CN105188422A - 富含蛋白质的烟草衍生组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开描述了从烟草属种的植物获得和/或衍生蛋白质的方法以及用于将这些蛋白质并入到各种产品中的方法。举例来说，提供了一种用于从所述烟草属种的植物或其部分获得富含蛋白质的材料的方法，所述方法包括：将一种或多种蛋白质从所述植物材料中提取到溶剂中以形成液体含有蛋白质的提取物；使固体的所提取的植物材料与所述液体含有蛋白质的提取物分离；使所述液体含有蛋白质的提取物澄清以形成澄清了的含有蛋白质的提取物和固体级分；以及处理所述澄清了的含有蛋白质的提取物以提供包含以重量计至少约60％的蛋白质的富含蛋白质的材料。

Description

富含蛋白质的烟草衍生组合物
技术领域
本发明涉及由烟草制成或衍生或以其它方式包含烟草或烟草的组分并且意图用于人类食用的产品。特别要关注的是由来自烟草属(Nicotiana)种的植物或植物的部分获得或衍生的成分或组分。
背景技术
香烟、雪茄、以及烟斗是利用呈各种形式的烟草的普遍吸烟制品。这些吸烟制品是通过加热或燃烧烟草以产生可以由吸烟者吸入的气溶胶(例如烟气)来使用的。诸如香烟的普遍吸烟制品具有基本上呈圆柱形棒状的结构并且包括由包装纸围绕，从而形成所谓的“烟草棒”的诸如切细的烟草(例如呈切割填料形式)的可抽吸材料的包状物、卷状物或柱状物。通常，香烟具有与烟草棒以端对端关系排列的圆柱形过滤元件。通常，过滤元件包括由被称为“滤棒成型纸(plugwrap)”的纸材料包围的增塑乙酸纤维素丝束。某些香烟包括过滤元件，所述过滤元件具有多个区段，并且这些区段之一可以包括活性炭颗粒。通常，使用被称为“接装纸(tippingpaper)”的外围包装材料使所述过滤元件与烟草棒的一端附接。还期望的是，将接装材料和滤棒成型纸穿孔以提供环境空气对抽吸的主流烟气的稀释。香烟是由吸烟者通过点燃其一端并且使烟草棒燃烧来使用的。然后，吸烟者通过在香烟的相对端(例如过滤嘴端)上进行抽吸来接受主流烟气进入他/她的口中。
用于制造香烟的烟草通常以共混形式使用。举例来说，通常被称为“美国共混物(Americanblend)”的某些普遍的烟草共混物包括烟熏烟、白肋烟以及香料烟(Orientaltobacco)的混合物，并且在很多情况下，包括某些加工过的烟草，如复原烟草和加工过的烟草梗。用于制造特定香烟品牌的烟草共混物内的每一种类型的烟草的精确量在品牌之间有所不同。然而，对于许多烟草共混物来说，烟熏烟占所述共混物相对大的比例，而香料烟占所述共混物相对小的比例。参见例如《烟草百科全书》(TobaccoEncyclopedia),Voges(编著)第44-45页(1984)；Browne,《香烟的设计》(TheDesignofCigarettes),第3版,第43页(1990)；以及《烟草的生产、化学以及技术》(TobaccoProduction,ChemistryandTechnology),Davis等,(编著)第346页(1999)。
烟草还可以所谓的“无烟”形式被享用。特别普遍的无烟烟草产品是通过将一定形式的加工过的烟草或含有烟草的制剂插入使用者的口中来使用的。参见例如以下文献中所阐述的无烟烟草制剂、成分、以及加工方法的类型：Schwartz的美国专利号1,376,586；Levi的美国专利号3,696,917；Pittman等的美国专利号4,513,756；Sensabaugh,Jr.等的美国专利号4,528,993；Story等的美国专利号4,624,269；Tibbetts的美国专利号4,991,599；Townsend的美国专利号4,987,907；Sprinkle,III等的美国专利号5,092,352；White等的美国专利号5,387,416；Williams的美国专利号6,668,839；Williams的美国专利号6,834,654；Atchley等的美国专利号6,953,040；Atchley等的美国专利号7,032,601；以及Atchley等的美国专利号7,694,686；Williams的美国专利公开号2004/0020503；Quinter等的美国专利公开号2005/0115580；Strickland等的美国专利公开号2005/0244521；Strickland等的美国专利公开号2006/0191548；Holton,Jr.等的美国专利公开号2007/0062549；Holton,Jr.等的美国专利公开号2007/0186941；Strickland等的美国专利公开号2007/0186942；Dube等的美国专利公开号2008/0029110；Robinson等的美国专利公开号2008/0029116；Mua等的美国专利公开号2008/0029117；Robinson等的美国专利公开号2008/0173317；Engstrom等的美国专利公开号2008/0196730；Neilsen等的美国专利公开号2008/0209586；Crawford等的美国专利公开号2008/0305216；Mua等的美国专利公开号2009/0025738；Brinkley等的美国专利公开号2009/0025739；Essen等的美国专利公开号2009/0065013；Kumar等的美国专利公开号2009/0293889；Doolittle等的美国专利公开号2010/0018540；Gerardi等的美国专利公开号2010/0018541；Gao等的美国专利公开号2010/0291245；Mua等的美国专利公开号2011/0139164；Coleman,III等的美国专利公开号2011/0174323；Beeson等的美国专利公开号2011/0247640；Coleman,III等的美国专利公开号2011/0259353；Cantrell等的美国专利公开号2012/0037175；Hunt等的美国专利公开号2012/0055494；Sebastian等的美国专利公开号2012/0103353；Byrd等的美国专利公开号2012/0125354；Cantrell等的美国专利公开号2012/0138073；以及Cantrell等的美国专利公开号2012/0138074；Arnarp等的PCTWO04/095959；Atchley等的PCTWO05/063060；Engstrom的PCTWO05/004480；Bjorkholm的PCTWO05/016036；Quinter等的PCTWO05/041699；以及Atchley的PCTWO10/132444；这些文献中的每一篇以引用的方式并入本文。
一种类型的无烟烟草产品被称为“鼻烟”。通常被称为“口含烟(snus)”的代表性类型的湿鼻烟产品已经在欧洲(Europe)，特别是在瑞典(Sweden)，通过或经由诸如以下的公司被制造：SwedishMatchAB公司、Fiedler&LundgrenAB公司、GustavusAB公司、SkandinaviskTobakskompagniA/S公司、以及RockerProductionAB公司。在美国可获得的口含烟产品已经由R.J.雷诺兹烟草公司(R.J.ReynoldsTobaccoCompany)以商品名CamelSnusFrost、CamelSnusOriginal以及CamelSnusSpice销售。还参见例如Bryzgalov等,1N1800生命周期评估(1N1800LifeCycleAssessment),一般散装和部分口含烟的比较性生命周期评估(ComparativeLifeCycleAssessmentofGeneralLooseandPortionSnus)(2005)。此外，与口含烟制造相关的某些质量标准已经被汇编为所谓的GothiaTek标准。代表性的无烟烟草产品还已经由以下公司以如下的商品名销售：HouseofOliverTwistA/S公司的OliverTwist；美国无烟烟草公司(U.S.SmokelessTobaccoCo.)的Copenhagen湿烟草、Copenhagen烟草袋、SkoalBandits、Skoal烟草袋、SkoalDry、Rooster、RedSeal粗丝(longcut)、Husky、以及Revel薄荷烟草包；菲利浦·莫里斯美国公司(PhilipMorrisUSA)的万宝路口含烟(MarlboroSnus)和“taboka”；美国鼻烟有限责任公司(AmericanSnuffCompany,LLC)的LeviGarrett、Peachy、Taylor'sPride、Kodiak、HawkenWintergreen、Grizzly、Dental、KentuckyKing、以及MammothCave；R.J.雷诺兹烟草公司的CamelSnus、CamelOrbs、CamelSticks、以及CamelStrips。已经被销售的其它示例性无烟烟草产品包括被称为Kayak湿鼻烟和ChattanoogaChew嚼烟(斯威舍国际公司(SwisherInternational,Inc.))；以及Redman嚼烟(平克顿烟草有限合伙制公司(PinkertonTobaccoCo.LP))的那些产品。
多年以来，已经提出了各种处理方法和添加剂来改变用于烟草产品中的烟草材料的总体特征或性质。举例来说，已经利用添加剂或处理方法来改变烟草材料的化学特性或感官特性，或者在可抽吸的烟草材料的情况下，改变通过抽吸包括烟草材料的制品所产生的主流烟气的化学特性或感官特性。香烟烟气的感官属性可以通过将调味材料并入香烟的各种组分中来增强。示例性调味添加剂包括薄荷醇和美拉德反应(Maillardreaction)产物，如吡嗪、氨基糖、以及阿马多利化合物(Amadoricompound)。美国香烟烟草共混物通常含有壳体组合物，所述壳体组合物包括调味成分，如甘草或可可粉；以及糖源，如高果糖玉米糖浆。还参见Leffingwell等,用于吸烟产品的烟草调味(TobaccoFlavoringforSmokingProducts),R.J.雷诺兹烟草公司(1972)，该文献以引用的方式并入本文。在一些情况下，涉及使用热的处理方法可以赋予加工过的烟草以所需的颜色或视觉特征、所需的感官特性或所需的物理性质或质地。用于制备用于烟草组合物中的风味和芳香组合物的各种方法阐述于以下文献中：Rooker的美国专利号3,424,171；Luttich的美国专利号3,476,118；Osborne,Jr.等的美国专利号4,150,677；Roberts等的美国专利号4,986,286；White等的美国专利号5,074,319；White等的美国专利号5,099,862；Sensabaugh,Jr.的美国专利号5,235,992；Raymond等的美国专利号5,301,694；Coleman,III等的美国专利号6,298,858；Coleman,III等的美国专利号6,325,860；Coleman,III等的美国专利号6,428,624；Dube等的美国专利号6,440,223；Coleman,III的美国专利号6,499,489；以及White等的美国专利号6,591,841；Coleman,III的美国专利申请公开号2004/0173228；以及Coleman,III等的美国专利申请公开号2010/0037903，这些文献中的每一篇以引用的方式并入本文。
