CN105360171B - 一种植物源抑菌剂的制备方法及用途 - Google Patents

一种植物源抑菌剂的制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物源抑菌剂的制备方法及用途。该植物源抑菌剂包含太行菊提取物干粉和水溶性纳米银，太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为80～90∶10～20；所述太行菊提取物干粉制备方法为：(a)将干燥的太行菊粉碎，用55～65％乙醇溶液热回流提取，合并滤液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用AB‑8大孔树脂富集活性成分，先用5～10％乙醇冲洗4～6个柱体积除去大极性成分，再用50～60％乙醇洗脱8～12个柱体积，收集50～60％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。

Description

一种植物源抑菌剂的制备方法及用途
技术领域
本发明涉及抑菌制剂开发，具体涉及一种植物源抑菌剂的制备方法及用途。
背景技术
目前广泛用于树木和植物上的杀菌剂，要求有较高的杀菌性和较好的持久性，以达到保护树木和植物不受菌虫的侵害。
这类杀菌剂仍以化学农药为主。但菌虫繁殖能力强，对环境适应快，已对多种农药产生了抗药性。另外，不合理使用化学农药，例如单一使用、连续使用或超量使用化学农药，又会加速菌虫产生抗药性的速度和发展程度。随着有害生物抗药性的增强，人们在生产中不断地加大农药使用剂量，于是形成了对农药的强烈依赖性。尽管一些化学药物在杀菌抑菌方面起了重要的作用，保证了农林产物的稳产、高产，但是这些化学药物的高毒性、严重的残留和污染问题也给人类健康带来了极大的隐患。尤其是今天，人们越来越重视环境问题，越来越需要更多的绿色食品，因此，解决高毒性、高残留和污染问题已刻不容缓。为达到此目的，人们更加注重从动植物和微生物中寻找高效、低毒、低残留或无残留的新型杀菌剂。
植物提取物是一类从植物体内提取纯化出来的成分，包含黄酮、多酚、生物碱、木脂素、萜类和醌类等多种化学成分，成分复杂，化学性质活泼，并且常以大量性质相似的同系物的混合物形式存在，植物源提取物不仅抵御植食动物对植物体的损害，同时也阻止了微生物的侵染，包括提高对各种致病菌的耐受力及保护受伤部位。除了植物致病菌外，植物多酚对动物体内和其他环境中的微生物都能产生明显的抑制作用，对包括真菌、细菌、酵母及病毒等在内的微生物具有广谱抗性。
以植物源提取物中多酚的抑菌机理为例：植物多酚能高度结合蛋白质，这无疑是其抑菌性的一个主要因素，往往在很低浓度就表现出明显的抑制作用，它是通过抑制酶活性，破坏病原菌代谢过程而实现其抑制作用地，另外，它还能通过与细胞膜结合或与微生物生存环境中的金属离子络合，破坏病原菌的正常新陈代谢，从而也能实现其抑制作用。植物多酚的化学结构及分子量影响其活性。酚羟基在苯环上的数目及位置影响酚类物质的相对毒性，羟基化程度增强导致毒性增强。分子量大者，往往不显示出抑菌性，低分子量的多酚往往表现出更强的微生物毒性。
但是随着长期反复的应用，病菌对药剂逐渐产生了不同程度的抗性。为了克服或延缓抗性的产生，延长药剂的使用寿命、扩大抗菌增强抑杀病菌的效果，将不同作用方式、不同作用机理的杀菌剂混配使用，是解决延缓抗性发展的有效措施之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物源抑菌剂，该抑菌剂的制备方法和用途。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种植物源抑菌剂，该植物源抑菌剂包含太行菊提取物干粉和水溶性纳米银，太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为80～90∶10～20；
所述太行菊提取物干粉制备方法为：(a)将干燥的太行菊粉碎，用55～65％乙醇溶液热回流提取，合并滤液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用AB-8大孔树脂富集活性成分，先用5～10％乙醇冲洗4～6个柱体积除去大极性成分，再用50～60％乙醇洗脱8～12个柱体积，收集50～60％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥即得。
进一步地，该植物源抑菌剂包含太行菊提取物干粉和水溶性纳米银，太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为85∶15；
所述太行菊提取物干粉制备方法为：(a)将干燥的太行菊粉碎，用55～65％乙醇溶液热回流提取，合并滤液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用AB-8大孔树脂富集活性成分，先用5～10％乙醇冲洗4～6个柱体积除去大极性成分，再用50～60％乙醇洗脱8～12个柱体积，收集50～60％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥即得。
