CN103535507A - 一种萃取大豆蛋白并提纯和回收表面活性剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种萃取大豆蛋白并提纯和回收表面活性剂的方法，主要包括以下步骤：(1)配制混合反胶束体系；(2)将大豆粉与反胶束体系混合，超声波辅助萃取，得到含有蛋白和油脂的前萃液；(3)蛋白前萃液旋转蒸发回收有机溶剂；(4)将缓冲溶液与蛋白前萃液混合反萃取得到蛋白水溶液和混合油；(5)分别对蛋白水溶液和混合油进行醇洗纯化，醇洗后离心分离的混合液经柱层析分离回收表面活性剂。本发明的优点：采用复合反胶束体系可减少表面活性剂对蛋白活性的影响；混合表面活性剂利于高分子量蛋白萃取；在反胶束后萃取蛋白前先通过旋转蒸发去除一定量的溶剂，降低了反胶束后萃取蛋白过程中缓冲溶液用量和废水排放量及干燥蛋白所需的能耗。
Description
技术领域
本发明属于反胶束技术及其应用领域和新能源开发领域，具体涉及到一种利用混合反胶束体系萃取大豆蛋白同时提纯和回收表面活性剂的方法。
背景技术
大豆蛋白在大豆中的含量高达40％，在营养方面，大豆蛋白所含氨基酸种类比较齐全，人体必需氨基酸比例较为均衡，是为数不多能替代动物蛋白的理想营养佳品。在功能性方面，大豆蛋白具有良好的凝胶形成性、起泡性、乳化性、吸油性、保水性，已成为现代食品工业中不可缺少的原料。目前工业生产大豆蛋白的工艺多以浸出脱脂过的豆粕为原料，通过碱溶酸沉的方法制取的。这种方法的生产工艺复杂，会产生大量的废水，大豆蛋白和溶剂直接接触而且豆粕脱溶过程，需要经过80℃以上的高温，这使豆粕中的蛋白无论从功能效价还是营养上来说，都有一定程度的降低。
反胶束萃取技术是一种新的分离纯化技术，可以同时萃取分离原料中的油脂和蛋白，可连续操作，条件温和等优点。但是，目前用于萃取油料作物中蛋白的反胶束体系，多是由阴离子表面活性剂，如丁二酸二异辛酯磺酸钠(AOT)、十二烷基硫酸钠(SDS)形成的，会在一定程度上使蛋白质变性；在反胶束后萃取蛋白的时表面活性剂会在蛋白质中有相当的残留，影响了蛋白食用的安全性，阻碍了反胶束实现工业化的步伐。
发明内容
本发明针对降低反胶束技术萃取蛋白时表面活性剂对蛋白活性的影响，采用阴离子与非离子表面活性剂形成的混合反胶束体系来萃取大豆蛋白，Tween系列表面活性剂是由天然的醇的脂肪酸酯与聚氧乙烷加成得到的，具有低毒、易生物降解、与离子型表面活性剂有较好的协同性等特点。利用表面活性剂在60-70％的乙醇中有很好的溶解性，而蛋白质在60-70％的乙醇不溶解这一特性来提纯大豆蛋白，利用氧化铝只吸附阴离子型表面活性剂而不吸收非离子型表面活性剂而将两者分离，从而回收表面活性剂。
本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：
一种萃取大豆蛋白并提纯和回收表面活性剂的方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤：
S1配制混合反胶束体系，所述混合反胶束体系包括表面活性剂、有机溶剂、助溶剂、缓冲溶液，所述表面活性剂由阴离子表面活性剂和非离子型表面活性剂复配而成，其中，所述混合反胶束体系中表面活性剂总浓度为50-110g／L，有机溶剂与助溶剂的体积比为4：1，缓冲溶液的pH为6-9、加入后使所述混合反胶束体系中水与表面活性剂的摩尔比W0值为16-24，阴离子表面活性剂和非离子型表面活性剂的体积配比为1：1-7：3；
S2将大豆粉与步骤S1中制备的混合反胶束体系混合，所述大豆粉加入量为15-30g／L，混合后利用超声波辅助萃取，之后固液分离得到含有蛋白和油脂的蛋白前萃液；
