CN105175485B - 一种从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然产物的分离和提取技术领域，尤其涉及一种从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法，主要是将粉碎后的红豆杉种子加入到反胶束体系中进行萃取，经前萃和后萃，离心分离得到含蛋白质的水相和含油的有机相，通过透析处理含蛋白质的水相得到红豆杉种子蛋白，通过萃取含油的有机相得到红豆杉种子油；本发明实现了蛋白质和油脂的同步提取，工艺简单，操作方便，选择性高；工艺条件温和，其中的溶剂均可以循环使用，对环境友好；且产品得率高，蛋白变性程度小。

Description

一种从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法

技术领域

本发明涉及天然产物的分离和提取技术领域，尤其涉及一种从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法。

背景技术

红豆杉是红豆杉科红豆杉属植物的总称，世界上约有11种，主要分布于北半球的温带至亚热带地区，我国有4个种和1个变种；由于红豆杉中含有抗癌活性物质紫杉醇，红豆杉已被世界公认为濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物。目前，国内外关于红豆杉的研究主要集中在紫杉醇的开发利用方面，且主要从红豆杉的枝、叶、皮、茎等部位进行提取分离，而关于红豆杉种子的研究则较少。红豆杉种子作为可再生资源，除含有紫杉醇外，还含有很多其它活性成分。

据研究，红豆杉种子属于油料种子，油脂和蛋白质是种子中的主要贮藏物质，具有一定的开发利用价值；而目前绝大多数的植物油料种子，都含有丰富的植物油和蛋白质，但是当前油料种子提油后的残渣基本都被废弃，这就造成了种子中蛋白质资源的极大浪费；即使油料种子提油后的残渣进行蛋白质提取，一般需要高温脱溶，导致残渣中蛋白质变性，降低了蛋白质的功能特性和营养特性，而且传统提取蛋白质的工艺繁琐、生产成本高；因此限制了残渣中蛋白质的深加工和再利用。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法，包括以下步骤：

构建反胶束体系：将异辛烷和正癸醇按体积比3-5:1的比例混合摇匀，再加入表面活性剂氯化双十八烷基二甲基铵(DODMAC)，使其均匀分布于有机相，其中有机相中氯化双十八烷基二甲基铵浓度为0.05-0.08g/mL；溶解完全后加入0.03-0.1倍溶液体积比的氯化钾-磷酸盐缓冲液，混合均匀后，得到澄清、透明、稳定的反胶束体系；

前萃：将红豆杉种子粉碎后添加到所述反胶束体系，采用变频微波辅助技术进行前萃，离心分离后得到前萃液和固体残渣；

后萃：将所述前萃液与KCl-磷酸盐缓冲液按体积比1:1-2的比例混合进行后萃，后萃完毕后，离心分离得到含蛋白质的水相和含油的有机相；

产品分离：对所述含蛋白质的水相进行蛋白质分离，对所述含油的有机相进行油脂分离。

具体地，所述反胶束体系中添加的所述氯化钾－磷酸盐缓冲液的浓度为0.05-0.3mol/L,pH为6.0-9.0。

较佳地，所述红豆杉种子粉碎后的目数为60－80目，添加量为0.01-0.03g/mL。

较佳地，所述前萃时采用变频微波辅助技术的萃取时间为20-40min，萃取温度为30-45℃。

较佳地，所述后萃中KCl－磷酸盐缓冲液的浓度为1.5－2.5mol/L，pH为6－9，所述后萃的时间为60－90min。

较佳地，产品分离具体包括蛋白质和油的分离以及溶剂的回收，主要根据各类物质的理化性质进行设计；具体地，所述蛋白质分离为：将所述含蛋白质的水相进行透析，干燥后得到红豆杉种子蛋白，透析中使用的透析袋截留分子量为3500Da；采用透析处理含蛋白的水相，由于种子蛋白的分子量较大，在分离时，盐离子和小分子物质不停扩散到袋外，而分子量较大的种子蛋白则被截留在袋内，分离蛋白质的过程简单，容易操作，且产品纯度高。

