CN105287657A - 一种治疗癫痫病的银杏叶提取物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种治疗癫痫病的银杏叶提取物，所述提取物的药效成分含总银杏萜内酯、总黄酮、原花青素，总银杏萜内酯含量10%~12%，总黄酮含量40%～44%，原花青素含量重量百分比45%~50%，总银杏萜内酯+总黄酮+原花青素>95%，总黄酮醇苷含量重量百分比24%～26%，且原花青素/总黄酮的含量重量比值为1.05~1.25，原花青素/总银杏萜内酯的含量重量比值为4.0~4.4。所述提取物可用于制备治疗癫痫持续性发作、癫痫后大鼠大脑内异常的痫性放电、癫痫引发的学习记忆障碍的药物。

Description

一种治疗癫痫病的银杏叶提取物及其用途

(一)技术领域：本发明涉及一种植物药提取物，具体地说是一种治疗癫痫病的银杏叶提取物。

(二)背景技术：癫痫，一种脑部疾病状态，以具有能够产生癫痫发作的持久易患性和出现相应的神经生物、认知、心理及社会等方面的后果为特征。根据脑部病变和放电部位的不同，癫痫的发作有多种形式，如精神上的异常，运动感觉上的异常，行为认知上的异常和记忆功能的异常等。癫痫并非独立的疾病，而是一组疾病或综合症，其病因复杂、临床表现多样。癫痫对人类的健康和社会经济的发展构成了很大的危险，因此世界卫生组织(WHO)将癫痫列为2l世纪攻克目标之一。

根据WHO在1997年的统计报告，发达国家的患病率为5.0‰，经济转轨国家患病率为6.1‰，发展中国家患病率为7.2‰，不发达国家患病率为11.2‰。截止1997年全球就有5000万癫痫患者。我国六城市(长沙、成都、上海、广州、银川、哈尔滨)患病率为4.6‰，在所有的癫痫患者中，约有30％～40％存在不同程度的认知功能损害以及学习记忆功能的减退。认知功能是人类和动物的大脑的高级神经活动，可简单的理解为四方面：接受功能，学习记忆功能，思维功能和表达功能。其中最主要的是学习记忆功能。记忆是人脑对经验过事物的识记、保持、再现或再认，它是进行思维、想象等高级心理活动的基础。人类记忆与大脑海马结构、大脑内部的化学成分变化有关。记忆与人类正常的生活和工作息息相关。随着现代神经学的研究发现，日常生活中的短期记忆都储存在海马体中，海马及其周边回路是人类记忆从短期到长期的关键区域，同时也影响了其他大脑区域的记忆储存。而颞叶癫痫能在一定程度上损害海马区细胞，进而导致记忆的损伤。反复癫痫发作可以导致海马结构发生病理变化，包括海马神经元的变性坏死、突触间隙异常增宽及突触后膜的密度改变、海马异常苔藓样发芽以及由此导致的突触联系异常。

随着对癫痫病研究的不断深入，临床发现绝大多数癫痫患者在忍受癫痫发作痛苦外，还要面对注意力无法集中，学习记忆能力减退等压力。这些都极大的降低了癫痫患者的生活质量，所以说癫痫病患者认知功能障碍的治疗恢复是改善提高患者生活品质的重中之重。

近年来，由于癫痫患者的数量迅速增加，病症呈现多元化、复杂化趋势。而临床常用药物虽然种类繁多，但大多存在用药剂量很难控制，长期使用会存在不良反应，疗效不明显，价格较高等问题。随着药物的大量服用，越来越多的患者对药物的耐受性不断提高，只能加大服药剂量或者换服新药，治疗成本随之上升，且副作用增大。

随着中药研究的日益深入，各种中药抗癫痫的机理不断被阐明，中药抗癫痫药效的开发成为热点。银杏叶作为传统中药，被广泛应用到心脑血管系统和神经系统等疾病的治疗中，其提取物在药物代谢和毒理作用方面的特点也已有较为明确的描述，因此在同类药物的筛选过程中具有优势。银杏叶中含有多种活性成分，包括银杏内酯、黄酮醇苷、原花青素、聚戊烯醇、双黄酮、有机酸等。因此，提供一种新的银杏叶提取物和新用途具有十分重要的价值。