S3将步骤S2中制备的蛋白前萃液旋转蒸发至有机溶剂蒸脱的65％-70％以回收部分有机溶剂得到蛋白前萃液的浓缩液；
S4将萃取用的缓冲溶液与步骤S3中制备的蛋白前萃液的浓缩液混合，反萃取得到蛋白水溶液和混合油，实施该步骤时，先用等体积的乙醇和萃取用的缓冲溶液的混合液对蛋白前萃液进行超声辅助后萃取，然后离心分离，上层为混合油下层为蛋白水溶液；
S5分别对步骤S4中制备的蛋白水溶液和混合油进行醇洗纯化，醇洗后的混合液经柱层析分离回收表面活性剂，其中，
S51在蛋白液中，在搅拌的情况下，加入浓度为95％的乙醇，使两者混合后乙醇的体积分数为60％-70％，之后振荡使表面活性剂溶解在乙醇水溶液中，分离得到的浆状物冷冻干燥后得到蛋白产品；
S52在混合油中，加入体积分数为60％-70％的乙醇水溶液，振荡后使表面活性剂溶解在乙醇水溶液中，静置分离，上层混合油在85℃-90℃水浴中旋转蒸发，蒸脱有机溶剂后即得到油脂；
S53分别收集步骤S51、S52中分离后的乙醇水溶液，使之通过装有110℃活化4-5小时的氧化铝的柱子，在柱子下面接收到乙醇与表面活性剂的混合液，经过旋转蒸发得到乙醇和非离子型表面活性剂，用40-50摄氏度的浓度为95％的乙醇洗脱柱子，在柱子下面接收到乙醇与表面活性剂的混合液，经过旋转蒸发得到乙醇和离子型表面活性剂。
在S1中混合反胶束体系是由表面活性剂、有机溶剂、缓冲溶液组成的，其中表面活性剂为阴离子表面活性剂和非离子型表面活性剂复配而成的。其中阴离子表面活性剂可以是丁二酸二异辛酯磺酸钠(AOT)，十二烷基硫酸钠(SDS)中的一种，非离子表面活性剂是指Tween系列，如Tween60(聚氧乙烯失水山梨醇硬脂酸酯)中的一种。表面活性剂总浓度为50-110g／L，两种表面活性剂的配比为1：1-7：3。有机溶剂为异辛烷、环己烷、正庚烷中的任意一种，助溶剂为正辛醇；形成反胶束的缓冲溶液为KCl-磷酸盐或者NaCl-磷酸盐。其中有机溶剂与助溶剂的比例为4：1，缓冲溶液的pH为6-9、加入量为30-50ml／L，使反胶束体系中水与表面活性剂的摩尔比W0值为16-24。
在S2中将大豆粉按15-30g／L的量加入反胶束溶液中，超声辅助萃取，超声波功率为210W-240W，萃取温度为35℃-45℃，萃取时间为40-60min，所述的固液分离是指使用离心分离的方法，转速为3000-6000r／min，离心时间为10-15min。
在S3中，取S2中离心分离的上清液进行旋蒸，旋转蒸发的条件为转速为40-50r／min，温度45-50℃，真空度<80kpa，旋转蒸发时间视蒸发溶剂的量而定，如需蒸发的1.5L-2L的样品，约需要1.5-2小时，溶剂蒸脱掉前萃液的65％-70％即可。
在S4中，取在S3中蒸脱掉部分溶剂前萃液，加入等体积的乙醇-KCl-缓冲溶液进行超声辅助后萃取，其中乙醇的浓度为(V／V)10％-15％，pH为7-9，KCl的浓度为1.0-1.3mol／L，超声辅助萃取条件为超声波的频率为20-50KHz，功率为180W-210W，萃取温度为35℃-40℃，萃取时间为30min-40min，萃取完成后离心分离，转速为3000-4000r／min，离心时间为8-10min。上层为含有溶剂的混合油，下层为蛋白水溶液。