进一步地，所述水溶性纳米银制备方法为：取十四烷酸溶于甲醇-水中，加入氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到硝酸银溶液中，再向硝酸银溶液中加入三乙胺，加热搅拌使沉淀完全溶解后，加入有机溶剂析出新的沉淀，抽滤，用有机溶剂洗涤，真空干燥即得所述水溶性纳米银。
进一步地，所述有机溶剂为丙酮。
进一步地，所述太行菊提取物干粉的制备方法为：(a)将干燥的太行菊粉碎，用60％乙醇溶液热回流提取，合并滤液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用AB-8大孔树脂富集活性成分，先用8％乙醇冲洗5个柱体积除去大极性成分，再用55％乙醇洗脱10个柱体积，收集55％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥即得。
为了能够通过建立HPLC指纹图谱的方法控制不同批次制备的太行菊提取物干粉的批间差异，所述太行菊提取物干粉的高效液相色谱分析方法为：
色谱柱：Agilent Zorbax Extent-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.2％甲酸溶液；
梯度洗脱程序：0～5min，A 8％→15％；5～10min，A 15％→35％；10～18min，A35％→55％；18～20min，A 55％→8％；20～25min，A 8％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：255nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
一种所述植物源抑菌剂的制备方法：用水溶解所述植物源抑菌剂，所述植物源抑菌剂的浓度为1.0～3.0g/100mL。
进一步地，用水溶解所述植物源抑菌剂，所述植物源抑菌剂的浓度为2.0g/100mL。
所述的植物源抑菌剂在抑制微生物生长方面的应用。
进一步地，所述微生物包括枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、聚生小穴壳菌、栗疫病菌、梨叶点霉、黑白轮枝孢和亚麻刺盘孢。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的植物源抑菌剂中发挥抑菌作用的为太行菊提取物和纳米银，经研究发现太行菊提取物和纳米银的抑菌作用之间互相具有协同作用，其共同作用效果远大于单一成分的作用，并且通过控制太行菊提取物和纳米银的比例能发挥最优的抑菌作用。
(2)本发明所述植物源抑菌剂的制备方法简单实用，通过控制所述植物源抑菌剂的浓度可以获得抑菌作用优异的抑菌剂。
附图说明
图1为太行菊提取物干粉的HPLC液相图谱。
具体实施方式
本发明所用试剂、材料无特殊说明外，均为可以从市场直接购买的常规试剂、材料。乙醇为食品级乙醇，不同浓度的乙醇溶液均为体积百分浓度。
本发明所述太行菊提取物干粉的制备方法为：
(a)将干燥的太行菊5kg粉碎，用60％乙醇溶液热回流提取(15L×3次)，合并滤液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释至2L，依次用石油醚(2L×3次)、乙酸乙酯(2L×3次)和水饱和的正丁醇(2L×3次)萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用AB-8大孔树脂富集活性成分，先用8％乙醇冲洗5个柱体积除去大极性成分，再用55％乙醇洗脱10个柱体积，收集55％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥即得(185g)。
为了控制太行菊提取物干粉的质量，提高不同批次的统一性，本发明提供了太行菊提取物干粉的液相分析方法。
太行菊提取物干粉供试品溶液配制：取太行菊提取物干粉5mg至50mL棕色容量瓶中，加30mL 8％乙腈水溶液超声溶解，冷却至室温后，继续加8％乙腈水溶液定容。
太行菊提取物干粉的液相分析方法如下：
色谱仪：Agilent 1260，二元泵
色谱柱：Agilent Zorbax Extent-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.2％甲酸溶液；
梯度洗脱程序：0～5min，A 8％→15％；5～10min，A 15％→35％；10～18min，A35％→55％；18～20min，A 55％→8％；20～25min，A 8％；
流动相流速：1.0mL·min-1；
检测波长：255nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
用制备的10批次的太行菊提取物干粉进行分析，进行色谱峰匹配，结果1～12号峰在10批样品色谱图中均出现，且均与周围色谱峰达到基线分离。因此标定12个峰为共有色谱峰，据此建立该提取物的HPLC质量控制图谱，结果见图1。
本发明所述水溶性纳米银的制备方法为：
取22.8g十四烷酸溶于140mL按体积比2:5混合的甲醇-水中，加入4g氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到100mL浓度为10mol/L的硝酸银溶液中，再向硝酸银溶液中加入15mL三乙胺，80℃条件下电磁搅拌2h使沉淀完全溶解后，加入35mL丙酮析出新的沉淀，抽滤，用丙酮洗涤，真空干燥即得所述水溶性纳米银。
