CN105238875A - 基于lrba基因检测抗ctla-4抗体药物疗效的试剂盒 - Google Patents

基于lrba基因检测抗ctla-4抗体药物疗效的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105238875A
CN105238875A CN201510801866.7A CN201510801866A CN105238875A CN 105238875 A CN105238875 A CN 105238875A CN 201510801866 A CN201510801866 A CN 201510801866A CN 105238875 A CN105238875 A CN 105238875A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lrba
ctla
composition
antibody drug
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510801866.7A
Other languages
English (en)
Inventor
肖飞
贺毅憬
刘杨
虞健
彭艳
涂超峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Hoomya Gene Technology Co Ltd
Original Assignee
Hunan Hoomya Gene Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Hoomya Gene Technology Co Ltd filed Critical Hunan Hoomya Gene Technology Co Ltd
Priority to CN201510801866.7A priority Critical patent/CN105238875A/zh
Publication of CN105238875A publication Critical patent/CN105238875A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药物疗效的试剂盒，所述试剂盒中包括：（1）核酸释放剂；（2）内标；（3）PCR反应液；（4）酶混合液；（5）LRBA阳性对照；（6）LRBA阴性对照。本发明试剂盒是检测抗CTLA-4抗体药物治疗黑色毒瘤疗效的有效工具，使用本发明试剂盒，可检测LRBA基因突变情况，实现对抗CTLA-4抗体药物治疗黑色毒瘤疗效的检测，填补市场空白。