在S5中，取S4中的蛋白液中，在搅拌的情况下，加入浓度为95％的乙醇，使两者混合后乙醇的体积分数为60％-70％，在振荡器上振荡20-30min，离心分离，浆状物冷冻干燥，即得到蛋白产品；取S4中的混合油，加入体积分数为60％-70％的乙醇水溶液，在振荡器上振荡20-30min，使表面活性剂溶解在乙醇水溶液中，静止分离，上层混合油在85℃-90℃水浴中旋转蒸发，蒸脱溶剂后即得到油脂。收集离心分离后的乙醇水溶液，在10℃-15℃水浴中使表面活性剂结晶2-3h，固体抽滤后60-65℃干燥，得到表面活性剂，液体70-80℃旋转蒸发回收乙醇。
本发明与现有技术相比所具备的优点在于：
(1)采用阴离子与非离子型表面活性剂形成的复合反胶束体系能够减少表面活性剂对蛋白活性的影响；
(2)非离子表面活性剂与离子型表面活性剂相比有更高的亲水性，因而能形成较大的水池，更有利于大豆中高分子量蛋白萃取；
(3)Tween系列表面活性剂是由天然的醇的脂肪酸酯与聚氧乙烷加成得到的，是环境友好型表面活性剂，具有低毒、易生物降解的特点。
(4)在反胶束后萃取蛋白前先通过旋转蒸发去除一定量的溶剂，降低了反胶束后萃取蛋白过程中废水排放量同时也降低了干燥蛋白所需的能耗。
(5)在蛋白后萃取的过程中通过醇洗进行蛋白纯化的同时也回收了表面活性剂，提高了生产效率。
(6)采用氧化铝柱层析柱法分离阴离子和非离子表面活性剂，该方法简便易行，分离条件温和。
附图说明
图1为本发明混合反胶束体系萃取大豆蛋白过程中同时提纯和回收表面活性剂的方法的工艺流程。
具体实施方式
本发明以下结合实施例和附图1作进一步描述，并不是限制本发明：
本发明的方案是使用混合反胶束体系萃取大豆蛋白，用通过醇洗纯化蛋白的同时回收表面活性剂。
首先配制混合反胶束溶液：所用的表面活性剂为阴离子型和非离子型表面活性剂复配而成的。将两种表面活性剂按照一定的比例和浓度加入相应体积的溶剂和助溶剂、适量的KCl-磷酸盐缓冲溶液，超声使其透明。
其中阴离子表面活性剂可以是丁二酸二异辛酯磺酸钠(AOT)，十二烷基硫酸钠(SDS)中的一种，非离子表面活性剂是指Tween系列，如Tween60(聚氧乙烯失水山梨醇硬脂酸酯)中的一种。表面活性剂总浓度为50-110g／L，两种表面活性剂的配比为1：1-7：3。有机溶剂为异辛烷、环己烷、正庚烷中的任意一种，助溶剂为正辛醇；形成反胶束的缓冲溶液为KCl-磷酸盐或者NaCl-磷酸盐。其中有机溶剂与助溶剂的比例为4：1，缓冲溶液的pH为6-9、加入量为30-50ml／L，使反胶束体系中水与表面活性剂的摩尔比W0值为16-24。
分离步骤参照图1所示，关键步骤工艺参数如下：
反胶束前萃取步骤：将全脂大豆粉按一定浓度加入反胶束体系中，超声辅助萃取一定时间，离心分离，取上清液。
其中全脂豆粉加入量为15g／L-30g／L，超声波功率为210W-240W，萃取温度为35℃-45℃，萃取时间为40-60min，离心分离转速为3000-6000r／min，离心时间为10-15min。
反胶束后萃取步骤：将前萃后的上清液旋转蒸发蒸发掉大部分溶剂，加入等体积的乙醇-KCl-缓冲溶液进行超声辅助后萃取，离心分离，上层为含有溶剂的混合油，下层为蛋白水溶液。
旋转蒸发的条件为转速为40-50r／min，温度45-50℃，真空度<80kpa，缓冲溶液中乙醇的浓度为(V／V)10％-15％，pH为7-9，KCl的浓度为1.0-1.3mol／L，超声辅助萃取条件为超声波的频率为20-50KHz，功率为180W-210W，萃取温度为35℃-40℃，萃取时间为30min-40min，萃取完成后离心分离，转速为3000-4000r／min，离心时间为8-10min。