考察药物的预防作用，一般先给药再制作动物模型；考察药物的治疗作用，一般先制作动物模型再给药。银杏叶提取物及其制剂在多篇硕士论文中提及具有一定的预防癫痫发作的作用，即预先给药，再制作癫痫动物模型，可以使癫痫模型鼠的癫痫发作次数和症状减轻，但对于先造模后给药的治疗作用却不明显。文献《不同剂量银杏叶提取物对红藻氨酸致痫大鼠神经肽Y蛋白表达的影响》(王芳,等.郑州大学学报：医学版.2014(2):207-210,)公开了先造模再给药，但其给药方式是腹腔注射，且给药剂量很大，为100～200mg/kg，并给药后24h内全部处死动物，这样很难判断银杏叶提取物对癫痫病的长期疗效。文献《银杏叶提取物对癫痫患者认知功能及脑脊液乙酰胆碱含量的影响》(段方荣,等.河北医学,2014(12期):2015-2017.)结果显示银杏叶片能明显改善癫痫患者的认知功能，这种作用于银杏叶片增强中枢胆碱能神经系统的功能促进Ach的释放相关；但研究结果显示，两组治疗后的疗效比较无显著差异，未提示银杏叶提取物能减少或减轻患者的癫痫发作。《银杏叶(达那康)添加治疗癫痫疗效观察》(彭建伟,等.中国实用医刊,2013,40(8):46-49.)公开了银杏叶片与其他抗癫痫药物联用能明显减少癫痫患者的发作频率，这种作用可能与银杏叶(达纳康)独特的清除自由基作用有关，提示自由基生成与清除平衡紊乱在癫痫发生中的价值。《银杏叶提取物辅助治疗癫痫临床观察》(解旭东,等.脑与神经疾病杂质,2000，8(3):172-173)公开了抗癫痫药物加用口服银杏叶提取物天保宁治疗癫痫总有效率58.65％，其抗癫痫作用主要来自银杏内酯B和槲皮素。在已有的报道中发现，银杏叶提取物抗癫痫的作用机制与抗氧化、抗细胞凋亡、保护神经细胞、调节N-甲基-D-天冬氨酸受体、γ-氨基丁酸受体、神经肽Y、c-Fos等蛋白的表达及调节Ca离子通道有关。因此，目前尚无文献报道单独应用银杏叶提取物能减少或减轻患者的癫痫发作，且银杏叶提取物抗癫痫作用主要来自银杏内酯B、槲皮素药效成分。

专利《一种银杏叶提取物及其制备方法和应用》(CN104147054A)公开了一种银杏叶提取物，其特征在于，总银杏萜内酯的含量为6％～12％(w/w)，总黄酮含量为40％～60％(w/w)，原花青素含量为30％～50％(w/w)，总银杏萜内酯％+总黄酮％+原花青素％>90％，且总黄酮醇苷含量24％～32％(w/w)，原花青素/总黄酮醇苷的含量比值为1～2。这种银杏叶提取物的抗氧化活性、神经保护活性、抗糖尿病及其并发症的活性比市面上常用的银杏叶提取物更好，其用于制备预防或治疗神经系统疾病的药物，可用于治疗糖尿病性白内障、糖尿病性视神经病变、糖尿性视网膜脂血症。

因此，目前已上市的银杏叶提取物其他抗癫痫药物联合用应用，具有一定的抗癫痫作用，但其单独应用效果不佳。

(三)发明内容：本发明结合中医理论，以及多年对银杏叶活性成分作用研究和实验研究，提供一种具有抗癫痫作用的银杏叶提取物，其可用于制备治疗癫痫病的药物中的用途。

本发明所述的癫痫病为癫痫持续性发作、癫痫后大脑内异常的痫性放电、癫痫引发的学习记忆障碍等。

本发明所述的用于治疗癫痫病的银杏叶提取物，其药效成分组成为：总银杏萜内酯的含量为10％～12％(w/w)，总黄酮含量为40％～44％(w/w)，原花青素含量为45％～50％(w/w)，且总银杏萜内酯％+总黄酮％+原花青素％>95％，总黄酮醇苷含量24％～26％(w/w)。

