CN105273032B

CN105273032B - 一种酸性氨基酸水解人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法

Info

Publication number: CN105273032B
Application number: CN201510677869.4A
Authority: CN
Inventors: 刘志; 阮长春; 孙光芝; 张金秋; 夏娟
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Yatai Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2015-10-20
Filing date: 2015-10-20
Publication date: 2017-10-31
Anticipated expiration: 2035-10-20
Also published as: CN105273032A

Abstract

本发明公开了一种酸性氨基酸水解人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，既将人参二醇组皂苷转化生成20R‑Rg₃、20S‑Rg₃、Rg₅和Rk1，人参三醇组皂苷转化生成Rg₆、F4、Rk3和Rh4。与现有制备工艺相比，酸性氨基酸的水解能力是中性氨基酸和碱性氨基酸的10倍以上，更适宜工业化制备人参稀有皂苷的需要，同时又克服了使用大量强酸强碱导致人参皂苷水解专一性差、得率低、腐蚀性强、污染环境和副产物较多等缺点；充分利用了人参资源，最大限度地提取、富集人参稀有皂苷，达到简单、快速、环保、低成本富集的目的，为工业化生产、新药制备提供方法保证。

Description

一种酸性氨基酸水解人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法

技术领域

本发明公开了一种酸性氨基酸水解人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，涉及人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rk1、Rg₅、Rg₆、F4、Rk3和Rh4提取，属于中医药有效成分提取分离技术领域。

背景技术

在人参制备技术领域中，人参皂苷按照苷元的结构不同分为二醇型人参皂苷(PPD)和三醇型人参皂苷(PPT)。PPD 和PPT 型人参皂苷都属于达玛烷型四环三萜类化合物,在人参皂苷中占大多数。稀有人参皂苷,如人参皂苷Rg₃、Rg₅、F₄、RK1、Rh₂、Rh₄等，在人参中微量存在或不存在。最新药理学研究表明, 稀有人参皂苷具有多种生理活性，如抗肿瘤、免疫调节、抗脑缺血、抗病毒、益智、抗炎和保肝等作用；人参皂苷的代谢研究表明,人参皂苷很难被胃肠道直接吸收, 生物利用率低, 但人参皂苷经过肠道菌代谢去糖基化后生成的人参稀有皂苷吸收率大大增加, 且生理活性广泛。这些稀有人参皂苷才是真正的发挥药效的物质,但其在人参中的含量很低,要获得进行药物开发所必需的量几乎是不可能的。

为了获得具有极高药用价值的人参稀有皂苷，从上世纪八十年代始，国内外生物技术工程及化学研究人员便开始了人参皂苷的结构改造研究，其研究目标主要针对人参二醇型皂苷和三醇型皂苷C3和C20位的糖基结构修饰，利用不同方法进行人参皂苷糖基改造，使人参中含量较高的二醇型和三醇型皂苷的糖基经过水解作用，定向转化为稀有人参皂苷。目前，用于人参皂苷糖基改造的主要方法为化学法。

化学法主要包括酸水解法和碱裂解法，单舒筠等报道了在55℃下采用60%的醋酸水解人参二醇组皂苷1h，结果转化人参二醇组皂苷为人参皂苷-Rh₂和-Rg₃, 并认为此法可用于工业化生产。于志博等研究了利用西洋参茎叶二醇组皂苷制备20(R)人参皂苷-Rh₂和20(R)-人参皂苷-Rg₃的方法, 20(R)人参皂苷-Rh₂的最佳制备条件为50%H₂SO₄ (乙醇体积的5%),80℃下降解4h; 20(R)-人参皂苷-Rg₃的最佳制备条件为3%H₂SO₄(乙醇体积的50%),90℃下降解3h。马佳慧等报道了以人参二醇组皂苷为原料,在10% HCl,85℃下降解4h,其产率为10.15%。马成俊等研究了工业化生产20(S)-PPD和20(S)-PPT的方法，最佳的反应条件为:总皂苷5%、碱浓度10%、温度250℃,降解30 min。李绪文等报道了20(S)-Rh₂的降解制备条件为:人参叶总皂苷与NaOH质量比为1.6∶1 (w/w),人参叶总皂苷与甘油质量比为15∶1(v/w), 220℃下，降解40min, 其转化率为55.64%; 20(S)-PPD的降解制备条件为:西洋参茎叶总皂苷与NaOH质量比为2.0∶1(w/w),西洋参茎叶总皂苷与甘油质量比为15∶1(v/w),235℃下降解200min, 其降解转化率为85.93%。这些文献虽然用酸、碱水解人参皂苷制备人参稀有皂苷的操作比较简单和快速，但是存在很多缺点，如：一、酸、碱水解人参皂苷专一性差、得率低；二、在实际的工业生产中高温高压的作业环境存在着许多安全隐患；三、强酸、强碱对设备器皿的腐蚀性特别大；四、由于向环境中排放大量的污染物，严重影响了环境质量；五、化学裂解法反应太剧烈，许多皂苷元在此条件下会发生化学变化生成多种副产物。如何克服这些缺点，又快又简便地制备人参稀有皂苷，已成为人参稀有皂苷工业化生产中有待解决的关键问题。