无烟烟草的感官属性还可以通过加入某些调味材料来增强。参见例如Williams的美国专利申请公开号2002/0162562；Williams的美国专利申请公开号2002/0162563；Atchley等的美国专利申请公开号2003/0070687；Williams的美国专利申请公开号2004/0020503；Breslin等的美国专利申请公开号2005/0178398；Strickland等的美国专利申请公开号2006/0191548；Holton,Jr.等的美国专利申请公开号2007/0062549；Holton,Jr.等的美国专利申请公开号2007/0186941；Strickland等的美国专利申请公开号2007/0186942；Dube等的美国专利申请公开号2008/0029110；Robinson等的美国专利申请公开号2008/0029116；Mua等的美国专利申请公开号2008/0029117；Robinson等的美国专利申请公开号2008/0173317；以及Neilsen等的美国专利申请公开号2008/0209586，这些文献中的每一篇以引用的方式并入本文。
将期望的是，提供用于改变可用于制造吸烟制品和/或无烟烟草产品的烟草(以及烟草组合物和制剂)的特征和性质的另外的组合物和方法。
发明内容
本发明提供了来自烟草属种的材料(例如烟草衍生材料)，所述材料包含来自烟草属种的植物的分离的组分，所述材料可用于被并入到用于多种烟草产品，如吸烟制品和无烟烟草产品中的烟草组合物中。本发明还提供了用于从烟草属种(例如烟草材料)中提取组分的方法、以及用于加工那些组分以及包含那些组分的烟草材料的方法。
具体来说，本发明提供了衍生自烟草材料的澄清了的富含蛋白质的材料、获得和/或衍生这些富含蛋白质的材料的方法、以及用于将这些富含蛋白质的材料并入到各种烟草组合物中的方法。
在某些方面，本公开提供了一种用于从烟草属种的植物或其部分获得富含蛋白质的材料的方法，所述方法包括：接收烟草属种的植物材料；在一定的时间内以及在一定的条件下使所述植物材料与溶剂接触，所述时间和条件足以将一种或多种蛋白质从所述植物材料中提取到所述溶剂中并且形成液体含有蛋白质的提取物；使固体的所提取的植物材料与所述液体含有蛋白质的提取物分离；使所述液体含有蛋白质的提取物澄清以形成澄清了的含有蛋白质的提取物和固体级分；以及处理所述澄清了的含有蛋白质的提取物以提供包含以干重计至少约60％的蛋白质的富含蛋白质的材料。
用于所述方法的各个步骤中的条件和试剂可以不同。举例来说，如本文所述加以处理的烟草属种的植物材料可以呈绿色植物材料、黄化植物材料、烤过的植物材料或其混合物的形式。在某些实施方案中，所述溶剂包含水并且可以任选地还包含偏亚硫酸氢钠、缓冲剂(例如抗坏血酸或甘氨酸)、或其组合。在一些实施方案中，所述溶剂具有碱性pH值。
所述方法的每一个步骤可以包括各种组成部分。举例来说，在一些实施方案中，所述澄清步骤包括将所述液体含有蛋白质的提取物的pH值调节到酸性pH值以及过滤所述提取物。举例来说，可以将所述澄清了的含有蛋白质的提取物的pH值调节到约4至约6的pH值，或可以调节到约5或约6的pH值。在一些实施方案中，所述澄清步骤包括将所述液体含有蛋白质的提取物的pH值调节到碱性pH值以及过滤所述提取物。
在一些实施方案中，所述处理步骤包括将所述澄清了的含有蛋白质的提取物的pH值调节到小于约6的pH值以形成酸性提取物；从所述酸性提取物分离沉淀物；以及将所述沉淀物洗涤以提供富含蛋白质的材料。在某些这样的实施方案中，所述澄清了的含有蛋白质的提取物被调节到的pH值可以被调节到约4.5至约6(以提供含有RuBisCO的富含蛋白质的材料)。可以例如在具有约1μm至约1kDa或约1μm至约10μm的孔径的过滤器上进行洗涤。在一个实施方案中，还可以通过以下各项中的一种或两种对在分离步骤之后保留的提取物进行处理：1)在具有1kDa-500kDa的孔径的过滤器上过滤并且分离作为保留物的第二富含蛋白质的材料；以及2)将所述提取物调节到小于约4.5的pH值并且从其中分离包含第二富含蛋白质的材料的第二沉淀物，其中所述第二富含蛋白质的材料是含有F2蛋白的富含蛋白质的材料。在一些这样的实施方案中，可以将澄清了的含有蛋白质的提取物的pH值调节到约3至约4.5的pH值以提供混合的含有RuBisCO并且含有F2蛋白的富含蛋白质的材料。
在洗涤步骤中所使用的溶剂可以是例如酸性溶液(例如柠檬酸溶液)。在一些实施方案中，通过这种形成沉淀物的方法所产生的富含蛋白质的材料一般可以包含以干重计至少约80％的蛋白质。在某些实施方案中，由此所获得的蛋白质是以干重计至少约50％的RuBisCO。
在其它实施方案中，所述处理步骤包括在陶瓷过滤器或超滤膜上过滤所述澄清了的含有蛋白质的提取物以得到保留物和液体渗透物；以及洗涤所述保留物以提供所述富含蛋白质的材料。在某些这样的实施方案中，所述澄清步骤可以包括调节所述液体含有蛋白质的提取物的pH值。在一些实施方案中，所述过滤步骤包括使所述澄清了的含有蛋白质的提取物穿过具有约1μm至约1kDa的孔径和/或截留分子量的一个或多个过滤器。在一些实施方案中，可以使用具有约10kDa和/或约20kDa的截留分子量的过滤器。举例来说，所述过滤步骤可以包括使所述澄清了的含有蛋白质的提取物穿过具有约1μm至约500kDa的孔径的过滤器并且其中所述保留物包含以干重计至少约50％的RuBisCO。作为另一个实例，所述过滤步骤可以包括使所述澄清了的含有蛋白质的提取物穿过具有约1kDa或更大(例如约1kDa至约500kDa)的截留分子量的过滤器并且所述保留物可以包含RuBisCO和F2蛋白的混合物。在一些这样的实施方案中，所述方法还可以包括使1kDa渗透物穿过具有约500kDa至1kDa的孔径的过滤器以得到包含F2级分蛋白的第二富含蛋白质的材料保留物。
在一些实施方案中，所述方法还可以包括将所述固体的富含蛋白质的材料喷雾干燥、冷冻干燥、或以其它方式脱水。此外，可以在所述方法的任何步骤任选地添加各种组分以去除颜色、气味、味道、生物碱、金属或其组合。这些组分可以例如选自由以下各项组成的组：活性炭、树脂、粘土、螯合剂、分子印迹聚合物、非印迹聚合物、或其组合。
在本公开的另一个方面，提供了一种根据本文所述的方法所获得的富含蛋白质的提取物。在另一个方面，提供了一种包含如本文所述的富含蛋白质的提取物的产品。举例来说，这些产品可以包括但不限于膳食补充剂、食品、饮料、个人护理物品、药物产品、以及宠物食品。
在另一个方面，提供了一种衍生自烟草属种的植物或其部分的富含蛋白质的材料，其中所述材料包含以干重计至少约60％的蛋白质。所述富含蛋白质的材料的组成可以不同并且可以例如包含RuBisCO、F2蛋白或其组合。在某些实施方案中，在所述富含蛋白质的材料中所述蛋白质包含以重量计至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％的RuBisCO。在某些实施方案中，在所述富含蛋白质的材料中所述蛋白质包含以重量计至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％的F2蛋白。
本发明包括但不限于以下实施方案。
实施方案1：一种用于从烟草属种的植物或其部分获得富含蛋白质的材料的方法，所述方法包括：接收烟草属种的植物材料；在一定的时间内以及在一定的条件下使所述植物材料与溶剂接触，所述时间和条件足以将一种或多种蛋白质从所述植物材料中提取到所述溶剂中并且形成液体含有蛋白质的提取物；使固体的所提取的植物材料与所述液体含有蛋白质的提取物分离；使所述液体含有蛋白质的提取物澄清以形成澄清了的含有蛋白质的提取物和固体级分；以及处理所述澄清了的含有蛋白质的提取物以提供包含以干重计至少约60％的蛋白质的富含蛋白质的材料。
实施方案2：任何前述或后续实施方案的方法，其中所述处理步骤包括将所述澄清了的含有蛋白质的提取物的pH值调节到小于约6的pH值以形成酸性提取物；从所述酸性提取物分离沉淀物；以及洗涤所述沉淀物以提供富含蛋白质的材料。
实施方案3：任何前述或后续实施方案的方法，其中将所述澄清了的含有蛋白质的提取物的pH值调节到约4.5至约6的pH值以提供含有RuBisCO的富含蛋白质的材料。
实施方案4：任何前述或后续实施方案的方法，其中还通过以下各项中的一种或两种对在所述分离步骤之后保留的提取物进行处理：1)在具有1kDa-500kDa的孔径的过滤器上过滤并且分离作为保留物的第二富含蛋白质的材料；以及2)将所述提取物调节到小于约4.5的pH值并且从其中分离包含第二富含蛋白质的材料的第二沉淀物，其中所述第二富含蛋白质的材料是含有F2蛋白的富含蛋白质的材料。
实施方案5：任何前述或后续实施方案的方法，其中在具有约1μm至约1kDa的孔径的过滤器上进行所述洗涤。
实施方案6：任何前述或后续实施方案的方法，其中将所述澄清了的含有蛋白质的提取物的pH值调节到约3至约4.5的pH值以提供含有RuBisCO并且含有F2蛋白的富含蛋白质的材料。
实施方案7：任何前述或后续实施方案的方法，其中用于洗涤所述沉淀物的溶剂是酸性溶液。
实施方案8：任何前述或后续实施方案的方法，其中所述富含蛋白质的材料包含以干重计至少约80％的蛋白质。
实施方案9：任何前述或后续实施方案的方法，其中所述处理步骤包括在陶瓷过滤器或超滤膜上过滤所述澄清了的含有蛋白质的提取物以得到保留物和液体渗透物；以及洗涤所述保留物以提供所述富含蛋白质的材料。
实施方案10：任何前述或后续实施方案的方法，其中所述澄清步骤包括调节所述液体含有蛋白质的提取物的pH值。
实施方案11：任何前述或后续实施方案的方法，其中所述过滤步骤包括使所述澄清了的含有蛋白质的提取物穿过具有约1μm至约1kDa的孔径的一个或多个过滤器。
实施方案12：任何前述或后续实施方案的方法，其中所述过滤步骤包括使所述澄清了的含有蛋白质的提取物穿过具有约1μm至约500kDa的孔径的过滤器并且其中所述保留物包含以干重计至少约50％的RuBisCO。
实施方案13：任何前述或后续实施方案的方法，其中所述过滤步骤包括使所述澄清了的含有蛋白质的提取物穿过具有约1kDa至约500kDa的孔径的过滤器并且其中所述保留物包含RuBisCO和F2蛋白的混合物。
实施方案14：任何前述或后续实施方案的方法，所述方法还包括使所述渗透物穿过具有约500kDa至1kDa的孔径的过滤器以得到作为保留物的第二富含蛋白质的材料，其中所述第二富含蛋白质的材料包含F2级分蛋白。
实施方案15：任何前述或后续实施方案的方法，其中所述烟草属种的植物材料呈绿色植物材料、黄化植物材料、烤过的植物材料或其混合物的形式。
实施方案16：任何前述或后续实施方案的方法，所述方法还包括将所述富含蛋白质的材料喷雾干燥、冷冻干燥、或以其它方式脱水。
实施方案17：任何前述或后续实施方案的方法，所述方法还包括在所述方法的任何步骤添加一种或多种组分以去除颜色、气味、味道、生物碱、金属、或其组合。
实施方案18：任何前述或后续实施方案的方法，其中所述一种或多种组分选自由以下各项组成的组：活性炭、树脂、粘土、螯合剂、分子印迹聚合物、非印迹聚合物、或其组合。
实施方案19：一种富含蛋白质的提取物，所述提取物是根据任何前述或后续实施方案的方法而获得的。
实施方案20：一种膳食补充剂、食品、饮料、个人护理物品、药物产品、或宠物食品，其包含根据任何前述或后续实施方案的方法所获得的富含蛋白质的提取物。
通过连同附图一起阅读以下详细说明，本公开的这些和其它特征、方面以及优势将是显而易见的，所述附图简述于下文中。本发明包括上述实施方案中的两个、三个、四个或更多个的任何组合以及本公开中所述的任何两个、三个、四个、或更多个特征或要素的组合，无论这些特征或要素是否在本文的具体实施方案说明中被明确地组合。本公开意图从整体上被解读，因此除非上下文另外明确规定，否则在它的各个方面和实施方案中的任一个中，所公开的本发明的任何可分离的特征或要素应当被视为意图是可组合的。根据下文，本发明的其它方面和优势将变得显而易见。
附图说明
为了提供对本发明的实施方案的理解，对附图进行参考，所述附图不一定是按比例绘制的，并且其中附图标记指代本发明的示例性实施方案的部件。附图仅仅是示例性的，而不应当被视为限制本发明。
图1是用于从烟草材料中得到蛋白质的一个方法实施方案的示意图；