醇洗纯化步骤：取后萃分离的混合油和蛋白液，在搅拌的情况下，分别加入一定浓度乙醇，使水相中乙醇的体积分数为60％-70％，在振荡器上振荡20-30min，离心分离，浆状物冷冻干燥，即得到蛋白产品，混合油在85℃-90℃水浴中旋转蒸发，蒸脱溶剂后即得到油脂。收集离心分离后的乙醇水溶液，通过装有经过110℃活化过的氧化铝的柱子，在柱子下面接收到乙醇表面活性剂溶液，经过70-80℃旋转蒸发得到乙醇和非离子型表面活性剂，用40-50℃浓度为95％的乙醇洗脱柱子，在柱子下面接收到乙醇表面活性剂溶液，经过70-80℃旋转蒸发得到乙醇和离子型表面活性剂。
实施例1
将100g经过预处理的全脂大豆粉加入到4L浓度为80g/L质量比为7：3的AOT-Tween60反胶束溶液中，反胶束溶液中，缓冲液为pH7.0、KCl浓度0.10mol／L的KCl-磷酸盐缓冲液，超声辅助萃取，在温度45℃，功率180w的条件下萃取30min，后离心10min，得到蛋白的前萃取率为85.83％。
得到蛋白前萃液3.8L，在45℃下旋转蒸发2h，得到浓缩液1.1L，加入等体积乙醇浓度为15％的1.0mol／L KCl-磷酸盐缓冲液，调节pH值8.0，超声辅助萃取，在温度40℃，功率210w的条件下萃取30min，后离心10min，上层溶液为混合油，下层溶液即为蛋白水溶液。在混合油中加入浓度为65％乙醇水溶液，在振荡器上振荡20min，使表面活性剂溶解在乙醇水溶液中，静置1h分离，上层混合油在85℃水浴中旋转蒸发，蒸脱溶剂后即得到油脂，油脂萃取率为92.37％，在蛋白液中，在搅拌的情况下，加入浓度为95％的乙醇1.3L，在振荡器上振荡25min，离心分离，转速为3000r／min，离心时间为10min。浆状物冷冻干燥，即得到蛋白产品；蛋白后萃率88.64％，蛋白总萃取率为76.08％。收集分离后的乙醇溶液，通过氧化铝层析柱，接收到乙醇表面活性剂溶液，经过70-80℃旋转蒸发得到乙醇和非离子型表面活性剂，将1L浓度为95％的乙醇加热到40-50℃，缓慢加入柱子，在柱子下面接收到乙醇表面活性剂溶液，经过70-80℃旋转蒸发得到乙醇和离子型表面活性剂。分别将两种表面活性剂放入烘箱中至恒重，表面活性剂回收率79.82％，乙醇水溶液旋蒸后回收率67.56％。
实施例2
将15g经过预处理的全脂大豆粉加入到500mL浓度为50g／L质量比为1：1的SDS-Tween60反胶束溶液中，超声辅助萃取，在温度35℃，功率240w的条件下萃取30min，后离心10min，得到蛋白的前萃取率为83.62％。得到蛋白前萃液470mL，在45℃下旋转蒸发30min，得到浓缩液100ml，加入等体积乙醇浓度为15％的1.2mol／L KCl-磷酸盐缓冲液，超声辅助萃取，后离心10min。在混合油中加入浓度为67％乙醇水溶液，在振荡器上振荡20min，静置30min分离，油脂萃取率为90.22％，在蛋白液中，加入浓度为95％的乙醇120ml，在振荡器上振荡20min，离心分离后浆状物冷冻干燥，即得到蛋白产品；蛋白后萃率为86.41％，蛋白总萃取率为72.25％。收集分离后的乙醇水溶液，先通过氧化铝层析柱的乙醇表面活性剂溶液，经过70-80℃旋转蒸发得到乙醇和非离子型表面活性剂，将150ml浓度为95％的乙醇加热到40-50℃，缓慢加入柱子，在柱子下面接收到乙醇表面活性剂溶液，经过70-80℃旋转蒸发得到乙醇和离子型表面活性剂。分别将两种表面活性剂放入烘箱中至恒重，表面活性剂回收率79.82％，乙醇水溶液旋蒸后回收率67.56％。表面活性剂回收率73.22％。乙醇水溶液旋蒸后回收率65.61％。
实施例3