本发明为了具有更好的抗癫痫作用，进一步优选，银杏叶提取物的药效成分组成为总银杏萜内酯的含量为11％(w/w)，总黄酮含量为40％(w/w)，原花青素含量为48％(w/w)，总银杏萜内酯％+总黄酮％+原花青素％＝99％，且总黄酮醇苷含量25％(w/w)。

本发明提供的用于治疗癫痫病的银杏叶提取物，对癫痫大鼠癫痫发作次数、脑电图、海马组织形态、学习记忆认知功能和脑源性神经营养因子(BDNF)，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)，血管内皮生长因子(VEGF)等蛋白表达的实验结果显示，本发明所提供的银杏叶提取物可以减少癫痫发作次数、改善脑电图、海马组织形态和学习记忆认知能力，其作用机制为：提高BDNF，GDNF，VEGF三种蛋白的表达，有效地促进神经干细胞分化成相关神经元细胞。

本发明发现，当银杏叶提取物的药效成分组成如下：总银杏萜内酯的含量为10％～12％(w/w)，总黄酮含量为40％～44％(w/w)，原花青素含量为45％～50％(w/w)，且总银杏萜内酯％+总黄酮％+原花青素％>95％，总黄酮醇苷含量24％～26％(w/w)，且原花青素/总黄酮的含量比值为1.05～1.25，原花青素/总银杏萜内酯的含量比值为4.0～4.4时，对大鼠癫痫发作次数的影响试验结果显示，银杏叶提取物以40mg/kg浓度灌胃4周、8周后，与模型组相比，能减少大鼠痫性发作的次数，有显著性统计学意义(P＜0.01)；对癫痫大鼠脑电图的影响试验结果显示，银杏叶提取物以40mg/kg浓度灌胃4周、8周后，癫痫大鼠散在的棘波、尖波出现数量明显低于其他组；对癫痫大鼠海马组织形态的影响试验结果显示，采用银杏叶提取物干预后的癫痫大鼠胞浆内尼氏小体丰富，并未见到核固缩等神经元变性受损特征；对癫痫大鼠学习记忆障碍的影响试验结果显示，采用银杏叶提取物干预后的大鼠进入目标区区域的次数显著高于其他组。

CN104147054A公开了一种银杏叶提取物，其药效成分组成为总银杏萜内酯的含量为6％～12％(w/w)，总黄酮含量为40％～60％(w/w)，原花青素含量为30％～50％(w/w)，总银杏萜内酯％+总黄酮％+原花青素％>90％，且总黄酮醇苷含量24％～32％(w/w)，原花青素/总黄酮醇苷的含量比值为1～2；但本发明人发现，只有当原花青素含量大于总黄酮，且原花青素/总黄酮的含量比值为1.2，原花青素/总银杏萜内酯的含量比值为4.0～4.4时，才能达到显著的抗癫痫作用；而中国专利CN104147054A公开的这种银杏叶提取物中原花青素含量总体较总黄酮含量低，其抗癫痫效果并不好。

本发明银杏叶提取物的制备方法如下：1)银杏叶经粉碎后，用乙醇溶液50～80％(v/v)提取，共2～3次，每次1小时，每次乙醇溶液用量为银杏叶的5～10倍，获得提取液；

2)回收提取液至黑色黏稠状浸膏；

3)浸膏冷却至低于10℃，用水浸提浸膏，水的用量为浸膏的5～10倍，浸提时间为12～48小时；

4)浸提液过滤，滤液用大孔树脂吸附分离，用乙醇溶液30％-70％(v/v)进行洗脱，获得洗脱液；

5)洗脱液干燥后即得银杏叶提取物。

作为优选方案，

步骤1)中，银杏叶经粉碎后，用乙醇溶液60％(v/v)提取，共提取3次，每次1小时，每次乙醇溶液用量为银杏叶的8倍。

步骤2)中，回收提取液至黑色黏稠状浸膏，该黑色黏稠状浸膏在50℃时，相对密度为1.25～1.30。

步骤3)中，浸膏冷藏6h以上，至4℃后，用0～4℃水浸提24～48h，水的用量为浸膏的6倍。

步骤4)浸提液过滤，滤液用HPD417大孔树脂吸附，水洗后，用乙醇溶液50％(v/v)洗脱，获得洗脱液；

步骤5)洗脱液干燥后即得银杏叶提取物。

本发明取得以下有益效果：

1.本发明提供了一种银杏叶提取物，银杏萜内酯、总黄酮和原花青素三者的含量>95％，总银杏萜内酯的含量为10％～12％(w/w)，总黄酮含量为40％～44％(w/w)，原花青素含量为45％～50％(w/w)，且总黄酮醇苷含量24％～26％(w/w)。该提取物可测成分含量银杏萜内酯+总黄酮+原花青素大于95％，杂质成分少，产品质量稳定、可控；且严格控制了原花青素/总黄酮的含量比值1.05～1.25，原花青素/总银杏萜内酯的含量比值4.0～4.4。

