CN105361168A - 一种复合型抗氧化肽及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合型抗氧化肽及制备方法，其发酵底物包括下述重量比的原料：玉米醇溶蛋白、大豆水解蛋白、麦芽蛋白；本发明以枯草芽孢杆菌种子菌悬液为发酵菌，以玉米醇溶蛋白、大豆水解蛋白及麦芽蛋白混合分散体系为发酵底物，进行液态发酵，将枯草芽孢杆菌种子发酵法和酶水解底物结合起来，在发酵过程中可以分解、改性大量的功能性抗氧化蛋白肽。本发明具有简化工艺流程，降低制备成本，使产物多样性等优点，制备的复合型抗氧化肽，功能突出，速溶性强及加工特性显著等优势，适用于降压、抗疲劳、醒酒、抗氧化等功能性蛋白肽产品的开发。该发明以发酵法改性醇溶蛋白使其研究阶段进入高潮期，解决单一品种抗氧化肽功能性不足的问题。
Description
技术领域
本发明涉及功能性食品加工技术领域，具体涉及一种复合型抗氧化肽及其制备方法。
背景技术
玉米醇溶蛋白是玉米中的主要蛋白质，具有独特的溶解特性、耐热性、成膜性和抗氧化性，可用于防潮隔氧、抗紫外线、保鲜、防静电等，还有一定的抑菌作用，其含有高比例的亮氨酸、丙氨酸和异亮氨酸等疏水性脂肪族氨基酸，在其多肽链中存在抗氧化、抗高血压，促酒精代谢等的功能序列区，采用必要的改性方法，可以使其功能特性释放出来，用于开发功能食品。
大豆蛋白是一种营养丰富的优质植物蛋白，主要由β-伴球蛋白(7S)和球蛋白(11S)组成，经过水解后可以得到一定功能性质的肽段，一方面具备易消化、抗疲劳、增强体力等特性，还具备一定的生理活性物质，在机体内有多种生理功能，使大豆肽在保健食品中的应用具有广泛的前景。特别经过生物酶改性，是一种新兴、无毒副作用、安全可行的改性方式，具有重要的应用意义。
啤酒糟历来被认为是有价值的饲料，它的蛋白质含量高达25%~30%。经啤酒糟超声碱提的麦芽蛋白具有较高的营养价值和较好的功能性质，但不很理想，其功能特性尚不能满足现代食品加工的要求，尤其是溶解性较差的问题，限制了麦芽蛋白在食品工业上的应用，有必要对其进行改性和修饰，从而使麦芽蛋白的功能性质得以改善。
生物活性复合肽是多种原料综合利用的新型研究成果，可有效的提高和拓展生物活性肽的生理功能，实现各种特性的优势互补，同时其抗氧化活性与加工特性均有了较强的改善，在保健品的开发上有着广阔的前景。
目前生物活性肽的常用制备方法有化学合成法、酶解法和微生物发酵法。化学法存在成本高，有残留化合物等问题，仅用于生产高价的药理级肽。酶解法由于其生产条件温和、反应过程易于控制，已被广泛应用到生物活性肽的工业生产上，然而大多数商品酶制剂价格昂贵，微生物发酵法制备的抗氧化肽苦味较低，芳香味较浓，然而微生物发酵法结合酶解法在抗氧化肽的制备方面还略有欠缺，仍多处于实验室广泛探究中。
发明内容
本发明的目的是为了得到一种具备玉米醇溶蛋白、大豆水解蛋白以及麦芽蛋白多种功能特性的发酵型、速溶抗氧化肽产品，具备降压、抗疲劳、醒酒、抗氧化以及优质加工特性的功能性。
本发明的另一个目的是解决单一品种抗氧化肽功能性不足的问题。
本发明是一种利用枯草芽孢杆菌种子菌悬液液态发酵玉米醇溶蛋白、大豆水解蛋白及麦芽蛋白混合蛋白制备复合抗氧化肽的方法，是通过以下步骤实现的：
一、一种复合型抗氧化肽发酵底物包括下述重量比的原料：
玉米醇溶蛋白70~85%；
大豆水解蛋白10~20%；
麦芽蛋白5~10%；
二、其制备方法如下：
1、制备玉米醇溶蛋白：
