칼륨염일 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 항노화 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화합물, 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 및 약학적으로 허용가능한 염은 전술한 바와 같다.
상기 항노화는 피부 노화를 방지하거나 억제하는 것을 말한다. 피부 노화는 시간의 흐름에 따른 내인성 노화 및 외부 환경에 의한 외인성 노화를 포함한다. 상기 피부 노화는 피부 주름, 잡티, 기미 등을 포함할 수 있다.
상기 피부 주름은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄일 수 있다. 상기 피부 주름은 광노화, 연령, 얼굴 표정, 수분 부족, 또는 이들의 조합에 의한 것일 수 있다. 상기 광노화는 자외선(UVA, UVB, 및 UVC 포함) 노출에 의한 피부 노화일 수 있다. 상기 피부 주름 개선은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것일 수 있다.
상기 조성물은 상기 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 전체 조성물 중량에 대하여 약 0.000001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.00001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.0001 중량% 내지 약 1 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 0.1 중량%, 또는 약 0.01 중량% 내지 약 0.1 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 기능성 화장품, 예를 들어 피부 주름 개선용 기능성 화장품일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 콜라겐 분해 억제, 프로콜라겐 분비, 시르투인 1(Sirtuin 1; Sirt1) 활성 촉진, 또는 이들의 조합의 효과를 가질 수 있다. 콜라겐 분해 억제는 콜라겐 분해 효소인 매트릭스 메탈로프로테아제-1(Matrix metalloproteinase-1; MMP-1)의 생성, 분비, 또는 활성의 억제에 의한 것일 수 있다. 상기 프로콜라겐은 콜라겐의 전구물질로서 섬유아세포에서 프로콜라겐 상태로 합성 및 분비된 후 세포 외에서 콜라겐으로 중합될 수 있다. 시르투인 1 활성 촉진은 시르투인 1 생성, 분비, 또는 활성의 촉진일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 상기 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 이외에, 화장료에 일반적으로 이용되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 예를 들어 유화제, 점증제, 유제, 계면활성제, 윤활제, 알코올류, 수용성 고분자제, 겔화제, 안정화제, 비타민, 무기염류, 유화제, 향료 같은 일반적인 보조 성분을 포함할 수 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용목적에 따라 그 첨가량을 화장료 고유의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에 공지된 항노화, 또는 주름 개선 성분으로서, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린, 및 클로렐라 추출물 중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물의 제형은 예를 들어 화장수, 외용 연고, 크림, 폼, 유연수, 유액, 파운데이션, 메이크업베이스, 에센스, 색조 화장료, 비누, 액체세정제, 입욕제, 자외선 차단용 크림, 자외선 차단용 오일, 피부접착용 패취 및 피부접착용 겔로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 매일 사용할 수 있으며 또한 정해지지 않은 기간 동안에도 사용할 수 있고, 바람직하게는 사용자의 연령, 피부상태 또는 피부타입, 상기 아미드 유도체 화합물의 농도에 따라 사용량, 사용횟수 및 기간을 조절할 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 피부 노화 억제, 피부 주름 예방 또는 치료, 또는 피부 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 화합물, 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 약학적으로 허용가능한 염, 피부 노화, 및 피부 주름은 전술한 바와 같다.
상기 피부 상처는 피부에 발생한 손상 또는 상해를 말한다. 상기 피부 상처는 찰과상, 타박상, 열상, 절창, 좌상, 자상, 욕창, 화상, 동상, 피부궤양 및 화학적 창상으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 피부 노화, 피부 주름, 또는 피부 상처의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 피부 노화, 피부 주름, 또는 피부 상처의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용 액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 및 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 경구 투여 제형(예를 들면, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 또는 과립), 또는 비경구 제형(예를 들면, 주사제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 전신 제형, 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 피부 외용제로 사용되어 피부에 도포될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 액제, 연고제, 크림제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 또는 에어로졸제의 제형일 수 있다. 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경피 흡수를 증가시키는 제제, 예를 들어 디메틸술폭시드, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 계면활성제, 아존, 알콜, 아세톤, 프로필렌글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜을 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 피부 노화 억제, 피부 주름 예방 또는 치료, 또는 피부 상처 치료 효과가 있는 다른 유효 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 예를 들어, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린, 및 클로렐라 추출물 중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 일 양상에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 2 g, 약 1 ㎍ 내지 약 1 g, 약 10 ㎍ 내지 약 500 mg, 약 100 ㎍ 내지 약 100 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 50 mg일 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
상기 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 2회 내지 24회, 3일 1회 내지 2회, 1주일에 1회 내지 6회, 2주일에 1회 내지 10회, 3주일에 1회 내지 15회, 4주일에 1회 내지 3회, 또는 1년에 1회 내지 12회 투여될 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 화장료 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선 방법을 제공한다.
상기 화장료 조성물, 피부 노화 억제, 및 피부 주름 개선은 전술한 바와 같다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부 노화 또는 피부 주름이 있거나, 그 정도가 심한 개체일 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 노화 억제, 피부 주름 예방 또는 치료, 또는 피부 상처 치료 방법을 제공한다.
상기 약학적 조성물, 피부 노화, 피부 주름, 예방, 및 치료는 전술한 바와 같다.
투여 방법은 경구, 또는 비경구 투여일 수 있다. 투여 방법은 예를 들어, 경구, 경피, 피하, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal), 또는 피내 경로일 수 있다. 상기 조성물은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있고, 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 함께 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 2회 내지 24회, 3일 1회 내지 2회, 1주일에 1회 내지 6회, 2주일에 1회 내지 10회, 3주일에 1회 내지 15회, 4주일에 1회 내지 3회, 또는 1년에 1회 내지 12회 투여될 수 있다.
다른 양상은 하기 군으로부터 선택되는 화학식으로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 피부 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
Figure PCTKR2017014019-appb-I000034
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000035
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Figure PCTKR2017014019-appb-I000036
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000037
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000038
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000039
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000040
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000041
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000042
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000043
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000044
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000045
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Figure PCTKR2017014019-appb-I000046
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000047
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000048
;
Figure PCTKR2017014019-appb-I000049
; 및
Figure PCTKR2017014019-appb-I000050
.
상기 입체이성질체, 유도체, 및 용매화물, 약학적으로 허용가능한 염, 피부 상처, 치료, 및 약학적 조성물은 전술한 바와 같다.
다른 양상은 일 양상에 따른 피부 상처 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 상처 치료 방법을 제공한다.
상기 피부 상처, 치료, 약학적 조성물, 개체, 및 투여는 전술한 바와 같다.
일 양상에 따른 아미드 유도체 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 이의 용도에 따르면, Sirt1의 발현을 증가시키는 효과가 우수하고, Sirt1의 활성화에 의한 피부 상처 치유 효과 및 피부 노화 억제 효과가 우수하므로, 피부 상처, 피부 노화 억제 또는 주름 개선용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 또한, 자외선 조사에 의해 유도된 피부 섬유아세포에서 MMP-1의 분비량 감소 및 프로콜라겐 타입 I의 분비량 증가, 및 Sirt1 분비량 및 활성 증가에 의해 항노화 또는 피부 주름을 개선하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 화합물 49를 처리하는 경우, HaCaT 및 NHDF 세포에 대한 세포생존율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 화합물 49를 처리하는 경우, NHDF(도 2A 및 2B) 및 HaCaT(도 2C 및 2D) 세포에 대한 Sirt1의 발현량을 확인한 결과이다.
도 3은 HaCaT 세포에서, Sirt1의 발현이 피부 상처 치유에 효과가 있음을 확인한 상처 치유 분석 결과이다.
도 4는 화합물 49를 처리하는 경우, NHDF(도 4A 및 4B) 및 HaCaT(도 4C 및 4D) 세포에 대한 상처 치유 분석 결과이다.
도 5는 화합물 49를 상처 난 쥐의 피부에 10일 동안 매일 국소 적용하여, 상처 회복 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 화합물 49를 상처 난 쥐의 피부에 10일 동안 매일 국소 적용한 후, 표피 세포를 분리하여 조직 염색(도 6A 내지 6C) 및 표피, 진피 재생과 육아 조직 형성(도 6D 및 6E)을 확인한 결과이다.
