CN111407849B - 一种治疗慢性硬膜下血肿的中药配方及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗慢性硬膜下血肿的中药配方及其制备方法，所述配方按照重量份数包括黄芪15～30g；川芎15～30g；生地9～18g；西洋参9～18g；珠子参9～18g；黄精9～18g；桂枝9～18g；扭子七3～6g；红毛七3～6g；桃儿七3～6g；地龙3～6g；鹿角胶3～6g；甘草3～6g。本发明的中药配方能促进慢性硬膜下血肿术后患者神经功能恢复，显著降低慢性硬膜下血肿的复发，改善预后，减轻家庭和社会的医疗负担,具有较大的经济效益及社会效益。

Description

一种治疗慢性硬膜下血肿的中药配方及其制备方法

技术领域

本发明涉及中药领域，尤其涉及一种治疗慢性硬膜下血肿的中药配方及其制备方法。

背景技术

慢性硬膜下血肿(Chronic Subdural Hematom，CSDH)是指由于外伤或者机体自身因素导致颅内持续出血，血液集聚在硬脑膜下腔，受伤3周以上出现症状，是神经外科常见的多发疾病之一。研究发现 CSDH在老年人群中高发，其发病率约占颅内血肿的10％，硬膜下血肿的25％，主要临床表现为慢性颅内压增高，少数患者可有偏瘫、失语和癫痫发作等神经功能症状。目前，随着人口老龄化进程发展及人均寿命提高，此病逐渐成为影响广大人群的主要危害之一。

慢性硬膜下血肿(CSDH)在祖国医学中无具体病名，但根据其病因、病机及临床表现可归属于为中医的“中风(出血性)”、“大厥”、“眩晕”、“血症”等范涛的一类疾病，病位在脑。《素问.调经论》曰：“孙络外溢，则有留血”；《灵枢·贼风》云:“若有所坠堕，恶血留内而不去”；巢元方在《诸病源侯论》卷之一第十三篇偏枯候中言：“风偏枯者，由血气偏虚，則腠理开，受於风湿，风湿客於半身，在分腠之間间，使血气凝，不能润养，久不瘥，真气去，邪气独留，則成偏枯”，明确提出中风病由气血偏虚，外感风湿而；李东垣在《医学发明》中言：“中风者，非外来风邪，乃本气自病也”，同时提到“凡人年逾四旬，气衰者，多有此疾”；朱丹溪在《丹溪心法》指出“中风大率主血虚有痰，治痰为先，次养血行血。或属虚，挟火(一作痰)与温，又须分气虚血虚。半身不遂，大率多痰，在左属死血瘀(一作血少)血，在右属痰有热，并气虚”；张景岳《医学全书、景岳全书》提出“人年四十而阴气自半，正以阴虚为言也。夫人生于阳而根于阴，根本衰则人必病，根本败则人必危矣。所谓根本者，即真阴也”；明代李中梓在《医宗必读》提出“火中、虚中、湿中、寒中、暑中、气中、食中、恶中”，脑血管病也出现在八屮中的火中、虚中；晚晴名家张士骧在《雪雅堂医案》指出“血冲脑气筋”学说；张锡纯《医学衷中参西录》提出“脑贫血”理论，临床治疗上提出采用建瓴汤或镇肝熄风汤来治疗这种先兆病，且指出停药的指证为：脉象平和，毫无弦硬之意。综上上述古今医家研究表明，脑为诸阳之会，清灵之窍，多因跌扑损伤，头部暴力或外力冲击，导致气滞血瘀，淤阻脑窍，致脑部气血运行不畅，日久络破血溢，气血凝滞，形成淤血，淤血阻窍，故头痛；瘀阻经络以致偏瘫；血瘀日久而耗气致气虚，气虚而进一步致血行不畅又加重血瘀，二者互为因果，相互纠结，最终可导致脑内血肿包囊；病位在脑，病性属本虚标实症。中医认为，“肾”与脑相关的理论源于《内经》的“肾主骨生髓”(《素问·阴阳应象大论》)，“脑为髓之海”(《灵枢·海论》)，以及“人始生，先成精，精成而脑髓生”(《灵枢·经脉》)等记载。中医学认为“脑为元神之府”，“五脏六腑之精气皆上注于脑”。肾中精气足则髓盈，上注于脑，可统帅调节全身精神活动。国医大师任继学教授认为髓由肾精所化，脊髓上行于脑，泌其津液润养脑髓。因此，肾精的充足与脑髓之健旺密切相关。我们认为髓海空虚为慢性硬膜下血肿发病之本，瘀血阻络为该病之标，治当培元固本，化瘀通络。因此我们提出了“培元固本以填髓，化瘀通络以醒神”这一治疗理念。

目前针对慢性硬膜下血肿的治疗有以下几种：

1、手术治疗：在临床中，CSDH临床表现及影像学检查发现符合手术指征，或病情危重的患者，经过保守治疗未能见效，还有诱发脑疝可能的患者，应及时采取手术治疗。包括①钻孔引流术：钻孔引流术主要适用于血肿范围小、液化较完全、范围相对局限，且血肿密度较均匀、无新鲜出血或不能耐受开颅手术患者，其存在的并发症有：脑组织损伤、颅内感染、颅内并发出血、血肿引流不畅、术后脑脊液漏、张力性气颅、癫痫和术后意识障碍、术后易复发等；②内窥镜辅助钻孔引流术：该手术操作时间长，费用较昂贵，需要全麻，术后清醒慢，可增加术后颅内感染机会，且高龄伴随心、肺功能严重异常者对其耐受较差；③骨瓣成形术：缺点为手术创伤大，老年人多不能耐受。

2、中药结合西医常规治疗：主要针对CSDH的临床症状表现不显著，同时经CT或MRI检查，诊断为较轻型，未达到手术指征，且患者强烈要求采用非手术治疗的CSDH,此类患者多采用中药联合西药的保守治疗方案。通过对照组和治疗组的疗效对比，差别有统计学意义(P＜0.01)证实了桂枝茯苓丸联合西药治疗慢性外伤性硬膜下血肿具有显著疗效，优于单纯西医治疗，但需中西医结合才能达到较好的疗效。