取玉米蛋白粉，经二氧化碳超临界脱色工艺，反应温度45~50℃，出口阀温度90~100℃，反应压力300~400bar，提取时间120min，流体流量6L/h进行脱色除杂处理。依微波-超声联合浸提，经脱色的玉米蛋白粉按1:20的料液比（m/v）加入70%的乙醇溶液，以440W输出功率的微波反应器提取三次，每次60s，4000r/min离心30min取上清液备用；将去上清液后的蛋白粉按1:10的料液比（m/v）加入70%的乙醇，用超声波复提，萃取温度45~50℃，超声作用时间20~25min，合并两次离心上清液，减压浓缩，控制乙醇浓度不高于50%。将减压浓缩液加入冷水稀释，同时调pH6.0~6.2，得到玉米醇溶蛋白沉淀，以纯净水反复冲洗，得沉淀物。将沉淀物置超低温冰箱-60~-80℃冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥10h得玉米醇溶蛋白成品；
2、制备大豆水解蛋白：
取低温豆粕，加入豆粕20倍的纯净水，用2mol/LNaOH调pH至80~8.1，搅拌2.5h后，在4℃条件下4000r/min离心30min，离心后将上清液以2mol/LHCl调pH至4.2~4.5。在4℃条件下8000r/min离心20min。用纯净水洗涤沉淀三次，加入一定比例的纯净水用乳化机使沉淀形成分散体系，并用2mol/LNaOH调pH至7.0~7.2。真空冷冻干燥备用。将得到的大豆分离蛋白用pH6.2的磷酸盐缓冲溶液配制一定量的蛋白溶液，采用低频低温超声，超声时间20min对大豆分离蛋白进行改性。改性后的大豆蛋白采用超静压两步酶水解反应生成大豆水解蛋白，第一步：胃蛋白酶在超静压200MPa，pH2.0，温度37℃，添加量5%，酶解15min；第二步，迅速调节pH8.5，温度60℃，添加6%碱性蛋白酶(2.0×104U/g)，在恒定pH条件下反应12h，置于100℃水浴灭酶15min，冷却室温后4000r/min离心20min取上清液，调节pH至等电点，8000r/min离心30min取沉淀物。将沉淀物置超低温冰箱-60~-80℃冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥10h得大豆水解蛋白成品；
3、制备麦芽蛋白：
取啤酒糟，按1:12的料液比（m/v）加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液，在50~60℃，功率为180~200W的超声提取器中提取1~1.5h，4000r/min离心20min，取上清液，调节pH为4.0~4.5，再8000r/min冷冻离心分离，沉淀置超低温冰箱-60~-80℃冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥10h得麦芽蛋白成品；
4、按照配方比例合并前三步得到的玉米醇溶蛋白，大豆水解蛋白以及麦芽蛋白，按1:20的料液比（m/v）加入纯净水，搅拌均匀成悬浊液的分散体系；
5、将上述均匀的分散体系调节pH至7.8~8.0，用高压蒸气灭菌锅在121℃杀菌20min，取出冷却至室温，加入5%（mL/mL）酶活力为2000U/mL的枯草芽孢杆菌种子菌悬液，混匀，于37℃、150~180r/min条件下振荡培养48h，置沸水浴中加热15min，然后迅速冷却至室温，以4000r/min离心20min获取上清液，调节等电点至4.5，沉降离心，以纯净水洗涤后，再离心，取沉淀物；
6、将上述沉淀物置超低温-60~-80℃冰箱冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥，冷阱温度-75~-80℃，真空度1.0Pa，冷冻干燥10h得复合型抗氧化肽成品。
本发明以枯草芽孢杆菌种子菌悬液为发酵菌，以玉米醇溶蛋白、大豆水解蛋白及麦芽蛋白混合分散体系为发酵底物，进行液态发酵，将枯草芽孢杆菌种子发酵法和酶水解底物结合起来，在发酵过程中可以分解、改性大量的功能性抗氧化蛋白肽。本发明具有简化工艺流程，降低制备成本，使产物多样性等优点，制备的复合型抗氧化肽，功能突出，速溶性强及加工特性显著等优势，适用于降压、抗疲劳、醒酒、抗氧化等功能性蛋白肽产品的开发。该发明以发酵法改性醇溶蛋白使其研究阶段进入高潮期，解决单一品种抗氧化肽功能性不足的问题。