图2是用于从烟草材料中得到蛋白质的一个不同的方法实施方案的示意图；
图3是具有香烟形式的吸烟制品的分解透视图，示出了香烟的可抽吸材料、包装材料部件以及过滤元件；以及
图4是无烟烟草产品实施方案的穿过所述产品的宽度所获取的横截面视图，示出了填充有本发明的无烟烟草组合物的外部烟草袋。
具体实施方式
现在将在下文中更充分地描述本发明。然而，本发明可以许多不同的形式被体现，而不应当被视为限于本文所阐述的实施方案；相反，提供这些实施方案以使得本公开将是透彻和完整的，并且将向本领域技术人员充分传达本发明的范围。除非上下文另外明确规定，否则如在本说明书以及权利要求书中所用的单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述”包括复数指代对象。提到“干重百分比”或“以干重为基础”时，指的是基于干成分(即除水之外的所有成分)的重量。
本公开提供了用于从诸如植物材料(例如烟草)的生物质中离析、分离、或以其它方式提取蛋白质的方法。尽管本公开主要集中在从烟草中提取蛋白质，但是应当指出的是，所述方法可以一般适用于除烟草以外的植物材料。在一些实施方案中，所述方法可以被定制成提取一种或多种特定的蛋白质类型或可以被推广到基于溶解性、化合物类型、化合物化学特性、化合物物理特性等提取蛋白质。一般来说，植物生物质的水溶性部分由两个级分组成。一个级分主要包含RuBisCO，它的亚基分子量是约550kD(通常被称为“级分1蛋白”或“F1蛋白”)。RuBisCO可以占叶的总蛋白含量的高达约25％以及叶的固体物质的高达约10％。第二级分(“级分2蛋白”或“F2蛋白”)一般含有具有在约3kD至约100kD范围内的分子量的蛋白质和肽的混合物并且还可以含有其它化合物，包括糖、维生素、生物碱、风味剂、以及氨基酸。
根据本文所述的方法提取的一种示例性蛋白质是核酮糖-1,5-双磷酸羧化酶/加氧酶(通常被称为RuBisCO)。RuBisCO基本上被认为是世界上最丰富的蛋白质，这是因为它存在于进行光合作用的每一种植物中。RuBisCO对二氧化碳的光合固定的初始步骤来说是必不可少的并且发挥催化核酮糖-1,5-双磷酸的羧化和/或加氧的功能。对于许多应用(例如食品、饲料产品、以及工业产品)，可能期望的是，将某些动物蛋白替换为植物蛋白。此外，在一些应用中，可能期望的是，替换某些其它植物蛋白(例如大豆蛋白和/或遗传修饰的蛋白)。已经发现RuBisCO表现出良好的营养特性并且是无色、无味以及无气味的。此外，RuBisCO的某些物理特性使它对于用于这些产品中是有利的，这是因为它具有优良的粘合、胶凝、溶解、以及乳化性能。
已经提出了不同的方法来从一系列广泛的植物材料中提取RuBisCO。例如参见Wildman等的美国专利号4,268,632；Bourke的美国专利号4,340,676；Johal的美国专利号4,400,471；Johal的美国专利号4,588,691；以及Garger等的美国专利号6,033,895，这些文献以引用的方式并入本文。然而，用于以大(工业)规模提取和纯化RuBisCO的方法尚未被论证。
本公开提供了一种用于从烟草属种的植物或其部分中提取和/或分离某些蛋白质的方法。因此，在一些实施方案中，本文所公开的方法可以提供富含蛋白质的材料，例如包含以干重计至少约50％的蛋白质、以干重计至少约60％的蛋白质、以干重计至少约70％的蛋白质、以干重计至少约80％的蛋白质、或以干重计至少约85％的蛋白质的材料。在一些实施方案中，所述富含蛋白质的材料包含RuBisCO和F2蛋白的混合物。在一些实施方案中，所述富含蛋白质的材料中的蛋白质主要包含RuBisCO。在一些实施方案中，所述富含蛋白质的材料中的蛋白质主要包含F2蛋白。
在一些实施方案中，所述蛋白质包含以干重计至少约60％的RuBisCO、以干重计至少约70％的RuBisCO、或以干重计至少约80％的RuBisCO、以干重计至少约90％的RuBisCO、以干重计至少约95％的RuBisCO、以干重计至少约98％的RuBisCO、或以干重计至少约99％的RuBisCO。应当指出的是，在本文使用术语“富含蛋白质的”的情况下，这在一些实施方案中可以指的是“富含RuBisCO的”，如下文所述。
在一些实施方案中，本公开明确地提供了一种用于从烟草属种的植物或其部分中提取和/或分离RuBisCO的方法。因此，在一些实施方案中，本文所公开的方法可以提供富含RuBisCO的材料，例如包含以干重计至少约50％的RuBisCO、以干重计至少约60％的RuBisCO、以干重计至少约70％的RuBisCO、以干重计至少约80％的RuBisCO、或以干重计至少约85％的RuBisCO的材料。
在某些实施方案中，本公开还提供了一种用于从烟草属种的植物或其部分中提取和/或分离F2蛋白的方法。因此，在一些实施方案中，本文所公开的方法可以提供富含F2蛋白的材料，例如包含以重量计至少约10％的F2蛋白、以重量计至少约20％的F2蛋白、以重量计至少约30％的F2蛋白、以重量计至少约40％的F2蛋白、以重量计至少约50％的F2蛋白、或以重量计至少约60％的F2蛋白的材料。
在一些实施方案中，本公开适用于大规模生产，其中术语大规模生产指的是以大批量生产水平加工大量的生物质(例如烟草)。术语“生物质”和相关术语，如“生物物质”和“植物来源”被理解成指的是所收获的植物中可以被加工以从其中提取、分离、或离析所关注的组分的任何部分。可以对于各种植物或其部分进行所述加工，如植物的种子、花、茎、梗、根、块茎、叶、或任何另外的部分。
根据本公开使用的示例性烟草植物材料可以是烟草属种的植物的某种形式。来自烟草属种的植物的选择可以不同；并且具体来说，一种烟草或多种烟草的类型可以不同。可以使用的烟草包括烟熏烟或弗吉尼亚(Virginia)烟草(例如K326)、白肋烟、晒干烟(例如印度卡努尔(IndianKurnool)烟和香料烟，包括卡泰里尼(Katerini)烟、普瑞利普(Prelip)烟、柯玛蒂尼(Komotini)烟、克撒锡(Xanthi)烟以及扬玻尔(Yambol)烟)、马里兰(Maryland)烟、深色烟、深色明火烤烟、深色晾烟(例如帕桑得(Passanda)烟、古巴诺(Cubano)烟、佳汀(Jatin)烟以及本珠克(Bezuki)烟)、浅色晾烟(例如北威斯康星(NorthWisconsin)烟和戈勒帕(Galpao)烟)、印度晾烟、俄罗斯红(RedRussian)烟和黄花烟(Rustica)，以及各种其它罕见的或专用烟草。有关各种类型的烟草、种植实践以及收获实践的说明阐述于《烟草生产、化学以及技术》(TobaccoProduction,ChemistryandTechnology),Davis等(编著)(1999)中，该文献以引用的方式并入本文。烟草属种可以使用遗传修饰或杂交育种技术来衍生(例如烟草植物可以被遗传工程化或杂交育种以增加或减少某些组分、特征或属性的产生或以其它方式改变某些组分、特征或属性)。有关适用于本发明中的烟草属种的类型的额外信息可以见于Dube等的美国专利申请公开号2012/0192880中，该专利申请公开以引用的方式并入本文。烟草植物可以被种植在温室、生长室、或田间户外或以水培方式种植。
可以针对其中存在的各种化合物的含量来选择烟草属种。举例来说，可以基于以下方面来选择植物：那些植物产生相对高量的需要从其中分离的一种或多种化合物(例如蛋白质)。在某些实施方案中，烟草属种的植物(例如Galpaocommun烟草)是因它们的叶表面化合物的丰度而被专门种植的。
根据本发明使用的烟草属种的植物的一个或多个部分可以不同。举例来说，可以收获几乎全部的植物(例如整个植物)，并且将它原样使用。或者，可以收获或分离植物的各个部分或碎块以供在收获后进一步使用。举例来说，可以分离叶、梗、茎、根、叶片、花、种子以及其各个部分和组合以用于进一步使用或处理。本发明的植物材料因此可以包含烟草属种植物的整个植物或任何部分。参见例如以下文献中所阐述的烟草植物的部分：Coleman,III等的美国专利申请公开号2011/0174323；以及Dube等的美国专利申请公开号2012/0192880，这些文献以引用的方式并入本文。
烟草属种的植物可以未成熟形式或成熟形式被使用，并且可以绿色形式或烤过的形式被使用，如Dube等的2012/0192880中所述，该文献以引用的方式并入本文。
可以对烟草材料进行各种处理工艺，如冷藏、冷冻、干燥(例如冷冻干燥或喷雾干燥)、辐照、黄化、加热、烹饪(例如烘烤、煎炸或煮沸)、发酵、漂白或以其它方式进行储存或处理以备后用。在一些实施方案中，在如本文所述进一步处理之前，可以向所收获的烟草喷洒缓冲液或抗氧化剂(例如偏亚硫酸氢钠缓冲液)以防止绿色植物发生褐变。其它示例性加工技术描述于例如Brinkley等的美国专利申请公开号2009/0025739和Coleman,III等的美国专利申请公开号2011/0174323中，这些专利申请公开以引用的方式并入本文。可以在收获之前或之后用酶和/或益生菌处理烟草属种植物的至少一部分，如2012年4月11日提交的Marshall等的美国专利申请号13/444,272和2012年7月19日提交的Moldoveanu的美国专利申请号13/553,222中所述，这些专利申请以引用的方式并入本文。
可以对烟草属种植物的所收获的一个或多个部分进行物理加工。可以将植物的一个或多个部分分成单个部分或碎块(例如可以从茎上取下根；可以从茎上取下梗；可以从茎和/或梗上取下叶；可以从花的剩余部分上取下花瓣)。尽管可以根据本发明使用烟草植物的任何单个部分或烟草植物的多个部分，但优选地使用烟草茎、烟草叶或烟草茎和叶这两者。还可以将植物的所收获的一个或多个部分细分成部分或碎块(例如，切细、切割、破碎、粉碎、磨碎或研磨成可以被表征为填料型碎块、颗粒、微粒或细粉的碎块或部分)。可以对植物的所收获的一个或多个部分施加外力或压力(例如通过压制或进行辊压处理)。举例来说，在某些实施方案中，可以使用单独的烟草茎或与植物的其它部分的组合(例如茎和叶一起)并且在一些实施方案中，可以进行Dube等的美国专利申请公开号2012/0152265中所述的类型的处理，该专利申请公开以引用的方式并入本文。
当实施这样的加工条件时，植物的所收获的一个或多个部分可以具有如下的水分含量，所述水分含量近似于它的天然水分含量(例如它在收获后即刻的水分含量)、通过对植物的所收获的一个或多个部分添加水分所实现的水分含量、或由干燥植物的所收获的一个或多个部分所产生的水分含量。因而，植物的所收获的一个或多个部分可以被原样用作烟草产品的组分或被进一步加工。
根据本发明，对烟草属种植物的一个或多个部分进行处理而以更有用(例如更浓缩)的形式提供其中所含的一种或多种组分(例如蛋白质)。可以通过本文所提供的方法提取和/或分离来自烟草属植物或其部分的各种化合物或化合物的混合物。如本文所用的“分离的组分”或“植物分离物”是从烟草属种的植物或其部分分离的化合物或化合物的复杂混合物。分离的组分可以是单一化合物、相似化合物的同源混合物(例如化合物的异构体)、或不相似化合物的异源混合物(例如不同类型的各种化合物的复杂混合物)。参见例如以下文献中有关分离的烟草组分和用于分离的技术的说明：Taylor等的美国专利申请公开号2007/0137663；Coleman,III等的美国专利申请公开号2011/0174323；Coleman,III等的美国专利申请公开号2011/0259353；Morton等的美国专利申请公开号2012/0141648；Dube等的美国专利申请公开号2012/0192880；Dube等的美国专利申请公开号2012/0192882；Byrd等的美国专利申请公开号2012/0272976；Byrd,Jr.等的美国专利申请公开号2012/0211016；以及Gerardi等的美国专利申请13/647,670，这些文献以引用的方式并入本文。