2.本发明提供了一种银杏叶提取物，可用于癫痫病的治疗，包括癫痫持续性发作、癫痫后大脑内异常的痫性放电、癫痫引发的学习记忆障碍等，其作用机制为：提高BDNF，GDNF，VEGF三种蛋白的表达，有效地促进神经干细胞分化成相关神经元细胞。其中抗癫痫作用主要是由原花青素产生的，改善学习记忆障碍主要是由银杏萜内酯产生的，而黄酮类化合物的存在，可以起到协同增效的作用；并且当原花青素、银杏萜内酯和总黄酮的含量在本发明规定的限定范围内，可以起到显著的抗癫痫作用和改善学习记忆障碍作用。

3.本发明提供的银杏叶提取物为纯天然植物提取物，相对于一线治疗的化学制剂，安全性更高，副作用更小。

(四)附图说明

附图1为各组大鼠脑电图结果

附图2为各组大鼠部分脑组织尼氏染色结果

附图3为大鼠海马BDNF，GDNF，VEGF蛋白表达免疫组化结果

(五)具体实施方式：

实施例1活性实验用药

药物1银杏叶提取物1号(市面上可购买到的普通银杏叶提取物)：总银杏萜内酯的含量为7％(w/w)，总黄酮含量为40％(w/w)，原花青素含量为5％(w/w)，总银杏萜内酯+总黄酮+原花青素＝52％，且总黄酮醇苷含量24％(w/w)，原花青素/总黄酮的含量比值为0.125。

药物2总银杏萜内酯提取物：总银杏萜内酯的含量95％(w/w)。

药物3银杏总黄酮提取物：总黄酮含量为95％(w/w)，且总黄酮醇苷含量50％(w/w)。

药物4银杏原花青素提取物：原花青素含量为95％(w/w)。

药物5银杏叶提取物2号：总银杏萜内酯的含量为10％(w/w)，总黄酮含量为48％(w/w)，原花青素含量为38％(w/w)，总银杏萜内酯+总黄酮+原花青素＝96％，且总黄酮醇苷含量28％(w/w)，原花青素/总黄酮的含量比值为0.79。

药物6银杏叶提取物3号：总银杏萜内酯的含量为8％(w/w)，总黄酮含量为44％(w/w)，原花青素含量为43％(w/w)，总银杏萜内酯+总黄酮+原花青素＝95％，且总黄酮醇苷含量24％(w/w)，原花青素/总黄酮的含量比值为0.98。

药物7银杏叶提取物4号(本发明的提取物)：总银杏萜内酯的含量为11％(w/w)，总黄酮含量为40％(w/w)，原花青素含量为48％(w/w)，总银杏萜内酯+总黄酮+原花青素＝99％，且总黄酮醇苷含量25％(w/w)，原花青素/总黄酮的含量比值为1.2，原花青素/总银杏萜内酯的含量比值4.36。

药物8银杏叶提取物5号(本发明的提取物)：总银杏萜内酯的含量为12％(w/w)，总黄酮含量为40％(w/w)，原花青素含量为48％(w/w)，总银杏萜内酯+总黄酮+原花青素＝100％，且总黄酮醇苷含量24.5％(w/w)，原花青素/总黄酮的含量比值为1.2，原花青素/总银杏萜内酯的含量比值4.0。

药物9银杏叶提取物6号(本发明的提取物)：总银杏萜内酯的含量为10.5％(w/w)，总黄酮含量为43.5％(w/w)，原花青素含量为45.5％(w/w)，总银杏萜内酯+总黄酮+原花青素＝99.5％，且总黄酮醇苷含量25.5％(w/w)，原花青素/总黄酮的含量比值为1.05，原花青素/总银杏萜内酯的含量比值4.3。