具体实施方式
实施例1按照下列步骤制备本发明的复合型抗氧化肽：
1、制备玉米醇溶蛋白：取500g湿法生产玉米淀粉的主要副产物玉米蛋白粉，要求蛋白含量70%以上，经二氧化碳超临界脱色工艺，反应温度45℃，出口阀温度100℃，反应压力400bar，提取时间120min，流体流量6L/h进行脱色除杂处理。依微波-超声联合浸提，经脱色的玉米蛋白粉加入70%的乙醇10000mL，以440W输出功率的微波反应器提取三次，每次60s，4000r/min离心30min取上清液备用；将去上清液后的蛋白粉加入70%的乙醇5000mL，用超声波复提，萃取温度45℃，超声处理20min，合并两次离心上清液，减压浓缩，控制乙醇浓度不高于50%。将减压浓缩液加入冷水稀释，同时调pH6.0，得到玉米醇溶蛋白沉淀，以纯净水反复冲洗，得沉淀物。将沉淀物置超低温冰箱-80℃冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥10h得玉米醇溶蛋白成品；
2、制备大豆水解蛋白：取低温豆粕500g加入10000g的纯净水，用2mol/LNaOH调pH至8.1，搅拌2.5h后，在4℃条件下4000r/min离心30min，离心后将上清液以2mol/LHCl调pH至4.5。在4℃条件下8000r/min离心20min。用纯净水洗涤沉淀三次，加入一定比例的纯净水用乳化机使沉淀形成分散体系，并用2mol/LNaOH调pH至7.0。真空冷冻干燥备用。取得到的大豆分离蛋白100g用pH6.2的磷酸盐缓冲溶液配制一定量的蛋白溶液，采用低频低温超声（20KHz，0℃水浴循环，400W）条件下超声时间20min对大豆分离蛋白进行改性。改性后的大豆蛋白采用超静压两步酶水解反应生成大豆水解蛋白，胃蛋白酶先在超静压200MPa，pH2.0，温度37℃，酶添加量5g，酶解15min；然后迅速调节pH8.5，温度60℃，添加6g碱性蛋白酶(2.0×104U/g)在恒定pH条件下反应12h，置于100℃水浴灭酶15min，冷却室温后4000r/min离心20min取上清液，调节pH至等电点，8000r/min离心30min取沉淀物。将沉淀物置超低温冰箱-80℃冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥10h得大豆水解蛋白成品；
3、制备麦芽蛋白：啤酒厂生产啤酒的副产物啤酒糟500g，要求蛋白含量28%以上，加入6000mL0.1mol/L的氢氧化钠溶液，在50℃，功率为200W的超声波提取器中提取1.5h，4000r/min离心20min，取上清液，调节pH为4.5，再8000r/min冷冻离心分离，沉淀置超低温冰箱-80℃冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥10h得麦芽蛋白成品；
4、将所得玉米醇溶蛋白70g、大豆水解蛋白20g及麦芽蛋白10g混合后，加入2000mL纯净水，以德国内切式均浆机搅拌均匀成悬浊液分散体系。调节pH至8.0，用高压蒸气灭菌锅在121℃杀菌20min，取出冷却至室温，加入100mL酶活力为2000U/mL的枯草芽孢杆菌种子菌悬液，混匀，于37℃、180r/min条件下振荡培养48h，置沸水浴中加热15min，然后迅速冷却至室温，以4000r/min离心20min获取上清液，调节等电点至4.5，沉降离心，以纯净水洗涤后，再离心，取沉淀物。将沉淀物置超低温-80℃冰箱冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥，冷阱温度-80℃，真空度1.0Pa，冷冻干燥10h得复合型抗氧化肽成品。
实施例2按照下列步骤制备本发明的复合型抗氧化肽：
