CN105301159A - 一种西罗莫司的高效液相色谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了西罗莫司的高效液相色谱分析方法，将含有西罗莫司的样品溶液通入色谱柱中，采用反向液相色谱外标百分比法定量分析，所述液相色谱条件为：色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料，规格4.6mm×150mm，3μm；流动相为：体积配比为18：82～22:78的流动相A与流动相B的混合溶液，等度洗脱，所述流动相A中磷酸、庚烷磺酸钠、水的质量配比为0.1:0.01:1，所述流动相B中甲醇与乙腈的体积配比15:85；检测波长为270nm～280nm；流速为1.5～2.0ml/min；柱温25～35℃；进样体积15～30μL。该高效液相分析方法具有实用可靠，稳定性较好，数据重现性强的优点，并且能够分离出杂质RRT1.07、杂质C、杂质RRT1.14。

Description

一种西罗莫司的高效液相色谱分析方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体而言，涉及一种西罗莫司的高效液相色谱分析方法。

背景技术

西罗莫司(sirolimus)又称雷帕霉素(rapamycin)，是一种大环内酯抗生素类免疫抑制剂。1977年西罗莫司被发现具有免疫抑制作用，1989年开始把西罗莫司作为治疗器官移植排斥反应的新药进行试用。经过Ⅲ期临床试验，1999年10月惠氏制药研制的西罗莫司口服溶液在美国首次上市，FDA允许它作为一种安全性较高的药物应用于临床防治肾移植排斥反应。

为了保证西罗莫司后续的研发和生产质量，需要对原料药及其制剂的质量进行控制。因此，研究获得一种西罗莫司的有关物质杂质检查和含量测定的检测方法，这对医药生产企业来说显得尤为迫切。在现有技术中，通常采用等度解决含量问题，采用梯度解决杂质问题，但因梯度的急剧变化常出现实验结果稳定性较差，数据偏差较大。

有鉴于此，有必要对现有技术中的西罗莫司的含量及其杂质含量的分析方法予以改进，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种西罗莫司的高效液相色谱分析方法，它能够同时准确测定出西罗莫司的含量和杂质。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种西罗莫司的高效液相色谱分析方法，

将含有西罗莫司的样品溶液通入色谱柱中，采用反向液相色谱外标百分比法定量分析，所述液相色谱条件为：

色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料，规格4.6mm×150mm，3μm；

流动相为：体积配比为18：82～22:78的流动相A与流动相B的混合溶液，等度洗脱，所述流动相A中磷酸、庚烷磺酸钠、水的质量配比为0.1:0.01:1，所述流动相B中甲醇与乙腈的体积配比为15:85；

检测波长为270nm～280nm；

流速为1.5～2.0ml/min；

柱温25～35℃；

进样体积15～30μL。

在一些实施方式中，样品溶液由含有西罗莫司的制剂与稀释剂组成。

在一些实施方式中，稀释剂由0.1％磷酸溶液与乙腈组成，所述0.1％磷酸溶液与乙腈的体积配比为50:65～50:75。

在一些实施方式中，制剂包括西罗莫司原料、西罗莫司片剂、西罗莫司胶囊或者西罗莫司口服溶液。

在一些实施方式中，稀释剂中0.1％磷酸溶液与乙腈的体积配比为50:70。

在一些实施方式中，制剂为西罗莫司片剂。

在一些实施方式中，检测波长为277nm，流速为1.8ml/min，柱温30℃，进样体积20μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所提供的西罗莫司的高效液相分析方法具有实用可靠，稳定性较好，数据重现性强的优点，并且能够从西罗莫司中有效分离出3个关键杂质，即杂质RRT1.07、杂质C与杂质RRT1.14。

附图说明

图1是实施例一中的西罗莫司原料的高效液相色谱图；

图2是实施例二中的西罗莫司制剂的高效液相色谱图；

图3是实施例一中的西罗莫司空白辅料的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。

实施例一：

西罗莫司原料含量和杂质的测定。

高效液相色谱条件：

色谱柱：ZorbaxEclipseplusC18，规格为4.6mm×150mm，3μm；

流动相配比为：流动相A：流动相B＝20:80(体积配比)，流动相A由磷酸:庚烷磺酸钠:水＝0.1:0.01:1(质量配比)组成，流动相B中由甲醇:乙腈＝15:85(体积配比)组成；

检测波长为277nm；

流速为1.5ml/min；

柱温30℃；

进样体积20μL；

稀释剂：0.1％磷酸溶液：乙腈＝50:70(体积配比)。

实验步骤：

溶液配制：

取西罗莫司原料约25mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，加适量稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照溶液；精密量取西罗莫司对照品10mg，置10ml量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为含量对照品溶液。精密量取供试品溶液、杂质对照溶液和含量对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，如图1所示，按照不加校正因子的自身对照法计算其杂质，按照外标法计算其含量。