药物10银杏叶提取物7号(本发明的提取物)：总银杏萜内酯的含量为11.5％(w/w)，总黄酮含量为42％(w/w)，原花青素含量为45.5％(w/w)，总银杏萜内酯+总黄酮+原花青素＝99％，且总黄酮醇苷含量25％(w/w)，原花青素/总黄酮的含量比值为1.08，原花青素/总银杏萜内酯的含量比值4.0。

药物11银杏叶提取物8号(本发明的提取物)：总银杏萜内酯的含量为11％(w/w)，总黄酮含量为41％(w/w)，原花青素含量为47.5％(w/w)，总银杏萜内酯％+总黄酮％+原花青素％＝99.5％，且总黄酮醇苷含量25.5％(w/w)，原花青素/总黄酮的含量比值为1.16，原花青素/总银杏萜内酯的含量比值4.3。

对以下实施例药效学实验证实，药物7～11抗癫痫的效果差不多，以药物7相对最佳，以下实施例2～6以药物7作为代表药物来描述本发明效果。

实施例2癫痫大鼠模型的制作

健康SD大鼠，饲养一星期以适应环境。分批腹腔注射氯化锂3mmol/kg，18-24h后注射匹罗卡品20mg/kg，且在注射匹罗卡品前30min，首先给予硫酸阿托品1mg/kg对抗匹罗卡品的外周胆碱能作用。匹罗卡品首次注射30min后，对未引发癫痫的大鼠，补注射匹罗卡品10mg/kg，每隔30min补注射一次，直至引发癫痫。注射达极量40mg/kg后，仅出现Ⅲ级以下一过性发作视为未点燃，对于建模未成功的大鼠予以淘汰。抽搐行为评价采用经Becker等修改后的Racine分级标准，即：0级，无任何反应：I级，湿狗样抖动、面部抽搐及咀嚼；II级，点头或甩头；Ⅲ级，前肢阵挛；IV级，前肢阵挛伴伸直；V级，前肢及全身阵挛，失去平衡，跌倒。大鼠癫痫持续1h后腹腔注射地西泮(安定)l0mg/kg止癫，若效果不佳30min后补注射一次。注射地西泮后，要格外小心，防止大鼠呼吸受到抑制而死亡。存活大鼠急性期过后进入静默期，开始的2-4d为毒性阶段，表现为蜷伏不动，不思饮食，易怒。此时，每天腹腔注射0.5ml糖盐水(50g/L)，以维持其正常的生理状态。此后行为渐趋正常。经过7d到20d的静默期后，开始产生自发性癫痫，进入慢性期。存活大鼠进入慢性期后，观察一段时间待大鼠的慢性发作形成常态后，按照大鼠的发作情况均分成10组，每组8只，分别为正常组，模型组，药物1～7组，阳性药组。

灌胃给药：药物1～7以40mg/kg浓度灌胃；阳性药卡马西平以108mg/kg浓度灌胃；正常组和模型组灌胃生理盐水。各组大鼠持续给药4周。

实施例3药物对大鼠癫痫发作次数的影响

用监控记录各组大鼠癫痫发作的次数，表1数据显示，7种银杏叶提取物用药前，各癫痫组大鼠痫性发作无统计学意义(P＞0.05)，说明大鼠用药前处于同一水平，具有可比性。7种银杏叶提取物分别用药4周、8周后，药物1和3对大鼠痫性发作无抑制作用(P＞0.05)；药物2、4、5、6能减少大鼠癫痫发作次数，但与模型组比较，无统计学意义(P＞0.05)；药物7用药4周、8周后，与模型组相比，均能减少大鼠痫性发作的次数，有显著性统计学意义(P＜0.01)。因此，本发明提供的银杏叶提取物(药物7)可降低癫痫大鼠痫性发作的次数。

表1不同银杏叶提取物对癫痫大鼠痫性发作次数的影响(n＝8)