可以被实施以根据本发明的一个实施方案从烟草植物或其部分中获得富含RuBisCO的提取物的一组示例性加工步骤的图示呈现于图1中。图1中所示的步骤的具体序列不应当被视为限制本发明。与本文所公开的程序和条件在功能上等同的对本公开的任何改动方案在本发明的范围内。举例来说，典型的分离工艺可以包括一个或多个工艺步骤，如溶剂提取(例如使用极性溶剂、有机溶剂或超临界流体)、色谱(例如制备型液相色谱)、澄清、蒸馏、过滤(例如超滤)、重结晶和/或溶剂-溶剂分配。在一些实施方案中，可以对烟草植物或其部分进行预处理，例如以释放某些化合物以使得所需的化合物可供用于更高效的分离。在一些实施方案中，使用多种方法获得所需的化合物。
在一些实施方案中，图1中所示的工艺可以被视为包括可以被单独地实施以从烟草植物或其部分中获得某些蛋白质的一组工艺100。在某些实施方案中，根据本发明所使用的工艺可以被视为整体的植物组分分离和提取工艺，这是因为单个工艺步骤以不妨碍在同一批中对任何其它植物组分的分离或提取的方式提供了对具体所需的植物组分进行的分离或提取。对于有关可以进行的具体加工类型的示例性细节，参见Morton等的美国专利申请公开号2012/0141648，该美国专利申请公开以引用的方式并入本文。
如图1中所示的实施方案中所示，可以将烟草材料匀浆(110)以提供固体浆料120和液体的含有蛋白质的提取物130。将提取物130澄清(140)以从其去除固体，从而得到固体级分150和澄清了的含有蛋白质的提取物160。对提取物160进行pH值调节(170)并且分离成液体组分180和固体的含有蛋白质的沉淀物190。对沉淀物190进行过滤以得到富含RuBisCO的材料210。任选地，可以处理液体组分180以得到富含F2蛋白的材料。
匀浆步骤110包括对植物材料的任何类型的加工，所述加工有效分解植物材料并且释放其组成部分。具体来说，匀浆可以指有效破坏或分裂植物细胞壁并且释放所述植物细胞内所含的流体和其它物质的任何加工。这样的加工可以包括使用诸如磨床、挤出机、锤磨机、胶体磨、法式压机(Frenchpress)等设备，如Morton等的美国专利申请公开2012/0141648中所更详细地描述，该美国专利申请公开以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，匀浆步骤110可以在提取溶剂存在下进行。在这方面，可以对植物材料进行组合的研磨和提取工艺，该工艺对植物材料施加研磨作用并且同时使所述植物材料与提取溶剂接触。或者，可以进行匀浆步骤，并且随后，可以使经过研磨的材料与提取溶剂接触。因此，可以在研磨之前、期间或之后将植物材料与提取溶剂组合。
可用于从烟草属种中提取组分的示例性技术在Coleman,III等的美国专利申请公开号2011/0259353和Byrd,Jr.等的美国专利申请公开号2012/0211016中被描述或提到，这些专利申请公开以引用的方式并入本文。根据本文所提供的方法从烟草中提取蛋白质的提取溶剂优选地是水(即水性溶剂)。其它示例性提取和分离溶剂或载体包括醇(例如甲醇或乙醇)、烃(例如庚烷和己烷)、乙醚、二氯甲烷、超临界二氧化碳、以及其组合。
在一些实施方案中，所述溶剂可以包括可用于促进从植物材料中对一种或多种特定的组分进行提取的多种化合物中的任何一种或多种。举例来说，在一些实施方案中，所述提取溶剂可以包含选自由以下各项组成的组的一种或多种材料：共溶剂、洗涤剂、表面活性剂、抗氧化剂、氨基酸、缓冲剂、蛋白质提取剂、酶、无机酸、以及其组合。在一些实施方案中，提取溶剂可以包含：甘氨酸、磷酸的一种或多种盐(例如作为缓冲材料)、一种或多种第I族或第II族卤化物盐(包括NaCl，例如作为蛋白质提取剂)、和/或抗氧化剂/还原剂(例如偏亚硫酸氢钠(Na2S2O5)、硫酸氢钠、或抗坏血酸)。
在一些实施方案中，所述提取溶剂可以包含缓冲溶液，所述缓冲溶液特别可用于在匀浆步骤期间将植物液体组分的pH值维持或以其它方式调节到预定的恒定水平。有利地，在提取溶剂中包括一种或多种抗氧化剂和/或缓冲剂(例如偏亚硫酸钠、抗坏血酸和/或甘氨酸)例如以抑制不希望有的氧化。当提取溶剂充当缓冲溶液时，提取溶剂包括一种或多种中和剂，例如像磷酸钠可能是有用的。由于在提取溶剂存在下进行匀浆期间进行紧密混合，因此应当了解的是，液体含有蛋白质的提取物130可以不仅包含来自植物材料的液体组分，而且还包含一定量的提取溶剂。
根据一些实施方案，可以调节提取溶剂的pH值以使由此提供的液体含有蛋白质的提取物中特定植物组分(例如蛋白质)的量达到最大。举例来说，可能有用的是，将pH值维持在碱性范围内或酸性范围内。举例来说，在一些实施方案中，提取溶剂的pH值可以是碱性的，例如在约7-14，例如约8-12，如约9-11的范围内(例如约10.5)。这样的范围对于其中期望使液体含有蛋白质的提取物的蛋白质含量达到最大的实施方案来说可能是特别有用的。
优选地可以将提取溶剂与植物材料以特定的比率组合以实现对所需组分的提取。在一些实施方案中，可以每1kg生物质约0.1L至约5L提取溶剂的比率将提取溶剂和植物材料组合。在其它实施方案中，所述比率可以是每1kg生物质约0.1L至约4L、约0.1L至约3L、约0.1L至约2L、约0.1L至约1L、约0.2L至约0.8L、约0.3L至约0.7L、或约0.4L至约0.6L的提取溶剂。在另外的实施方案中，所述工艺可以每1kg生物质使用至少约0.1L、至少约0.2L、至少约0.3L、或至少约0.4L的提取溶剂。在一个实施方案中，所述工艺可以包括每1kg生物质组合约0.5L的提取溶剂。
提取工艺的条件可以不同。在一些实施方案中，将烟草属种的植物与溶剂组合以形成材料(例如呈悬浮液或浆液的形式)。在某些实施方案中，被添加以形成潮湿材料的溶剂的量可以是以所述材料的总重量计至少约50重量％、或至少约60重量％、或至少约70重量％。在一些情况下，溶剂的量可以被描述为至少约80重量％或至少约90重量％。
有利地，在不存在加热的情况下进行提取。然而，在一些实施方案中，可以在匀浆步骤110中在各种温度和压力下对烟草材料进行加热。在某些实施方案中，将所述材料加热到高温(例如高于室温)以实现对微粒材料中的化合物的提取。举例来说，可以将潮湿材料加热到大于约50℃、大于约60℃、大于约70℃、大于约80℃、大于约90℃、大于约100℃、大于约125℃、大于约150℃、大于约175℃、或大于约200℃。在某些实施方案中，对压力和温度进行调节以使得潮湿材料的温度与水(或其它溶剂)在大气压下的沸点相比升高。本领域技术人员将知晓的是，液体的沸点与它的压力有关，并且因此将能够相应地调节压力和温度以使所述材料沸腾。
可以在压力受控和加压的环境中进行加热，尽管可以使用通风罐中的大气压而不脱离本发明。优选的压力容器配备有外部加热源，并且还可以配备有用于搅拌的装置，如叶轮。在其它实施方案中，使用被放置在微波炉、对流烘箱中或由红外线加热所加热的封闭容器进行热处理工艺。提供压力受控的环境的容器的实例阐述于Dube等的美国专利申请公开号2012/0192880中，该专利申请公开以引用的方式并入本文。在加热工艺期间由反应混合物所经受的典型压力常常在约10psig至约1,000psig的范围内，通常在约20psig至约500psig的范围内。
可以在大气空气、或环境大气中或在受控气氛，如一般惰性气氛内进行加热。可以使用诸如氮气、氩气以及二氧化碳等气体。或者，在某些实施方案中，烃气(例如甲烷、乙烷或丁烷)或氟碳气也可以提供受控气氛的至少一部分，这取决于处理条件的选择和所需的反应产物。
实现提取所需的时间量部分地取决于进行提取时的温度和压力。举例来说，在一些实施方案中，将材料加热到高温和/或将材料加压提高了提取速率。提取工艺的时间范围通常是至少约30分钟(例如至少约1小时或至少约2小时)并且通常少于约24小时(例如少于约12小时或少于约8小时)，尽管可以使用其它时间段而不脱离本发明。在一些实施方案中，可以进行多次提取以从其中提取另外的化合物。参见例如Havkin-Frenkel的美国专利申请公开号2008/0254149，该美国专利申请公开以引用的方式并入本文。
在将烟草材料匀浆之后，可以将所得的材料分离成固体浆料120和液体含有蛋白质的提取物130(即根据本公开从加工过的植物材料中提取的液体)。可以通过任何手段，例如粗滤或用于从匀浆混合物中抽出液体组分的其它方法来进行分离。固体浆料120一般主要含有植物纤维(或纤维素)和果胶并且在一些实施方案中可以被单独加工，如Morton等的美国专利申请公开2012/0141648中所提供，该美国专利申请公开以引用的方式并入本文。
在各种实施方案中，液体含有蛋白质的提取物130可以呈绿色或棕色浆汁的形式；然而，应当了解的是，术语“液体含有蛋白质的提取物”可以指的是从植物材料或生物物质中提取的任何液体，而与提取液体的颜色无关。在一些实施方案中，提取物130可以包含包括但不限于蛋白质、肽、糖和/或生物碱的组分。液体含有蛋白质的提取物通常包含被夹带在液体中的一定水平的固体(不溶性)材料。所述提取物可以被表征为是浆液、悬浮液或溶液，这取决于具体实施方案，这可以基于所使用的植物材料的类型、所使用的具体提取溶剂、以及需要分离的组分来决定。
在匀浆并且与固体浆料120分离之后，可以加工含有蛋白质的提取物130以使浆汁澄清，如图1的步骤140所示。澄清一般使得植物材料中不溶于含有蛋白质的提取物的提取溶剂中的部分中的一些或全部被去除。在一些实施方案中，澄清可以使得提取物130的另外的高分子量组分被去除。澄清步骤提供固体级分150和澄清了的含有蛋白质的提取物160。澄清在实现某些所需的植物组分(例如蛋白质)在可溶性级分中的所需浓度中可以是一个重要的步骤。参见例如Dube等的美国专利申请公开号2012/0152265中所述的澄清技术，该美国专利申请公开以引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，澄清包括多个步骤，包括但不限于一个或多个化学处理步骤、一个或多个加热步骤、一个或多个过滤步骤、一个或多个其它类型的分离步骤(例如离心和/或沉降)、或其一定的组合。在澄清包括多个步骤的情况下，应当了解的是，可以按任何顺序进行这多个步骤。
在一些实施方案中，澄清步骤140可以包括将各种材料(即澄清剂)添加到所提取的液体中。举例来说，可以被添加到原始的所提取液体中的具体澄清剂包括但不限于各种盐、石灰、硫、以及其它化合物以使液体稳定或澄清。在某些实施方案中，可以例如经由添加适量的酸或碱来调节提取物的pH值。可用于这个目的的示例性酸性材料或碱性材料包括但不限于柠檬酸、盐酸、磷酸和/或氢氧化钠。在一些实施方案中，调节提取物的pH值可以使液体稳定或澄清。在一些实施方案中，调节提取物的pH值可以促进特定组分(合乎需要的或不希望有的)从其中沉淀，这些组分随后可以被取出。在某些实施方案中，调节pH值以使得提取物是微酸性的(例如具有约5至约7的pH值)。在其它实施方案中，调节pH值以使得提取物是碱性的(例如具有约7至约12的pH值)。
在一些实施方案中，所添加的澄清剂可以充当絮凝剂，所述絮凝剂可以促进一种或多种杂质的去除。举例来说，絮凝剂和/或助滤剂可以去除悬浮颗粒和/或溶解的分子或离子。一些常见的示例性助滤剂包括纤维素纤维、珍珠岩、膨润土、硅藻土、以及其它含硅材料。随后可以通过任何手段(例如过滤、沉降、离心等)从液体中去除絮凝剂和/或助滤剂。在某些实施方案中，将活性炭添加到提取物中以从其中去除颜色、气味和/或味道。作为活性炭的替代物或除了活性炭之外，可以使用各种其它类型的材料来去除颜色、气味和/或味道并且它们意图被涵盖在本文所述的方法内。