氨基酸是指含有氨基的羧酸,生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。通常根据氨基酸分子中所含氨基(-NH2 )和羧基(-COOH)的数目，将其分为中性、酸性和碱性氨基酸三类，各类氨基酸的组成和性质有截然不同之处。中性氨基酸含1个氨基和1个羧基，主要包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、蛋氨酸和羟脯氨酸；酸性氨基酸含1个氨基和2个羧基，主要包括天冬氨酸、谷氨酸；碱性氨基酸则含有2个氨基和1个羧基，主要包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。目前已有文献报道在模拟红参加工的条件下，使用人参皂苷Rb₁或Rb₂与甘氨酸混合120℃加热3小时，结果人参皂苷Rb₁或Rb₂被水解生成20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rk1和Rg₅；且反应后的混合产物抗氧化能力明显升高，这与皂苷水解下来的糖与甘氨酸反应生成了美拉德反应产物有关。此外有文章报道人参皂苷Re分别与丝氨酸、赖氨酸、丙氨酸和亮氨酸混合120℃加热3小时，结果人参皂苷Re被水解成Rg₂、Rg₆和F4；且反应产物的抗氧化、抗癌和对肾脏的保护作用明显增强。然而这些氨基酸大多使用的是中性氨基酸和碱性氨基酸，而作为酸性更强的酸性氨基酸水解人参皂苷的研究未见报道。

发明内容

本发明公开一种利用酸性氨基酸催化水解人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，可以高效绿色环保的水解人参皂苷制备人参稀有皂苷，解决了现有制备工艺使用大量强酸强碱导致人参皂苷水解专一性差、得率低、腐蚀性强、污染环境和副产物较多等缺点。

本发明所述的一种酸性氨基酸水解人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，包括以下步骤：

将人参二醇组皂苷或三醇组皂苷按照质量体积比为1:1-1:20（千克/升）溶于水中，加入酸性氨基酸，使人参二醇组皂苷或三醇组皂苷与酸性氨基酸的质量比为1:20-30:1（千克/千克）；然后放到高压锅中60-150℃下蒸煮0.5-4小时，取出蒸煮过的水解产物上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用50-90%乙醇洗脱，回收乙醇后，人参二醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1；人参三醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷Rg₆、F4、Rk3和Rh4。

本发明的优选制备方法，包括以下步骤：

将人参二醇组皂苷或三醇组皂苷按照质量体积比为1:5（千克/升）溶于水中，加入酸性氨基酸，使人参二醇组皂苷或三醇组皂苷与酸性氨基酸的质量比为10:1（千克/千克）；然后放到高压锅中120℃蒸煮1小时，取出蒸煮过的水解产物上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用80%乙醇洗脱，回收乙醇后，人参二醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1；人参三醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷Rg₆、F4、Rk3和Rh4。

本发明产品可以制成片剂、胶囊剂、粉剂或注射剂等药物学上的任何剂型，用于治疗癌症,肿瘤,糖尿病,高血脂症,心肌或脑缺血,机体免疫功能受损,以及消化系统等疾病。

通过实验研究发现在相同条件下，酸性氨基酸水解人参皂苷的能力是中性氨基酸和碱性氨基酸的10倍以上，因而酸性氨基酸催化水解人参皂苷可以作为一种高效环保的人参稀有皂苷工业化制备的方法。

本发明的积极效果在于：公开了对人参皂苷进行了催化水解制备人参稀有皂苷的新方法，既将人参二醇组皂苷转化生成20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1，人参三醇组皂苷转化生成Rg₆、F4、Rk3和Rh4。与现有制备工艺相比，酸性氨基酸的水解能力是中性氨基酸和碱性氨基酸的10倍以上，更适宜工业化制备人参稀有皂苷的需要，同时又克服了使用大量强酸强碱导致人参皂苷水解专一性差、得率低、腐蚀性强、污染环境和副产物较多等缺点；充分利用了人参资源，最大限度地提取、富集人参稀有皂苷，达到简单、快速、环保、低成本富集的目的，为工业化生产、新药制备提供方法保证。