도 7은 화합물 49를 처리하는 경우, NHDF 세포에 대한 PIP 발현량을 확인한 결과이다.
도 8은 자외선 조사로 유도된 섬유아세포에서 화합물 11 및 37의 농도에 따른 세포생존율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 9a 및 도 9b는 각각, 자외선 조사로 유도된 섬유아세포에서 화합물 11 및 37의 농도에 따른 MMP-1 분비량의 분비량(pg/㎖) 및 프로콜라겐타입 I의 분비량(ng/㎖)의 그래프이다.
도 10a 및 도 10b는 각각, 자외선 조사로 유도된 섬유아세포에서 화합물 11 및 37의 농도에 따른 Sirt1의 발현량 및 활성(정상에 대한 백분율(%))을 나타내는 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 아미드 유도체 화합물의 준비
1. 아미드 유도체 화합물의 합성
아미드 유도체 화합물 중, 화합물 1~26, 31~35, 42, 45~49는 하기 반응식 1을 참고하여 합성하였다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000051
구체적으로 본 발명의 화합물 1은 하기 반응식 2와 같이, 4-클로로신남산(1eq, 100mg) 및 2-아미노피리딘(1.2eq, 62mg)을 피리딘(0.3M, 1.7㎖)에 더하였다. 이후, 온도를 -15℃로 낮추고 옥시염화인(1.2eq, 0.06㎖을 천천히 적가한 다음, 상온으로 온도를 올려 1시간 동안 교반하였다. 1시간 후, 상기 반응물에 얼음을 더하여 반응을 종결시키고 에틸아세테이트로 추출한 다음, 황산마그네슘을 넣고 탈수한 후 농축하였다. 상기 과정을 통해 얻어진 농축물을 헥산:에틸아세테이트(1:1)의 조건으로 컬럼을 진행하여 화합물 1(129mg)을 얻었다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000052
또한, 상기 화합물 1과 같이 제조하되 하기 표 1의 acid/amine part를 참고하여, 화합물 2~26, 31~35, 42, 45~49를 합성하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000053
Figure PCTKR2017014019-appb-I000054
Figure PCTKR2017014019-appb-I000055
다음으로, 본 발명의 아미드 유도체 화합물 중, 화합물 28~30, 36~41은 하기 반응식 3을 참고하여 합성하였다.
[반응식 3]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000056
구체적으로, 에탄올 용매 조건에서 화합물 A에 1N의 NaOH을 가하여 가수분해한 후 화합물 B(phosphoryl acetic acid)를 얻었다. 이후, 상기 화합물 B를 염화메틸렌 용매 조건 하에서 EDCI(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 더하여 반응성이 좋은 화합물 C를 얻었다. 이후, 상기 과정에서 수득한 중간체인 화합물 C는, 염화메틸렌 용매 조건 하에서 아민(
Figure PCTKR2017014019-appb-I000057
또는
Figure PCTKR2017014019-appb-I000058
)과 0.85 당량으로 축합반응하고 TLC로 아민이 사라졌음을 확인한 다음, Girard's reagent T를 처리하여 β-포스포노 아미드인 화합물 D(
Figure PCTKR2017014019-appb-I000059
또는
Figure PCTKR2017014019-appb-I000060
)를 수득하였다. 상기 과정에서 얻은 화합물 D는 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran: THF) 용매 조건에서 하기 표 2를 참고하여, 1.5 당량의 알데하이드 및 t-BuOK를 처리하여 본 발명의 화합물 28~30 및 36~41을 얻었다.
[표 2]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000061
다음으로, 본 발명의 아미드 유도체 화합물 중, 화합물 27 및 43를 합성하기 위해, 본 발명의 화합물 6 또는 32(1eq, 200mg)를 톨루엔(3㎖)에 더한 다음 lawesson's reagent(1.1eq, 304mg)를 혼합하여 60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 과정을 통해 얻은 반응물에 증류수를 더하여 반응을 종결한 다음, 에테르로 추출하고 황산마그네슘을 넣어 탈수한 후 농축하였다. 상기 농축물은 헥산:에틸아세테이트(10:1)의 조건으로 컬럼을 진행하여 화합물 27 및 43을 얻었다.
또한, 본 발명의 아미드 유도체 화합물 중, 화합물 44는 하기 반응식 4를 참고하여 합성하였다.
[반응식 4]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000062
구체적으로, 2,4-디클로로벤즈알데하이드(1eq, 1.75g), 메틸트리페닐포스핀브롬화물(1eq, 3.57g) 및 수산화나트륨(1.5g)을 1,4-디옥산(10㎖) 및 증류수(0.5㎖)에 넣고 70℃에서 교반하였다. 상기 과정을 통해 얻은 반응물에 에틸아세테이트 및 증류수를 더하여 반응을 종결한 다음, 황산마그네슘을 넣어 탈수한 후 농축하였다. 이후, 염화술포닐(2eq)과 DMF를 더하고 90℃에서 3시간 교반한 다음, 실온으로 냉각하고 얼음을 넣어 반응을 종결하였다. 추가 정제과정 없이 상기 반응물에 2-아미노피리딘(1eq), 트리에틸아민(2eq) 및 염화메틸렌(0.1M)을 더한 다음 4시간 동안 교반하였다. 이후, 클로로메탄 및 증류수로 반응을 종결하고 황산마그네슘을 넣어 탈수한 후 농축한 다음, 헥산:에틸아세테이트(2:1)의 조건으로 컬럼을 진행하여 화합물 44를 얻었다.
2. 아미드 유도체 화합물의 물리화학적 구조의 확인
상기 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 합성한 화합물 1 내지 49의 물리화학적 특성은 다음과 같다.
(1) (E)-3-(4- 클로로페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 1)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000063
(E)-3-(4-chlorophenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 6.52 (1H, d, J = 15.5 Hz), 7.06 (1H, t, J = 6.0 Hz), 7.35 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.45 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.72 (2H, dd, J = 4.0, 15.4 Hz), 8.29 (1H, d, J = 4.6 Hz), 8.33 (1H, d, J = 8.3 Hz), 8.42 (1H, br s).
(2) (E)-3-(4- 클로로페닐 )-N-(1H- 이미다졸 -2-일) 아크릴아미드 (화합물 2)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000064
(E)-3-(4-chlorophenyl)-N-(1H-imidazol-2-yl)acrylamide;
(3) (E)-3-(4- 클로로페닐 )-N-(피리미딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 3)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000065
(E)-3-(4-chlorophenyl)-N-(pyrimidin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 7.02 (1H, t, J = 4.8 Hz), 7.31 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.36 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.50 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.79 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.20 (1H, br s), 8.62 (2H, d, J = 4.8 Hz).
(4) (E)-3-(4- 클로로페닐 )-N-(피라진-2-일) 아크릴아미드 (화합물 4)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000066
(E)-3-(4-chlorophenyl)-N-(pyrazin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ H 6.53 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.38 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.49 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.77 (1H, d, J = 15.5 Hz), 7.91 (1H, br s), 8.25 (1H, s), 8.36 (1H, s), 9.65 (1H, s).
(5) (E)-3-(4- 클로로페닐 )-N-( 옥사졸 -2-일) 아크릴아미드 (화합물 5)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000067
(E)-3-(4-chlorophenyl)-N-(oxazol-2-yl)acrylamide;
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ H 6.43 (1H, d, J = 16.0 Hz), 6.77 (1H, br s), 7.00 (1H, s), 7.37 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.47 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.51 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.78 (1H, d, J = 15.3 Hz).
(6) (E)-3-(4-( tert -부틸) 페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 6)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000068
(E)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.31 (9H, s) 6.57 (1H, td, J = 1.2, 15.6 Hz), 7.06 (1H, dd, J = 5.3, 7.1 Hz), 7.37 (2H, d, J = 6.3 Hz), 7.44 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.74 (1H, dd, J = 1.8, 15.9 Hz), 7.77 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.31 (1H, d, J = 4.8 Hz), 8.40 (1H, dd, J = 0.8, 8.6 Hz), 9.26 (1H, br s).