下面结合具体实施例对本发明提供的植物源抑菌剂作详细说明。
实施例1：太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为85∶15，抑菌剂的浓度为2.0g/100mL
按照上述制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银的方法分别制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银。分别称取太行菊提取物干粉1.7g和水溶性纳米银0.3g至100mL容量瓶中，先加50mL水震荡溶解，再用水定容至刻度。
实施例2：太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为80∶20，抑菌剂的浓度为2.0g/100mL
按照上述制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银的方法分别制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银。分别称取太行菊提取物干粉1.6g和水溶性纳米银0.4g至100mL容量瓶中，先加50mL水震荡溶解，再用水定容至刻度。
实施例3：太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为90∶10，抑菌剂的浓度为2.0g/100mL
按照上述制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银的方法分别制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银。分别称取太行菊提取物干粉1.8g和水溶性纳米银0.2g至100mL容量瓶中，先加50mL水震荡溶解，再用水定容至刻度。
实施例4：实施例1的对比试验1，太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为75∶25，抑菌剂的浓度为2.0g/100mL
按照上述制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银的方法分别制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银。分别称取太行菊提取物干粉1.5g和水溶性纳米银0.5g至100mL容量瓶中，先加50mL水震荡溶解，再用水定容至刻度。
实施例5：实施例1的对比试验2，太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为95∶5，抑菌剂的浓度为2.0g/100mL
按照上述制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银的方法分别制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银。分别称取太行菊提取物干粉1.9g和水溶性纳米银0.1g至100mL容量瓶中，先加50mL水震荡溶解，再用水定容至刻度。
实施例6：太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为85∶15，抑菌剂的浓度为1.0g/100mL
按照上述制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银的方法分别制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银。分别称取太行菊提取物干粉0.85g和水溶性纳米银0.15g至100mL容量瓶中，先加50mL水震荡溶解，再用水定容至刻度。
实施例7：太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为85∶15，抑菌剂的浓度为3.0g/100mL
按照上述制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银的方法分别制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银。分别称取太行菊提取物干粉2.55g和水溶性纳米银0.45g至100mL容量瓶中，先加50mL水震荡溶解，再用水定容至刻度。
实施例8：实施例1的对比试验3，太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为85∶15，抑菌剂的浓度为0.5g/100mL
按照上述制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银的方法分别制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银。分别称取太行菊提取物干粉0.425g和水溶性纳米银0.075g至100mL容量瓶中，先加50mL水震荡溶解，再用水定容至刻度。
实施例9：实施例1的对比试验4，太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为85∶15，抑菌剂的浓度为3.5g/100mL