Description

基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药物疗效的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测抗CTLA-4抗体药物疗效的试剂盒，尤其涉及一种基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药物治疗黑色毒瘤疗效的试剂盒。
背景技术
黑色素瘤是临床上较为常见的皮肤黏膜和色素膜肿瘤，恶性程度极高，黑色素瘤晚期患者的中位生存期为7～9个月，1年内的生存率仅为25％。在过去30年，黑色素瘤发病率明显增加，死亡率也在持续性上升。据世界卫生组织(WHO)统计，每年死于皮肤癌的患者大约有66000人，其中80％死于黑色素瘤。
细胞毒性T细胞相关抗原‐4(CTLA‐4)又名CD152，是由CTLA‐4基因编码的一种跨膜蛋白质，表达于活化的CD4+和CD8+T细胞。CTLA‐4与其配体B7分子结合后产生抑制性信号，抑制T细胞激活，使肿瘤细胞免受T淋巴细胞攻击。因此阻断CTLA‐4的免疫效应，可刺激免疫细胞大量增殖，从而诱导或增强抗肿瘤疫反应。基于前述理论，CTLA‐4为许多疾病包括肿瘤的免疫治疗提供了新的方法。因此，发展抗CTLA‐4抗体用于肿瘤的免疫治疗，是目前肿瘤靶向免疫治疗的热点。Ipilimumab正是靶向作用于CTLA‐4的全人源化单克隆抗体，其通过作用于APC与T细胞的活化途径而间接活化抗肿瘤免疫反应，达到清除癌细胞的目的。目前，该抗体药物已用于黑色毒瘤的治疗中，但市场上尚未有检测该抗体药物疗效的检测产品。
目前，已有美国NIH过敏及传染性疾病研究所的研究人员发现，T细胞中的LPS‐responsivebeige‐likeanchor(LRBA)基因能通过溶酶体抑制CTLA4，CTLA4会抑制T细胞激活，使肿瘤细胞免受T淋巴细胞攻击。因此LRBA的基因突变可间接刺激免疫细胞大量增殖，从而增强抗肿瘤免疫反应。
对于有LRBA突变的患者来说，抗CTLA‐4抗体药物治疗更有效。由此可见，抗CTLA‐4抗体药物的疗效与LRBA发生基因突变有关，具体可参见《PatientswithLRBAdeficiencyshowCTLA4lossandimmunedysregulationresponsivetoabatacepttherapy》一文。但目前尚无检测抗CTLA-4抗体药物疗效的有效工具。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药物疗效的试剂盒，使用这种试剂盒，检测LRBA基因突变情况，可以预测该抗CTLA-4抗体药物治疗黑色毒瘤的疗效。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药物疗效的试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)核酸释放剂：为一种无菌水溶液，由60～100mmol/L的氯化钾、0.01～2wt％(优选0.1－0.5wt％)的十二烷基磺酸钠和0.05～1wt％(优选0.1－0.2wt％)的乙醇组成；
所述百分比以无菌水的质量为计算基准；
(2)内标，序列为：
5’‐CTGGACTTAAATCCTATTGTTCCAGTCCTGTCATCCAGTTAGCTGACTCACGTATTCGTAGCCACCCTTCTGGAGGTGCAATCTAACCTATGTCATCAG‐3’。
(3)PCR反应液，包括以下三组由用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针组成的组合物，所述三组组合物分别为：
组合物1:上游引物11：5’‐TGGCCTCAAGCAGTTCTCCCACTTTG‐3’
下游引物12：5’‐TACCCCCTTTACCAGTCATTGTCTTC‐3’
探针13：5’‐TGGATTCTAATCCTCAAGATATCCACCC‐3’
组合物2：上游引物21：5’‐TACATAGGGTTTGACTTTATTATTT‐3’
下游引物22：5’‐GTCTCAGCCTGCAGAGTAGCTGGG‐3’
探针23：5’‐TAGAGACAGGGTTTCCCCATGTT‐3’
组合物3：上游引物31：5’‐ATTACAGGTGCCTGCCACCATGCCT‐3’
下游引物32：5’‐CCTTTCACCTATCGCACGAGTATCAT‐3’
探针33：5’‐TTTTTGTTTTGCTCTTGTCATTACTGGAG‐3’。
其中组合物1针对6745G>T，组合物2针对7516C>T，组合物3针对7604C>T。
所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针，其序列分别为：
内标上游引物：5’‐GACCAGCTCCATCCTAAGGTTCCAG‐3’
内标下游引物：5’‐CTGATGACATATTTGAGATTGCACC‐3’
内标探针：5’‐TTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCCA–3’。
所述PCR反应液中还包括脱氧核糖核苷三磷酸dNTP；所述脱氧核糖核苷三磷酸dNTP包括dATP、dCTP、dUTP、dGTP或DTTP。