(7) (E)-3-(4- 메톡시페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 7)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000069
(E)-3-(4-methoxyphenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 3.83 (3H, s), 6.52 (1H, d, J = 15.6 Hz), 6.90 (2H, d, J = 9.0 Hz), 7.02 (1H, t, J = 6.3 Hz), 7.50 (2H, d, J = 5.4 Hz), 7.72-7.77 (2H, m), 8.24 (1H, d, J = 5.1 Hz), 8.41 (1H, d, J = 9.0 Hz), 9.36 (1H, br s).
(8) (E)-3-(2- 클로로페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 8)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000070
(E)-3-(2-chlorophenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ H 6.57 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.06 (1H, q, J = 4.0 Hz), 7.26-7.32 (2H, m), 7.42 (1H, dd, J = 1.6, 7.6 Hz), 7.60 (1H, dd, J = 2.1, 7.2 Hz), 7.75 (1H, t, J = 7.9 Hz), 8.15 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.28 (1H, dd, J = 1.1, 4.8 Hz), 8.36 (1H, d, J = 8.4 Hz), 8.44 (1H, br s).
(9) (E)-N-(피리딘-2-일)-3-(4-( 트리플루오로메틸 ) 페닐 ) 아크릴아미드 (화합물 9)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000071
(E)-N-(pyridin-2-yl)-3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 6.66 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.07 (1H, q, J = 4.0 Hz), 7.60 (4H, s), 7.75 (1H, dd, J = 1.5, 15.6 Hz), 7.78 (1H, d, J = 15.9 Hz), 8.30 (1H, d, J = 4.2 Hz), 8.37 (1H, d, J = 8.1 Hz), 9.16 (1H, br s).
(10) (E)-3-(4- 브로모페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 10)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000072
(E)-3-(4-bromophenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
(11) (E)-3-(4-( tert - 뷰톡시 ) 페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 11)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000073
(E)-3-(4-(tert-butoxy)phenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.35 (9H, s), 6.49 (1H, d, J = 15.6 Hz), 6.95 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.04 (1H, q, J = 4.1 Hz), 7.39 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.69-7.76 (2H, m), 8.30 (1H, d, J = 3.9 Hz), 8.39 (1H, d, J = 8.4 Hz), 9.32 (1H, br s).
(12) (E)-3-(4-( tert -부틸) 페닐 )-N-(피리딘-3-일) 아크릴아미드 (화합물 12)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000074
(E)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-(pyridin-3-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.27 (9H, s), 6.61 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.22-7.27 (1H, m), 7.33 (2H, d, J = 6.6 Hz), 7.39 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.73 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.29-8.34 (2H, m), 8.64 (1H, d, J = 2.7 Hz), 8.75 (1H, br s).
(13) (E)-3-(4-( tert -부틸) 페닐 )-N-(피리딘-4-일) 아크릴아미드 (화합물 13)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000075
(E)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-(pyridin-4-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.29 (9H, s), 6.28 (1H, d, J = 15.3 Hz), 7.36 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.43 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.63 (2H, d, J = 6.3 Hz), 7.76 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.47-8.52 (3H, m).
(14) (E)-3-(4-( tert -부틸) 페닐 )-N-(4- 클로로피리딘 -2-일) 아크릴아미드 (화합물 14)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000076
(E)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-(4-chloropyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.32 (9H, s), 6.50 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.04 (1H, dd, J = 2.0, 5.3 Hz), 7.41 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.48 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.76 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.16 (1H, d, J = 5.4 Hz), 8.44-8.45 (2H, m).
(15) (E)-3-(4-( tert -부틸) 페닐 )-N-(5- 클로로피리딘 -2-일) 아크릴아미드 (화합물 15)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000077
(E)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-(5-chloropyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.32 (9H, s), 6.49 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.41 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.49 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.68 (1H, dd, J = 2.3, 9.2 Hz), 7.75 (1H, d, J = 15.3 Hz), 8.14 (1H, br s), 8.23 (1H, d, J = 2.7 Hz), 8.34 (1H, d, J = 9.0 Hz).
(16) (E)-N-(5- 브로모피리딘 -2-일)-3-(4-( tert -부틸) 페닐 ) 아크릴아미드 (화합물 16)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000078
(E)-N-(5-bromopyridin-2-yl)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.31 (9H, s), 6.53 (1H, d, J = 15.3 Hz), 7.40 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.47 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.79 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.93 (1H, dd, J = 2.1, 9.0 Hz), 8.50 (1H, d, J = 8.7 Hz), 8.55 (1H, s), 8.66 (1H, br s).
(17) (E)-3-(4-( tert -부틸) 페닐 )-N-(5-( 트리플루오로메틸 )피리딘-2-일) 아크 릴아미드(화합물 17)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000079
(E)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-(5-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.31 (9H, s), 6.49 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.40 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.48 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.81 (1H, dd. J = 2.4, 9.0 Hz), 8.21 (1H, br s), 8.29 (1H, d, J = 9.0 Hz), 8.32 (1H, d, J = 1.8 Hz).
(18) (E)-N-(피리딘-2-일)-3-(2-( 트리플루오로메틸 ) 페닐 ) 아크릴아미드 (화합물 18)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000080
(E)-N-(pyridin-2-yl)-3-(2-(trifluoromethyl)phenyl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 6.55 (1H, d, J = 15.3 Hz), 7.07 (1H, dq, J = 0.9, 4.1 Hz), 7.47 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.56 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.67-7.79 (3H, m), 8.13 (1H, dd, J = 2.0, 11.6 Hz), 8.23 (1H, d, J = 5.1 Hz), 8.38 (1H, d, J = 8.4 Hz), 8.84 (1H, br s).
(19) (E)-3-(2- 메톡시페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 19)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000081
(E)-3-(2-methoxyphenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 3.87 (3H, s), 6.72 (1H, d, J = 15.6 Hz), 6.95 (2H, q, J = 8.4 Hz), 7.02-7.07 (1H, m), 7.34 (1H, dt, J = 1.1, 7.9 Hz ), 7.50 (1H, dd, J = 1.4, 8.0 Hz), 7.75 (1H, ddd, J = 0.9, 7.95 Hz), 8.01 (1H, d, J = 15.9 Hz), 8.27 (1H, d, J = 5.1 Hz), 8.38 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.50(1H, br s).
(20) (E)-3-(3- 클로로페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 20)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000082
(E)-3-(3-chlorophenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 6.55 (1H, d, J = 15.6), 7.07 (1H, m), 7.32-7.40 (3H, m), 7.52 (1H, s), 7.71 (1H, d, J = 15.6), 7.75 (1H, m), 8.28 (1H, d, J = 5.4 Hz), 8.34 (1H, d, J = 8.7 Hz), 8.50(1H, d, br s).
(21) (E)-3-(3- 메톡시페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 21)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000083
(E)-3-(3-methoxyphenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide:
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 3.81 (3H, s), 6.54 (1H, d, J = 15.0 Hz), 6.91-7.33 (4H, m), 7.72-7.77 (2H, m), 8.29 (1H, d, J = 7.2 Hz ), 8.36 (1H, d, J = 8.4 Hz), 8.58 (1H, br s).
(22) (E)-3-(4-( tert -부틸) 페닐 )-N-(4- 메틸피리딘 -2-일) 아크릴아미드 (화합물 22)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000084
(E)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-(4-methylpyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.30 (9H, s), 2.38 (3H, s), 6.55 (1H, J = 15.6 Hz), 6.88 (1H, d, J = 5.1 Hz), 7.42 (4H, q, J = 7.0 Hz ), 7.74 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.15 (1H, d, J = 5.1 Hz), 8.23 (1H, s), 9.25 (1H, br s).