1、制备玉米醇溶蛋白：取500g湿法生产玉米淀粉的主要副产物玉米蛋白粉，要求蛋白含量70%以上，经二氧化碳超临界脱色工艺，反应温度50℃，出口阀温度100℃，反应压力300bar，提取时间120min，流体流量6L/h进行脱色除杂处理。依微波-超声联合浸提，经脱色的玉米蛋白粉加入70%的乙醇10000mL，以440W输出功率的微波反应器提取三次，每次60s，4000r/min离心30min取上清液备用；将去上清液后的蛋白粉加入70%的乙醇5000mL，用超声波复提，萃取温度50℃，超声处理25min，合并两次离心上清液，减压浓缩，控制乙醇浓度不高于50%。将减压浓缩液加入冷水稀释，同时调pH6.0，得到玉米醇溶蛋白沉淀，以纯净水反复冲洗，得沉淀物。将沉淀物置超低温冰箱-80℃冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥10h得玉米醇溶蛋白成品；
2、制备大豆水解蛋白：取低温豆粕500g加入10000g的纯净水，用2mol/LNaOH调pH至8.1，搅拌2.5h后，在4℃条件下4000r/min离心30min，离心后将上清液以2mol/LHCl调pH至4.5。在4℃条件下8000r/min离心20min。用纯净水洗涤沉淀三次，加入一定比例的纯净水用乳化机使沉淀形成分散体系，并用2mol/LNaOH调pH至7.0。真空冷冻干燥备用。取得到的大豆分离蛋白100g，用pH6.2的磷酸盐缓冲溶液配制一定量的蛋白溶液，采用低频低温超声（20KHz，0℃水浴循环，400W）条件下超声时间20min对大豆分离蛋白进行改性。改性后的大豆蛋白采用超静压两步酶水解反应生成大豆水解蛋白，胃蛋白酶先在超静压200MPa，pH2.0，温度37℃，酶添加量5g，酶解15min；然后迅速调节pH8.5，温度60℃，添加6g碱性蛋白酶(2.0×104U/g)在恒定pH条件下反应12h，置于100℃水浴灭酶15min，冷却室温后4000r/min离心20min取上清液，调节pH至等电点，8000r/min离心30min取沉淀物。将沉淀物置超低温冰箱-80℃冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥10h得大豆水解蛋白成品；
3、制备麦芽蛋白：啤酒厂生产啤酒的副产物啤酒糟500g，要求蛋白含量28%以上，加入6000mL0.1mol/L的氢氧化钠溶液，在60℃，功率为180W的超声波提取器中提取1.5h，4000r/min离心20min，取上清液，调节pH为4.5，再8000r/min冷冻离心分离，沉淀置超低温冰箱-80℃冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥10h得麦芽蛋白成品；
4、将所得玉米醇溶蛋白85g、大豆水解蛋白10g及麦芽蛋白5g混合后，加入2000mL纯净水，以德国内切式均浆机搅拌均匀成悬浊液分散体系。调节pH至8.0，用高压蒸气灭菌锅在121℃杀菌20min，取出冷却至室温，加入100mL酶活力为2000U/mL的枯草芽孢杆菌种子菌悬液，混匀，于37℃、150r/min条件下振荡培养48h，置沸水浴中加热15min，然后迅速冷却至室温，以4000r/min离心20min获取上清液，调节等电点至4.5，沉降离心，以纯净水洗涤后，再离心，取沉淀物。将沉淀物置超低温-80℃冰箱冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥，冷阱温度-75℃，真空度1.0Pa，冷冻干燥10h得复合型抗氧化肽成品。
Claims (2)
1.一种复合型抗氧化肽，其特征在于：包括下述重量比的原料：
玉米醇溶蛋白70~85%；
大豆水解蛋白10~20%；
麦芽蛋白5~10%。
2.一种权利要求1所述的复合型抗氧化肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（一）、制备玉米醇溶蛋白