3、外科手术结合中药治疗：CSDH术后由于高龄、饮酒、双侧血肿、服用抗凝药、术后血肿腔积气和微创穿刺术未能完全清除血肿腔的物质，血肿腔的抗凝物质依然依附在新生的毛细血管处，新生的毛细血管血液不断渗出，再次形成血肿亦是硬膜下血肿复发的重要因素，中药对此具有显著的疗效。因此通过外科手术结合中药治疗结论是：运用活血醒脑汤治疗，能有效提高血肿清除率，减少血肿残余量，促进神经功能恢复，提高患者日常生活活动能力，减少并发症发生率，在临床中具有运用价值。但这也只是外科手术和中药相结合的技术。

以上治疗方式为目前慢性硬膜下血肿的三大主要研究方向，而且也在临床上有所使用，目前针对慢性硬膜下血肿的治疗大多以手术为主，虽然手术疗效尚可，然而本病多发于老年人且易出现术后复发，老年患者对反复手术的耐受和接受度有限，为了解决这一问题，在欧美及国内学者做出大量研究，提出氨甲环酸、他汀类药物和血管紧张素转化酶抑制剂等相关药物应用于术后可能会降低血肿复发，但至今仍没有关于其使用的高质量证据。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种治疗慢性硬膜下血肿的中药配方及其制备方法，以克服现有技术副作用大、治疗费用高、治疗后复发率高的缺陷。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种治疗慢性硬膜下血肿的中药配方，所述配方按照重量份数包括黄芪15～30g；川芎15～30g；生地9～18g；西洋参9～18g；珠子参9～18g；黄精9～18g；桂枝9～18g；扭子七3～6g；红毛七3～ 6g；桃儿七3～6g；地龙3～6g；鹿角胶3～6g；甘草3～6g。

作为优选，所述配方按照重量份数包括黄芪15g；川芎15g；生地9g；西洋参9g；珠子参9g；黄精9g；桂枝9g；扭子七3g；红毛七3g；桃儿七3g；地龙3g；鹿角胶3g；甘草3g。

作为优选，所述配方按照重量份数包括黄芪20g；川芎20g；生地12g；西洋参12g；珠子参12g；黄精12g；桂枝12g；扭子七4g；红毛七4g；桃儿七4g；地龙4g；鹿角胶4g；甘草4g。

作为优选，所述配方按照重量份数包括黄芪30g；川芎30g；生地18g；西洋参18g；珠子参18g；黄精18g；桂枝18g；扭子七6g；红毛七6g；桃儿七6g；地龙6g；鹿角胶6g；甘草6g。

各原料药的药理如下：

黄芪：甘，微温。归肺、脾、肝、肾经。益气固表、敛汗固脱、托疮生肌、利水消肿。

川芎：辛，温。归肝、胆经。行气开郁，祛除风燥湿，活血止痛。

生地：甘，寒。归心，肝，肾经。清热凉血，养阴，生津

西洋参：性凉，味甘、微苦。归心、肺、肾经。补气养阴，清热生津。

珠子参：苦、甘，微寒。归肝、肺、胃经。补肺，养阴，活络，止血。

黄精：甘、平。归脾、肺、肾经。补气养阴，健脾，润肺，益肾。

桂枝：辛，甘，温。归心，肺，膀胱。发汗解肌，温通经脉，助阳化气。

扭子七：苦、涩。散血，止血，行气。

红毛七：辛，苦，性温。归肝，胃经。活血散瘀；祛风除湿；行气止痛。

桃儿七：苦，温。清热解毒，化痰散结，祛瘀消肿。

地龙：咸，寒。归肝、脾、膀胱经。清热定惊，通络，平喘，利尿。

鹿角胶：甘、咸，温。归肾、肝经。温补肝肾，益精养血。

甘草：甘，平。归心、肺、脾、胃经。补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药。

一种治疗慢性硬膜下血肿的中药配方的制备方法，包括以下步骤，

步骤一：称取配方量西洋参及珠子参，浸泡6小时后煎煮2次，首次为1小时，第二次为2小时，两次药液滤过浓缩后文火熬制成膏，得制备物Ⅰ；

步骤二：称取配方量扭子七、红毛七及桃儿七，粉碎，加6-10 倍量15％-60％的乙醇回流提取2次，每次1小时，过滤并合并滤液， 60±5℃减压浓缩，得制备物Ⅱ；

步骤三：称取配方量地龙打粉，得制备物Ⅲ；

步骤四：称取配方量黄芪、川芎、生地、黄精、桂枝及甘草放入砂锅中，加入冷水至没过药材3-5cm，浸泡30分钟，武火烧至沸腾后继续文火慢煎30分钟，过滤得1次滤液；

步骤五：再向砂锅中加入0.9-1L温水，继续武火烧至沸腾，文火煎煮30分钟，过滤得2次滤液；

步骤六：将1次滤液和2次滤液合并，并将制备物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ加入滤液中，加热浓缩至400ml；

步骤七：称取配方量鹿角胶，加入到步骤六制备的400ml烊化即可。

临床报告

临床观察1

1.1临床资料

选取陕西中医药大学附属医院2013年1月至2019年4月住院的 CSDH术后患者165例，其中男性140例，女性25例；术后常规治疗(止血、营养神经、抗感染)配合口服该中药67例，未口服中药 98例。