(4)酶混合液：包括耐热DNA聚合酶(Taq酶)1～5U/μl和尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)0.5～2U/μl(优选1～1.2U/μl)。其中，UNG酶的功能是降解含有dN的PCR产物，利用UNG酶和PCR反应液中的dNTP可以起到预防PCR产物污染的作用，从而防止样本检测假阴性。
(5)LRBA阳性对照：为针对3种突变位点所在区域合成质粒的混合物，以及包含内标目的序列片段的质粒，其中组合物1针对6745G>T，组合物2针对7516C>T，组合物3针对7604C>T；
所述阳性质粒序列为：
AGAGGTTACCCTGCGCCTAGAACCTGCACGAGAGTGGGGGAGGAGTGAGCCTGTTCGGGGGCCTCTTGGACCTGCCTTCACCCAGAACCCAGCTTTTTGAGCCCGGGAGAAGCGGGTGGCTAGTAGTGGGGTGCCTTTAGTAACTTACTTGACCGACAATAACTATTTCCCTCTTGTCCCCTCAAAACCCTAAAACAAAACCTAGCCTATTTAACATATATTTAATCTTCCAATAGGGTTTGGCGTTGTTGTCAGCCTCGGGGAGAGAGATTGGACAAATATTCTCCAAGAGGAGGAGGGCGACGCCAAGGACTTTCCACATCAACTGCTTTGGGGTATCTCCACAAGTTGGAAGAGGGACCCTTTCGTTTTGCATTGCGTGTGTTGTGCTCATTACCAGTGCAGCGACTGCCGTCCCAGGGTGACTCTGAGTTGTCCTTTATCGTGAGCTAGCAATGGCTAGCGAAGACAATCGTGTCCCTTCCCCGCCACCAACAGGTGATGACGGGGGAGGTG；
(6)LRBA阴性对照：为以灭菌生理盐水稀释的内标目的序列片段的质粒。
本发明试剂盒是检测抗CTLA‐4抗体药物治疗黑色毒瘤疗效的有效工具，使用本发明试剂盒，可检测LRBA基因突变情况，实现对抗CTLA‐4抗体药物治疗黑色毒瘤疗效的检测，填补市场空白。
附图说明
图1为本发明实施例DNA检测结果为阳性的待测样本扩增曲线及DNA检测结果为阴性的待测样本扩增曲线。
其中：①为DNA检测结果为阳性的待测样本扩增曲线；②为DNA检测结果为阴性的待测样本扩增曲线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明做进一步详细说明。
实施例1
本实施例之基于LRBA基因检测抗CTLA‐4抗体药物治疗黑色毒瘤疗效的试剂盒，其组成成分包括：
(1)核酸释放剂：为一种无菌水溶液，由100mmol/L的氯化钾(KCl)，0.1wt％的十二烷基磺酸钠(SDS)，0.1wt％的乙醇组成；
所述百分比以无菌水的质量为计算基准；
(2)内标(阳性内对照)：为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为2.00E+04copies/ml，内标(即100碱基对)的序列为：
5’‐CTGGACTTAAATCCTATTGTTCCAGTCCTGTCATCCAGTTAGCTGACTCACGTATTCGTAGCCACCCTTCTGGAGGTGCAATCTAACCTATGTCATCAG‐3’；
(3)PCR反应液：包括10×PCR反应缓冲液5μl，缓冲液主要由吐温和生理盐水组成，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸DNTP，0.3μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物所述用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针有三组，其碱基对序列分别为：
组合物1:上游引物11：5’‐TGGCCTCAAGCAGTTCTCCCACTTTG‐3’
下游引物12：5’‐TACCCCCTTTACCAGTCATTGTCTTC‐3’
探针13：5’‐TGGATTCTAATCCTCAAGATATCCACCC‐3’
组合物2：上游引物21：5’‐TACATAGGGTTTGACTTTATTATTT‐3’
下游引物22：5’‐GTCTCAGCCTGCAGAGTAGCTGGG‐3’
探针23：5’‐TAGAGACAGGGTTTCCCCATGTT‐3’
组合物3：上游引物31：5’‐ATTACAGGTGCCTGCCACCATGCCT‐3’
下游引物32：5’‐CCTTTCACCTATCGCACGAGTATCAT‐3’
探针33：5’‐TTTTTGTTTTGCTCTTGTCATTACTGGAG‐3’。
所述用于内标检测的上游引物、下游引物和探针，其序列分别为：
内标上游引物：5’‐GACCAGCTCCATCCTAAGGTTCCAG‐3’
内标下游引物：5’‐CTGATGACATATTTGAGATTGCACC‐3’
内标探针：5’‐TTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCCA–3’。
所述PCR反应液，0.3μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针，0.3μmol/L的用于内标片段扩增的上游引物和下游引物，0.1μmol/L的用于检测内标的探针。其中：
所述脱氧核糖核苷三磷酸dNTP包括dATP、dCTP、dUTP、dGTP或DTTP；