有利地，在没有使含有蛋白质的提取物的温度升高到高于环境温度的情况下(即在没有加热的情况下)进行根据本公开的澄清。然而，在某些实施方案中，澄清步骤140可以包括加热提取物。在一些实施方案中，可以加热液体来引发用于澄清的所需反应和/或以使提取物的某些组分溶解或不溶解。加热提取物所用的温度和时间可以不同。在一些实施方案中，将提取物130加热到沸腾，这可以引起额外固体的形成，所述固体随后可以通过本文所述的方法中的任一种被去除。在一些实施方案中，可能期望的是，加热提取物以去除一些溶剂(即以浓缩提取物)。举例来说，在一个实施方案中，可以在通风容器中加热所提取的液体以蒸发一部分的水。加热液体时的温度和压力可以不同。参见例如Dube等的美国专利公开号2012/0152265中所述的溶剂去除技术，该美国专利公开以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，澄清步骤140包括将含有蛋白质的提取物130引入到分离设备中，如滗析器或离心机(例如滗析离心机)。在一些实施方案中，澄清步骤140包括使提取物穿过压滤机。因此可以对所述提取物进行加工以将所述提取物分离成可溶性液体级分(渗透物)(即澄清了的含有蛋白质的提取物160)和固体级分150。代表性的离心系统描述于例如Berit等的美国专利号6,817,970、Kohlstette等的美国专利号5,899,845、Zettier等的美国专利号5,267,937、Schulz等的美国专利号4,966,576、以及Droste等的美国专利号5,865,719中，这些专利中的每一篇以引用的方式整体并入本文。用于离心的合适条件可以是基于例如时间间隔、进料速率、用于排出固体粒料的停留时间、操作速度、以及重力。代表性的压滤机描述于例如Anderson的美国专利号2,843,267；Davis的美国专利号3,204,769；Kohonen的美国专利号4,354,934；Noda等的美国专利号4,512,889；Lintunen的美国专利号4,544,448；以及Pierson的美国专利号5,482,623中，这些专利以引用的方式并入本文。
在图1中所示的实施方案中，在澄清之后，调节澄清了的含有蛋白质的提取物160的pH值(图1的步骤170)。可以通过添加适量的酸性材料或碱性材料，如柠檬酸、盐酸、磷酸或氢氧化钠来调节液体浓缩物的pH值。在某些实施方案中，调节提取物160的pH值以确保所述提取物是酸性的(即具有低于7的pH值)或碱性的(即具有高于7的pH值)。在一些实施方案中，优选地将所述提取物酸化以得到具有在约4至约7，例如约4.5至约6.5、或约5至约6范围内的pH值，例如具有约5的pH值的提取物。在某些实施方案中，将pH值调节到约6产生了澄清了的提取物。在某些实施方案中，将pH值调节到约5引起了RuBisCO沉淀，可以分离(例如通过过滤或滗析其余液体)并且随后洗涤所述RuBisCO。在某些实施方案中，有利的是，将pH值维持在高于约4或高于约4.5，这是因为除了RuBisCO之外，低于这些值的pH值还可能引起另外的固体沉淀(例如其它蛋白质、糖和/或淀粉等)。
然而，在其它实施方案中，可能期望使另外的蛋白质(例如F2级分蛋白)沉淀。在这样的实施方案中，将pH值调节到例如低于约4.5(例如约3至约4.5，例如约4)。由于pH值调节步骤170一般会引起澄清了的提取物的一种或多种组分沉淀，因此可能有利的是，将经过pH值调节的提取物维持足够的时间和温度，所述时间和温度足以使得固体充分沉淀和/或沉降。
在使固体沉淀和/或沉降之后，分离液体组分和固体组分以得到液体组分180和固体含有蛋白质的沉淀物190。可以各种方式，例如通过滗析液体和/或过滤混合物来实现固体组分和液体组分的分离。在某些实施方案中，沉淀物190的颜色是白色。在一些实施方案中，在与液体组分180分离后，例如使用柠檬酸溶液洗涤沉淀物190。柠檬酸溶液的浓度可以不同，并且在某些实施方案中是例如约5mM。除了柠檬酸之外或作为柠檬酸的替代物，可以使用各种溶液，并且有利地，这样的溶液仅包含食品级组分。可以用于这一洗涤步骤的其它示例性溶液包括但不限于抗坏血酸和/或乙酸。
沉淀物190一般包含RuBisCO以及各种另外的组分。应当指出的是，沉淀物190的内含物可以部分地取决于在前一步骤中所使用的pH值。举例来说，在pH值是约4.5至约6的情况下，沉淀物190可以包含更多的RuBisCO，而在pH值低于约4.5的情况下，沉淀物190可以另外包括显著量的例如F2蛋白。
可以对沉淀物190进行一个或多个过滤步骤200以将RuBisCO与任何其余组分(例如其它蛋白质、脂肪以及脂质)分离。过滤的工艺可以包括溶解沉淀物190(例如在柠檬酸水溶液中)，使液体穿过一个或多个过滤网和/或滤膜以取出所选尺寸的微粒物质(从而得到保留在过滤材料上或过滤材料中的保留物和穿过过滤材料的渗透物)和/或所述液体中具有高于一定阈值的分子量的组分。由于RuBisCO一般是沉淀物190中最大的组分，因此有利地使用过滤器或滤膜，所述过滤器或滤膜可以保留RuBisCO，而允许其余组分穿过。在某些实施方案中，可以使用陶瓷过滤器来分离RuBisCO。
在一些实施方案中，利用微滤，其中使溶解的沉淀物190与半透膜接触。所述膜可以是任何类型的，如板框式(具有膜和支撑板的堆叠)、螺旋缠绕式(具有围绕管卷起的膜和支撑材料的连续层)、管式(具有进料流过的膜界定的核心和其中收集渗透物的外部管状外壳)、或中空纤维(具有若干个小直径管或纤维，其中渗透物被收集在围绕所述纤维的筒区中)。所述膜可以由任何材料构建。举例来说，通常使用聚砜、聚醚砜、聚丙烯、聚偏氟乙烯以及乙酸纤维素膜，尽管可以使用其它材料而不脱离本文所述的本发明。参见例如如Dube等的美国专利申请公开号2012/0152265中所阐述的超滤技术(其同样可以应用于微滤)，该美国专利申请公开以引用的方式并入本文。
微滤膜是可以广泛的孔径获得的(通常在约0.05微米或0.1微米至约10微米的范围内)。实际上，具有高于孔径的分子量的化合物被保留在保留物中，并且具有低于孔径的分子量的化合物穿过过滤器进入渗透物中。微滤方法通常不能够取出低分子量有机化合物和离子。
微滤通常是交叉流分离工艺。待处理的液流(进料)沿着膜表面切向流动，从而分成穿过膜的一个物流(渗透物)和没有穿过膜的另一个物流(保留物或浓缩物)。可以改变微滤系统的操作参数以实现所需的结果。举例来说，可以经由施加的压力使待过滤的进料混合物与膜接触。穿过膜的渗透速率与施加的压力成正比；然而，最大压力可能是有限的。可以调节混合物穿过膜表面的流动速度。还可以改变温度。通常，渗透速率随温度升高而增加。
市售的微滤系统是容易获得的并且可以用于本发明的微滤方法。举例来说，商业供应商，如密理博公司(Millipore)、实验室公司(Labs)、应用膜公司(AppliedMembranesInc.)、颇尔公司(PallCorporation)、公司以及Porex公司(PorexCorporation)制造各种滤膜和滤筒和/或过滤系统(例如切向流过滤系统)。示例性膜包括但不限于微滤系统和Forty-XTM盘式过滤器(来自西门子公司(Siemens))；MFK系列、WinefilterTM系列、以及Super-CorTMMF系列膜(来自科氏膜系统公司(KochMembraneSystems))；Durapore膜和XL盒(来自密理博公司)； 和中空纤维模块(来自实验室公司)；Cyclopore膜(来自公司)；膜(格拉弗科技公司(GraverTechnologies))；以及微滤膜(来自东丽工业株式会社(TorayIndustries,Inc.))。在某些实施方案中，所述膜是陶瓷膜，包括但不限于膜(来自颇尔公司)、MF膜(来自CleaNSep系统公司(CleaNSepSystems))、陶瓷膜(来自Sterlitech公司(SterlitechCorporation))、InsideCeRAMTM膜、FiltaniumTM膜、和IsofluxTM膜(来自塔米工业公司(TamiIndustries))、以及陶瓷膜(来自威立雅水务公司(VeoliaWater))。可商购获得的过滤系统包括但不限于密理博公司的LabscaleTM切向流过滤(TFF)系统以及实验室公司的和切向流过滤系统。
在某些实施方案中，可以使用多级过滤工艺。这样的实施方案使用具有不同的(通常递减的)截留分子量的多个过滤器和/或膜。根据本发明，可以连续使用多个过滤器和/或膜。适用于其中期望过滤的本发明的各种实施方案中的另外的过滤装置包括Clapp等的美国专利号4,941,484中所公开的那些，该美国专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。在一些情况下，这个实施方案中的微滤步骤可以被替换为本文所述的一个或多个超滤步骤或与本文所述的一个或多个超滤步骤组合。
过滤器或一系列过滤器(例如单一1.4μm陶瓷过滤器)有利地保留了固体富含RuBisCO的材料210作为保留物并且优选地允许沉淀物190的大部分另外的组分穿过过滤器进入渗透物中。然后洗涤(例如使用5mM柠檬酸)保留物以产生富含RuBisCO的材料210。如上文所指出，除了柠檬酸之外或作为柠檬酸的替代物，可以使用各种溶液(例如包含食品级组分，如乙酸和/或抗坏血酸的溶液)。在一些实施方案中，根据图1的方法所提供的富含RuBisCO的提取物包含以干重计至少约60％的RuBisCO、以干重计至少约70％的RuBisCO、以干重计至少约80％的RuBisCO、以干重计至少约90％的RuBisCO、以干重计至少约95％的RuBisCO、以干重计至少约98％的RuBisCO、或以干重计至少约99％的RuBisCO。富含RuBisCO的提取物可以各种形式被提供，所述形式包括例如半固体形式或固体形式。在一些实施方案中，可以将提取物脱水以产生真正的固体形式。有利地，图1的方法在工业规模上是适用的。虽然先前已经报道了从各种植物中分离RuBisCO的各种工艺，但是这些工艺中无一者已经被证实在这样的大规模上是适用的。有利地，本文所述的工艺主要依靠使用陶瓷过滤来提供所需产物，这是一种容易按比例缩放的方法。相比之下，传统方法通常利用一个或多个离心步骤，这些步骤难以转换成工业规模。
如图1中所示，可以任选地处理液体组分180以产生富含F2蛋白的材料。如所指出，在一些实施方案中，通过适当的pH值选择，含有蛋白质的沉淀物190可以主要包含RuBisCO。在这样的实施方案中，在所述液体组分中通常含有显著量的F2级分。可以例如通过过滤(例如穿过如下的过滤器或膜，在所述过滤器或膜上一般保留F2蛋白，而允许某些其余组分穿过)或通过沉淀(例如通过将液体组分180的pH值调节到足以使F2蛋白沉淀的pH值，如低于约4.5，优选地约3至约4.5)来处理该液体组分。
如图2中所示的实施方案中所示的用于产生富含RuBisCO和F2蛋白的材料、富含RuBisCO的材料和/或富含F2蛋白的材料的替代工艺220包括以下步骤。可以将烟草材料匀浆(110)以提供固体浆料120和液体含有蛋白质的提取物130。将提取物130澄清(140)以从其去除固体，从而得到固体级分150和澄清了的含有蛋白质的提取物160。将提取物160过滤(230)和洗涤以得到固体富含RuBisCO的材料240和渗透物250。在某些实施方案中，所述渗透物可以包含F2蛋白并且可以任选地加工所述渗透物以得到富含F2蛋白的材料260。
可以如上文对于图1的方法所述来实施图2的步骤和材料(即步骤110至提取物160)。根据图2中所示的方法，优选的是，澄清步骤140包括pH值调节步骤以提供酸性的或碱性的澄清了的含有蛋白质的提取物。
在图2的方法中，对澄清了的(酸性的或碱性的)含有蛋白质的提取物160进行过滤(230)。