1.2治疗方法

常规治疗：止血、营养神经、抗感染、对症、支持治疗。

配合口服中药：常规治疗基础上，上述中药水煎口服，一方为一剂，一日一剂，一日两次，早、晚饭后半小时各服用200ml，30天为 1疗程，治疗周期为5个疗程。

1.3疗效判定标准

术后复发：术后随访3个月内原血肿部位再发血肿，并伴有神经系统症状或体征。

术后未复发：术后随访3个月内原血肿部位未再发血肿，无神经症状。

结果显示：常规治疗98例患者中，有14例患者血肿原位复发，配合中药口服的67例患者仅有6例原位复发。所有患者均无明显毒副作用发生。

临床观察2

2.1临床资料

随机选取陕西中医药大学附属医院2013年1月至2019年4月住院的CSDH术后患者67例，术后常规治疗(止血、营养神经、抗感染)基础上配合口服该中药。

2.2治疗方法

常规治疗配合口服中药：常规治疗基础上，上述中药水煎口服，一方为一剂，一日一剂，一日两次，早、晚饭后半小时各服用200ml， 30天为1疗程，治疗周期为5个疗程。

2.3疗效判定标准

显效：症状体征明显缓解，CT复查血肿面积减少。

有效：症状体征缓解，CT复查血肿无明显变化。

无效：症状体征无缓解，头颅CT复查血肿有增加。

结果显示：显效43例，有效18例，无效6例。所有患者均无明显毒副作用发生。

本发明的有益效果是：

发明人对相关文献进行梳理，挖掘中医治疗经验，结合临床工作实践，提出了“培元固本以填髓，化瘀通络以醒神”的观点，认为髓海空虚为慢性硬膜下血肿发病之本，瘀血阻络为该病之标，治当培元固本，化瘀通络。根据这一治则，形成了治疗该疾病的中药组方，临床证实，本方能促进硬膜下血肿吸收和神经功能改善、有效降低硬膜下血肿复发。

本发明的中药配方应用以来，明显的减少了CSDH患者术后的复发，减少了患者因多次手术带来的痛苦和经济负担。随着人口老龄化的加剧，慢性硬膜下血肿的发生率逐年攀升，手术治疗后复发率较高，培元化瘀方的临床应用将有效降低慢性硬膜下血肿的复发，减少手术次数，降低治疗成本，减轻患者痛苦，减轻家庭和社会的医疗负担，具有较大的经济效益及社会效益。

附图说明

图1为各组小鼠给药后体重变化图；

图2为各组急性实验小鼠血细胞统计结果图；

图3为各组急性毒性实验小鼠血生化学统计结果图；

图4中a和b分别为急性病毒实验对照组和实验组的肝细胞的在显微镜下放大400倍的扫描电镜对比图；

图5中a和b分别为急性病毒实验对照组和实验组的心肌细胞的在显微镜下放大400倍的扫描电镜对比图；

图6中a和b分别为急性病毒实验对照组和实验组的脾脏细胞的在显微镜下放大400倍的扫描电镜对比图；

图7中a和b分别为急性病毒实验对照组和实验组的肺脏细胞的在显微镜下放大400倍的扫描电镜对比图；

图8中a和b分别为急性病毒实验对照组和实验组的肾脏细胞的在显微镜下放大400倍的扫描电镜对比图；

图9为慢性毒性实验大鼠体重统计结果图；

图10为组方慢性毒性实验大鼠体重统计结果；

图11为组方慢性毒性实验大鼠血细胞学统计结果(给药期)

图12为组方慢性毒性实验大鼠血细胞学统计结果(恢复期)；

图13为组方慢性毒性实验大鼠血生化学统计结果(给药期)；

图14为组方慢性毒性实验大鼠血生化学统计结果(恢复期)；

图15为慢性毒性实验急性病毒实验对照组、给药期、恢复期的肝细胞的在显微镜下放大400倍的扫描电镜对比图；

图16为慢性毒性实验急性病毒实验对照组、给药期、恢复期的心肌细胞的在显微镜下放大400倍的扫描电镜对比图；

图17为慢性毒性实验急性病毒实验对照组、给药期、恢复期的脾脏细胞的在显微镜下放大400倍的扫描电镜对比图；

图18为慢性毒性实验急性病毒实验对照组、给药期、恢复期的肺脏细胞的在显微镜下放大400倍的扫描电镜对比图；

图19为慢性毒性实验急性病毒实验对照组、给药期、恢复期的肾脏细胞的在显微镜下放大400倍的扫描电镜对比图；

图20中a为HMEC-1细胞200倍镜下的电镜扫描图；

b为HMEC-1细胞400倍镜下的电镜扫描图；

图21中a为5％含药血清组3h的电镜扫描图；

b为15％含药血清3h的电镜扫描图；

图22中a为空白组3h对血管成管情况的电镜图；

b为组方配方中含药血清3h对血管成管情况的电镜图；

图23为本发明中药配方的应用证明。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

在本申请中，根据患者年龄、身体状况等因素，对该组方研制出最小用量、常用量和最大剂量，并以三种实施例为例

实施例1

一种治疗慢性硬膜下血肿的中药配方，所述配方按照重量份数包括黄芪15g；川芎15g；生地9g；西洋参9g；珠子参9g；黄精9g；桂枝9g；扭子七3g；红毛七3g；桃儿七3g；地龙3g；鹿角胶3g；甘草3g。

实施例2

一种治疗慢性硬膜下血肿的中药配方，所述配方按照重量份数包括黄芪20g；川芎20g；生地12g；西洋参12g；珠子参12g；黄精12g；桂枝12g；扭子七4g；红毛七4g；桃儿七4g；地龙4g；鹿角胶4g；甘草4g。

实施例3

一种治疗慢性硬膜下血肿的中药配方，所述配方按照重量份数包括黄芪30g；川芎30g；生地18g；西洋参18g；珠子参18g；黄精18g；桂枝18g；扭子七6g；红毛七6g；桃儿七6g；地龙6g；鹿角胶6g；甘草6g。

实施例1-3均采用如下制备方法制备

步骤一：称取配方量西洋参及珠子参，浸泡6小时后煎煮2次，首次为1小时，第二次为2小时，两次药液滤过浓缩后文火熬制成膏，得制备物Ⅰ；

步骤二：称取配方量扭子七、红毛七及桃儿七，粉碎，加6-10 倍量15％-60％的乙醇回流提取2次，每次1小时，过滤并合并滤液， 60±5℃减压浓缩，得制备物Ⅱ；

步骤三：称取配方量地龙打粉，得制备物Ⅲ；

步骤四：称取配方量黄芪、川芎、生地、黄精、桂枝及甘草放入砂锅中，加入冷水至没过药材3-5cm，浸泡30分钟，武火烧至沸腾后继续文火慢煎30分钟，过滤得1次滤液；

步骤五：再向砂锅中加入0.9-1L温水，继续武火烧至沸腾，文火煎煮30分钟，过滤得2次滤液；

步骤六：将1次滤液和2次滤液合并，并将制备物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ加入滤液中，加热浓缩至400ml；