(23) (E)-3-(4-( tert -부틸) 페닐 )-N-(5- 페닐피리딘 -2-일) 아크릴아미드 (화합물 23)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000085
(E)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-(5-phenylpyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.30 (9H, s), 6.58 (1H, d, J = 15.3 Hz ), 7.34-7.57 (9H, m), 7.77 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.97 (1H, dd, J = 2.3, 8.6 Hz), 8.47 (1H, d, J = 9.0 Hz), 8.53 (1H, d, J = 2.4 Hz), 8.98 (1H, br s).
(24) (E)-3-(4-( tert -부틸) 페닐 )-N-(6- 메톡시피리딘 -2-일) 아크릴아미드 (화합물 24)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000086
(E)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-(6-methoxypyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.30 (9H, s), 3.86 (1H, s), 6.48(1H, d, J = 9.0 Hz), 6.52 (1H, d, J = 15.3 Hz), 7.45 (4H, q, J = 10.9 Hz), 7.6 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.74 (1H, d, J = 16.2 Hz), 7.81 (1H, br s), 7.86 (1H, d, J = 7.8 Hz).
(25) (E)-3-(4-( tert -부틸) 페닐 )-N-(피리딘-2-일)but-2- 엔아미드 (화합물 25)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000087
(E)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-(pyridin-2-yl)but-2-enamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.30 (9H, s), 2.62 (3H, s), 6.18 (1H, s), 6.52 (1H, ddd, J = 1.1, 5.0, 7.2 Hz), 7.39 (4H, s), 7.71 (1H, dt, J = 2.2, 7.9 Hz), 8.25 (1H, m), 8.33 (1H, d, J = 8.7 Hz ), 8.64 (1H, br s).
(26) (E)-3-(4-( tert -부틸) 페닐 )-N- 메틸 -N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 26)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000088
(E)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-methyl-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
(27) (E)-3-(4-( tert -부틸) 페닐 )-N-(피리딘-2-일)prop-2- 엔티오아미드 (화합물 27)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000089
(E)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-(pyridin-2-yl)prop-2-enethioamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.30 (9H, s), 6.71 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.10 (1H, t, J = 6.3 Hz), 7.37-7.50 (4H, m), 7.76 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.85 (1H, t, J = 7.1 Hz), 8.25 (1H, d, J = 6.0 Hz), 8.49 (1H, d, J = 8.4 Hz ), 9.81 (1H, br s).
(28) (E)-N-(4-( tert -부틸) 페닐 )-3-(피리딘-4-일) 아크릴아미드 (화합물 28)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000090
(E)-N-(4-(tert-butyl)phenyl)-3-(pyridin-4-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.28 (9H, s), 6.74 (1H, d, J = 11.7 Hz), 7.30-7.36 (4H, m), 7.54 (2H, d, J = 6.1 Hz), 7.63 (1H, d, J = 11.6 Hz), 7.97 (1H, br s), 8.56 (2H, dd, J = 4.2, 11.0 Hz).
(29) (E)-N-(4-( tert -부틸) 페닐 )-3-(피리딘-3-일) 아크릴아미드 (화합물 29)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000091
(E)-N-(4-(tert-butyl)phenyl)-3-(pyridin-3-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.28 (9H, s), 6.68 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.25-7.34 (4H, m), 7.66 (1H, s), 7.69 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.74 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.14 (1H, s), 8.53 (1H, d, J = 6.3 Hz), 8.73 (1H, s).
(30) (E)-N-(4-( tert -부틸) 페닐 )-3-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 30)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000092
(E)-N-(4-(tert-butyl)phenyl)-3-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.28 (9H, s), 7.14 (1H, d, J = 15.0 Hz), 7.23-7.25 (1H, m), 7.31 (3H, t, J = 13.8 Hz ), 7.38 (1H, br s), 7.52 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.70 (1H, s), 7.72 (1H, d, J = 8.7 Hz), 8.61 (1H, d, J = 4.2 Hz).
(31) (E)-3-(3,4- 디클로로페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 31)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000093
(E)-3-(3,4-dichlorophenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 6.60 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.17 (1H, q, J = 9.4 Hz), 7.39 (1H, d, J = 10.5 Hz ), 7.43 (1H, d, J = 15.3 Hz), 7.64 (1H, s), 7.70 (1H, d, J = 15.0 Hz), 7.86 (1H, t, J = 8.0 Hz), 8.25 (1H, d, J = 4.2 Hz), 8.44 (1H, d, J = 8.4 Hz), 9.31 (1H, br s).
(32) (E)-3-(2,4- 디클로로페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 32)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000094
(E)-3-(2,4-dichlorophenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 6.56 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.07 (1H, t, J = 6.5 Hz), 7.27 (1H, d, J = 1.8 Hz ), 7.44 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.54 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.76 (1H, dt, J = 1.6, 7.9 Hz), 8.08 (1H, d, J = 15.3 Hz), 8.28 (1H, d, J = 4.8 Hz), 8.36 (1H, d, J = 8.7 Hz), 8.69 (1H, br s).
(33) (E)-3-(2,4-bis( 트리플루오로메틸 ) 페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 33)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000095
(E)-3-(2,4-bis(trifluoromethyl)phenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 4.60 (2H, s), 7.13 (1H, dd, J = 5.5, 7.0 Hz), 7.44 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.79 (2H, t, J = 8.2 Hz), 7.94 (1H, s), 8.26 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.34 (1H, d, J = 5.4 Hz), 9.24 (1H, brs).
(34) (E)-3-(2- 클로로 -4- 플루오로페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 34)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000096
(E)-3-(2-chloro-4-fluorophenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 6.57 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.02 (1H, dt, J = 2.6, 8.3 Hz), 7.12 (1H, d, J = 6.0 Hz), 7.17 (1H, dd, J = 2.6, 8.2 Hz), 7.65 (1H, dd, J = 6.0, 8.7 Hz), 7.84 (1H, dt, J = 1.6, 7.9 Hz), 8.12 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.25 (1H, d, J = 4.5 Hz), 8.43 (1H, d, J = 8.4 Hz).
(35) (E)-3-(2- 요오도페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 35)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000097
(E)-3-(2-iodophenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 6.44 (1H, dd, J = 1.2, 15.3 Hz), 7.01-7.09 (2H, m), 7.35 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.54 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.75 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.89 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.98 (1H, d, J = 15.3 Hz), 8.28 (1H, d, J = 4.8 Hz), 8.37 (1H, d, J = 7.5 Hz), 8.64 (1H, brs).
(36) (E)-3-(2- 클로로 -4- 모르폴리노페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 36)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000098
(E)-3-(2-chloro-4-morpholinophenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
(37) (E)-3-(2- 클로로 -4-(피페리딘-1-일) 페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미 드(화합물 37)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000099
(E)-3-(2-chloro-4-(piperidin-1-yl)phenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.63 (6H, s), 3.26 (4H, s), 6.40 (1H, d, J = 15.3 Hz), 6.74 (1H, dd, J = 2.4, 9.0 Hz), 6.84 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.02 (1H, ddd, J = 1.0, 5.1, 7.4 Hz), 7.47 (1H, d, J = 8.7 Hz), 7.72 (1H, dt, J = 2.0, 7.8 Hz), 8.08 (1H, d, J = 15.3 Hz), 8.26 (1H, d, J = 3.0 Hz), 8.37 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.71 (1H, brs).
(38) (E)-3-(2- 클로로 -4-( 피롤리딘 -1-일) 페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미 드(화합물 38)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000100
(E)-3-(2-chloro-4-(pyrrolidin-1-yl)phenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
(39) (E)-3-(2- 클로로 -4-(피페라진-1-일) 페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미 드(화합물 39)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000101
(E)-3-(2-chloro-4-(piperazin-1-yl)phenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.63 (4H, s), 3.00 (2H, t, J = 4.8 Hz), 3.24 (2H, t, J = 5.0 Hz), 6.39 (1H, d, J = 15.6 Hz), 6.78 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.86 (1H, d, J = 2.4 Hz), 7.02 (1H, t, J = 6.3 Hz), 7.52 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.71 (1H, t, J = 7.8 Hz), 8.07 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.26 (1H, d, J = 4.8 Hz), 8.33 (1H, d, J = 8.4 Hz).