所述用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针有三组，其碱基对序列分别为：
组合物1:上游引物11：5’‐TGGCCTCAAGCAGTTCTCCCACTTTG‐3’
下游引物12：5’‐TACCCCCTTTACCAGTCATTGTCTTC‐3’
探针13：5’‐TGGATTCTAATCCTCAAGATATCCACCC‐3’
组合物2：上游引物21：5’‐TACATAGGGTTTGACTTTATTATTT‐3’
下游引物22：5’‐GTCTCAGCCTGCAGAGTAGCTGGG‐3’
探针23：5’‐TAGAGACAGGGTTTCCCCATGTT‐3’
组合物3：上游引物31：5’‐ATTACAGGTGCCTGCCACCATGCCT‐3’
下游引物32：5’‐CCTTTCACCTATCGCACGAGTATCAT‐3’
探针33：5’‐TTTTTGTTTTGCTCTTGTCATTACTGGAG‐3’。
所述用于内标检测的上游引物、下游引物和探针，其序列分别为：
内标上游引物：5’‐GACCAGCTCCATCCTAAGGTTCCAG‐3’
内标下游引物：5’‐CTGATGACATATTTGAGATTGCACC‐3’
内标探针：5’‐TTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCCA–3’。
(4)酶混合液：包括耐热DNA聚合酶(Taq酶)5U/μl，尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)1U/μl。
(5)LRBA阳性对照：为针对3种突变位点所在区域合成质粒的混合物，以及包含内标目的序列片段的质粒，其中组合物1针对6745G>T，组合物2针对7516C>T，组合物3针对7604C>T：质粒为经上海英潍捷公司合成，经本公司合格的试剂盒检测，Ct值≤30；
所述阳性质粒序列为：
AGAGGTTACCCTGCGCCTAGAACCTGCACGAGAGTGGGGGAGGAGTGAGCCTGTTCGGGGGCCTCTTGGACCTGCCTTCACCCAGAACCCAGCTTTTTGAGCCCGGGAGAAGCGGGTGGCTAGTAGTGGGGTGCCTTTAGTAACTTACTTGACCGACAATAACTATTTCCCTCTTGTCCCCTCAAAACCCTAAAACAAAACCTAGCCTATTTAACATATATTTAATCTTCCAATAGGGTTTGGCGTTGTTGTCAGCCTCGGGGAGAGAGATTGGACAAATATTCTCCAAGAGGAGGAGGGCGACGCCAAGGACTTTCCACATCAACTGCTTTGGGGTATCTCCACAAGTTGGAAGAGGGACCCTTTCGTTTTGCATTGCGTGTGTTGTGCTCATTACCAGTGCAGCGACTGCCGTCCCAGGGTGACTCTGAGTTGTCCTTTATCGTGAGCTAGCAATGGCTAGCGAAGACAATCGTGTCCCTTCCCCGCCACCAACAGGTGATGACGGGGGAGGTG
(6)LRBA阴性对照：以灭菌生理盐水稀释的内标目的序列片段的质粒，经本公司合格的试剂盒检测为阴性。
实施例2
采用上述实施例1中的试剂盒检测未知的血液样本，其具体操作步骤如下：
一、试剂准备
根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例取相应量的PCR反应液(40μl/人份)、酶混合液(3μl/人份)及内标(0.5μl/人份)，充分混匀成PCR‐mix；瞬时离心后备用。
二、样本提取
1、外周血样本：使用石蜡切片核酸提取试剂盒提取DNA作为待测样本；所述石蜡切片核酸提取试剂盒使用北京天根核酸提取试剂盒；
2、LRBA阳性对照、LRBA阴性对照：阴、阳性对照为已经由上海英潍捷公司合成的质粒，不需要提取。
三、向PCR反应管中加样
每个反应管中加入上述步骤二中处理后的待测样本、LRBA阳性对照、LRBA阴性对照各10μl；静置10分钟后，每管加入步骤一中的PCR‐mix40μl，然后，吸打混匀2‐3次，去除气泡后盖上管盖，2000rpm离心30秒。
四、荧光PCR反应与结果分析(在荧光定量PCR扩增仪上进行)
1、将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本。
2、荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:None)检测待测突变位点；针对6745G>T，针对7516C>T，针对7604C>T位点；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测内标；参比荧光(PassiveReference)设置为none。
3、荧光定量PCR反应条件见表1：
表1荧光定量PCR反应条件
4、结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析，也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析，然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cyclethreshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；如果待测样本的扩增曲线呈S型(见图1中①)，测定Ct值≤39(Ct值>0)，则可判该待测样本中LRBA基因有突变，即检测结果为阴性；如果待测样本的扩增曲线平直(见图1中②)，测定显示无Ct值的样本，则可判该待测样本中LRBA基因无突变，即检测结果为阳性。