将150g经过预处理的全脂大豆粉加入到5L浓度为90g／L质量比为6：4的SDS-Tween85反胶束溶液中，超声辅助萃取，在温度40℃，功率210w的条件下萃取30min，后离心10min，得到蛋白的前萃取率为89.37％。得到蛋白前萃液4.8L，在50。C下旋转蒸发3h，得到浓缩液1.2L，加入等体积乙醇浓度为15％的1.1mol／L KCl-磷酸盐缓冲液，超声辅助萃取，后离心10min。在混合油中加入浓度为67％乙醇水溶液，在振荡器上振荡20min，静置30min分离，油脂萃取率为93.16％，在蛋白液中，加入浓度为95％的乙醇1.3L，在振荡器上振荡20min，离心分离10min。蛋白后萃率为90.33％，蛋白总萃取率为80.72％。收集分离后的乙醇水溶液，收集分离后的乙醇水溶液，先通过氧化铝层析柱的乙醇表面活性剂溶液，经过70-80℃旋转蒸发得到乙醇和非离子型表面活性剂，将1.51浓度为95％的乙醇加热到40-50℃，缓慢加入柱子，在柱子下面接收到乙醇表面活性剂溶液，经过70-80℃旋转蒸发得到乙醇和离子型表面活性剂。分别将两种表面活性剂放入烘箱中至恒重，表面活性剂回收率79.82％，乙醇水溶液旋蒸后回收率67.56％。在15℃下结晶3h析出表面活性剂，表面活性剂回收率76.54％。乙醇水溶液旋蒸后回收率62.57％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的范围之内。
Claims (10)
1.一种萃取大豆蛋白并提纯和回收表面活性剂的方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤：
S1配制混合反胶束体系，所述混合反胶束体系包括表面活性剂、有机溶剂、助溶剂、缓冲溶液，所述表面活性剂由阴离子表面活性剂和非离子型表面活性剂复配而成，其中，所述混合反胶束体系中表面活性剂总浓度为50-110g／L，有机溶剂与助溶剂的体积比为4：1，缓冲溶液的pH为6-9、加入后使所述混合反胶束体系中水与表面活性剂的摩尔比W0值为16-24，阴离子表面活性剂和非离子型表面活性剂的体积配比为1：1-7∶3；
S2将大豆粉与步骤S1中制备的混合反胶束体系混合，所述大豆粉加入量为15-30g／L，混合后利用超声波辅助萃取，之后固液分离得到含有蛋白和油脂的蛋白前萃液；
S3将步骤S2中制备的蛋白前萃液旋转蒸发至有机溶剂蒸脱的65％-70％以回收部分有机溶剂得到蛋白前萃液的浓缩液；
S4将萃取用的缓冲溶液与步骤S3中制备的蛋白前萃液的浓缩液混合，反萃取得到蛋白水溶液和混合油，实施该步骤时，先用等体积的乙醇和萃取用的缓冲溶液的混合液对蛋白前萃液进行超声辅助后萃取，然后离心分离，上层为混合油下层为蛋白水溶液；
S5分别对步骤S4中制备的蛋白水溶液和混合油进行醇洗纯化，醇洗后的混合液经柱层析分离回收表面活性剂，其中，
S51在蛋白液中，在搅拌的情况下，加入浓度为95％的乙醇，使两者混合后乙醇的体积分数为60％-70％，之后振荡使表面活性剂溶解在乙醇水溶液中，分离得到的浆状物冷冻干燥后得到蛋白产品；
S52在混合油中，加入体积分数为60％-70％的乙醇水溶液，振荡后使表面活性剂溶解在乙醇水溶液中，静置分离，上层混合油在85℃-90℃水浴中旋转蒸发，蒸脱有机溶剂后即得到油脂；
S53分别收集步骤S51、S52中分离后的乙醇水溶液，使之通过装有110℃活化4-5小时的氧化铝的柱子，在柱子下面接收到乙醇与表面活性剂的混合液，经过旋转蒸发得到乙醇和非离子型表面活性剂，用40-50摄氏度的浓度为95％的乙醇洗脱柱子，在柱子下面接收到乙醇与表面活性剂的混合液，经过旋转蒸发得到乙醇和离子型表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的萃取大豆蛋白并提纯和回收表面活性剂的方法，其特征在于，步骤S1中制备的混合反胶束体系中，阴离子表面活性剂可以是丁二酸二异辛酯磺酸钠(AOT)、十二烷基硫酸钠(SDS)中的一种，非离子表面活性剂为Tween系列，如Tween60(聚氧乙烯失水山梨醇硬脂酸酯)中的一种。