(40) (E)-3-(4-( 아제판 -1-일)-2- 클로로페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 40)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000102
(E)-3-(4-(azepan-1-yl)-2-chlorophenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.53 (4H, s), 1.77 (4H, s), 3.45 (4H, t, J = 6.0 Hz), 6.38 (1H, d, J = 15.3 Hz), 6.56 (1H, dd, J = 2.4, 9.0 Hz), 6.65 (1H, d, J = 2.7 Hz), 7.04 (1H, t, J = 5.1 Hz), 7.50 (1H, d, J = 5.1 Hz), 7.75 (1H, dt, J = 1.5, 8.0 Hz), 8.10 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.25 (1H, d, J = 4.5 Hz), 8.38 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.68 (1H, brs).
(41) (E)-3-(2- 클로로 -4-(디메틸아미노) 페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 41)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000103
(E)-3-(2-chloro-4-(dimethylamino)phenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 3.01 (6H, s), 6.51 (1H, d, J = 15.3 Hz), 6.61 (1H, d, J = 9.6 Hz), 6.65 (1H, d, J = 2.4 Hz), 7.16 (1H, t, J = 7.0 Hz), 7.59 (1H, d, J = 8.7 Hz), 7.89 (1H, t, J = 6.0 Hz), 8.16 (1H, d, J = 15.3 Hz), 8.19 (1H, s), 8.51 (1H, d, J = 8.7 Hz).
(42) 3-(4-( tert -부틸) 페닐 )-N-(피리딘-2-일) 프로판아미드 (화합물 42)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000104
3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-(pyridin-2-yl)propanamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.28 (9H, s), 2.68 (2H, t, J = 8.0 Hz), 3.01 (2H, t, J = 7.8 Hz), 7.00 (1H, dt, J = 1.7, 6.1 Hz), 7.14 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.30 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.69 (1H, dt, J = 4.1, 7.1 Hz), 8.19-8.28 (2H, m), 8.34 (1H, s).
(43) (E)-3-(2,4- 디클로로페닐 )-N-(피리딘-2-일)prop-2- 엔티오아미드 (화합물 43)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000105
(E)-3-(2,4-dichlorophenyl)-N-(pyridin-2-yl)prop-2-enethioamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 6.73 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.21 (1H, t, J = 6.6 Hz), 7.28 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.44 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.62 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.96 (1H, t, J = 7.1 Hz), 8.14 (1H, d, J = 15.5 Hz), 8.23 (1H, d, J = 4.4 Hz), 8.53 (1H, d, J = 8.6 Hz).
(44) (E)-2-(2,4- 디클로로페닐 )-N-(피리딘-2-일) 에텐 -1- 설폰아미드 (화합물 44)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000106
(E)-2-(2,4-dichlorophenyl)-N-(pyridin-2-yl)ethene-1-sulfonamide;
(45) 2-(2,4- 디클로로페닐 )-N-(피리딘-2-일) 시클로프로판 -1- 카복스아미드 (화합물 45)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000107
2-(2,4-dichlorophenyl)-N-(pyridin-2-yl)cyclopropane-1-carboxamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 1.35 (1H, dt, J = 4.4, 7.4 Hz), 1.65-1.77 (2H, m), 2.74 (1H, dt, J = 4.6, 7.8 Hz), 6.94 (1H, d, J = 5.2 Hz), 6.96-6.99 (1H, m), 7.15 (1H, dd, J = 2.0, 8.6 Hz), 7.37 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.68 (1H, dt, J = 1.8, 8.0 Hz), 8.18 (1H, d, J = 4.8 Hz), 8.22 (1H, d, J = 8.4 Hz), 8.98 (1H, s).
(46) 2-((2,4- 디클로로페닐 )아미노)-N-(피리딘-2-일) 아세트아미드 (화합물 46)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000108
2-((2,4-dichlorophenyl)amino)-N-(pyridin-2-yl)acetamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 3.93 (2H, d, J = 5.7 Hz), 5.00 (1H, t, J = 5.2 Hz), 6.47 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.00 (1H, ddd, J = 0.93, 4.95, 7.32 Hz), 7.05 (1H, dd, J = 2.3, 8.7 Hz), 7.26 (1H, d, J = 2.4 Hz), 7.67 (1H, dt, J = 1.8, 7.8 Hz), 8.18-8.22 (2H, m), 8.80 (1H, s).
(47) (E)-3-(4- 클로로 -2- 플루오로페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 47)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000109
(E)-3-(4-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 6.57 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.02 (1H, dt, J = 2.6, 8.3 Hz), 7.12 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.17 (1H, dd, J = 2.6, 8.3 Hz), 7.65 (1H, dd, J = 6.0, 8.7 Hz), 7.84 (1H, dt, J = 1.1, 7.9 Hz), 8.12 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.25 (1H, d, J = 4.5 Hz), 8.43 (1H, d, J = 8.4 Hz), 9.20 (1H, s).
(48) (E)-3-(2- 플루오로 -4- 메톡시페닐 )-N-(피리딘-2-일) 아크릴아미드 (화합물 48)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000110
(E)-3-(2-fluoro-4-methoxyphenyl)-N-(pyridin-2-yl)acrylamide;
(49) (E)-3-(2,4- 디클로로페닐 )-N- 페닐아크릴아미드 (화합물 49)
Figure PCTKR2017014019-appb-I000111
(E)-3-(2,4-dichlorophenyl)-N-phenylacrylamide;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ H 6.67 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.08 (1H, t, J = 7.2 Hz), 7.14 (1H, dd, J = 5.6, 12.2 Hz), 7.29 (2H, t, J = 7.8 Hz), 7.38 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.48 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.65 (2H, d, J = 7.8 Hz), 8.00 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.17 (1H, s).
실시예 2. 아미드 유도체 화합물의 피부 상처 치료 효과
1. 세포의 배양
실시예 2에서 사용된 세포 중, HaCaT 세포(Korean Cell Line Bank, Seoul National University, Korea), Raw 264.7 세포(American Type Culture Collection, USA) 와 NHDF(normal human dermal fibroblast cells) 세포는10%[v/v] FBS(fetal bovine serum) 및 1%[v/v] PS(페니실린-스트렙토마이신)가 포함된 high glucose DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Thermo Scientific, USA) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건의 습윤 인큐베이터에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대 배양을 시행하였다.
또한, HUVEC(American Type Culture Collection, USA) 세포는 20%[v/v] FBS 및 1% LSGS(low serum growth supplement, Invitrogen, USA)이 포함된 M200(Invitrogen, USA) 배지에서 배양하였으며, 모든 세포는 37℃, 5% CO2 조건의 습윤 인큐베이터에서 배양하였다.
2. 세포생존율의 측정
실시예 1.2에 기재된 바와 같은 아미드 유도체 화합물의 HaCaT 세포 또는 NHDF 세포에 대한 세포생존율을 측정하기 위해 MTT assay를 실시하였다.
먼저, 상기 실시예 2.1에서 배양한 HaCaT 세포 또는 NHDF 세포 1×105를 6웰 플레이트에 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, DMSO에 용해된 본 발명의 화합물 49(각 1, 5 또는 10 μM)이 포함된 2 ㎖의 무혈청 DMEM 배지로 교체하여 24시간을 추가로 더 배양하였다. 배양이 끝나면, 상기 화합물이 처리된 세포에 500 ㎍/㎖의 MTT 시약 2 ㎖를 더하여, 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 1시간 후, MTT 시약이 포함된 배지를 제거한 다음, 각 웰의 포르마잔 결정에 1 ㎖의 DMSO를 더하여 30분 동안 교반하고, 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Molecular Devices, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 아미드 유도체 화합물을 HaCaT 세포 또는 NHDF 세포에 처리하는 경우, 세포독성을 나타내지 않아 피부 상처 치료용, 피부 노화 억제용 또는 주름 개선용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.