理论上，在读取检测结果时，同一待测样本中最多可以检测出三个突变位点全部突变，也即共发生三种突变；当然也可以是其中仅有一个碱基位置发生突变。只要是发生上述3种突变类型中的任一种，都说明病人使用该类药物疗效较好。
按照上述操作步骤对80例使用Ipilimumab的黑色毒瘤患者的毒瘤组织进行检测，其中58例患者的LRBA基因有突变，相应临床疗效较好。
以上仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围内。
序列表　
<110>湖南宏雅基因技术有限公司
<120>基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药物疗效的试剂盒
<160>14
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>99
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
CTGGACTTAA　ATCCTATTGT　TCCAGTCCTG　TCATCCAGTT　AGCTGACTCA　CGTATTCGTA　60
GCCACCCTTC　TGGAGGTGCA　ATCTAACCTA　TGTCATCAG　99
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
TGGCCTCAAG　CAGTTCTCCC　ACTTTG　26
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
TACCCCCTTT　ACCAGTCATT　GTCTTC　26
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
TGGATTCTAA　TCCTCAAGAT　ATCCACCC　28
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
TACATAGGGT　TTGACTTTAT　TATTT　25
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
GTCTCAGCCT　GCAGAGTAGC　TGGG　24
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>7
TAGAGACAGG　GTTTCCCCAT　GTT　23
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>8
ATTACAGGTG　CCTGCCACCA　TGCCT　25
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成
<400>9
CCTTTCACCT　ATCGCACGAG　TATCAT　26
<210>10
<211>29
<212>DNA
<213>人工合成
<400>10
TTTTTGTTTT　GCTCTTGTCA　TTACTGGAG　29
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>11
GACCAGCTCC　ATCCTAAGGT　TCCAG　25
<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>12
CTGATGACAT　ATTTGAGATT　GCACC　25
<210>13
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成
<400>13
TTGCTGACTC　ACGTATTCGT　AGCCCA　26
<210>14
<211>516
<212>DNA
<213>人工合成
<400>14
AGAGGTTACC　CTGCGCCTAG　AACCTGCACG　AGAGTGGGGG　AGGAGTGAGC　CTGTTCGGGG　60
GCCTCTTGGA　CCTGCCTTCA　CCCAGAACCC　AGCTTTTTGA　GCCCGGGAGA　AGCGGGTGGC　120　TAGTAGTGGG　GTGCCTTTAG　TAACTTACTT　GACCGACAAT　AACTATTTCC　CTCTTGTCCC　180
CTCAAAACCC　TAAAACAAAA　CCTAGCCTAT　TTAACATATA　TTTAATCTTC　CAATAGGGTT　240
TGGCGTTGTT　GTCAGCCTCG　GGGAGAGAGA　TTGGACAAAT　ATTCTCCAAG　AGGAGGAGGG　300
CGACGCCAAG　GACTTTCCAC　ATCAACTGCT　TTGGGGTATC　TCCACAAGTT　GGAAGAGGGA　360
CCCTTTCGTT　TTGCATTGCG　TGTGTTGTGC　TCATTACCAG　TGCAGCGACT　GCCGTCCCAG　420
GGTGACTCTG　AGTTGTCCTT　TATCGTGAGC　TAGCAATGGC　TAGCGAAGAC　AATCGTGTCC　480
CTTCCCCGCC　ACCAACAGGT　GATGACGGGG　GAGGTG　516