具体地，所述油脂分离为：将所述含油的有机相，先减压蒸发回收异辛烷，再往余液中加入约为其2-3倍体积的60％-80％(体积分数)乙醇萃取0.5-1h，得到种子油脂和乙醇相，将所述乙醇相低温冷冻后，回收低温沉淀的表面活性剂以及剩余的正癸醇；其中，含油的有机相中还含有异辛烷、DODMAC、正癸醇，由于异辛烷的沸点为99.3℃，正癸醇的沸点为233℃，可以通过减压蒸发首先分离出异辛烷；而种子油几乎不溶于乙醇，DODMAC可溶于乙醇，且在低温下易沉淀，可采用乙醇萃取和低温沉淀相结合的方法进行分离，实现溶剂和表面活性剂的循环利用。

本发明的有益效果：

一方面，采用反胶束萃取技术与传统提取油脂和蛋白质的方法相比，可实现两者的同步萃取，且原料利用率高，生产工艺简单，成本较低，选择性高，操作方便，工艺条件温和，其中的溶剂均可以循环使用，对环境友好；且产品得率高，蛋白变性程度小；

另一方面，采用变频微波辅助反胶束萃取，具有萃取效果好、萃取时间短等优点；相对于普通微波萃取，随着时间的延长，普通微波萃取会导致萃取温度急速上升，易造成局部温度过高从而导致蛋白质变性；而变频微波能保持萃取温度的恒定，使萃取更加均匀，且易于在低温下保持蛋白质的活性。

附图说明

图1、本发明实施例的工艺路线图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，以助于本领域技术人员理解本发明。

本发明中，所采用的反胶束体系是表面活性剂分子在非极性有机溶剂中自发形成具有热力学稳定性的纳米级聚集体，其内部形成“水池”，可溶解水和其它亲水性分子；反胶束萃取一般包括前萃与后萃两个过程，原料加入反胶束溶液中，在油脂溶于有机溶剂的同时蛋白质也被萃入反胶束体系中的极性水池内，称为前萃过程；通过调节水相的pH值、离子强度等因素，促使蛋白质从反胶束的“水池”转入到水相中，称为后萃过程。

在构建的DODMAC/异辛烷/正癸醇反胶束体系时，首先考虑表面活性剂，由于红豆杉种子蛋白的等电点在酸性范围，根据反胶束溶液的静电原理，表面活性剂应选取阳离子型表面活性剂更为合适，而DODMAC为季铵盐型阳离子表面活性剂，且季铵盐基团可以与加溶的水分子通过氢键更好的结合，具有良好的增溶性，因此选择DODMAC作为表面活性剂；而表面活性剂中的溶剂选择主要考虑以下几种，检测结果如表1所示。

表1

DODMAC－正癸醇－异辛烷的组合，在反胶束体系中，DODMAC不仅溶解迅速，而且萃取能力强，是一种性能优良的的反胶束体系，因此选其来构建反胶束体系。具体使用在红豆杉种子的分离提取中详见如下实施例。

实施例1

一种从红豆杉种子中同步提取蛋白和油的方法，包括以下步骤：

(1)构建反胶束体系：将异辛烷和正癸醇按体积比为3：1的比例混合摇匀，再加入适量的表面活性剂DODMAC(氯化双十八烷基二甲基铵)，使得DODMAC浓度为0.05g/mL，摇匀，使其均匀分布于有机相；混匀后加入0.03倍溶液体积比的KCl－磷酸盐缓冲液，振荡约5min后，得到澄清、透明、稳定的反胶束体系；其中KCl－磷酸盐缓冲液浓度为0.05mol/L，pH值6；

(2)前萃：将红豆杉种子粉碎至60目，干燥后添加到步骤(1)中的反胶束体系，采用变频微波辅助技术进行前萃，萃取温度30℃，萃取时间30min，萃取完毕后离心分离得到前萃液和固体残渣；其中，红豆杉种子的添加量为0.01g/mL；

(3)后萃：将步骤(2)中取得的前萃液与KCl－磷酸盐缓冲液按体积比1：1混合进行后萃，萃取时间为60min，后萃完毕后，离心分离得到含蛋白质的水相和含油的有机相；其中，该处的KCl－磷酸盐缓冲液浓度为1.5mol/L，pH值为6；