附图说明

图1：酸性氨基酸水解人参二醇组皂苷转化成稀有皂苷的HPLC 图；

图2：酸性氨基酸水解人参皂苷Re转化成稀有皂苷的HPLC图；

图3：酸性氨基酸水解人参二醇组皂苷转化成稀有皂苷的途径；

图4：酸性氨基酸水解人参皂苷Re转化成稀有皂苷的途径。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

将人参二醇组皂苷或三醇组皂苷按照质量体积比为1:1（千克/升）溶于水中，加入酸性氨基酸，使人参二醇组皂苷或三醇组皂苷与酸性氨基酸的质量比为1:10（千克/千克）；然后放到高压锅中80℃下蒸煮1小时，取出蒸煮过的水解产物上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用60%乙醇洗脱，回收乙醇后，人参二醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1(图1和图3)；人参三醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷Rg₆、F4、Rk3和Rh4(图2和图4)。

实施例2

将人参二醇组皂苷或三醇组皂苷按照质量体积比为1:10（千克/升）溶于水中，加入酸性氨基酸，使人参二醇组皂苷或三醇组皂苷与酸性氨基酸的质量比为1:1（千克/千克）；然后放到高压锅中100℃下蒸煮2小时，取出蒸煮过的水解产物上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用70%乙醇洗脱，回收乙醇后，人参二醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1(图1和图3)；人参三醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷Rg₆、F4、Rk3和Rh4(图2和图4)。

实施例3

将人参二醇组皂苷或三醇组皂苷按照质量体积比为1:20（千克/升）溶于水中，加入酸性氨基酸，使人参二醇组皂苷或三醇组皂苷与酸性氨基酸的质量比为20:1（千克/千克）；然后放到高压锅中120℃下蒸煮4小时，取出蒸煮过的水解产物上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用80%乙醇洗脱，回收乙醇后，人参二醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1(图1和图3)；人参三醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷Rg₆、F4、Rk3和Rh4(图2和图4)。

实施例4

将人参二醇组皂苷或三醇组皂苷按照质量体积比为1:5（千克/升）溶于水中，加入酸性氨基酸，使人参二醇组皂苷或三醇组皂苷与酸性氨基酸的质量比为1:5（千克/千克）；然后放到高压锅中150℃下蒸煮0.5小时，取出蒸煮过的水解产物上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用90%乙醇洗脱，回收乙醇后，人参二醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1(图1和图3)；人参三醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷Rg₆、F4、Rk3和Rh4(图2和图4)。

实施例5

将人参二醇组皂苷或三醇组皂苷按照质量体积比为1:12（千克/升）溶于水中，加入酸性氨基酸，使人参二醇组皂苷或三醇组皂苷与酸性氨基酸的质量比为10:1（千克/千克）；然后放到高压锅中110℃下蒸煮1.5小时，取出蒸煮过的水解产物上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用75%乙醇洗脱，回收乙醇后，人参二醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1(图1和图3)；人参三醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷Rg₆、F4、Rk3和Rh4(图2和图4)。

实施例6

将人参二醇组皂苷或三醇组皂苷按照质量体积比为1:15（千克/升）溶于水中，加入酸性氨基酸，使人参二醇组皂苷或三醇组皂苷与酸性氨基酸的质量比为30:1（千克/千克）；然后放到高压锅中60℃下蒸煮3小时，取出蒸煮过的水解产物上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用50%乙醇洗脱，回收乙醇后，人参二醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1(图1和图3)；人参三醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷Rg₆、F4、Rk3和Rh4(图2和图4)。

为了进一步说明本发明方法中酸性氨基酸催化水解人参皂苷转化生成稀有人参皂苷的途径和转化率，以下采用高效液相色谱法对转化过程和转化产物进行了定量分析实验。

试验例

1 实验材料和试剂

供式样品人参二醇组皂苷提取物粉末和人参皂苷Re为实验室自制; 人参皂苷Rb₁、Rb₂、Rc、Rd、20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1标准品（中国药品生物制品检验所）,人参皂苷Rg₆、F4、Rk3和Rh4标准品为本实验室自制。正亮氨酸（Nor），丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、蛋氨酸（Met）、赖氨酸（Lys）、甘氨酸（Gly）、酪氨酸（Tyr）丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、组氨酸（His）均购买于国药集团化学试剂有限公司。色谱级乙腈（美国Fisher公司），其他试剂为分析纯。

实验方法

2.1 标准品溶液的配置：精密称取各单体人参皂苷标准品各适量，置于同一容量瓶内，加80%乙醇水溶液溶解并定容，配制成各人参皂苷对照品的浓度均为1 mg/ml，摇匀，得混合标准品储备液。精密吸取0.2 ml储备液溶液置于1ml容量瓶中，用80%乙醇水溶液稀释至刻度，得混合对照品溶液，4℃存储，备用。