3. Sirt1 활성의 확인
Sirt1은 p53의 K382 부분을 디아세틸화시키는 단백질로, 세포 내에서 Sirt1의 활성(deacetylase activity)이 높아지면(Sirt1 deacetylase activity 활성이 증가한다는 것과 Sirt1 활성이 높아진다는 것은 동일한 의미임), p53의 활성이 떨어진다는 보고(Molecular Cell, 28, 277-290, 2007)를 이용하여 p53의 활성을 세포 내에서 확인하였다. 즉, 루시퍼라아제 트랜스펙션(transfection)을 이용하여 p53의 활성을 측정함으로써, Sirt1의 활성을 예측하는 방법을 사용하였으며, 구체적으로, 한국등록특허 제10-1548605호를 참고하여 실시하였다.
HEK293 세포가 단층으로 70% 정도 채워지면(confluency) PBS로 세척한 다음, 0.25%의 트립신(trypsin)을 실온에서 1분간 처리한 후 DMEM을 가하여 세포를 회수하고, 2,500rpm에서 5분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하여 세포 침전물을 얻었다. 이 후 상기 세포들을 DMEM 배지로 잘 혼합하였다. 다음으로는 무혈청 배지 100㎕에 3㎕의 리포펙타민(lipofectamine, life Technologies, Inc)을 점적한 후 천천히 섞어 15분간 실온에 방치한 후, 3.0㎍의 p53-Luc(p53-루시퍼라아제 벡터), 3.0㎍의 pCMV-β-갈락토시다아제(transfection의 효율을 일정하게 맞추기 위한 표준물질로 β-galactosidase 유전자를 가진 plasmid), 0.2㎍의 Sirt1, 0.3㎍의 Myc 발현 벡터(Myc expression vector) 또는 공벡터(empty vector)를 넣은 미세 원침 튜브를 이용하여 30초에 걸쳐 상기 혈청 결핍 배지에 천천히 점적하면서 혼합하여 실온에서 다시 15분간 방치하였다. 리포펙타민과 각각의 벡터(또는 DNA-plasmid)의 혼합액과 HEK293 세포를 천천히 섞어 현탁액 상태로 20분간 실온에서 배양한 후 60mm 배양용기에 분주하고 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이 후, 다음날 화합물 1 내지 49를 각각 10, 20㎍/㎖의 농도로 첨가한 후 다시 24시간 동안 배양하였으며, 이때 대조군으로는 레스베라트롤(resveratrol)을 사용하였다.
다음으로는, 배양된 HEK293 세포를 PBS로 2회 세척하고 각각의 배양용기에 500㎕의 추출용액을 가하여 세포를 파괴한 뒤 14,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 이 때 얻은 상층액(세포 추출액)을 루시퍼라아제(luciferase)와 β-갈락토시다아제의 활성 측정에 사용하였다.
루시퍼라아제 활성은 100㎕의 세포에서 추출된 상층액(세포 추출액)과 100㎕의 20nM D-luciferin과 300㎕의 반응액(20mM glycin, 12.5mM MgSO4, 3mM EGTA, 15mM potassium phosphate, 1mM DTT, 1mM ATP)을 사용하여 발광분석기(luminometer)로 측정하였다. 유전자 주입 효율을 보정하기 위하여 β-갈락토시다아제(β-galatosidase) 활성을 측정하여 루시퍼라아제 활성을 보정하였다. β-갈락토시다아제의 활성은 30㎕의 세포추출액과 66㎕의 ONPT(4mg/㎖), 204㎕의 반응액(0.1M sodium phosphate, 1mM MgCl2, 45mM β-mercaptoethanol, pH 7.5)을 37℃ 항온조에서 반응시킨 후 분광광도계(spectrophotometer)로 흡광도를 측정하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000112
표 3을 참고하면, 본 발명의 아미드 유도체는 EC50값이 양성대조군인 레스베라트롤에 비해 최소 7700배 이상으로 나타나, Sirt1의 효소 활성을 증가시키는 효과가 현저하게 우수한 것임을 확인할 수 있었다.
4. 피부 세포에서 Sirt1 발현량의 확인
실시예 2.1에 기재된 바와 같이 배양한 HaCaT 세포 또는 NHDF 세포가 단층(monolayer)으로 80% 채워지면(confluency) PBS로 두 번씩 세척한 다음, DMSO로 용해한 본 발명의 화합물 49를 1, 5 또는 10μM이 되도록 무혈청 배지로 희석하여 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 회수하고, lysis 버퍼(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 50mM Tris-Cl)로 용해하여 단백질을 얻었다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 하여 Bio-Rad Protein Assay(Bio-Rad, CA, USA)로 측정하였다.
이후, 40㎍의 단백질을 취하여 SDS-PAGE(8-15%[w/v] 폴리아크릴아미드 젤 사용)를 실시한 뒤, 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 전이시켰다. 상기 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween 20)에 용해된 5%[w/v] 탈지유로 블록킹하고, 항체(Sirt1, α-Tubulin)반응한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참고하면, 본 발명의 아미드 유도체 화합물을 NHDF 세포(도 2A 및 2B) 또는 HaCaT 세포(도 2C 및 2D)에 처리하는 경우, 모든 세포에서 농도 의존적으로 Sirt1의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
5. 피부 상처 치료 효과의 확인
Sirt1의 발현이 피부 상처 치유에 효과가 있음을 확인하기 위해, 먼저, siRNA를 이용하여 형질주입(transfection)한 HaCaT 세포로 상처 치유 분석(wound healing assay)을 실시하였고, 이후, 상기 HaCaT 세포에 본 발명의 화합물 49를 처리하여 피부 상처 치료 효과를 확인하였다.
먼저, 실시예 2.1에 기재된 바와 같이 배양된 HaCaT 세포를 96웰 플레이트에 접종하여, 1.4~1.5%의 리포펙타민(lipofectamine)이 들어있는 무혈청 배지에 Sirt1 siRNA 또는 scramble RNA을 최종 농도 100nM이 되도록 용해하고, 동일한 부피의 무혈청 배지를 혼합하여, 상기 접종된 HaCaT 세포에 처리한 다음, 형질주입(transfection)을 하였다. 이후, 상기 HaCaT 세포를 단층(monolayer)으로 배양하여, Wound MakerTM tool(Essen Bioscience, Michigan, USA)로 스크래치(scratch wounds)를 낸 뒤, 세포의 긁힌 부분을 IncuCyte ZOOM®(Essen Bioscience, MI, USA)으로 4시간 마다 확인하여, Sirt1의 발현이 피부 상처 치유에 효과가 있음을 도 3에 나타내었다.
또한, 본 발명의 화합물을 처리했을 시의 피부 상처 치유 효과를 확인하기 위해, 상기 과정과 동일하게 NHDF 세포 또는 HaCaT 세포를 단층으로 배양하고, 스크래치를 낸 뒤, 무혈청 배지에 용해된 본 발명의 화합물 49를 1, 5 또는 10μM로 처리하여 24시간 동안 배양하였으며, 이때, 비교를 위해 무처리군을 동일한 과정으로 실시하였다. 이후, 세포의 긁힌 부분을 4시간 마다 확인하여 도 4에 나타내었다.
먼저, 도 3을 참고하면, 스크래치낸 HaCaT 세포에 Sirt1을 knockdown한 siRNA를 처리하는 경우, 대조군 또는 scramble siRNA를 처리한 결과보다 상처 회복 속도가 느리므로, Sirt1의 발현이 피부 상처 치유에 효과가 있음을 알 수 있었다.
또한, 도 4를 참고하면, 스크래치낸 NHDF 세포 또는 HaCaT 세포에 본 발명의 화합물 49를 처리하는 경우, 농도 의존적으로 상처 치유 효과가 나타나는 것임을 확인할 수 있었다.
이에, 본 발명의 화합물을 상처 난 피부에 처리하는 경우, Sirt1의 발현에 의해 농도 의존적으로 피부 상처 치유 효과도 증가하는 것임을 알 수 있었다.