实施例4药物对癫痫大鼠脑电图的影响

给药结束后，以10％的水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，麻醉起效后，将大鼠固定于脑立体定位仪上，暴露颅骨，根据Paxinos&Waston脑图谱，于大鼠海马区(前囟后3.8mm，旁开2.0mm，硬膜下2.6mm)、安装不锈钢电极，接地电极固定在后侧颅骨，并以牙托粉及牙科水泥固定。采用电极为不锈钢双极电极，直径为0.2mm，Teflon绝缘，为双股螺旋状，末端刮掉绝缘层0.5mm，双极间距0.5-0.8mm。电极焊接到一个小型插头，然后用牙科水泥固定插头。术后等大鼠完全清醒后进入实验过程。海马区脑电图(EEG)用PowerLab脑电记录和分析系统(ADinstruments，Australia)测定。记录时间为1h。各组大鼠脑电图见图1。正常组大鼠脑电图以α波或β波、散在少量θ波的基础波为主，无明显节律性，点燃成功后难治性模型大鼠脑电图表现为大量高幅尖波、棘波、棘一慢复合波，出现大量痫性放电；各给药组均可见到散在的棘波、尖波出现，而以药物7组出现的最少。

实施例5药物对癫痫大鼠海马组织形态的影响

脑电图测定完毕后，取大鼠的海马组织，置于4％的多聚甲醛溶液，4℃冰箱中过夜，固定好的组织置于OCT包埋剂中，放于恒温冰冻切片机中-20℃骤冷。完全变硬后，立即用切片机切片，连续切三张取一张，厚度25μm并用载玻片裱片。立即进行尼氏染色。结果如图2所示，正常组海马组织切片染色后，海马区可见大量致密的尼氏体细胞，并且排列紧密有序，染色均匀，细胞形态正常；而模型组海马组织切片染色后，神经元数目与正常组减少明显，排列稀疏，细胞形态不正常，部分神经元细胞体积皱缩，核固缩，胞浆深染，受损严重，胞浆内尼氏小体减少；银杏提取物干预后，神经元细胞形态接近正常，尤其是药物7干预后的癫痫大鼠胞浆内尼氏小体丰富，并未见到核固缩等神经元变性受损特征。说明本发明提供的银杏提取物(药物7)可以有效地保护海马神经元的损伤。

实施例6药物对癫痫大鼠学习记忆障碍的影响

灌胃20天后进行水迷宫实验。获得性训练实验，将水池分为四个象限，平台放置于其中一个象限中央，且平台要低于水面。实验开始将大鼠头朝池壁放入池中，记录动物找到水下平台的时间。前几次训练中，如果时间超过60s，则引导动物到平台，让其停留10s。每只动物每天训练4次，训练5天。获得性训练实验，将水池分为四个象限，平台放置于其中一个象限中央，且平台要低于水面。实验开始将大鼠头朝池壁放入池中，记录动物找到水下平台的时间。前几次训练中，如果时间超过60s，则引导动物到平台，让其停留10s。每只动物每天训练4次，训练5天。记录水迷宫数据，上平台时间，大鼠游的总距离，进入目标象限的次数，进入目标象限的潜伏期，在目标象限里的时间，在每个象限的时间百分比等。由表2可以看到，各给药组和正常组进入目标区区域的次数比模型组多，其中药物2、4、5、6与模型组相比，有显著性差异(P<0.05)；药物7效果最好，与模型组相比，有非常显著的差异(P<0.01)。

表2不同银杏叶提取物对癫痫大鼠在平台象限停留时间和穿越次数的比较(n＝8)

实施例7药物7抗癫痫和改善学习记忆障碍的机制(一)

血清诱导分化组：培养的神经干细胞离心后弃上清，加入含10％胎牛血清诱导分化液，移入放有经多聚赖氨酸包被的载玻片的培养皿中，37℃、5％CO₂培养箱内培养。

药物诱导分化组：培养的神经干细胞离心后弃上清，加入含不同浓度的药物的完全培养液，移入放有经多聚赖氨酸包被的载玻片的培养皿中，37℃、5％CO₂培养箱内培养。

自然分化组：培养的神经干细胞离心后弃上清，加入完全培养液，移入到放有多聚赖氨酸处理过的载玻片的培养皿中，37℃、5％CO₂培养箱内培养。实验中总共分成了5组，分组如下：

(1)血清诱导分化组:加入含10％胎牛血清诱导分化液(10％胎牛血清+DMEM/F12+EGF20μg/1)

(2)自然分化组:加入正常无血清NSC培养基(DMEM/F12、2％B27、EGF20μg/l)