2.2 待测供试样品的制备：向人参二醇组皂苷和人参皂苷Re的水溶解中，分别加入丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、蛋氨酸（Met）、胱氨酸（Cys-Cys）、赖氨酸（Lys）、甘氨酸（Gly）、酪氨酸（Tyr）丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、组氨酸（His），使各氨基酸的浓度达到5mg/ml, 然后120℃加热1h。将蒸煮后的水解反应产物用无水乙醇溶解，定容至10 mL量瓶中，摇匀放置，用前以0.25μm的滤膜过滤，作为供试品溶液。另取天冬氨酸和谷氨酸分别加入到上述二醇组皂苷和人参皂苷Re 的水溶液中，使酸性氨基酸的浓度达到0.5mg/ml,在同样条件下蒸煮，蒸后取出定容至10 mL量瓶中，摇匀放置，用前以0.25μm的滤膜过滤。

2.3色谱条件：色谱柱Cosmosil 5 C₁₈-MS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05 mol/l 磷酸二氢钾水溶液（B）；洗脱梯度：0-20 min，22%A；20-25 min，22%-29%A；25-45 min，29%A；45-55 min，29%-35%A；55-60 min，35%-50%A；60-75 min，50%-70%A；75-85min，70%A，柱温：25 ℃；检测波长：203 nm；流速：1 ml/min；进样量：20μl；分析时间：85min。

2.4 标准曲线的绘制：精密吸取人参对照品储备液适量，分别稀释至7个不同浓度的混合对照品溶液，精确吸取20 μl，按照上述条件进样分析，记录各个峰的峰面积，以峰面积Y对质量浓度X (mg/ml）进行线性回归，各单体皂苷在0.010 mg/ml-0.640 mg/ml范围内线性关系良好，得回归方程、线性范围和相关系数。

3 实验结果

二醇组皂苷粉末单独高温高压处理未发生转化，当加入单体氨基酸后经过高温高压处理，则发生相应的转化，且各氨基酸对皂苷的转化率存在较大的差异性，主要表现在谷氨酸和天冬氨酸能够将二醇组皂苷完全转化到Rg₃（R、S）、Rk₁和Rg₅（见附图1和附图3）,而赖氨酸和精氨酸则不能转化二醇皂苷，其他中性氨基酸皂苷转化率在17.6%-92.6%之间。进一步我们将酸性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸的浓度由5mg/ml 降到0.5mg/ml, 在相同条件下进行水解反应，结果水解的转化率与5mg/ml浓度时相同（见表1），这说明酸性氨基酸水解人参皂苷的能力是中性氨基酸的10倍以上，可以作为一种高效绿色环保型催化剂制备人参稀有皂苷。

结论：氨基酸对人参皂苷Re的转化规律和对二醇皂苷的转化规律相似，人参皂苷Re单独高温高压处理未发生转化，当加入谷氨酸和天冬氨酸后，人参皂苷Re全部转化，转化产物为Rg₂(S、R)、Rh₁(S、R)、Rg₆、F₄、Rk₃、Rh₄（见附图2和附图4），赖氨酸和精氨酸则不能转化人参皂苷Re，其他中性氨基酸对皂苷转化率在17.6%-92.6%之间。当降低谷氨酸和天冬氨酸的浓度为0.5mg/ml时,其转化皂苷的转化率与5mg/ml浓度时相同（见表2），说明酸性氨基酸转化Re的能力是其他中性氨基酸的10倍以上。

注：-表示未检测到。

Claims

1.一种利用天冬氨酸和谷氨酸水解人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，包括以下步骤：

将人参二醇组皂苷或三醇组皂苷按照1:20千克/升的比例溶于水中，加入酸性氨基酸，使人参二醇组皂苷或三醇组皂苷与酸性氨基酸的比例为20:1千克/千克；然后放到高压锅中120℃下蒸煮4小时，取出蒸煮过的水解产物上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用80%乙醇洗脱，回收乙醇后，人参二醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1；人参三醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷Rg₆、F4、Rk3和Rh4。

2.一种利用天冬氨酸和谷氨酸水解人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，包括以下步骤：

将人参二醇组皂苷或三醇组皂苷按照1:12千克/升的比例溶于水中，加入酸性氨基酸，使人参二醇组皂苷或三醇组皂苷与酸性氨基酸的比例10:1千克/千克；然后放到高压锅中110℃下蒸煮1.5小时，取出蒸煮过的水解产物上大孔树脂柱D₁₀₁，先用水洗五个柱体积，再用75%乙醇洗脱，回收乙醇后，人参二醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷20R-Rg₃、20S-Rg₃、Rg₅和Rk1；人参三醇组皂苷水解产物得到稀有人参皂苷Rg₆、F4、Rk3和Rh4。