(4)蛋白质的分离：将步骤(3)获得的含蛋白质的水相使用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析，干燥后得到红豆杉种子蛋白，此时蛋白质的萃取率为73.6％，萃取出来的蛋白质纯度为91.6％。

(5)油的分离及溶剂回收：将步骤(3)获得的含油的有机相，首先通过减压蒸发回收异辛烷，再往余液中加入2倍体积的60％乙醇萃取0.5h，得到种子油和乙醇相，此时种子油的萃取率为78.2％，萃取出来的种子油纯度为86.5％；将乙醇相于－4℃低温冷冻1h，回收低温沉淀的DODMAC以及剩余的正癸醇。

实施例2

一种从红豆杉种子中同步提取蛋白和油的方法，包括以下步骤：

(1)构建反胶束体系：将异辛烷和正癸醇按5：1的比例混合摇匀，再加入表面活性剂DODMAC，使得DODMAC浓度为0.08g/mL，摇匀，使其均匀分布于有机相；溶解完全后加入0.1倍溶液体积比的KCl－磷酸盐缓冲液，将混合溶液振荡约10min后，得到澄清、透明、稳定的反胶束体系；其中，KCl－磷酸盐缓冲液浓度为0.3mol/L，pH值9；

(2)前萃：将粉碎至80目的红豆杉种子干燥完毕后，添加到步骤(1)制得的反胶束体系中，采用变频微波辅助技术进行前萃，萃取温度45℃，萃取时间40min，萃取完毕后离心分离得到前萃液和固体残渣；其中，红豆杉种子的添加量为0.03g/mL；

(3)后萃：将步骤(2)中得到的前萃液与KCl－磷酸盐缓冲液按体积比1：2混合进行后萃，萃取时间为90min，后萃完毕后，离心分离得到含蛋白质的水相和含油的有机相；其中，KCl－磷酸盐缓冲液浓度为2.5mol/L，pH值9；

(4)蛋白质的分离：将步骤(3)中获得的含蛋白质的水相使用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析，干燥后得到红豆杉种子蛋白，此时蛋白质的萃取率为75.2％，萃取出来的蛋白质纯度为91.8％。

(5)油的分离及溶剂回收：将步骤(3)获得的含油的有机相，首先通过减压蒸发回收异辛烷，再往余液中加入3倍体积的80％乙醇萃取1h，得到种子油和乙醇相，此时种子油的萃取率为81.4％，得到的种子油纯度为87.1％；另外将乙醇相于－4℃低温冷冻2h，回收低温沉淀的DODMAC以及剩余的正癸醇。

实施例3

一种从红豆杉种子中同步提取蛋白和油的方法，包括以下步骤：

(1)构建反胶束体系：将异辛烷和正癸醇按体积比为4：1的比例混合摇匀，再加入表面活性剂DODMAC，摇匀，使其均匀分布于有机相，其中DODMAC浓度为0.06g/mL；溶解完全后加入0.08倍溶液体积比的KCl－磷酸盐缓冲液，振荡约10min后，得到澄清、透明、稳定的反胶束体系；其中KCl－磷酸盐缓冲液浓度为0.2mol/L，pH7；

(2)前萃：将粉碎至80目的红豆杉种子干燥完毕后，添加到步骤(1)中制得的反胶束体系，采用变频微波辅助技术进行前萃，萃取温度35℃，萃取时间30min，萃取完毕后离心分离得到前萃液和固体残渣；其中，红豆杉种子的添加量为0.02g/mL；

(3)后萃：将前萃中得到的前萃液与KCl－磷酸盐缓冲液体积比1：1混合进行后萃，萃取时间为70min，后萃完毕后，离心分离得到含蛋白质的水相和含油的有机相；其中，KCl－磷酸盐缓冲液浓度为2mol/L，pH值7，

(4)蛋白质的分离：将步骤(3)获得的含蛋白质的水相使用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析，干燥后得到红豆杉种子蛋白，此时蛋白质的萃取率为81.3％，得到的蛋白质纯度为92.5％；

(5)油的分离及溶剂回收：将步骤(3)获得的含油有机相，首先通过减压蒸发回收异辛烷，再往余液中加入2.5倍体积的70％乙醇萃取1h，得到种子油和乙醇相，此时种子油的萃取率为84.6％，得到的种子油纯度为88.2％；将乙醇相于－4℃低温冷冻2h，回收低温沉淀的DODMAC以及剩余的正癸醇。