过滤的工艺可以包括使液体穿过一个或多个陶瓷过滤器或半透膜以取出所选尺寸的微粒物质(从而得到保留在过滤材料上或过滤材料中的保留物和穿过过滤材料的渗透物)和/或所述提取物中具有高于一定阈值的分子量的组分。所述膜可以是任何类型的，如板框式(具有膜和支撑板的堆叠)、螺旋缠绕式(具有围绕管卷起的膜和支撑材料的连续层)、管式(具有进料流过的膜界定的核心和其中收集渗透物的外部管状外壳)、或中空纤维(具有若干个小直径管或纤维，其中渗透物被收集在围绕所述纤维的筒区中)。所述膜可以由任何材料构建。举例来说，通常使用聚砜、聚醚砜、聚丙烯、聚偏氟乙烯以及乙酸纤维素膜，尽管可以使用其它材料而不脱离本文所述的本发明。参见例如Dube等的美国专利申请公开号2012/0152265中所述的超滤技术，该美国专利申请公开以引用的方式并入本文。
超滤膜是可以广泛的孔径获得的(通常在约0.1微米至约0.001微米的范围内)。膜更通常由它们的截留分子量来描述。超滤膜通常被分类为具有约103Da至约105Da的截留数均分子量的膜。实际上，具有高于截留分子量的分子量的化合物被保留在保留物中，并且具有低于截留分子量的分子量的化合物穿过过滤器进入渗透物中。超滤方法通常不能够取出低分子量有机化合物和离子。
超滤通常是交叉流分离工艺。待处理的液流(进料)沿着膜表面切向流动，从而分成穿过膜的一个物流(渗透物)和没有穿过膜的另一个物流(保留物或浓缩物)。可以改变超滤系统的操作参数以实现所需的结果。举例来说，可以经由施加的压力使待过滤的进料混合物与膜接触。穿过膜的渗透速率与施加的压力成正比；然而，最大压力可能是有限的。可以调节混合物穿过膜表面的流动速度。还可以改变温度。通常，渗透速率随温度升高而增加。
市售的超滤系统是容易获得的并且可以用于本发明的超滤方法。举例来说，商业供应商，如密理博公司、实验室公司、颇尔公司、公司、Porex公司、以及施耐德过滤公司(SnyderFiltration)制造各种滤膜和滤筒和/或过滤系统(例如切向流过滤系统)。示例性膜包括但不限于和膜以及XL盒(来自密理博公司)；和中空纤维模块(来自实验室公司)；以及Microza过滤器和CentramateTM、CentrasetteTM、MaximateTM以及MaxisetteTM切向流滤膜盒。可商购获得的过滤系统包括但不限于密理博公司的LabscaleTM切向流过滤(TFF)系统以及实验室公司的和切向流过滤系统。
根据本发明可能有用的过滤器和/或膜包括具有以下截留分子量的那些：小于约500,000Da、小于约250,000Da、小于约100,000Da、小于约75,000Da、小于约50,000Da、小于约25,000Da、小于约20,000Da、小于约15,000Da、小于约10,000Da、小于约5,000Da、以及约1,000Da。在某些实施方案中，使用多级过滤工艺。这样的实施方案使用具有不同的(通常递减的)截留分子量的多个过滤器和/或膜。根据本发明，可以连续使用多个过滤器和/或膜。举例来说，可以使用500,000Da截留分子量过滤器来进行第一次过滤并且可以使用1,000Da截留分子量过滤器进行第二次过滤，尽管可以使用具有各种其它截留分子量和/或孔径的过滤器。适用于其中期望过滤的本发明的各种实施方案中的另外的过滤装置包括Clapp等的美国专利号4,941,484中所公开的那些，该美国专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。
在过滤后，蛋白质有利地被保留在滤膜(或过滤器)上。有利地洗涤所述保留物(例如使用甘氨酸缓冲液或组氨酸、柠檬酸钠、磷酸钾或磷酸钠溶液)并且可以将所述保留物干燥(例如喷雾干燥或冷冻)以提供富含蛋白质的材料240。在一些实施方案中，富含蛋白质的材料240可以是富含RuBisCO的材料或一般富含蛋白质的材料(包含RuBisCO和F2级分蛋白这两者)。特定的膜截留分子量可以有助于控制根据图2的方法220所提供的富含蛋白质的产物240的组成。
举例来说，在某些实施方案中，过滤步骤230利用500kDa超滤膜，所述超滤膜可以引起F1蛋白(RuBisCO)与F2蛋白的分离。RuBisCO一般不穿过500kDa超滤膜，而F2蛋白却会穿过；因此，500kDa膜上的保留物应当基本上由RuBisCO蛋白质组成，在所述保留物中存在很少的F2蛋白到不存在F2蛋白。在这样的实施方案中，F2蛋白应当存在于渗透物250中，可以任选地将所述渗透物250进一步纯化(例如经由去除糖、脂肪以及脂质)以得到富含F2蛋白的材料260。在一些实施方案中，这种进一步的加工可以由进一步超滤步骤(例如使渗透物250穿过1kDa膜、10kDa膜或20kDa膜)以及干燥所得的保留物(例如通过喷雾干燥或冷冻)组成。在一些实施方案中，可能不需要干燥保留物，这是因为在某些实施方案中，它可以液体或半固体形式使用。
在某些实施方案中，超滤步骤230利用1kDa膜，所述膜一般将RuBisCO和F2蛋白一起维持在保留物中，从而允许提取物的其它组分(例如糖、脂肪以及脂质)穿过。在这样的实施方案中，所得的固体保留物(富含蛋白质的材料240)将包含RuBisCO和F2蛋白的混合物。在由此提供的样品中RuBisCO与F2蛋白的比率可以不同。当然，应当了解的是，如果需要分别提供富含RuBisCO的材料和富含F2蛋白的材料的话，可以任选地如本文所提供对这种混合物进行进一步分离。在某些实施方案中，将富含蛋白质的材料240溶解在合适的溶剂中并且使它穿过500kDa超滤膜可以引起F1蛋白(RuBisCO)与F2蛋白的分离，这是因为RuBisCO将被保留在膜上并且可以被洗涤以得到富含RuBisCO的材料270。可以任选地将渗透物浓缩和干燥以得到富含F2蛋白的材料260。
在一些实施方案中，本文所公开的方法可以提供富含蛋白质的材料，例如包含以干重计至少约50％的蛋白质、以干重计至少约60％的蛋白质、以干重计至少约70％的蛋白质、以干重计至少约80％的蛋白质、以干重计至少约90％的蛋白质、以干重计至少约95％的蛋白质、以干重计至少约98％的蛋白质、或以干重计至少约99％的蛋白质的材料。在一些实施方案中，所述富含蛋白质的材料中的蛋白质包含以干重计至少约60％的RuBisCO、以干重计至少约70％的RuBisCO、以干重计至少约80％的RuBisCO、以干重计至少约90％的RuBisCO、以干重计至少约95％的RuBisCO、以干重计至少约98％的RuBisCO、或以干重计至少约99％的RuBisCO。
在一些实施方案中，本公开明确地提供了用于从烟草属种的植物或其部分中提取和/或分离RuBisCO的方法。因此，在一些实施方案中，本文所公开的方法可以提供富含RuBisCO的材料，例如包含以干重计至少约50％的RuBisCO、以干重计至少约60％的RuBisCO、以干重计至少约70％的RuBisCO、以干重计至少约80％的RuBisCO、以干重计至少约90％的RuBisCO、以干重计至少约95％的RuBisCO、以干重计至少约98％的RuBisCO、或以干重计至少约99％的RuBisCO的材料。在一些实施方案中，本公开还提供了用于从烟草属种的植物或其部分中提取和/或分离F2蛋白的方法。因此，在一些实施方案中，本文所公开的方法可以提供富含F2蛋白的材料，例如包含以干重计至少约10％的F2蛋白、以干重计至少约20％的F2蛋白、以干重计至少约30％的蛋白、以干重计至少约50％的F2蛋白、以干重计至少约60％的F2蛋白、以干重计至少约70％的F2蛋白、以干重计至少约80％的F2蛋白、以干重计至少约90％的F2蛋白、以干重计至少约95％的F2蛋白、以干重计至少约98％的F2蛋白、或以干重计至少约99％的F2蛋白的材料。
尽管在一些实施方案中，本文所述的富含蛋白质的材料可以被直接使用，但是可能期望的是，对所述材料进行热处理以例如将所述材料巴氏灭菌或以其它方式使所述材料发生化学改变。这一热处理可以在本文所述的工艺中的任一种之前或之后(例如在图1的工艺100中的步骤和/或图2的工艺220中的步骤中的任一个之前或之后)进行以从烟草属种的植物中分离一种或多种组分。举例来说，可以通过以下步骤对烟草材料进行热加工：将烟草材料、水、以及选自由以下各项组成的组的添加剂混合以形成潮湿的烟草混合物：赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、二价阳离子和三价阳离子、天冬酰胺酶、糖、酚类化合物、还原剂、具有游离硫醇基的化合物、氧化剂(例如过氧化氢)、氧化催化剂、植物提取物以及其组合；以及将潮湿的烟草混合物在至少约60℃的温度下加热以形成经过热处理的烟草混合物。在一个实施方案中，在水、NaOH以及添加剂(例如赖氨酸)存在下在约88℃下将经过处理的烟草提取物热处理约60分钟。这样的热处理可以有助于防止由天冬酰胺与还原糖在烟草材料中的反应所引起的丙烯酰胺的产生并且可以提供一定程度的巴氏灭菌。参见例如Chen等的美国专利公开号2010/0300463，该美国专利公开以引用的方式并入本文。在其中在本发明的无烟烟草产品中使用经过热处理的烟草衍生材料的某些实施方案中，所述产品的特征可以在于非常低的丙烯酰胺含量。举例来说，在一些实施方案中，所述无烟烟草产品的特征在于少于约500ppb(ng/g)、少于约400ppb、少于约300ppb、少于约200ppb、或少于约100ppb的丙烯酰胺含量。
在一些实施方案中，除了任选的热处理之外或作为任选的热处理的替代方案，可以对烟草材料进行辐照(例如以确保没有微生物与经过处理的富含蛋白质的材料缔合)。
在本文所公开的用于从烟草属种的植物中分离一种或多种组分的方法中的一种或多种之后，如果需要的话，可以对由此所获得的任何液体材料进行进一步加工。举例来说，可以对烟草材料进行进一步处理步骤，作为本文所述的其它分离步骤的替代物或除本文所述的其它分离步骤之外，可以使用这些步骤。在一些实施方案中，使提取物(例如液体含有蛋白质的提取物130、澄清了的含有蛋白质的提取物160、或渗透物250)与印迹聚合物或非印迹聚合物接触，如例如以下文献中所述：Bhattacharyya等的美国专利公开号2007/0186940；Rees等的美国专利公开号2011/0041859；和Jonsson等的美国专利公开号2011/0159160；以及2011年5月19日提交的Byrd等的美国专利申请号13/111,330，所有这些文献以引用的方式并入本文。可以使用分子印迹聚合物或非印迹聚合物进行处理来去除提取物的某些组分，如烟草特异性亚硝胺(TSNA)，包括N'-亚硝基降烟碱(NNN)、(4-甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N'-亚硝基新烟草碱(NAT)、以及N'-亚硝基假木贼碱(NAB)；聚芳族烃(PAH)，包括苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽、以及茚并[1,2,3-cd]芘；或其它霍夫曼分析物(Hoffmannanalyte)。在一些实施方案中，可以使用分子印迹聚合物或非印迹聚合物从提取物中去除尼古丁。
在一些实施方案中，可以使本文所述的材料(例如提取物或固体)中的一种或多种经受条件以引起这些材料中所含的化合物进行化学转化。举例来说，可以将从烟草属种的植物或其部分中获得的烟草材料进行处理以引起化学转化或与其它成分混合。在一些实施方案中，可以将从其中获得的烟草衍生提取物(包括液体级分和固体级分)进行处理以引起化学转化或与其它成分混合。烟草材料或其提取物的化学转化或改性可以引起烟草材料或提取物的某些化学特性和物理特性(例如其感官属性)发生变化。示例性化学改性工艺可以通过酸/碱反应、水解、氧化、加热和/或酶处理来实施；并且因而，化合物可以进行各种降解反应。示例性化学转化技术阐述于Coleman,III等的美国专利申请公开号2011/0174323和Coleman,III等的美国专利申请公开号2011/0259353中，这些美国专利申请公开以引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，处理烟草材料或其提取物(包括液体级分和/或固体级分)以提供降解产物。降解产物是由根据本发明提取和/或分离的化合物产生的任何化合物。降解产物可以由这些化合物天然形成或可以通过加速降解过程产生(例如通过添加热和/或化学品来加速化合物的分解)。这些化合物可以例如借助于氧化(例如经由使用H2O2或其它氧化剂处理)和/或水解反应来降解。