6. 동물 모델에서 피부 상처 치료 효과의 확인
동물모델에서의 피부 상처 치료 효과를 확인하기 위해, SKH-1 무모쥐(hairless mice, 5-weeks-old, Shizuoka Laboratory Animal Center, Japan)를 23℃에서 65%의 습도 조건 및 12시간 간격의 낮/밤이 유지되는 관리조건에서 적응시켰으며, 동물실험의 모든 절차는 가천대학교(Gachon University, Cancer and Diabetes Institute, LCDI-2013-0022)의 동물관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 지침으로 실시하였다.
무모쥐의 등에 6mm의 펀치생검(biopsy punch)을 실시하여 두 군데의 동일한 상처를 만든 다음, 상기 상처난 무모쥐를 무작위로 선택하여 대조군(vehicle), 본 발명의 화합물을 0.05%, 0.1%, 0.5%의 농도별로 각각 국소 적용하였다. 이때, 본 발명의 화합물은 증류수, 에탄올 및 프로판디올이 5:3:2로 혼합된 혼합물로 용해하였으며, 대조군은 증류수, 에탄올 및 프로판디올이 5:3:2로 혼합된 혼합물만 사용하여, 상처 부위에 10일 동안 매일 국소 적용한 다음, 상처 치유 효과를 도 5에 나타내었다.
또한, 상기 상처 부위에 본 발명의 화합물을 국소 적용한 피부 샘플(상처의 중앙 부위를 포함)은 에탄올로 건조되기(dehydrated) 전에 10% 포르말린으로 고정한 다음 크실렌(xylene)으로 세척하였다. 이후, 샘플은 파라핀 왁스로 고정하고, 5㎛ 두께로 잘라 H&E(hematoxylin and eosin) 및 Masson's trichrome 염색을 실시한 다음, 광학현미경(light microscope, Olympus, Japan)을 이용하여, 상처 부위(본 발명의 화합물을 국소 적용하여 5일 및 10일 경과 한 피부 샘플)를 도 6A 내지 6C에 나타내었다. 표피 재생 및 복구(granulation)는 하기 표 4를 참고하여, 표피 및 진피 재생은 3점 평점법을 사용하였으며, 육아조직(granulation tissue) 형성은 4점 평점법으로 측정한 다음 도 6D 및 6E에 나타내었다.
[표 4]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000113
도 5 및 6을 참고하면, 본 발명의 화합물을 쥐의 상처 난 피부에 10일 동안 매일 국소 적용하는 경우, 4일차부터 상처 회복 속도가 대조군에 비해 2배 이상으로 현저하게 차이가 났으며, 10일후에는 상처가 거의 치유된 것임을 확인할 수 있었다. 또한, 조직 염색 결과를 확인하면, 표피 및 진피 재생과 육아조직(granulation tissue) 형성이 대조군에 비해 우수하였으며, 콜라겐 형성도 우수한 것임을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 아미드 유도체 화합물의 항노화 또는 피부주름 개선 효과
1. PIP( procollagen Type Ⅰ C-peptide) 발현량의 확인
실시예 2.1에 기재된 바와 같이 배양된 NHDF 세포 5×105개를 100mm 플레이트에 접종하고 하루 동안 배양한 후, 본 발명의 화합물 49를 1, 5, 10μM 농도로 처리하여 3일 동안 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다. 3일 후, 세포 배양액을 채취하여 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type- I C peptide EIA kit, Takara, Japan)로 프로펩타이드(propeptide)의 양을 측정하였으며, 배지에서 프로콜라겐 타입-I C 펩타이드(procollagen type- I C peptide; PIP)의 농도는 상기 키트 제조사의 지시에 따라 결정하였고, 각 샘플은 3회 반복으로 실험하여 콜라겐 생합성 정도를 측정하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물을 NHDF 세포에 처리하는 경우, 콜라겐 합성의 전구체인 PIP의 생성이 농도 의존적으로 증가하여, 피부 노화 억제 및 주름개선에 효과적인 것임을 알 수 있었다.
2. 자외선 조사로 유도된 섬유아세포에서 독성 평가
정상 인간 섬유아세포(normal human dermal fibroblast: NHDF)는 건강한 수컷 도너(Healthy young male donor, MCTT Core, Inc, Seoul, Korea)의 피부 조직검사(skin biopsy)로부터 수득하여 100 nm 조직배양 용기에 접종하였다. 접종된 NHDF를 10%(v/v) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum: FBS)과 1%(w/v) 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서, 약 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 배양된 세포는 6 계대와 10 계대 사이의 세포를 사용하였고, 세포 밀집도가 약 80%에 도달하면 60 mm 배양 접시에 1.2×105 세포/웰로 접종하였다.
상기 100 mm 배양 접시에 접종한 NHDF 세포가 약 80%의 세포 밀도에 도달하면, 세포를 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline: PBS)로 2번 세척하였다. 그 후, 자외선 조사 장치(Bio-Link BLX-312; Vilber Lourmat GmbH, France)를 이용하여, 준비된 세포에 144 mJ/㎠ 선량(dose)의 자외선을 조사하였다. 자외선 조사한 후, 세포를 PBS로 3번 세척하고 혈청을 포함하지 않는 배지로 교환한 다음, 즉시 화합물 11 및 37을 각각 5 μM 와 10 μM 농도로 처리하였다.
화합물 11 및 37의 세포독성 평가를 위해, MTT 분석을 통해 세포생존율을 분석하였다. 준비된 세포를 약 72 시간 동안 배양한 후, 1 mg/ml의 MTT 시약 100 ㎕를 처리하였다. ELISA 리더(Molecular Devices E09090; San Francisco, CA, USA)를 사용하여 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하고, 화합물의 농도에 따른 세포 생존율을 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 5 μM 및 10 μM의 화합물 11 및 37은 모두 자외선을 조사한 NHDF 세포에서 유의한 세포독성을 나타내지 않았다.
3. 피부 노화 및 피부 주름 관련 효소의 분비량의 확인
(1) MMP -1의 분비량의 확인
피부 주름과 관련하여, 매트릭스 메탈로프로테아제-1(Matrix metalloproteinase-1: MMP-1)는 콜라겐 분해에 관여하는 효소로 알려져 있다. 이에, 화합물 11 및 37이 MMP-1의 저해 활성이 있는지 여부를 확인하였다.
실시예 3.2에 기재된 바와 같이, NHDF 세포에 자외선을 조사하고, 화합물 11 및 37을 처리한 후, 약 72시간 동안 배양하였다. 그 후, 각 웰로부터 세포배양액(conditioned medium)을 회수하고 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트(Human Total MMP-1 kit, R&D Systems, R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA)를을 사용하여 MMP-1의 분비량을 분석하였다. 실험은 3회 반복하여 측정하고, MMP-1 분비량의 분비량을 도 9a에 나타내었다.
도 9a에 나타난 바와 같이, 우선 NHDF 세포에 자외선을 조사할 경우 자외선을 조사하지 않은 세포에 비해 MMP-1의 분비량이 증가하였다. 화합물 11 및 37은 자외선 조사된 NHDF 세포에서 MMP-1의 분비량을 유의하게 감소시켰다. 특히, 화합물 11은 MMP-1의 분비량을 현저하게 감소시키는 뛰어난 효과를 가짐을 확인하였다. 따라서, 화합물 11 및 37은 자외선 조사로 인한 광노화 유도 세포에서 MMP-1의 분비량을 감소시킴을 확인하였다.
(2) 프로콜라겐타입 I의 분비량의 확인
피부 콜라겐 타입 I은 섬유아세포 내에서 프로콜라겐(procollagen)으로 합성된 후 세포 외로 분비되고, 세포 외로 분비된 프로콜라겐은 절단되고 가교(cross-liking)되어 콜라겐 섬유를 형성함으로써 제조되는 것으로 알려져 있다. 이에, 화합물 11 및 37이 프로콜라겐 타입 I의 분비 활성이 있는지 여부를 확인하였다.
실시예 3.3(1)에 기재된 바와 같이, NHDF 세포에 자외선을 조사하고, 화합물 11 및 37을 처리하고, 약 72시간 동안 배양하였다. 그 후, 회수된 세포배양액을 ELISA 키트(Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan)을 사용하여 프로콜라겐 타입 I의 분비량을 분석하였다. 실험은 3회 반복하여 측정하고, 프로콜라겐 타입 I의 분비량을 도 9b에 나타내었다.