3.根据权利要求2所述的萃取大豆蛋白并提纯和回收表面活性剂的方法，其特征在于，步骤S1中制备的混合反胶束体系中，形成反胶束的有机溶剂为异辛烷、环己烷、正庚烷中的任意一种，助溶剂为正辛醇；形成反胶束的缓冲溶液为KCl-磷酸盐或者NaCl-磷酸盐；其中缓冲溶液的pH为6-9、加入量为30-50ml／L，使反胶束体系中水与表面活性剂的摩尔比W0值为16-24。
4.根据权利要求3所述的萃取大豆蛋白并提纯和回收表面活性剂的方法，其特征在于，步骤S2中超声波功率为210-240W，萃取温度为35℃-45℃，萃取时间为40-60min，所述的固液分离为离心分离，转速为3000-6000r／min，离心时间为10-15min。
5.根据权利要求4所述的萃取大豆蛋白并提纯和回收表面活性剂的方法，其特征在于，步骤S3中所述有机溶剂的回收工艺为，旋转蒸发的条件为转速为40-50r／min，温度45-50℃，真空度<80kpa，旋转蒸发至溶剂蒸脱的65％-70％。
6.根据权利要求5所述的萃取大豆蛋白并提纯和回收表面活性剂的方法，其特征在于，步骤S4中所述的萃取用的缓冲溶液与步骤S3中制备的蛋白前萃液的浓缩液混合反萃取得到蛋白水溶液和混合油的工艺为，先用等体积的浓度为15％-20％(V／V)的乙醇和缓冲溶液对前萃液进行超声辅助后萃取，然后离心分离，上层为混合油下层为蛋白水溶液。
7.根据权利6所述的萃取大豆蛋白并提纯和回收表面活性剂的方法，
其特征在于，所述的后萃取蛋白过程为，萃取用的缓冲溶液和乙醇的混合液中乙醇的浓度为(V／V)10％-15％，缓冲溶液为pH为7-9的KCl浓度为1.0-1.3mol／L的磷酸盐缓冲液；超声辅助萃取条件为超声波的频率为20-50KHz，功率为180W-210W，萃取温度为35℃-40℃，萃取时间为30min-40min。
8.根据权利要求1所述的萃取大豆蛋白并提纯和回收表面活性剂的方法，其特征在于，步骤S5中所述的对蛋白水溶液和混合油进行醇洗纯化，并回收表面活性剂的工艺为，在蛋白液中，在搅拌的情况下，加入浓度为95％的乙醇，使两者混合后乙醇的体积分数为60％-70％，在振荡器上振荡20-30min，离心分离，转速为3000-4000r／min，离心时间为8-10min。浆状物冷冻干燥，即得到蛋白产品。
9.根据权利要求1所述的萃取大豆蛋白并提纯和回收表面活性剂的方法，其特征在于，步骤S5中所述的对蛋白水溶液和混合油进行醇洗纯化，并回收表面活性剂的工艺为，在混合油中，加入体积分数为60％-70％的乙醇水溶液，在振荡器上振荡20-30min，使表面活性剂溶解在乙醇水溶液中，静置1h分离，上层混合油在85℃-90℃水浴中旋转蒸发，蒸脱溶剂后即得到油脂。
10.根据权利要求1所述的萃取大豆蛋白并提纯和回收表面活性剂的方法，其特征在于，步骤S5中所述表面活性剂的回收工艺为，收集步骤S51、S52中分离后的乙醇水溶液，通过装有110℃活化4-5小时的氧化铝的柱子，在柱子下面接收到乙醇表面活性剂混合液，经过旋转蒸发得到乙醇和非离子型表面活性剂，用40-50摄氏度的浓度为95％的乙醇洗脱柱子，在柱子下面接收到乙醇表面活性剂混合液，经过旋转蒸发得到乙醇和离子型表面活性剂。
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