步骤七：称取配方量鹿角胶，加入到步骤六制备的400ml烊化即可。

对于制备方法的说明：

通过本制备方法，能够充分利用药物，最大程度获取药物有效成分。

步骤一：西洋参等药物较为珍贵，其有效成分需要久煎才可提取，和其他药物一起煎，不能将有效成分很好的发挥，一方面降低了药效，另一方面浪费了药材；提膏是参类药材的有效制法，方法简单，制膏后能最大限度的发挥药物的效果。

步骤二：扭子七、红毛七及桃儿七为植物茎叶，不可久煎，和其它药物一起煎会造成有效成分的过度挥发，特别是现在许多中药熬制是机器一次性完成，无法实现后下，更加重了有效成的丢失。醇提避免有效成分挥发，且可以直接入其它药物的煎剂，使用方便，且可以有效的发挥药物作用。故乙醇提取；

步骤三、四：根据地龙、鹿角胶的使用方法，最大程度发挥其有效成分。

本发明药物的用法与用量：水煎口服，一方为一剂，一日一剂，一日两次，早、晚饭后半小时各服用200ml，30天为1疗程。

针对实施例1的4个典型案例

王某某，男，70岁，住院号：2213657，3月前不慎摔倒，12周前开始出现头痛、头晕，查颅脑CT示：左侧额颞顶部慢性硬膜下血肿，出血量约95ml，行钻孔引流术，术后血肿少量残留，服用本发明中药方剂5个疗程复查CT血肿完全吸收，随访两年无复发。

王某，女，70岁，住院号：2213657，无明显诱因出现头晕、双下肢无力，查颅脑CT示：双侧额顶部少量慢性硬膜下血肿，左侧出血量约15ml，右侧出血量约10ml，无明显手术指征，服用本发明中药方剂5个疗程复查CT左侧少量血肿，右侧血肿完全吸收，随访两年无复发。

李某，男，67岁，门诊号：6713423，外伤后间断头晕，自觉肢体无力3月余，查颅脑CT示：右侧额顶部慢性硬膜下血肿，出血量约35ml，患者既往有糖尿病病史，血糖控制欠佳，暂不考虑手术，给予阿托伐他汀钙10mg每晚一次，配合服用本发明中药方剂6个疗程，复查CT血肿较前吸收，后续用本方案，随访两年未行手术治疗。

韩某某，男，86岁，住院号：2351288，患者无明显诱因突发头晕，双下肢无力，查颅脑CT示：左侧额颞顶部慢性硬膜下血肿，出血量55ml，考虑患者年龄较大，家属拒绝手术，给无服用本发明中药方剂5个疗程后，头晕、肢体无力症状较前缓解，复查颅脑CT血肿较前稍有吸收，继续服用本方半年，复查CT血肿未明显增加，随访两年患者基本稳定。

针对实施例2的3个典型案例

王某某，男，51岁，住院号：2194550，4月前外伤致颅脑损伤， 1周前开始出现头痛、右下肢无力，查颅脑CT示：左侧额颞顶部慢性硬膜下血肿，出血量约98ml，行钻孔引流术，术后血肿少量残留，服用本发明中药方剂6个疗程复查CT血肿完全吸收，随访两年无复发。

段某，女，60岁，住院号：2256687，自诉无明显诱因近月头痛、头晕、右侧肢体活动不利，并进行性加重，查颅脑CT示:左侧额颞顶部慢性硬膜下血肿,出血量约110ml，行钻孔引流术，术后血肿少量残留，服用本发明中药方剂8个疗程，复查CT血肿完全吸收，随访两年无复发。

徐某某，男，55岁，门诊号：7811242,慢性硬膜下血肿术后，复查颅脑CT示：右侧额颞部慢性硬膜下血肿术后，血肿少量残留，服用本发明中药方剂8个疗程，复查CT血肿完全吸收，随访两年无复发。

针对实施例3的2个典型案例

王某，男，43岁，住院号：23797481，1月前不慎摔倒，近半月偶感头痛、头晕，查颅脑CT示：右侧额颞顶部少量慢性硬膜下血肿，无明显手术指征。服用本发明中药方剂4个疗程后，头痛、头晕症状未在发生，继续服用2个疗程，复查CT血肿完全吸收，随访两年无复发。

王某，男，42岁，住院号：2424102，2月前高处坠落伤，近1 月感头晕、左侧肢体麻木，查颅脑CT示：左侧额颞部慢性硬膜下血肿，出血量约40ml，患者本人拒绝手术。服用阿托伐他汀钙配合本发明中药方剂2个疗程后，头晕、肢体无力症状减轻，复查颅脑CT 血肿未增加，较前有所吸收，继续原方案6个疗程，复查CT血肿较前吸收，血肿残留约25ml，随访两年患者病情稳定。

(一)中药组方的急性毒性实验研究

1.1实验药物

组方由黄芪30g；川芎30g；生地18g；西洋参18g；珠子参18g；黄精18g；桂枝18g；扭子七6g；红毛七6g；桃儿七6g；地龙6g；鹿角胶6g；甘草6g组成，均购自陕西中医药大学附属医院。

1.2实验动物

昆明小鼠60只，雌雄各半，鼠龄4-6周，体重20±2g，动物级别:普通级，一次性购自成都达硕实验动物有限公司。

1.3实验试剂

10％水合氯醛、4％多聚甲醛，乙醇、二甲苯、苏木素、伊红、血常规检测试剂盒(日本希森美康株式会社)、AST\ALT\TBIL\TC试剂盒(陕西博达生物科技有限公司)、TP\ALB\BUN\CR试剂盒(北京博奥森生物公司)