도 9b에 나타난 바와 같이, 자외선 조사된 NHDF 세포에서 프로콜라겐 타입 I의 분비량은 자외선 조사에 의해 감소하였다. 화합물 11 및 37은 자외선 조사된 NHDF 세포에서 프로콜라겐 타입 I의 분비량을 유의하게 증가시켰다. 따라서, 화합물 11 및 37은 자외선 조사로 인한 광노화 유도 세포에서 프로콜라겐 타입 I의 분비량을 증가시킴을 확인하였다.
4. 피부 세포에서 Sirt1 의 발현량 및 화합물 Sirt1 활성 확인
(1) 피부 세포에서 Sirt1 의 발현량의 확인
실시예 3.3(1)에 기재된 바와 같이 배양된 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 용해 완충액(150 mM NaCl, 1%(v/v) NP-40, 0.5%(w/v) 소듐 데옥시콜레이트, 0.1%(w/v) 소듐 도데실 술페이트, 50 mM Tris-Cl)으로 용해하여 단백질을 얻었다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 하여 Bio-Rad 단백질 어어세이(Bio-Rad, CA, USA)로 측정하였다. 이후, 30 ㎍의 단백질을 취하여 SDS-PAGE (8-15%[w/v] 폴리아크릴아미드 겔 사용) 및 항-Sirt1 항체(Invitrogen) 및 항α-튜불린 항체(Invitrogen)를 사용한 면역블로팅을 수행하였다. 면역블로팅 결과를 도 10a에 나타내었다.
도 10a에 나타난 바와 같이, NHDF 세포에 자외선을 조사할 경우, 자외선을 조사하지 않은 세포에 비해 Sirt1의 발현량이 감소하였다. 화합물 11 및 37은 자외선 조사된 NHDF 세포에서 Sirt1의 발현량을 유의하게 증가시켰다.
(2) 피부 세포에서 Sirt1 의 활성의 확인
실시예 3.4(1)에 기재된 바와 같이 배양된 세포로부터 단백질을 얻었다. Sirt1 활성도를 측정하기 위해, SIRT1 Direct Fluorescent Screening Assay Kit(Cayman, USA)로 Sirt1 활성도를 측정하였다. 비교군으로서, Sirt1 활성을 증가시키는 것으로 알려진 레스베라트롤(Resveratrol)(Sigma-aldrich)을 10 μM 또는 50 μM의 농도로 사용하였다. 실험은 키트 제조사의 지시에 따라 진행하였고, 3회 반복을 실험하여 Sirt1 활성도를 측정하였다. 측정된 Sirt1 활성도를 도 10b에 나타내었다.
도 10b에 나타내는 바와 같이, Sirt1의 활성도가 레스베라트롤에 비해 화합물 37에 의해 농도 의존적으로 증가하였다. 따라서, 화합물 37은 자외선 조사된 NHDF 세포에서 Sirt1의 활성을 유의하게 증가시키는 것을 확인하였다.
제제예 1. 약학적 제제
1. 친수성 연고제의 제조
화합물 1 내지 49, 예를 들어 화합물 49를 사용하여, 하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상의 방법으로 친수성 연고제를 제조하였다.
[표 5]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000114
2. 정제의 제조
화합물 1 내지 49, 예를 들어 화합물 49를 사용하여, 하기 표 6에 기재된 성분을 혼합한 후, 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
[표 6]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000115
제제예 2. 화장료 제제
1. 유연 화장수의 제조
화합물 1 내지 49, 예를 들어 화합물 49를 사용하여, 하기 표 7에 기재된 조성에 따라 통상의 방법으로 유연 화장수를 제조하였다.
[표 7]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000116
2. 영양 에센스의 제조
화합물 1 내지 49, 예를 들어 화합물 49를 사용하여, 하기 표 8에 기재된 조성에 따라 통상의 방법으로 영양 에센스를 제조하였다.
[표 8]
3. 크림의 제조
화합물 1 내지 49, 예를 들어 화합물 49를 사용하여, 하기 표 9에 기재된 조성에 따라 통상의 방법으로 크림을 제조하였다.
[표 9]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000118
4. 팩의 제조
화합물 1 내지 49, 예를 들어 화합물 49를 사용하여, 하기 표 10에 기재된 조성에 따라 통상의 방법으로 팩을 제조하였다.
[표 10]
Figure PCTKR2017014019-appb-I000119

Claims (16)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000120
    상기 화학식 1에서,
    R1, R2, R4, 및 R5는 서로 독립적으로 수소 원자, 히드록시기, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C6의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C6의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C3의 할로알킬기, 페닐, 또는 이들의 조합이고;
    R3은 수소 원자, 히드록시기, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C6의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C6의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C3의 할로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C8의 헤테로시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C6 아민기, 또는 이들의 조합이고; 및
    R2, R3, R4, 및 R5 중 하나 이상은 수소가 아니다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 1 중 R3은 수소 원자, Cl, F, Br, -CF3, 터트-부틸(t-Bu), 메톡시, 터트-부톡시(t-BuO-), 모르폴리노페닐, 피페리딘, 피롤리딘, 피페라진, 아제판, 디메틸아미노, 또는 이들의 조합인 것인 화합물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 1 중 R1은 수소 원자, Cl, Br, 메틸, 메톡시, -CF3, 페닐, 또는 이들의 조합인 것인 화합물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 1 중 R2, R4, 및 R5는 서로 독립적으로 수소 원자, Cl, I, F, 메톡시, -CF3, 또는 이들의 조합인 것인 화합물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물:
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000121
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000122
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000123
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000124
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000125
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000126
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000127
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000128
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000129
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000130
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000131
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000132
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000133
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000134
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000135
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000136
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000137
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000138
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000139
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000140
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000141
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000142
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000143
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000144
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000145
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000146
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000147
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000148
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000149
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000150
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000151
    ; 및
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000152
    .
  6. 청구항 1의 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 항노화 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 피부 주름은 광노화, 연령, 얼굴 표정, 수분 부족, 또는 이들의 조합에 의한 것인 화장료 조성물.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 전체 조성물 중량에 대하여 0.000001 중량% 내지 10 중량% 포함하는 것인 화장료 조성물.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 화장료 조성물의 제형은 화장수, 외용 연고, 크림, 폼, 유연수, 유액, 파운데이션, 메이크업베이스, 에센스, 색조 화장료, 비누, 액체세정제, 입욕제, 자외선 차단용 크림, 자외선 차단용 오일, 피부접착용 패취 및 피부접착용 겔로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화장료 조성물.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 화장료 조성물은 콜라겐 분해 억제, 프로콜라겐 분비, 시르투인 1(Sirtuin 1; Sirt1) 활성 촉진, 또는 이들의 조합의 효과를 갖는 것인 화장료 조성물.
  11. 청구항 1의 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 피부 노화 억제, 피부 주름 예방 또는 치료, 또는 피부 상처 치료용 약학적 조성물.
  12. 청구항 6의 화장료 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선 방법.
  13. 하기 군으로부터 선택되는 화학식으로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 피부 상처 치료용 약학적 조성물:
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000153
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000154
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000155
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000156
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000157
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000158
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000159
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000160
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000161
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000162
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000163
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000164
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000165
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000166
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000167
    ;
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000168
    ; 및
    Figure PCTKR2017014019-appb-I000169
    .
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 피부 상처는 찰과상, 타박상, 열상, 절창, 좌상, 자상, 욕창, 화상, 동상, 피부궤양 및 화학적 창상으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 약학적 조성물.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 약학적 조성물의 제형은 액제, 연고제, 크림제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 또는 에어로졸제인 것인 약학적 조성물.
  16. 청구항 13의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 상처 치료 방법.
PCT/KR2017/014019 2016-12-01 2017-12-01 아미드 유도체 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 이를 포함하는 피부 노화 억제, 주름 개선, 또는 피부 상처 치료용 약학적 또는 화장료 조성물 WO2018101793A2 (ko)

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