(3)药物诱导分化高剂量组:加入药物7终浓度为25mg/ml银杏提取物的NSC培养基

(4)药物诱导分化中剂量组:加入药物7终浓度为12.5mg/ml银杏提取物的NSC培养基

(5)药物诱导分化低剂量组:加入药物7终浓度为6.25mg/ml银杏提取物的NSC培养基

接种培养4d后用相差显微镜观察细胞的生长状况。

通过显微镜对细胞观察，结果如下：原代神经干细胞在培养9d后，可以看到大多数细胞以2～6个细胞聚集起来细胞团，并且随培养时间的增加细胞团逐渐变多，细胞团数目明显变多，体积也较前两天增大，呈规则圆形，分散悬浮生长，胞体呈多极、双极或圆形。自然分化组细胞在处理后，几乎没有分化，细胞形态与原代神经干细胞基本一致。血清诱导分化组细胞在处理后，有部分分化的细胞，分化率约为20％～30％。3个药物诱导分化组细胞分化程度较高，神经球周边伸出大量触角，且各个神经球之间相互联结；细胞分化程度与药物剂量成正比，高剂量细胞分化率高达80～90％，中剂量60～70％，低剂量30～40％。结果表明，本发明提供的银杏叶提取物(药物7)能改善癫痫大鼠的学习记忆，其机制之一是能够诱导大脑中神经干细胞分化为神经元。

实施例8药物7抗癫痫和改善学习记忆障碍的机制(二)

取癫痫大鼠脑组织，并置于4％的多聚甲醛溶液，4℃冰箱中过夜。将石蜡切片常规脱蜡、水化，于3％H₂O₂中室温孵育10min。蒸馏水冲洗后PBS洗两次，每次5min；滴加正常兔血清液室温封闭15min，倾去。分别滴加浓度为1:200的兔抗鼠BDNF，GDNF，VEGF多克隆抗体50μL，4℃孵育过夜。PBS洗涤3次后滴加生物素化二抗15min。PBS洗涤3次后滴加SABC液，室温孵育15min。PBS洗涤4次，滴加DAB显色液，室温显色2-5min，进行脱水、透明、封片处理。光学显微镜下观察，BDNF，GDNF，VEGF阳性染色显示胞浆内有棕黄色着色颗粒。采用图象分析软件Image-ProPlus6.0对每张图片进行分析扫描，以扫描结果中的累积光密度值为测定指标。

由图3和表3结果得，本发明提供的银杏叶提取物(药物7)可以使癫痫大鼠海马组织中的BDNF、VEGF和GDNF蛋白免疫阳性细胞数增加，与模型组比较有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。结果表明，本发明提供的银杏叶提取物(药物7)能改善癫痫大鼠的学习记忆，其另一机制是能够提高海马组织中BDNF、VEGF和GDNF蛋白的表达。

表3大鼠大脑海马组织BDNF、VEGF和GDNF阳性细胞表达情况(个/高倍视野)(x±s,n＝8)

与模型组相比较：*P<0.05,**P<0.01

Claims (4)

1.一种治疗癫痫病的银杏叶提取物，其药效成分重量百分比为总银杏萜内酯的含量为10%~12%，总黄酮含量为40%～44%，原花青素含量为45%~50%，总银杏萜内酯%+总黄酮%+原花青素%>95%，总黄酮醇苷含量24%～26%，且原花青素/总黄酮的含量重量比值为1.05~1.25，原花青素/总银杏萜内酯的含量重量比值为4.0~4.4。

2.根据权利要求1所述的治疗癫痫病的银杏叶提取物，其特征在于，所述银杏叶提取物药效成分的重量百分比为：总银杏萜内酯的含量为11%，总黄酮含量为40%，原花青素含量为48%，总银杏萜内酯%+总黄酮%+原花青素%=99%，总黄酮醇苷含量25%，且原花青素/总黄酮的含量重量比值为1.2，原花青素/总银杏萜内酯的含量重量比值为4.36。

3.根据权利要求1或2所述的治疗癫痫病的银杏叶提取物，其用于制备治疗癫痫病的药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的治疗癫痫病的银杏叶提取物，其用于制备治疗癫痫持续性发作、癫痫后大鼠大脑内异常的痫性放电、癫痫引发的学习记忆障碍的药物。