表1：系统适用性测试结果

化合物名称或代号	保留时间(min)	分离度(R)	理论塔板数
				西罗莫司	14.262	2.1	7120
RRT1.07	15.530	1.9	6542
				杂质C	16.154	2.0	5125
RRT1.14	16.660	1.9	3513

根据表1可以看出，西罗莫司原料中各杂质可以得到有效分离，分离度均大于1.8,，峰形良好，峰纯度良好，理论塔板数大于3000，拖尾因子小于1.5，符合标准。

西罗莫司原料药，含量结果：为97.4％；杂质结果：杂质RRT1.07的含量为0.5％、杂质C的含量为1.2％、杂质RRT1.14的含量为0.3％。西罗莫司中关键的3个杂质均能准确测定出。同时对西罗莫司原料药进行破坏试验，降解杂质也得到了有效的分离，分离度大于1.8，主峰纯度较好，本发明可以有效的评价西罗莫司原料药的质量。

本发明提供的分析方法，根据中国药典2010版，完成方法学验证，包括系统适性试验、破坏性试验、影响因素试验、回收率试验、以及耐用性试验。经过这些验证，本发明提供的分析方法实用可靠，稳定性较好。

实施例二：

西罗莫司片剂的含量和杂质的测定。

高效液相色谱条件：

色谱柱：岛津InertsilC18，规格为4.6mm×150mm，3μm；

流动相配比为：流动相A：流动相B＝18:82(体积配比)，流动相A由磷酸:庚烷磺酸钠:水＝0.1:0.01:1(质量配比)组成，流动相B由甲醇:乙腈＝15:85(体积配比)组成；

检测波长为277nm；

流速为1.6ml/min；

柱温25℃；

进样体积20μL。

稀释剂：0.1％磷酸溶液：乙腈＝50:75(体积配比)。

实验步骤：

溶液配制：

取西罗莫司片剂适量(约相当于西罗莫司25mg)，精密称定，置于25ml容量瓶中，加适量稀释剂稀释至刻度，55℃超声30分钟、3000RPM离心15分钟、0.45微米滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度作为杂质对照溶液；取片剂空白辅料适量，置于25ml容量瓶中，加适量稀释剂稀释至刻度，55℃超声30分钟、3000RPM离心15分钟、0.45微米滤膜过滤，续滤液作为空白辅料溶液；精密量取西罗莫司对照品10mg，置10ml量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为含量对照品溶液。精密量取供试品溶液、杂质对照溶液、空白辅料和含量对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，如图2所示，按照不加校正因子的自身对照法计算其杂质，按照外标法计算其含量。

表2：系统适用性测试结果

化合物名称或代号	保留时间(min)	分离度(R)	理论塔板数
				西罗莫司	14.247	2.2	7241
RRT1.07	15.507	1.9	6415
				杂质C	16.136	1.9	5233
RRT1.14	16.676	1.8	3416

根据表2可以看出，空白辅料不干扰西罗莫司的含量检测，也不干扰其杂质检测。西罗莫司片剂中各杂质可以得到有效分离，分离度均大于1.8,，峰形良好，峰纯度良好，理论塔板数大于3000，拖尾因子小于1.5，符合标准。

西罗莫司片剂，含量结果：相当于标示量的99.2％；杂质结果：杂质RRT1.07的含量为0.04％、杂质C的含量为2.5％、杂质RRT1.14的含量为0.3％。西罗莫司片剂中关键的3个杂质均能准确测定出。同时对西罗莫司片剂进行破坏试验，降解杂质也得到了有效的分离，分离度大于1.8，主峰纯度较好，本发明可以有效的评价西罗莫司片剂的质量。

本发明提供的分析方法，根据中国药典2010版，完成方法学验证，包括系统适性试验、破坏性试验、影响因素试验、回收率试验、以及耐用性试验。经过这些验证，本发明提供的分析方法实用可靠，稳定性较好。

实施例三：

西罗莫司胶囊的含量和杂质的测定。

高效液相色谱条件：

色谱柱：迪马二代C18，规格为4.6mm×150mm，3μm；

流动相配比为：流动相A：流动相B＝22:78(体积配比)，流动相A由磷酸:庚烷磺酸钠:水＝0.1:0.01:1(质量配比)组成，流动相B由甲醇:乙腈＝15:85(体积配比)组成；