实施例4

一种从红豆杉种子中同步提取蛋白和油的方法，包括以下步骤：

(1)构建反胶束体系：将异辛烷和正癸醇按体积比为3：1的比例混合摇匀，再加入表面活性剂DODMAC，摇匀，使其均匀分布于有机相，其中，DODMAC浓度为0.07g/mL；溶解完全后加入0.05倍溶液体积比的KCl－磷酸盐缓冲液，振荡约10min后，得到澄清、透明、稳定的反胶束体系；其中，KCl－磷酸盐缓冲液浓度为0.15mol/L，pH8；

(2)前萃：将粉碎至60目的红豆杉种子干燥完毕后，添加到步骤(1)中制得的反胶束体系，采用变频微波辅助技术进行前萃，萃取温度30℃，萃取时间25min，萃取完毕后离心分离得到前萃液和固体残渣；其中，红豆杉种子的添加量为0.02g/mL；

(3)后萃：将步骤(2)中得到的前萃液与KCl－磷酸盐缓冲液按体积比2：3混合进行后萃，萃取时间为80min，后萃完毕后，离心分离得到含蛋白质的水相和含油的有机相；其中KCl－磷酸盐缓冲液浓度为2mol/L，pH值8；

(4)蛋白质的分离：将步骤(3)获得的含蛋白质的水相使用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析，干燥后得到红豆杉种子蛋白，此时蛋白质的萃取率为79.4％，得到的蛋白质的纯度为92.1％；

(5)油的分离及溶剂回收：将步骤(3)获得的含油的有机相，首先通过减压蒸发回收异辛烷，再往余液中加入2倍体积的75％乙醇萃取1h，得到种子油和乙醇相，此时种子油的萃取率为82.1％，得到的种子油纯度为87.5％；将乙醇相于－4℃低温冷冻1.5h，回收低温沉淀的DODMAC以及剩余的正癸醇。

实施例5

一种从红豆杉种子中同步提取蛋白和油的方法，包括以下步骤：

(1)构建反胶束体系：将异辛烷和正癸醇按体积比4：1的比例混合摇匀，再加入适量的表面活性剂DODMAC(氯化双十八烷基二甲基铵)，摇匀，使其均匀分布于有机相，其中DODMAC浓度为0.06g/mL；溶解完全后加入0.06倍溶液体积比的KCl－磷酸盐缓冲液，振荡约10min后，得到澄清、透明、稳定的反胶束体系；其中，KCl－磷酸盐缓冲液溶度为0.2mol/L，pH值9；

(2)前萃：将粉碎至80目的红豆杉种子干燥完毕后，添加到上述反胶束体系中，采用变频微波辅助技术进行前萃；萃取温度设置为35℃，萃取时间30min，萃取完毕后离心分离得到前萃液和固体残渣；其中，红豆杉种子的添加量为0.03g/mL；

(3)后萃：将上述前萃液与KCl－磷酸盐缓冲液按体积比1：1混合进行后萃，萃取75min，后萃完毕后，离心分离得到含蛋白质的水相和含油的有机相；其中，KCl－磷酸盐缓冲液浓度为2.5mol/L，pH值9；

(4)蛋白质的分离：将步骤(3)获得的含蛋白质的水相使用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析，干燥后得到红豆杉种子蛋白，此时蛋白质的萃取率为78.6％，；得到的蛋白质纯度为92.0％

(5)油的分离：将步骤(3)获得的含油有机相，首先通过减压蒸发回收异辛烷，再往余液中加入2.5倍体积的70％乙醇萃取1h，得到种子油和乙醇相，此时种子油的萃取率为81.7％，得到的种子油纯度为86.9％；