1.4主要仪器及设备

电子天平 BS223SMAX220gd＝0.001北京赛多利斯仪器系统有限公司

湘仪高速离心机 TG-WS高速离心机长沙相仪离心机仪器有限公司

光学显微镜 OLYMPUSCX21

全自动脱水机 TC-120S德国

全自动生化分析仪 口立7020型日本

石蜡包埋机 TB-718EL德国

石蜡切片机 R136德国

全自动血液细胞分析仪HEMAVET950FS英国Drew公司

2.实验方法

2.1实验动物的饲养

动物饲养于陕西中医药大学实验动物房，雌雄分笼，实验前适应性喂养1周，观察饮食及一般情况，若无异常则可做实验对象。每天更换垫料及饮水，保持实验室温度18-22℃，相对湿度50％-60％。

2.2药液制备

药液煎煮按照中药常规煎法进行，直至最大浓度，即恰好通过强饲针头，不会导致药理化性状改变的浓度，终浓度为4.92g/ml,药液保存于4℃冰箱保存。

2.3急性毒性实验

2.3.1预实验:取昆明小鼠10只，雌雄各半，体重18～22g，给药前禁食不禁水12h，以该组方的最大浓度(含生药4.92g/mL)，小鼠的最大耐受量(0.4ml/10g体重)，灌胃1次/日，给药后常规饲养，观察 7d。观察小鼠外观、行为、呼吸、分泌物、排便、死亡等一般情况。结果:在给药当日见小鼠活动自如，皮肤颜色、呼吸、进食、饮水、精神状态正常，无异常分泌物，小鼠1周内无一死亡，也无明显中毒反应，提示该组方难以测出半数致死量(LD₅₀)，故改做小鼠最大给药量实验。

2.3.2正式试验：

2.3.2.1实验分组

48只昆明小鼠随机分为4组，分别为空白对照组、该组方低、中、高剂量组。每组12只，雌雄各半。

2.3.2.2给药及日常饲养

实验前小鼠均禁食不禁水12小时，按0.4ml/10g体重灌胃，每日2次，中间间隔8小时。空白对照组予等体积生理盐水，该组方低、中、高剂量组分别为98.4g/kg,196.8g/kg,393.6g/kg，分别相当于成人临床日用量的48倍，96倍，192倍。灌胃后即开始观察小鼠的行为反应，每天一次，连续观察14天。

2.3.2.3观察指标

①每日观察小鼠行为、皮毛、饮食、眼睛和粘膜的变化、呼吸、排便、分泌物等变化，以及中毒和死亡情况。每周测量小鼠体重，绘制图表。

②在给药后第14天，检测小鼠的血液学各项指标:红细胞总数 (RBC),白细胞总数(WBC)、血小板计数((PLT)、血红蛋白量(Hb)等。

③在给药后第14天，检测小鼠血液生化学指标:血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清丙氨酶转化酶(ALT)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr) 等生化学指标。

④实验结束后，取小鼠心、肝、脾、肺、肾行HE染色，光镜下观察脏器组织的病理变化。

2.3.3石蜡切片、HE染色实验步骤如下

(1)固定:将组织在4％多聚甲醛中固定24小时，然后取出并用流水冲洗。

(2)脱水、透明、浸蜡步骤如下:

①75％乙醇，120分钟；②80％乙醇，60分钟；③85％乙醇，60分钟；

④95％乙醇Ⅰ，60分钟；⑤95％乙醇Ⅱ，60分钟；⑥无水乙醇Ⅰ，60 分钟；⑦无水乙醇Ⅱ，60分钟；⑧二甲苯Ⅰ，30分钟；⑨二甲苯Ⅱ， 30分钟；⑩石蜡Ⅰ，60分钟；

石蜡Ⅱ，60分钟；

石蜡Ⅲ，60分钟；共12小时。

(3)包埋:包埋框中倒满融化石蜡，将组织置于其中，石蜡凝固后，组织即被包在其中。

(4)切片和封片:切片前应先修蜡块，将蜡块切成方形，各个面修平整，然后切片厚度设定为5um，旋转切出蜡片，镊子夹出完整切片，放入展片机内展平后，用载玻片捞起，在烤片机上60℃烘烤30分钟。

(5)HE染色，步骤如下：

脱蜡：二甲苯Ⅰ， 10分钟；二甲苯Ⅱ， 10分钟；

复水：无水乙醇Ⅰ， 5分钟；无水乙醇Ⅱ， 5分钟；

95％乙醇， 5分钟；90％乙醇， 5分钟；

80％乙醇， 5分钟；70％乙醇， 5分钟；

流水冲洗， 1分钟；

染色：苏木精， 5分钟；流水冲洗， 1分钟；

1％盐酸酒精分化 20秒；流水冲洗， 30秒；

伊红， 5分钟；流水冲洗， 1分钟；

脱水：95％乙醇Ⅰ， 5分钟；95％乙醇Ⅱ， 5分钟；

100％乙醇Ⅰ， 5分钟；100％乙醇Ⅱ， 2分钟；

透明：二甲苯Ⅰ， 2分钟；二甲苯Ⅱ， 2分钟；

(6)中性树胶封片:将树胶滴在载玻片中心，放上盖玻片，干燥后即可在光学显微镜下阅片。

2.3.4实验数据处理：采用SPSS21.0软件，单因素方差分析((ANOVA)，数据以平均值±标准差

表示，以p<0.05为显著性差异的标准。

3.结果

3.1小鼠一般状态观察结果

给药第一天，小鼠活动较少，静伏，饮食减少，余未见其他异常反应，第二天至实验结束，小鼠自由活动，外观正常，饮食正常，体重增加，二便正常，无异常分泌物，无中毒反应和死亡，具体观察见附录表。实验前各组小鼠体重比较无明显差异，实验过程中各组小鼠体重呈上升趋势，见图1；实验后各组小鼠体重比较无统计学差异 (p>0.05)，见表1和图1:

表1实验各组小鼠给药后体重(g)变化表

3.2小鼠血液学指标检测结果

给药结束后各组小鼠的血液学指标均在正常范围内，各用药组与空白对照组比较无明显差异(p＞0.05)，各用药组间比较亦无统计学差异(p＞0.05)，具体见表2和图2：

表2该组方急性毒性实验小鼠血细胞成分的统计结果

3.3小鼠血液生化学各项指标检测结果

给药结束后各组小鼠的血生化学指标均未见明显异常，各用药组与空白对照组比较无明显差异(p＞0.05)，各用药组间比较亦无统计学差异(p＞0.05)，具体见表3和图3：

表3：该组方急性毒性实验小鼠血生化学统计结果

3.4光镜下观察脏器的病理形态学改变

实验结束后解剖动物，取各组小鼠的肝、心、脾、肺、肾，首先做肉眼观察，脏器均未发生改变，其次光学显微镜下观察，结果表明该组方各个剂量组小鼠的肝、心、脾、肺、肾的组织形态学均正常，未见药物引起的器质性改变。说明该组方对重要脏器无病理性损害，具体见图4a、4b、5a、5b、6a、6b、7a、7b、8a、8b。

其中：

图4a的对照组中肝细胞正常；图4b的实验组中肝细胞形态正常，未见异常改变；

图5a的对照组心肌细胞正常；图5b的实验组心肌细胞形态正常，未见异常改变；

图6a的对照组脾脏细胞正常；图6b的实验组脾脏细胞形态正常，未见异常改变；

图7a的对照组肺脏细胞正常；图6b的实验组肺脏细胞形态正常，未见异常改变；

图8a的对照组肾脏细胞正常；图6b的实验组肾脏细胞形态正常，未见异常改变。

(二)中药组方的的慢性毒性实验研究

1.实验材料

1.1实验药物：与急性毒性实验相同。

1.2实验动物

SD大鼠80只，雌雄各半，鼠龄4-6周，体重80-100g，动物级别:普通级，统一购自成都达硕实验动物有限公司。

1.3主要试剂：与急性毒性实验相同。

1.4主要仪器及设备：与急性毒性实验相同。

2.实验方法

2.1实验动物的饲养：与急性毒性实验相同。

2.2该组方及其制备：与急性毒性实验相同。

2.3实验分组及给药

将大鼠随机分为4组，每组20只，雌雄各半。分别为空白对照组和该组方低、中、高剂量组。因药物浓度有限，难以达到中毒剂量，故长期毒性实验以药物最大浓度为高剂量组作为剂量分组设置的依据。该组方高、中、低剂量组给药量分别为98.4g/kg、49.2g/kg、24.6g/kg，相当临床成人日用量48倍、24倍、12倍，空白对照组给等体积生理盐水，按体重2ml/100g，每天灌胃一次，连续给药8周。分两批取材，第一批10只大鼠为给药8周后处死，第二批10只大鼠为停药后继续观察2周(恢复期)后处死。

2.4观察指标

2.4.1一般情况:给药期和恢复期每天观察并记录大鼠的外观、活动、皮肤毛发、饮食、呼吸、分泌物等情况。

2.4.2体重变化：给药期和恢复期每周测量体重，绘制曲线变化图。

2.4.3血液学指标

在给药后8周检测血液学各项指标:红细胞总数(RBC),白细胞总数(WBC)及其分类(L,N)、血小板计数(PLT)、血红蛋白量(Hb)等。8 周后随机选择10只大鼠处死，剩余10只正常饲养2周后(恢复期) 同法采集血样，检测上述指标。

2.4.4血液生化学指标

于用药后8周检测血液学各项指标:血清天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)、血清丙氨酶转化酶(ALT),尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)等生化学指标。8周后随机抽取10只大鼠处死，剩余10只正常饲养2周后(恢复期)同法采集血样，检测上述指标。

2.4.5主要脏器的病理学观察

给药期和恢复期各组大鼠取血后解剖，肉眼观察肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏的变化，并作HE染色，光镜下观察组织器官有无病变。HE染色步骤同急性毒性实验。

2.5实验数据处理：与急性毒性实验相同。

3.结果

3.1一般状态观察

该组方给药8周及停药恢复期2周大鼠无异常表现及活动，无中毒反应。首次给药后各组大鼠活动，饮食均减少，2～4小时后大鼠恢复正常，与对照组比较无显著差异。实验期间大鼠均无呼吸异常，口唇、尾部无发绀，无异常分泌物，自发活动正常，无困倦、昏厥，无运动失调，四肢无震颤、抽搐，无心动过速，无水样便、呕吐等，无尿失禁、流泪、撕咬、竖毛、烦躁、异常活动等异常情况。

3.2大鼠体重变化

该组方给药前，各组大鼠体重无明显差异，给药后各组体重逐渐递增，不同时间各剂量组组间及与对照组比较差异无统计学意义(P＞ 0.05)，恢复期各组大鼠体重仍持续增加，各组之间比较差异仍无统计学意义(P＞0.05)，结果见表4、表5以及图9、图10。

表4该组方慢性毒性实验大鼠体重统计结果

(给药期)

表5该组方慢性毒性实验大鼠体重统计结果

(恢复期)

3.3大鼠血细胞学指标检测结果

该组方给药8周和停药2周后分别检测外周血象，血细胞检测结果显示：各组大鼠在给药期和恢复期的血液学的各项指标均在正常范围，该组方高、中、低各剂量组的血细胞学检测各项指标与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，各给药剂量组组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。具体见表6、7以及图11、图12。结果表明该组方对外周血液无明显毒副作用，恢复期亦无延迟性损害。

表6：该组方慢性毒性实验大鼠血细胞学统计结果

(给药期)

表7：该组方慢性毒性实验大鼠血细胞学统计结果

(恢复期)

3.4大鼠血液生化学指标检测结果

该组方给药8周，血生化学检测结果显示：高剂量组和中剂量组 AST值升高(平均值均在正常范围内)，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，各给药组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，低剂量组与对照组AST值比较差异无统计学意义(P＞0.05)；其余指标各给药组组间及与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。停药 2周后，所有大鼠生化指标均恢复正常，各给药组组间及与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表8、9以及图13、图14。