按照上述制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银的方法分别制备太行菊提取物干粉和水溶性纳米银。分别称取太行菊提取物干粉2.975g和水溶性纳米银0.525g至100mL容量瓶中，先加50mL水震荡溶解，再用水定容至刻度。
实施例10：实施例1～9制备的抑菌剂对特定菌种的抑菌效果实验
采用牛津杯法，验证实施例1～9制备的抑菌剂对枯草芽孢杆菌(①)、大肠杆菌(②)、巨大芽孢杆菌(③)、金黄色葡萄球菌(④)、聚生小穴壳菌(⑤)、栗疫病菌(⑥)、梨叶点霉(⑦)、黑白轮枝孢(⑧)、亚麻刺盘孢(⑨)9种菌株的杀菌效果。
供试细菌悬浮液的制备：将供试菌种分别在无菌条件下接种在试管斜面培养基上，置37℃恒温培养箱内培养20小时，待菌长出，加入无菌蒸馏水，溶解，振荡，形成悬浮菌液。
将无菌固体LB培养基加热融化，冷却至50～60℃，倒入无菌培养皿中，分别滴加几滴供试细菌悬浮液，轻轻摇匀，培养基的厚度为2～2.5mm。将无菌的牛津杯摆放于各含菌的平板上，每个平板4只，分别注入实施例1～9制备的抑菌剂水溶液0.20ml，在37℃培养24小时，观察杀菌情况，测量每种菌株产生的抑菌圈大小。
表1实施例1～9制备的抑菌剂对特定菌种的抑菌效果实验
参考药物敏感实验判定标准在抑菌圈大于9毫米为高敏，表1的结果说明：抑菌剂的抑菌效果一方面与太行菊提取物干粉和水溶性纳米银的重量比有关，另一方与抑菌剂的使用浓度有关。太行菊提取物干粉和水溶性纳米银的重量比过高或过低均会降低抑菌活性，二者在一定重量比范围内具有最佳的协同作用。抑菌剂浓度在1.0～3.0g/100mL范围内抑菌效果较好。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (8)

1.一种植物源抑菌剂水溶液，其特征在于：将植物源抑菌剂用水溶解而成，植物源抑菌剂的浓度为1.0～3.0g/100mL；其中，所述植物源抑菌剂由太行菊提取物干粉和水溶性纳米银组成，太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为80～90∶10～20；
所述太行菊提取物干粉制备方法为：(a)将干燥的太行菊粉碎，用55～65％乙醇溶液热回流提取，合并滤液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用AB-8大孔树脂富集活性成分，先用5～10％乙醇冲洗4～6个柱体积除去大极性成分，再用50～60％乙醇洗脱8～12个柱体积，收集50～60％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥即得。
2.根据权利要求1所述的植物源抑菌剂水溶液，其特征在于：所述植物源抑菌剂由太行菊提取物干粉和水溶性纳米银组成，太行菊提取物干粉与水溶性纳米银的重量比为85∶15；
所述太行菊提取物干粉制备方法为：(a)将干燥的太行菊粉碎，用55～65％乙醇溶液热回流提取，合并滤液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用AB-8大孔树脂富集活性成分，先用5～10％乙醇冲洗4～6个柱体积除去大极性成分，再用50～60％乙醇洗脱8～12个柱体积，收集50～60％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥即得。
3.根据权利要求1或2所述的植物源抑菌剂水溶液，其特征在于，所述水溶性纳米银制备方法为：取十四烷酸溶于甲醇-水中，加入氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到硝酸银溶液中，再向硝酸银溶液中加入三乙胺，加热搅拌使沉淀完全溶解后，加入有机溶剂析出新的沉淀，抽滤，用有机溶剂洗涤，真空干燥即得所述水溶性纳米银。
4.根据权利要求3所述的植物源抑菌剂水溶液，其特征在于：所述有机溶剂为丙酮。
5.根据权利要求1或2所述的植物源抑菌剂水溶液，其特征在于，所述太行菊提取物干粉的制备方法为：(a)将干燥的太行菊粉碎，用60％乙醇溶液热回流提取，合并滤液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，过滤，用AB-8大孔树脂富集活性成分，先用8％乙醇冲洗5个柱体积除去大极性成分，再用55％乙醇洗脱10个柱体积，收集55％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥即得。
6.根据权利要求1或2所述的植物源抑菌剂水溶液，其特征在于：将植物源抑菌剂用水溶解而成，植物源抑菌剂的浓度为2.0g/100mL。
7.权利要求1或2所述的植物源抑菌剂水溶液在抑制微生物生长方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述微生物包括枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、聚生小穴壳菌、栗疫病菌、梨叶点霉、黑白轮枝孢和亚麻刺盘孢。
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