(6)溶剂回收：将步骤(5)中的乙醇相于－4℃低温冷冻1h，回收低温沉淀的DODMAC以及剩余的正癸醇。

实施例6

一种从红豆杉种子中同步提取蛋白和油的方法，包括以下步骤：

(1)构建反胶束体系：将异辛烷和正癸醇按体积比为5：1的比例混合摇匀，再加入适量的表面活性剂DODMAC(氯化双十八烷基二甲基铵)，摇匀，使其均匀分布于有机相，其中，DODMAC浓度为0.05g/mL；溶解完全后加入0.04倍溶液体积比的KCl－磷酸盐缓冲液，振荡约10min后，得到澄清、透明、稳定的反胶束体系；其中，KCl－磷酸盐缓冲液浓度为0.1mol/L，pH值8；

(2)前萃：将粉碎至60目的红豆杉种子干燥完毕后，添加到反胶束体系，采用变频微波辅助技术进行前萃，萃取温度30℃，萃取时间25min，萃取完毕后离心分离得到前萃液和固体残渣；其中，红豆杉种子的添加量为0.02g/mL，

(3)后萃：将上述前萃液与KCl－磷酸盐缓冲液按体积比1：2混合进行后萃，萃取85min，后萃完毕后，离心分离得到含蛋白质的水相和含油的有机相；其中，该处KCl－磷酸盐缓冲液浓度为2mol/L，pH值8；

(4)蛋白质的分离：将步骤(3)获得的含蛋白质的水相使用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析，干燥后得到红豆杉种子蛋白，此时蛋白质的萃取率为76.9％，得到的蛋白质纯度为91.7％。

(5)油的分离：将步骤(3)获得的含油有机相，首先通过减压蒸发回收异辛烷，再往余液中加入2倍体积的80％乙醇萃取2h，得到种子油和乙醇相，此时种子油的萃取率为80.6％，得到的种子油纯度为86.8％；

(6)溶剂回收：将步骤(5)中得到的乙醇相于－4℃低温冷冻2h，回收低温沉淀的DODMAC以及剩余的正癸醇。

上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。

Claims (9)

1.一种从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建反胶束体系：将异辛烷和正癸醇按体积比3-5:1的比例混合摇匀，再加入表面活性剂氯化双十八烷基二甲基铵，使其均匀分布于有机相，其中有机相中氯化双十八烷基二甲基铵浓度为0.05-0.08g/mL；溶解完全后加入0.03-0.1倍溶液体积比的氯化钾-磷酸盐缓冲液，混合均匀后，得到澄清、透明、稳定的反胶束体系；

前萃：将红豆杉种子粉碎后添加到所述反胶束体系，采用变频微波辅助技术进行前萃，离心分离后得到前萃液和固体残渣；

后萃：将所述前萃液与KCl-磷酸盐缓冲液按体积比1:1-2的比例混合进行后萃，后萃完毕后，离心分离得到含蛋白质的水相和含油的有机相；

产品分离：对所述含蛋白质的水相进行蛋白质分离，对所述含油的有机相进行油脂分离。

2.根据权利要求1所述的从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法，其特征在于：所述氯化钾－磷酸盐缓冲液的浓度为0.05-0.3mol/L,pH为6.0-9.0。

3.根据权利要求1所述的从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法，其特征在于：所述红豆杉种子的添加量为0.01-0.03g/mL。

4.根据权利要求1所述的从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法，其特征在于：所述红豆杉种子粉碎后的目数为60－80目。

5.根据权利要求1所述的从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法，其特征在于：所述前萃时采用变频微波辅助技术的萃取时间为20-40min，萃取温度为30-45℃。

6.根据权利要求1所述的从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法，其特征在于：所述后萃中KCl-磷酸盐缓冲液的浓度为1.5－2.5mol/L，pH为6－9，所述后萃的时间为60－90min。

7.根据权利要求1所述的从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法，其特征在于，所述蛋白质分离具体为：将所述含蛋白质的水相进行透析，干燥后得到红豆杉种子蛋白。

8.根据权利要求1所述的从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法，其特征在于，所述油脂分离具体为：将所述含油的有机相，先减压蒸发回收异辛烷，再往余液中加入2-3倍体积的60％-80％乙醇萃取0.5-1h，得到种子油脂和乙醇相。

9.根据权利要求8所述的从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法，其特征在于：所述油脂分离还包括溶剂回收，具体为将所述乙醇相低温冷冻后，回收低温沉淀的表面活性剂以及剩余的正癸醇。