表8：该组方慢性毒性实验大鼠血生化学统计结果

(给药期)

注：与空白组比较，*：P＜0.05；各剂量组间比较，Δ：P＜0.05。

表9该组方慢性毒性实验大鼠血生化学统计结果

(恢复期)

3.5大鼠系统解剖及脏器系数变化

系统解剖：对给药8周和停药恢复2周的每只大鼠进行解剖，肉眼观察各组大鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器组织，均未见异常变化。称量解剖器官并计算脏器系数，结果显示：给药8周，高剂量组肺脏系数下降，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，中、低剂量组肺脏系数与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，各剂量组心、肝、脾、肾脏系数组间及与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；停药2周后恢复期，各剂量组心、肝、脾、肺、肾脏系数组间及与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表10。

表10该组方慢性毒性实验大鼠脏器系数统计结果

注：与空白组比较，*：P＜0.05；各剂量组间比较，△：P＜0.05。

3.6对重要器官组织病理形态的影响

3.6.1肉眼观察

参照附图15a、15b、15c、16a、16b、16c、17a、17b、17c、 18a、18b、15c、19a、19b、19c，空白对照组和各给药组大鼠肝、心、脾、肺、肾的大小、色泽、质地、形状均无异常改变，也无肿胀、萎缩、坏死等病变。剪开胃及十二指肠，观察胃肠粘膜，各组大鼠胃肠粘膜均无异常改变，表明经口给药对胃、十二指肠无损害作用。余脏器亦无异常改变。

3.6.2镜下观察

肺:各组大鼠肺泡大小均匀，无异常改变。

心脏:各组大鼠心房、心室肌纤维结构正常，未见异常。

脾:各组大鼠脾被膜、脾小梁、红、白髓结构正常，脾小体无明显增生。

肝:大鼠肝细胞结构正常，未见变性或坏死。

肾:各组大鼠肾脏皮质、髓质、乳头区、肾小球结构正常，近、远曲小管上皮细胞正常，无肿胀、变性，管腔正常，肾间质无炎性渗出物。

(三)中药组方对血清中VEGF及SIRT1含量的影响

1.资料与方法

1.1一般资料:选取我院2018年1月至2019年12月收治的52例CSDH患者及同期招纳的38例志愿者，CSDH患者中脱落8例(未按时服药6例，随访脱落2例)CSDH患者中男性36例，女性8例，年龄为42～82岁，平均年龄(57.4±13.6)岁。志愿者中男性24例，女性14例，年龄为36～ 64岁，平均年龄(50.4±12.4)岁。CSDH患者参与试验纳入标准：(1) CT或MRI诊断为CSDH，且手术指征明确；(2)既往无心脑血管基础疾病，无感染性疾病；(3)年龄≥18岁，患者签署知情同意书，接受实验研究全过程。志愿者纳入标准：(1)门诊体检或自愿加入本实验者，CT或MRI诊断排除CSDH；(2)既往无心脑血管基础疾病，无感染性疾病；(3)年龄≥18岁，签署知情同意书，愿意接受实验研究。本研究经陕西中医药大学附属医院医学伦理委员会审核批准。 1.2口服中药：黄芪15～30g；川芎15～30g；生地9～18g；西洋参9～ 18g；珠子参9～18g；黄精9～18g；桂枝9～18g；扭子七3～6g；红毛七3～6g；桃儿七3～6g；地龙3～6g；鹿角胶3～6g；甘草3～6g组成，均购自陕西中医药大学附属医院。口服药物7天为一疗程，共服用4 疗程。

1.3外周血采取时间：所有患者及志愿者纳入试验后采取外周静脉血一次；试验患者服药4疗程后采取外周血一次。

1.4仪器与试剂VEGF及SIRT1的含量检测均采用酶联免疫吸附法， VEGF及SIRT1检测试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)；酶标仪 (450nm波长滤光片)；高精度移液器(EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL,20-200μL,200-1000μL)；37℃恒温箱；双蒸水或去离子水；吸水纸。

1.5方法所有患者及志愿者采取外周血后离心20分钟，取上清检测，所有的操作流程均严格按照说明书操作，根据OD值绘制标准曲线，查出相应的浓度，计算。

1.6统计学方法采用SPSS24.0软件分析，计量资料以(x±s)表示；采用t检验；P<0.05为差异显著。

2.结果

CSDH血肿外周血清中VEGF及SIRT1的含量详表1、2。

表1CSDH患者及健康志愿者外周血清中VEGF浓度(pg/ml，x±s)

表2CSDH患者及健康志愿者外周血清中SIRT1浓度(ng/ml，x±s)

本次试验证实，CSDH患者外周血清VEGF水平均高于正常人体，这与我们前期动物实验研究结果是一致的，本次研究发现，CSDH患者血清SIRT1水平低于正常人体，沉默信息调节因子2相关酶 1(sirtuin1,SIRT1)是一种NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶，是Sirtuins家族成员之一。目前的研究表明：增加SIRT1表达有望逆转血管老化，从而延缓衰老。SIRT1的抗血管老化作用与VEGF的表达密切相关。研究表明，SIRT1表达与VEGF呈负相关，SIRT1的激活或过表达将下调或抑制VEGF表达。因此外周血清中SIRT1水平也影响着 CSDH的发生及复发。

本次试验证实了该中药组方能降低人体外周血清中VEGF水平，同时激活并增加SIRT1含量。该组方能减少并抑制血肿外膜中VEGF 表达，从而减轻外膜新生脆弱血管生成速度，减缓新生血管反复再出血，这是该组方影响CSDH发生及复发的重要作用机制，该机制前期已经得到学者认可。本次研究我们还得到了新的发现，该组方能增加SIRT1表达，抑制VEGF表达从而影响CSDH的发生及复发。

(四)中药组方含药血清对人微血管内皮细胞增殖的影响

1.材料与方法

1.1材料

人微血管内皮细胞(HMEC-1由ATCC公司提供)。SPF级Wister 大鼠[西安科奥生物有限公司，SCXK2019-0014]，DMEM培养基及胎牛血清购于武汉博士德生物有限公司，基质胶购于南京凯基生物有限公司。