根据本公开的方法所获得的富含蛋白质的材料(即富含RuBisCO的材料、组合的富含RuBisCO/F2蛋白的材料、和/或富含F2蛋白的材料)的形式可以不同。通常，这些材料呈固体、液体或半固体或凝胶的形式。所得的制剂可以具体形式、绝对形式或纯形式被使用。本文所述的烟草衍生材料的固体形式可以包括喷雾干燥的形式和冷冻干燥的形式。本文所述的烟草衍生材料的液体形式可以包括水性或有机溶剂载体内所含的制剂。
富含蛋白质的材料(即富含RuBisCO的材料、组合的富含RuBisCO蛋白质/富含F2蛋白的材料、和/或富含F2蛋白的材料)可用作各种组合物的材料。举例来说，在一些实施方案中，本文所述的烟草衍生材料被并入烟草组合物内，特别是被并入吸烟制品或无烟烟草产品中的烟草组合物中。根据本发明，烟草产品包括与根据本发明的烟草衍生材料(即富含RuBisCO的材料、组合的富含RuBisCO/F2蛋白的材料、和/或富含F2蛋白的材料)中的一种或多种组合的烟草。即，所述烟草产品的一部分可以包含一定形式的根据本公开所制备的富含蛋白质的烟草材料制剂。
向烟草组合物中添加本文所述的一种或多种烟草衍生材料可以多种方式增强烟草组合物，这取决于烟草衍生材料的性质和烟草组合物的类型。示例性的富含蛋白质的提取物、固体级分以及其组合可以用来为烟草产品提供风味和/或香气(例如所述组合物可以改变烟草组合物或由其衍生的烟气的感官特征)。其它富含蛋白质的提取物、固体级分以及其组合可以在烟草组合物内实现功能性目的，如粘结剂或填料功能。某些富含蛋白质的提取物、固体级分以及其组合可以用作烟草产品的一种或多种传统组分的替代物。
添加了本公开的烟草衍生材料的烟草产品可以不同，并且可以包括被配置成或被适配成向所述产品的使用者递送烟草或其某种组分的任何产品。示例性烟草产品包括吸烟制品(例如香烟)、无烟烟草产品、以及含有尼古丁和/或在使用期间不燃烧的烟草材料或其它植物材料的产生气溶胶的器件。将本发明的富含蛋白质的烟草衍生材料并入烟草产品中可以包括使用烟草材料或非烟草植物材料作为制剂的载体，诸如通过使烟草衍生的富含蛋白质的材料(即富含RuBisCO的材料、组合的富含RuBisCO/F2蛋白的材料和/或富含F2蛋白的材料)吸收到烟草或其它植物材料中或以其它方式使烟草衍生的富含蛋白质的材料与载体材料缔合来实现。可以用作本发明的制剂的载体的烟草类型可以不同，并且可以包括本文所论述的烟草类型中的任一种，包括各种烤烟材料(例如烟熏烟或晾烟)或其部分(例如烟草叶片或烟草梗)。添加了所述制剂的烟草材料的物理构造也可以不同，并且可以包括呈切细或微粒形式、或呈薄片(例如复原烟草薄片)形式或呈全叶形式的烟草材料。
因此，在一些实施方案中，本文所提供的富含蛋白质的烟草衍生材料可以用作制造吸烟制品的组合物。举例来说，可以将根据本发明所制备的制剂与壳体材料混合以及作为壳体成分或作为敷料应用于烟草。再此外，本发明的制剂可以在香烟制造过程期间被并入香烟过滤嘴中(例如滤棒、滤棒成型纸、或接装纸中)或被并入香烟包装纸中，优选地在内表面上。参见例如Dube等的美国专利公开号2012/0192880中所阐述的与吸烟制品中所用的烟草隔离件相关的说明和参考文献，该美国专利公开以引用的方式并入本文。代表性的烟草共混物、非烟草组分、以及由其制造的代表性的香烟也阐述于上文所指出的Dube等的参考文献中。
参考图3，示出了一种吸烟制品10，该吸烟制品10呈香烟的形式并且具有可以含有本发明的制剂的吸烟制品的某些代表性的部件。香烟10包括被容纳在外围包装材料16中的一包或一卷可抽吸填充材料(例如约0.3g至约1.0g的可抽吸填充材料，如烟草材料)的一般呈圆柱形的棒12。棒12常规地被称为“烟草棒”。烟草棒12的末端是开放的以暴露可抽吸的填充材料。香烟10被示出为具有施加于所述包装材料16上的一个任选条带22(例如印刷涂层，包括成膜剂，如淀粉、乙基纤维素或藻酸钠)，并且该条带在与香烟的纵轴横切的方向上包围香烟棒。条带22可以被印刷在包装材料的内表面上(即，面向可抽吸的填充材料)，或不太优选地，被印刷在所述包装材料的外表面上。
在烟草棒12的一端处是点燃端18，并且在进口端20处设置有过滤元件26。所述过滤元件26被定位于烟草棒12的一端附近，以使得所述过滤元件和烟草棒以端对端的关系轴向排列，优选地彼此邻接。过滤元件26可以具有一般呈圆柱形的形状，并且其直径可以基本上等于烟草棒的直径。过滤元件26的末端允许空气和烟气穿过其中。
通气的或空气稀释的吸烟制品可以具有任选的空气稀释装置，如一系列的穿孔30，所述穿孔中的每一个延伸穿过接装材料和滤棒成型纸。任选的穿孔30可以通过本领域的普通技术人员已知的各种技术，如激光穿孔技术来制成。或者，可以使用所谓的离线空气稀释技术(例如经由使用多孔滤棒成型纸和预穿孔的接装纸)。本发明的制剂可以被并入吸烟制品的部件中的任一个内，包括但不限于作为烟草包的组分、作为包装纸的组分(例如被包括在包装纸内或涂在包装纸的内部或外部上)、作为粘合剂、作为过滤元件组分、和/或处于位于吸烟制品的任何区域中的胶囊内。
本发明的制剂还可以被并入产生气溶胶的器件中，所述器件含有尼古丁和/或在使用期间不意图燃烧的烟草材料(或其某个部分或组分)，包括所谓的“电子烟”。这些类型的吸烟制品中的一些利用可燃的燃料源，所述燃料源被燃烧以提供气溶胶和/或加热形成气溶胶的材料。其它利用电池供电的加热元件以加热形成气溶胶的组合物。描述了产生加味蒸气、可见的气溶胶或加味蒸气和可见的气溶胶的混合物的类型的吸烟制品的示例性参考文献包括Dube等的美国专利公开号2012/0192880中所阐述的那些，该美国专利公开以引用的方式并入本文。
本发明的制剂可以被并入无烟烟草产品中，如散装湿鼻烟(例如口含烟)；散装干鼻烟；嚼烟；制粒的烟草碎块；挤出或成型的烟草条、碎块、棒、圆柱体或棍；微细的经过研磨的粉末；微细的或磨碎的粉状碎块和组分团聚物；片状碎块；模塑的烟草碎块；口香糖；带状膜卷；易溶于水的或可分散于水的膜或条；可熔融的组合物；糖锭；软锭剂；或具有外壳和内部区域的胶囊样材料。各种类型的无烟烟草产品在Dube等的美国专利公开号2012/0152265中被描述或提到，该美国专利公开以引用的方式并入本文。
参考图4，示出了包含本发明的制剂的代表性的口含烟类型的烟草产品。具体来说，图4图示了无烟烟草产品40，所述无烟烟草产品40具有水可渗透的外部烟草袋42，所述外部烟草袋42容纳无烟烟草组合物44。所述烟草产品的部件中的任一个可以包含如本文所述的烟草衍生材料(例如烟草袋内衬的内部或外部或其中所容纳的无烟烟草组合物的一部分)。
可以受益于使用本发明的制剂的许多示例性无烟烟草组合物包含切细的或微粒烟草材料，所述材料可以用作本发明的富含蛋白质的烟草衍生材料的载体。本发明的无烟烟草组合物还可以包括水溶性的聚合粘结剂材料和任选的其它成分，它们提供将在使用期间在口腔中缓慢崩解的可溶性组合物。在某些实施方案中，所述无烟烟草组合物可以包括脂质组分，所述脂质组分提供在口腔中熔融的可熔融的组合物(而不是仅仅溶解)，如Cantrell等的美国专利公开号2012/0037175中所述的组合物，该美国专利公开以引用的方式并入本文。
在一个具体的无烟烟草产品实施方案中，将本发明的组合物添加到非烟草植物材料中，如选自马铃薯、甜菜(例如糖用甜菜)、谷物、豌豆、苹果等的植物材料。所述非烟草植物材料可以加工过的形式被使用。在某些优选的实施方案中，所述非烟草植物材料可以经过提取的形式被使用，并且因而，将某些溶剂可溶性组分的至少一部分从该材料中取出。非烟草的所提取的植物材料通常被高度提取，这意味着所述植物材料的显著量的水溶性部分已经被取出。参见例如Beeson等的美国专利公开号2011/0247640，该美国专利公开以引用的方式并入本文。
另外的成分可以与根据本发明的无烟烟草组合物混合，或以其它方式并入其中。所述成分可以是人工的，或可以从草药或生物来源获得或衍生。示例性的成分类型包括盐(例如氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾、乙酸钠、乙酸钾等)、天然甜味剂(例如果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、香兰素、乙基香兰素、葡糖苷、甘露糖、半乳糖、乳糖等)、人工甜味剂(例如蔗糖素、糖精、阿斯巴甜糖、丁磺氨钾、纽甜(neotame)等)、有机填料和无机填料(例如谷物、加工谷物、膨化谷物、麦芽糊精、右旋糖、碳酸钙、磷酸钙、玉米淀粉、乳糖、甘露醇、木糖醇、山梨糖醇、微细纤维素等)、粘结剂(例如聚维酮、羧甲基纤维素钠以及其它改性纤维素类型的粘结剂、藻酸钠、黄原胶、基于淀粉的粘结剂、阿拉伯树胶、卵磷脂等)、pH值调节剂或缓冲剂(例如金属氢氧化物，优选地碱金属氢氧化物，如氢氧化钠和氢氧化钾，以及其它碱金属缓冲剂，如金属碳酸盐，优选地碳酸钾或碳酸钠，或金属碳酸氢盐，如碳酸氢钠等)、着色剂(例如染料和颜料，包括焦糖色和二氧化钛等)、湿润剂(例如甘油、丙二醇等)、泡腾材料(如某些酸/碱组合)、口腔护理添加剂(例如百里香油、桉叶油以及锌)、防腐剂(例如山梨酸钾等)、糖浆(例如蜂蜜、高果糖玉米糖浆等)、崩解助剂(例如微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、淀粉羟基乙酸钠、预胶凝化玉米淀粉等)、调味料和调味混合物、抗氧化剂、以及其混合物。示例性封装的添加剂描述于例如Atchley的WO2010/132444中，该文献先前已经以引用的方式并入本文。还参见Hunt等的美国专利公开号2012/0055494和Byrd等的美国专利公开号2012/0199145中所阐述的无烟烟草成分，这些美国专利公开以引用的方式并入本文。
被并入烟草组合物或烟草产品内的本发明的富含蛋白质的烟草衍生材料的量可以取决于所述富含蛋白质的烟草衍生材料的所需功能、所述富含蛋白质的烟草衍生材料的化学组成、以及添加了所述富含蛋白质的烟草衍生材料的烟草组合物的类型。被添加到烟草组合物中的富含蛋白质的烟草衍生材料的量可以不同，但是以添加了所述组合物的烟草组合物的总干重计，将通常不超过约50重量％。举例来说，以烟草组合物的总干重计，被添加到烟草组合物中的富含蛋白质的烟草衍生材料的量可以在约0.25重量％至约25重量％或约1重量％至约10重量％的范围内。
尽管在烟草组合物的背景下大体描述了这些富含蛋白质的烟草衍生材料的用途，但是应当指出的是，这些制剂可以适用于许多其它类型的组合物中。举例来说，本发明的富含蛋白质的烟草材料可以用于食品或饮料中或以其它方式被并入预期用于口服食用的膳食补充剂中，诸如如由1994年膳食补充剂健康与教育法(DietarySupplementHealthandEducationAct，DSHEA)所定义的膳食补充剂。富含蛋白质的烟草材料还可以被并入被专门设计用于动物的食品(例如宠物食品)中。另外的用途包括美容组合物和药物组合物。
本发明的含有蛋白质的膳食补充剂可以采取各种形式，包括粉末、液体、棒状物等。这些补充剂通常包括另外的组分和赋形剂，如甜味剂、填料、着色剂、抗氧化剂、维生素、矿物等。本发明的富含蛋白质的材料可以用于例如以下文献中所阐述的组合物和制剂中：Robertson的美国专利公开号2006/0280840；Herzog的美国专利公开号2008/0268095；Rotem等的美国专利公开号2009/0317530；Verbiest等的美国专利公开号2011/0020501；Scheele的美国专利公开号2011/0245158；Cavallo等的美国专利公开号2012/0064058；Hoijer等的美国专利公开号2012/0301599；以及Romero等的美国专利公开号2013/0046018，所有这些文献以引用的方式并入本文。