检测波长为277nm；

流速为1.8ml/min；

柱温28℃；

进样体积20μL。

稀释剂：0.1％磷酸溶液：乙腈＝50:65(体积配比)。

实验步骤：

溶液配制：

取西罗莫司胶囊内容物适量(约相当于西罗莫司25mg)，精密称定，置于25ml容量瓶中，加适量稀释剂稀释至刻度，50℃超声20分钟、5000RPM离心10分钟、0.45微米滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度作为杂质对照溶液；取胶囊空白辅料适量，置于25ml容量瓶中，加适量稀释剂稀释至刻度，50℃超声20分钟、5000RPM离心10分钟、0.45微米滤膜过滤，续滤液作为空白辅料溶液；精密量取西罗莫司对照品10mg，置10ml量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为含量对照品溶液。精密量取供试品溶液、杂质对照溶液、空白辅料和含量对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录液相色谱图，如图2所示，按照不加校正因子的自身对照法计算其杂质，按照外标法计算其含量。

结果表明，空白辅料不干扰西罗莫司胶囊的含量检测，也不干扰其杂质检测。西罗莫司胶囊中各杂质可以得到有效分离，分离度均大于1.8，峰形良好，峰纯度良好，理论塔板数大于3000，拖尾因子小于1.5，符合标准。

西罗莫司胶囊，含量结果：相当于标示量的99.2％；杂质结果：杂质RRT1.07的含量为0.34％、杂质C的含量为1.95％、杂质RRT1.14的含量为0.32％。西罗莫司胶囊中关键的3个杂质均能准确测定出。同时对西罗莫司胶囊进行破坏试验，降解杂质也得到了有效的分离，分离度大于1.8，主峰纯度较好，本发明可以有效的评价西罗莫司胶囊的质量。

实施例四：

西罗莫司口服液的含量和杂质的测定。

高效液相色谱条件：

色谱柱：热电C18，规格为4.6mm×150mm，3μm；

流动相配比为：流动相A：流动相B＝20:80(体积配比)，流动相A由磷酸:庚烷磺酸钠:水＝0.1:0.01:1(质量配比)组成，流动相B由甲醇:乙腈＝15:85(体积配比)组成；

检测波长为277nm；

流速为2.0ml/min；

柱温35℃；

进样体积20μL。

稀释剂：0.1％磷酸溶液：乙腈＝50:72(体积配比)。

实验步骤：

溶液配制：

取西罗莫司口服液适量(约相当于西罗莫司25mg)，精密称定，置于25ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，50℃超声5分钟、0.45微米滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度作为杂质对照溶液；取口服液空白辅料适量，置于25ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，50℃超声5分钟、0.45微米滤膜过滤，续滤液作为空白辅料溶液；精密量取西罗莫司对照品10mg，置10ml量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，作为含量对照品溶液。精密量取供试品溶液、杂质对照溶液、空白辅料溶液和含量对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，如图2所示，按照不加校正因子的自身对照法计算其杂质，按照外标法计算其含量。

结果表明，空白辅料不干扰西罗莫司口服液的含量检测，也不干扰其杂质检测。西罗莫司口服液中各杂质可以得到有效分离，分离度均大于1.8,，峰形良好，峰纯度良好，理论塔板数大于3000，拖尾因子小于1.5，符合标准。

西罗莫司口服液，含量结果：相当于标示量的99.8％；杂质结果：杂质RRT1.07的含量为0.42％、杂质C的含量为1.68％、杂质RRT1.14的含量为0.29％。西罗莫司口服液中关键的3个杂质均能准确测定出。同时对西罗莫司口服液进行破坏试验，降解杂质也得到了有效的分离，分离度大于1.8，主峰纯度较好，本发明可以有效地评价西罗莫司口服液的质量。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.一种西罗莫司的高效液相色谱分析方法，其特征在于，

将含有西罗莫司的样品溶液通入色谱柱中，采用反向液相色谱外标百分比法定量分析，所述液相色谱条件为：

色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料，规格4.6mm×150mm，3μm；

流动相为：体积配比为18：82～22:78的流动相A与流动相B的混合溶液，等度洗脱，所述流动相A中磷酸、庚烷磺酸钠、水的质量配比为0.1:0.01:1，所述流动相B中甲醇与乙腈的体积配比为15:85；

检测波长为270nm～280nm；

流速为1.5～2.0ml/min；

柱温25～35℃；

进样体积15～30μL。

2.根据权利要求1所述的西罗莫司的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述样品溶液由含有西罗莫司的制剂与稀释剂组成。

3.根据权利要求2所述的西罗莫司的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述稀释剂由0.1％磷酸溶液与乙腈组成，所述0.1％磷酸溶液与乙腈的体积配比为50:65～50:75。

4.根据权利要求2所述的西罗莫司的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述制剂包括西罗莫司原料、西罗莫司片剂、西罗莫司胶囊或者西罗莫司口服溶液。

5.根据权利要求3所述的西罗莫司的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述稀释剂中0.1％磷酸溶液与乙腈的体积配比为50:70。

6.根据权利要求4所述的西罗莫司的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述制剂为西罗莫司片剂。

7.根据权利要求1所述的西罗莫司的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述检测波长为277nm，流速为1.8ml/min，柱温30℃，进样体积20μL。