1.2组方大鼠含药血清的制备

取SPF级Wister大鼠30只，所有大鼠适应性喂养7d后，随机分为正常血清(生理盐水)空白组、组方血清组，剂量根据成人每日临床用量，根据实验动物与人体表面积等效剂量表换算而成(0.025 g/kg体质量，体表面积换算公式：200g大鼠的给药剂量＝70kg人的给药剂量×0.018)。组方组(组方由黄芪30g；川芎30g；生地 18g；西洋参18g；珠子参18g；黄精18g；桂枝18g；扭子七6g；红毛七6g；桃儿七6g；地龙6g；鹿角胶6g；甘草6g组成，均购自陕西中医药大学附属医院。)给予中药水煎剂3ml/次，2次、日灌胃，对照组给予同等剂量的生理盐水灌胃，连续给药3d，第3天灌胃药后0.5h、1h、1.5h和2h分别在无菌条件下，腹主动脉取血，分离血清，56℃水浴30min灭活补体，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.3：体外血管生成评估

在96孔板每孔包被50μL基质胶，37℃培养1h，随后每孔用100μL含有1.5×10⁴HMEC-1的培养基接种，培养基中含有不同浓度的含药血清，一共分为三组：组方组，空白血清组、对照组(不含血清)，每组设5个副孔。37℃，5％CO₂培养箱培养3h、12h、 24h后在显微镜下照相。

1.4：CCK-8检测培元化瘀方对人微血管内皮细胞增殖的影响

实验分组为正常对照组、含药血清组和空白对照组(采用只加 DMEM培养基无细胞的代替)，将人微血管内皮细胞按照1.0×10⁵个 /mL的数量接种于96孔板中，每孔100μL于37℃、5％CO₂中培养，24h后正常对照组换成含有DMEM的培养基，含药血清组为含10％、15％、20％培元化瘀方的DMEM培养基，继续培养48h以后，然后加 10μLCCK-8检测试剂培养2h后，酶标仪检测吸光度值，每次试验设3个复孔。在酶标仪上测定各孔450nm处吸光度值(A)。按下列公式计算细胞抑制率＝1-(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组) ×100％。

1.5：统计学方法

应用SPSS21.0统计学软件分析，采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2.结果

2.1组方含药血清对人微血管内皮细胞增殖的影响，

组方含药血清能够抑制人微血管内皮细胞增殖，随着含药血清浓度的增加细胞增殖抑制逐渐增加，含药血清组与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，具体看附图。

如图20中的a和b相对比，可以看出细胞形态呈梭形贴壁生长；

如图21中的a和b相对比，为3h时细胞成管的图，可以看出来15％浓度的含药血清组明显比5％浓度的血清组成管数量多，说明血清浓度为5％时抑制率更高；

2.2组方含药血清对人微血管内皮细胞血管生成有抑制作用，3h后与空白组、对照组比较有明显抑制作用，具体看附图。

如图22中的a和b，a为空白组3h对血管成管情况的电镜图；

图22中的b为组方配方中含药血清3h对血管成管情况的电镜图；

从图中可以看出本申请含药血清培养的细胞3h后血管成管比不用药的空白组的成血管少；表明了本申请中中药能够抑制血管内皮细胞生成血管的速度。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种治疗慢性硬膜下血肿的中药，其特征在于：所述中药按照重量份数由黄芪15～30g；川芎15～30g；生地9～18g；西洋参9～18g；珠子参9～18g；黄精9～18g；桂枝9～18g；扭子七3～6g；红毛七3～6g；桃儿七3～6g；地龙3～6g；鹿角胶3～6g；甘草3～6g制成。

2.根据权利要求1所述的一种治疗慢性硬膜下血肿的中药，其特征在于：所述中药按照重量份数由黄芪15g；川芎15g；生地9g；西洋参9g；珠子参9g；黄精9g；桂枝9g；扭子七3g；红毛七3g；桃儿七3g；地龙3g；鹿角胶3g；甘草3g制成。

3.根据权利要求1所述的一种治疗慢性硬膜下血肿的中药，其特征在于：所述中药按照重量份数由黄芪20g；川芎20g；生地12g；西洋参12g；珠子参12g；黄精12g；桂枝12g；扭子七4g；红毛七4g；桃儿七4g；地龙4g；鹿角胶4g；甘草4g制成。

4.根据权利要求1所述的一种治疗慢性硬膜下血肿的中药，其特征在于：所述中药按照重量份数由黄芪30g；川芎30g；生地18g；西洋参18g；珠子参18g；黄精18g；桂枝18g；扭子七6g；红毛七6g；桃儿七6g；地龙6g；鹿角胶6g；甘草6g制成。

5.根据权利要求1-4任一项所述的一种治疗慢性硬膜下血肿的中药的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

步骤一：称取配方量西洋参及珠子参，浸泡6小时后煎煮2次，首次为1小时，第二次为2小时，两次药液滤过浓缩后文火熬制成膏，得制备物Ⅰ；

步骤二：称取配方量扭子七、红毛七及桃儿七，粉碎，加6-10倍量15%-60%的乙醇回流提取2次，每次1小时，过滤并合并滤液，60±5℃减压浓缩，得制备物Ⅱ；

步骤三：称取配方量地龙打粉，得制备物Ⅲ；

步骤四：称取配方量黄芪、川芎、生地、黄精、桂枝及甘草放入砂锅中，加入冷水至没过药材3-5cm，浸泡30分钟，武火烧至沸腾后继续文火慢煎30分钟，过滤得1次滤液；

步骤五：再向砂锅中加入0.9-1L温水，继续武火烧至沸腾，文火煎煮30分钟，过滤得2次滤液；

步骤六：将1次滤液和2次滤液合并，并将制备物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ加入滤液中，加热浓缩至400ml；

步骤七：称取配方量鹿角胶，加入到步骤六制备的400ml烊化即可。

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