实验
以下实施例更充分地说明了本发明的方面，所述实施例被阐述以说明本发明的某些方面，而不被视为限制本发明。
实施例1：酸性澄清和沉淀以获得RuBisCO
收获烟草植物，将叶从茎上剥落，并且在粉碎机中将叶通过向其中添加水来匀浆，然后将所述材料通入卧式螺旋压力机中以进行液体提取。由此所获得的液体含有蛋白质的提取物是具有8.6的pH值的绿色浆汁。首先通过使所述提取物穿过滗析器来使这种含有蛋白质的提取物澄清。使用盐酸将含有蛋白质的提取物的pH值调节到5.9。任选地将硅藻土添加到所述提取物中，将混合物搅拌15分钟，然后穿过压滤机。
用柠檬酸和盐酸处理所得的澄清了的含有蛋白质的提取物以将pH值调节到4.92。使经过pH值调节的提取物静置47小时。将液体从混合物的顶部滗析出，并且获得处于所述混合物底部的沉降的固体，并且将所述固体在1.4μm的陶瓷过滤器上使用切向流过滤来处理。将来自其中的保留物浓缩以得到富含蛋白质的烟草衍生材料。由此所获得的材料包含以重量计约85％至约99％的蛋白质。
实施例2：酸性澄清以获得RuBisCO
收获烟草植物，将叶从茎上剥落，并且在粉碎机中将叶通过向其中添加水来匀浆，然后将所述材料通入卧式螺旋压力机中以进行液体提取。由此所获得的液体含有蛋白质的提取物是具有8.4的pH值的绿色浆汁。首先通过使所述提取物穿过滗析器来使这种含有蛋白质的提取物澄清。使用盐酸将含有蛋白质的提取物的pH值调节到5.9。任选地将硅藻土添加到所述提取物中，将混合物搅拌15分钟，然后穿过压滤机。用水洗涤滤液，将pH值调节到5.9以提高蛋白质的回收率。
将所得的澄清了的含有蛋白质的提取物在500kDa反渗透过滤器上使用切向流过滤来处理。将保留物用甘氨酸溶液(75mM甘氨酸，pH10.5)洗涤以得到富含RuBisCO的烟草衍生材料保留物(包含以重量计约75％至85％的蛋白质)。将渗透物冷却到8℃并且在1kDa反渗透过滤器上使用切向流过滤来处理。将1kDa保留物用甘氨酸溶液洗涤并且浓缩以得到富含F2蛋白的烟草衍生材料(包含约30％-40％的F2蛋白，尽管已经使用替代性过滤法，例如使用10kDa和/或20kDa过滤器代替1kDa过滤器获得了更高的百分比，例如65％)。
实施例3：酸性澄清和沉淀以获得RuBisCO
收获烟草植物，将叶从茎上剥落，并且在粉碎机中将叶通过向其中添加水来匀浆，然后将所述材料通入卧式螺旋压力机中以进行液体提取。由此所获得的液体含有蛋白质的提取物是具有8.7的pH值的绿色浆汁。首先通过使所述提取物穿过滗析器来使这种含有蛋白质的提取物澄清。使用盐酸将含有蛋白质的提取物的pH值调节到5.9。将硅藻土添加到所述提取物中，将混合物搅拌15分钟，然后穿过压滤机。
用盐酸处理所得的澄清了的含有蛋白质的提取物以将pH值调节到4.98。使经过pH值调节的提取物静置60小时。将液体从混合物的顶部滗析出，并且获得处于所述混合物底部的沉降的固体，并且将所述固体在1.4μm的陶瓷过滤器上使用切向流过滤来处理。将来自其中的保留物浓缩以得到富含蛋白质的烟草衍生材料。由此所获得的材料包含以重量计约85％至约99％的蛋白质。
实施例4：碱性澄清以获得RuBisCO级分和F2级分
收获烟草植物，将叶从茎上剥落，并且在粉碎机中将叶通过向其中添加水来匀浆，然后将所述材料通入卧式螺旋压力机中以进行液体提取。由此所获得的液体含有蛋白质的提取物是具有8.5的pH值的绿色浆汁。首先通过使所述提取物穿过滗析器来使这种含有蛋白质的提取物澄清。使用氢氧化钠将含有蛋白质的提取物的pH值调节到10.5。添加活性炭并且将硅藻土添加到提取物中，将混合物搅拌15分钟，然后与压滤机接触。在所述混合物没有穿过压滤机时，使用盐酸将混合物的pH值调节到5.9，然后使所述混合物穿过压滤机。
将所得的澄清了的含有蛋白质的渗透物在500kDa反渗透过滤器上使用切向流过滤来处理。将保留物用甘氨酸溶液(75mM甘氨酸，pH10.5)洗涤，从而得到含有RuBisCO蛋白质的保留物(包含以重量计约75％至85％的蛋白质)并且储存。将渗透物冷却到8℃并且在1kDa反渗透过滤器上使用切向流过滤来处理。将保留物用甘氨酸溶液洗涤并且浓缩以得到富含F2级分蛋白的烟草衍生材料(包含约30％-40％的F2蛋白，尽管已经使用替代性过滤法，例如使用10kDa和/或20kDa过滤器代替1kDa过滤器获得了更高的百分比，例如65％)。
实施例5：酸性澄清以获得RuBisCO级分和F2级分
收获烟草植物，将叶从茎上剥落，并且在粉碎机中将叶通过向其中添加水来匀浆，然后将所述材料通入卧式螺旋压力机中以进行液体提取。由此所获得的液体含有蛋白质的提取物是具有8.4的pH值的绿色浆汁。首先通过使所述提取物穿过滗析器来使这种含有蛋白质的提取物澄清。使用盐酸将含有蛋白质的提取物的pH值调节到5.9。添加活性炭并且将硅藻土添加到所述提取物中，将混合物搅拌15分钟，然后穿过压滤机。将所得的澄清了的含有蛋白质的渗透物在500kDa反渗透过滤器上使用切向流过滤来处理。将保留物用甘氨酸溶液(75mM甘氨酸，pH10.5)洗涤，从而得到含有RuBisCO蛋白质的保留物(包含以重量计约75％至85％的蛋白质)，将所述保留物储存。将渗透物冷却到8℃并且在1kDa反渗透过滤器上使用切向流过滤来处理。将保留物用甘氨酸溶液洗涤并且浓缩以得到富含F2级分蛋白的烟草衍生材料(包含约30％-40％的F2蛋白，尽管已经使用替代性过滤法，例如使用10kDa和/或20kDa过滤器代替1kDa过滤器获得了更高的百分比，例如65％)。
实施例6：分离组合的RuBisCO和F2蛋白以及后续的分离
收获烟草植物，切碎，并且在粉碎机中通过向其中添加水来匀浆，然后将所述材料通入卧式螺旋压力机中以进行液体提取。由此所获得的液体含有蛋白质的提取物是具有5.6的pH值的绿色浆汁。使用氢氧化钠将含有蛋白质的提取物的pH值调节到7.10。将硅藻土添加到所述提取物中，将混合物搅拌15分钟，然后穿过压滤机。将所得的澄清了的含有蛋白质的渗透物在1kDa过滤器上使用切向流过滤来处理。所述保留物包含RuBisCO和F2蛋白的混合物并且包含约50％的蛋白质。
本发明的许多改动方案和其它实施方案将由已经获益于上述说明中所呈现的教导的本发明所属领域的技术人员所想到。因此，应当了解的是，本发明不限于所公开的具体实施方案并且改动方案和其它实施方案意图被包括在所附权利要求书的范围内。尽管在本文使用了特定的术语，但它们仅在一般的和描述性的意义上而不是为了限制的目的被使用。

Claims (20)

1.一种用于从烟草属(Nicotiana)种的植物或其部分获得富含蛋白质的材料的方法，所述方法包括：
接收所述烟草属种的植物材料；
在一定的时间内以及在一定的条件下使所述植物材料与溶剂接触，所述时间和条件足以将一种或多种蛋白质从所述植物材料中提取到所述溶剂中并且形成液体含有蛋白质的提取物；
使固体的所提取的植物材料与所述液体含有蛋白质的提取物分离；
使所述液体含有蛋白质的提取物澄清以形成澄清了的含有蛋白质的提取物和固体级分；以及
处理所述澄清了的含有蛋白质的提取物以提供包含以干重计至少约60％的蛋白质的富含蛋白质的材料。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述处理步骤包括将所述澄清了的含有蛋白质的提取物的pH值调节到小于约6的pH值以形成酸性提取物；
从所述酸性提取物分离沉淀物；以及
洗涤所述沉淀物以提供富含蛋白质的材料。
3.如权利要求2所述的方法，其中将所述澄清了的含有蛋白质的提取物的pH值调节到约4.5至约6的pH值以提供含有RuBisCO的富含蛋白质的材料。
4.如权利要求3所述的方法，其中还通过以下各项中的一种或两种对在所述分离步骤之后保留的所述提取物进行处理：1)在具有1kDa-500kDa的孔径的过滤器上过滤并且分离作为保留物的第二富含蛋白质的材料；以及2)将所述提取物调节到小于约4.5的pH值并且从其中分离包含第二富含蛋白质的材料的第二沉淀物，其中所述第二富含蛋白质的材料是含有F2蛋白的富含蛋白质的材料。
5.如权利要求2所述的方法，其中在具有约1μm至约1kDa的孔径的过滤器上进行所述洗涤。
6.如权利要求2所述的方法，其中将所述澄清了的含有蛋白质的提取物的pH值调节到约3至约4.5的pH值以提供含有RuBisCO并且含有F2蛋白的富含蛋白质的材料。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述用于洗涤所述沉淀物的溶剂是酸性溶液。
8.如权利要求2所述的方法，其中所述富含蛋白质的材料包含以干重计至少约80％的蛋白质。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述处理步骤包括在陶瓷过滤器或超滤膜上过滤所述澄清了的含有蛋白质的提取物以得到保留物和液体渗透物；以及
洗涤所述保留物以提供所述富含蛋白质的材料。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述澄清步骤包括调节所述液体含有蛋白质的提取物的pH值。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述过滤步骤包括使所述澄清了的含有蛋白质的提取物穿过具有约1μm至约1kDa的孔径的一个或多个过滤器。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述过滤步骤包括使所述澄清了的含有蛋白质的提取物穿过具有约1μm至约500kDa的孔径的过滤器并且其中所述保留物包含以干重计至少约50％的RuBisCO。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述过滤步骤包括使所述澄清了的含有蛋白质的提取物穿过具有约1kDa至约500kDa的孔径的过滤器并且其中所述保留物包含RuBisCO和F2蛋白的混合物。
14.如权利要求12所述的方法，所述方法还包括使所述渗透物穿过具有约500kDa至1kDa的孔径的过滤器以得到作为所述保留物的第二富含蛋白质的材料，其中所述第二富含蛋白质的材料包含F2级分蛋白。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述烟草属种的植物材料呈绿色植物材料、黄化植物材料、烤过的植物材料或其混合物的形式。
16.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括将所述富含蛋白质的材料喷雾干燥、冷冻干燥、或以其它方式脱水。
17.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括在所述方法的任何步骤添加一种或多种组分以去除颜色、气味、味道、生物碱、金属、或其组合。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种组分选自由以下各项组成的组：活性炭、树脂、粘土、螯合剂、分子印迹聚合物、非印迹聚合物、或其组合。
19.一种富含蛋白质的提取物，所述提取物是根据如权利要求1至18中任一项所述的方法来获得的。
20.一种膳食补充剂、食品、饮料、个人护理物品、药物产品或宠物食品，其包含如权利要求19所述的富含蛋白质的提取物。
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