Claims (5)

1.一种基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药物疗效的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(1)核酸释放剂：为一种无菌水溶液，由60～100mmol/L的氯化钾、0.01～2wt％的十二烷基磺酸钠和0.05～1wt％的乙醇组成；
所述百分比以无菌水的质量为计算基准；
(2)内标，序列为：
5’‐CTGGACTTAAATCCTATTGTTCCAGTCCTGTCATCCAGTTAGCTGACTCACGTATTCGTAGCCACCCTTCTGGAGGTGCAATCTAACCTATGTCATCAG‐3’；
(3)PCR反应液，包括以下三组由用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针组成的组合物，所述三组组合物分别为：
组合物1:上游引物11：5’‐TGGCCTCAAGCAGTTCTCCCACTTTG‐3’
下游引物12：5’‐TACCCCCTTTACCAGTCATTGTCTTC‐3’
探针13：5’‐TGGATTCTAATCCTCAAGATATCCACCC‐3’
组合物2：上游引物21：5’‐TACATAGGGTTTGACTTTATTATTT‐3’
下游引物22：5’‐GTCTCAGCCTGCAGAGTAGCTGGG‐3’
探针23：5’‐TAGAGACAGGGTTTCCCCATGTT‐3’
组合物3：上游引物31：5’‐ATTACAGGTGCCTGCCACCATGCCT‐3’
下游引物32：5’‐CCTTTCACCTATCGCACGAGTATCAT‐3’
探针33：5’‐TTTTTGTTTTGCTCTTGTCATTACTGGAG‐3’；
其中组合物1针对6745G>T，组合物2针对7516C>T，组合物3针对7604C>T；
所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针，其序列分别为：
内标上游引物：5’‐GACCAGCTCCATCCTAAGGTTCCAG‐3’
内标下游引物：5’‐CTGATGACATATTTGAGATTGCACC‐3’
内标探针：5’‐TTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCCA–3’；
所述PCR反应液中还包括脱氧核糖核苷三磷酸dNTP；
(4)酶混合液：包括耐热DNA聚合酶1～5U/μl和尿嘧啶DNA糖基化酶0.5～2U/μl；
(5)LRBA阳性对照：为针对3种突变位点所在区域合成质粒的混合物，以及包含内标目的序列片段的质粒，其中组合物1针对6745G>T，组合物2针对7516C>T，组合物3针对7604C>T；
所述阳性质粒序列为：
AGAGGTTACCCTGCGCCTAGAACCTGCACGAGAGTGGGGGAGGAGTGAGCCTGTTCGGGGGCCTCTTGGACCTGCCTTCACCCAGAACCCAGCTTTTTGAGCCCGGGAGAAGCGGGTGGCTAGTAGTGGGGTGCCTTTAGTAACTTACTTGACCGACAATAACTATTTCCCTCTTGTCCCCTCAAAACCCTAAAACAAAACCTAGCCTATTTAACATATATTTAATCTTCCAATAGGGTTTGGCGTTGTTGTCAGCCTCGGGGAGAGAGATTGGACAAATATTCTCCAAGAGGAGGAGGGCGACGCCAAGGACTTTCCACATCAACTGCTTTGGGGTATCTCCACAAGTTGGAAGAGGGACCCTTTCGTTTTGCATTGCGTGTGTTGTGCTCATTACCAGTGCAGCGACTGCCGTCCCAGGGTGACTCTGAGTTGTCCTTTATCGTGAGCTAGCAATGGCTAGCGAAGACAATCGTGTCCCTTCCCCGCCACCAACAGGTGATGACGGGGGAGGTG；
(6)LRBA阴性对照：为以灭菌生理盐水稀释的内标目的序列片段的质粒。
2.根据权利要求1所述的基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药物疗效的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂中，十二烷基磺酸钠的浓度为0.1－0.5wt％。
3.根据权利要求1或2所述的基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药物疗效的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂中，乙醇的浓度为0.1－0.2wt％。
4.根据权利要求1或2所述的基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药物疗效的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中的脱氧核糖核苷三磷酸dNTP包括dATP、dCTP、dUTP、dGTP或DTTP。
5.根据权利要求1或2所述的基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药物疗效的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液中，尿嘧啶DNA糖基化酶的浓度为1～1.2U/μl。
CN201510801866.7A 2015-11-19 2015-11-19 基于lrba基因检测抗ctla-4抗体药物疗效的试剂盒 Pending CN105238875A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510801866.7A CN105238875A (zh) 2015-11-19 2015-11-19 基于lrba基因检测抗ctla-4抗体药物疗效的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510801866.7A CN105238875A (zh) 2015-11-19 2015-11-19 基于lrba基因检测抗ctla-4抗体药物疗效的试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105238875A true CN105238875A (zh) 2016-01-13