取玉米蛋白粉，经二氧化碳超临界脱色工艺，反应温度45~50℃，出口阀温度90~100℃，反应压力300~400bar，提取时间120min，流体流量6L/h进行脱色除杂处理；依微波-超声联合浸提，经脱色的玉米蛋白粉按1:20的料液比（m/v）加入70%的乙醇溶液，以440W输出功率的微波反应器提取三次，每次60s，4000r/min离心30min取上清液备用；将去上清液后的蛋白粉按1:10的料液比（m/v）加入70%的乙醇，用超声波复提，萃取温度45~50℃，超声作用时间20~25min，合并两次离心上清液，减压浓缩，控制乙醇浓度不高于50%；将减压浓缩液加入冷水稀释，同时调pH6.0~6.2，得到玉米醇溶蛋白沉淀，以纯净水反复冲洗，得沉淀物；将沉淀物置超低温冰箱-60~-80℃冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥10h得玉米醇溶蛋白成品；
（二）、制备大豆水解蛋白
取低温豆粕，加入豆粕20倍的纯净水，用2mol/LNaOH调pH至80~8.1，搅拌2.5h后，在4℃条件下4000r/min离心30min，离心后将上清液以2mol/LHCl调pH至4.2~4.5；在4℃条件下8000r/min离心20min；用纯净水洗涤沉淀三次，加入一定比例的纯净水用乳化机使沉淀形成分散体系，并用2mol/LNaOH调pH至7.0~7.2，真空冷冻干燥备用；取得到的大豆分离蛋白用pH6.2的磷酸盐缓冲溶液配制一定量的蛋白溶液，采用低频低温超声，超声时间20min对大豆分离蛋白进行改性，改性后的大豆蛋白采用超静压两步酶水解反应生成大豆水解蛋白，第一步：胃蛋白酶在超静压200MPa，pH2.0，温度37℃，添加量5%，酶解15min；第二步，迅速调节pH8.5，温度60℃，添加6%碱性蛋白酶(2.0×104U/g)，在恒定pH条件下反应12h，置于100℃水浴灭酶15min，冷却室温后4000r/min离心20min取上清液，调节pH至等电点，8000r/min离心30min取沉淀物；将沉淀物置超低温冰箱-60~-80℃冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥10h得大豆水解蛋白成品；
（三）、制备麦芽蛋白
取啤酒糟，按1:12的料液比（m/v）加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液，在50~60℃，功率为180~200W的超声提取器中提取1~1.5h，4000r/min离心20min，取上清液，调节pH为4.0~4.5，再8000r/min冷冻离心分离，沉淀置超低温冰箱-60~-80℃冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥10h得麦芽蛋白成品；
（四）、按照配方比例合并前三步得到的玉米醇溶蛋白，大豆水解蛋白以及麦芽蛋白，按1:20的料液比（m/v）加入纯净水，搅拌均匀成悬浊液的分散体系；
（五）、将上述均匀的分散体系调节pH至7.8~8.0，用高压蒸气灭菌锅在121℃杀菌20min，取出冷却至室温，加入5%（mL/mL）酶活力为2000U/mL的枯草芽孢杆菌种子菌悬液，混匀，于37℃、150~180r/min条件下振荡培养48h，置沸水浴中加热15min，然后迅速冷却至室温，以4000r/min离心20min获取上清液，调节等电点至4.5，沉降离心，以纯净水洗涤后，再离心，取沉淀物；
（六）、将上述沉淀物置超低温-60~-80℃冰箱冷冻24h，再由真空冷冻干燥机冷冻干燥，冷阱温度-75~-80℃，真空度1.0Pa，冷冻干燥10h得复合型抗氧化肽成品。
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