Family

ID=55036693

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510801866.7A Pending CN105238875A (zh) 2015-11-19 2015-11-19 基于lrba基因检测抗ctla-4抗体药物疗效的试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105238875A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002078614A2 (en) * 2001-04-02 2002-10-10 University Of South Florida Lps-responsive chs1/beige-like anchor gene and therapeutic applications thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002078614A2 (en) * 2001-04-02 2002-10-10 University Of South Florida Lps-responsive chs1/beige-like anchor gene and therapeutic applications thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABDULLAH ALANGARI: "LPS-responsive beige-like anchor (LRBA) gene mutation in a family with inflammatory bowel disease and combined immunodeficiency", 《J ALLERGY CLIN IMMUNOL.》 *
BERNICE LO: "Patients with LRBA deficiency show CTLA4 loss and immune dysregulation responsive to abatacept therapy", 《SCIENCE》 *
GABRIELA LOPEZ-HERRERA: "Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity", 《THE AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS》 *
LOUIS-MARIE CHARBONNIER: "Regulatory T Cell Deficiency and Immune dysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy, X-Linked-Like Disorder Due to Loss of Function Mutations in LRBA", 《J ALLERGY CLIN IMMUNOL. 》 *
SHOSHANA REVEL-VILK: "Autoimmune lymphoproliferative syndrome-like disease in patients with LRBA mutation", 《CLINICAL IMMUNOLOGY》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106399555A (zh) 一种实时荧光定量pcr检测方法及其标准品和检测试剂盒
CN105002283B (zh) 一种用于检测人c-kit基因突变的QPCR组合物及试剂盒
CN102747158A (zh) 一种人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
CN103695531A (zh) Abcb1基因多态性焦磷酸测序方法及试剂盒
CN101608240A (zh) 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针及其使用方法
CN108251510A (zh) 一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用
CN105838777A (zh) ddPCR技术监测肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的方法
CN103667514A (zh) 一种人白介素28b基因多态性荧光pcr检测试剂盒
CN106148498A (zh) Kras基因突变检测试剂盒及其应用
CN108277263A (zh) 一种检测braf基因v600e的引物探针组合物及其检测方法
CN105861726A (zh) Braf基因突变检测试剂盒
CN105256036A (zh) 一种检测血清中lncARSR的试剂盒及其在检测肾癌舒尼替尼耐药中的应用
CN104531881A (zh) 一种人k-ras基因突变荧光pcr检测试剂盒
Ma et al. NTRK fusions in thyroid cancer: pathology and clinical aspects
CN107190005B (zh) lncRNA作为生物标志物在肺腺癌诊治中的应用
CN105238875A (zh) 基于lrba基因检测抗ctla-4抗体药物疗效的试剂盒
CN110387372A (zh) 抑制lncRNA表达在胃癌治疗中的应用
CN103757109B (zh) 一种指导噻嗪类利尿药用药的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法
CN105463117A (zh) 检测人riok2基因表达量和相对表达量的引物对
CN105274104A (zh) 一种预测抗pd-l1抗体药物药效的检测试剂盒
CN109825585A (zh) 一种鼻咽癌诊断和/或预后评估的生物标记物
CN106702002A (zh) 一种用于肺腺癌诊治的生物标志物
CN105838778A (zh) ddPCR技术监控结直肠癌患者对帕尼单抗/西妥昔单抗耐药的方法
CN105838779A (zh) ddPCR技术监控胃肠道间质瘤患者对伊马替尼/舒尼替尼耐药的方法
CN105506131A (zh) 检测人aeg-1基因表达量和相对表达量的引物对

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: He Yijing

Inventor after: Xiao Fei

Inventor after: Liu Yang

Inventor after: Yu Jian

Inventor after: Peng Yan

Inventor after: Tu Chaofeng

Inventor before: Xiao Fei

Inventor before: He Yijing

Inventor before: Liu Yang

Inventor before: Yu Jian

Inventor before: Peng Yan

Inventor before: Tu Chaofeng

COR Change of bibliographic data
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160113

RJ01 Rejection of invention patent application after publication