CN108003251A - 一种菠萝皮渣多糖的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种菠萝皮渣多糖的提取方法。本发明菠萝皮渣多糖的提取方法包括：预处理、脱脂、原料酶解、滤渣水提、浓缩、醇沉、脱蛋白、脱色素和干燥等步骤，其中采用木聚糖酶和果胶酶Y‑23的混合酶制剂，可有效提高菠萝皮渣多糖的提取率，随之加入三氯乙酸‑正丁醇混合溶液对粗多糖脱蛋白，加入X‑5大孔吸附树脂对脱蛋白后的多糖溶液脱色，通过各步骤条件的控制，可提高菠萝皮渣多糖的纯度。本发明方法简单、快速，与热水浸提法、超声波辅助提取法和纤维素酶提法相比，所得菠萝皮渣多糖提取率和纯度高，并具有较好的抗氧化活性，可用于制备功能性食品及化妆品等。

Description

一种菠萝皮渣多糖的提取方法

技术领域

本发明属于园艺作物产品深加工技术领域，具体地涉及一种菠萝皮渣多糖的提取方法。

背景技术

菠萝（Ananas comosus）又名凤梨、旺梨，是热带四大名果之一，具有解暑止渴、降压利尿和消食止泻等功效。据不完全统计，我国热带地区菠萝种植面积达6.7万hm²，产量达144万吨。在菠萝鲜食和加工过程中会产生大量皮渣，占果实重量的15~20%，其中总糖、水分和柠檬酸的比例与果肉相差无几，由于加工技术和相关研究匮乏，导致大量皮渣被丢弃，不仅造成资源浪费，还加重了环境污染。

多糖是菠萝皮渣的主要活性成分之一，研究发现菠萝皮渣多糖具有抗氧化、抗脂质过氧化和抗肿瘤作用，同时还可改善肠道内环境、抑制T和B淋巴细胞增殖、增强断奶猪仔的抗病能力。基于此，若将菠萝皮渣进行资源再利用来制备多糖对于提高菠萝深加工产业的附加值、延长菠萝产业链、指导其精深加工具有重要的现实意义。

目前，有关菠萝皮渣多糖提取工艺的研究报道多为水提醇沉法和超声波辅助提取法，其中水提醇沉法是多糖提取的最传统方法，其操作简便，成本低，不需特殊设备，但提取率较低。超声波辅助提取技术与热水浸提法相比，具有快速高效、省时节能等优点，但对操作要求高，设备投入大。酶提取技术是近年来被广泛应用到植物有效成分提取中的一项生物技术，其可降低提取条件，在比较温和的条件下加速有效成分的提取。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种菠萝皮渣多糖的提取方法。该工艺采用原料酶解、残渣水提、醇沉淀、脱蛋白和脱色素的方法，提取的菠萝皮渣多糖得率高、纯度好，对DPPH·自由基具有较强的清除活性。本发明提高了菠萝皮渣的利用率，实现资源的高效利用。

本发明的技术方案如下：一种菠萝皮渣多糖的提取方法，包括以下步骤：

（1）预处理：将经过筛选的菠萝皮渣经冷冻干燥后打粉，得菠萝皮渣干粉；

（2）脱脂：将步骤（1）所得菠萝皮渣干粉置于容器中，加入沸程规格30~60℃的石油醚回流提取1~4次，收集滤渣，自然晾干后备用；

（3）原料酶解：向步骤（2）制得的菠萝皮渣粉末中以1:20~1:40g/mL料液比加入蒸馏水，同时加入0.5~3.0%的复合酶，在40~65℃，pH4.0~7.0的水浴条件下进行酶解0.5~3.0h，酶解结束后加热灭活复合酶；将酶解液以4000~8000r/min的条件离心5~20min，分别收集上清液和滤渣；

（4）残渣水提：向步骤（3）所得滤渣中加入20~40倍重量的水，热水浸提1~3h，以转速3000~5000r/min离心5~20min，分别收集上清液和滤渣；滤渣重复提取1~2次，得上清液；

（5）浓缩：合并步骤（3）和（4）所得的上清液~，真空减压浓缩至原体积的1/4~1/6，得浓缩液；

（6）醇沉：向浓缩液中缓慢加入3~5倍体积的95%乙醇溶液进行沉淀并不断搅拌，4℃静置醇析过夜，以转速4000~5000r/min离心5~10min，收集沉淀，再用95%乙醇洗涤1~2次，得菠萝皮渣多糖沉析物；

（7）干燥：将洗涤后的菠萝皮渣多糖沉析物进行冷冻干燥，然后粉碎，过100目筛，得粗多糖；

（8）脱蛋白：将步骤（7）得到的粗多糖配制成质量浓度为5~10mg/mL的多糖溶液，加入三氯乙酸-正丁醇混合溶液，室温振荡1~4h，将其转移至分液漏斗中，室温静置2~3h后取下层溶液，得脱蛋白多糖溶液；

（9）脱色素：向步骤（8）得到的脱蛋白多糖溶液中加入5~25%（m/v）的大孔吸附树脂，混匀，室温振荡4~24h，抽滤，得脱色多糖溶液；

（10）将步骤（9）得到的脱色多糖溶液采用流动蒸馏水透析48~72h，后经冷冻干燥得到菠萝皮渣多糖。

进一步，所述步骤（1）中，所述菠萝皮渣冷冻干燥处理条件如下：温度为-40~-60℃，压力为6-15Pa，时间为24~36h，所述菠萝皮渣干粉目数为40~60目。

进一步的，所述步骤（3）中，所述复合酶为木聚糖酶和果胶酶Y-23的混合物，其中木聚糖酶和果胶酶Y-23的质量配比为3:1~1:3；木聚糖酶和果胶酶Y-23的质量配比优选为1:2。

优选地，所述步骤（3）中，原料酶解条件为：复合酶添加量2.2%、酶解时间2.1h、酶解温度53℃、pH6.0，整个酶解过程在旋转蒸发仪中进行，转速为130r/min。

进一步，所述步骤（4）中，热水浸提温度为90~100℃。

进一步，所述步骤（8）中，所述三氯乙酸-正丁醇混合溶液是由三氯乙酸溶液与正丁醇按体积比1:5~1:15混合制得，其中，三氯乙酸溶液浓度为10~20%；所述三氯乙酸-正丁醇混合溶液与多糖溶液体积比为2:1~1:2。

优选地，所述步骤（8）中，三氯乙酸溶液浓度为10%，三氯乙酸溶液与正丁醇体积比为1:10，三氯乙酸-正丁醇混合溶液与多糖溶液体积比为2:1。

进一步，所述步骤（9）中，所述大孔吸附树脂为X-5，整个脱色素过程在恒温摇床中进行，转速为150~200r/min。

进一步，所述步骤（10）中，所述透析袋的分子截留量为8-14kDa。

采用本发明的提取方法制得的菠萝皮渣多糖可用于制备功能性食品或化妆品。

本发明技术方案中，对复合酶辅助提取菠萝皮渣多糖的作用酶种类、复合酶配比进行了筛选，并对提取工艺条件进行了优化，获得最优的技术方案为：复合酶（木聚糖酶:果胶酶Y-23=1:2，M/M）添加量2.2%、酶解时间2.1h、酶解温度53℃、pH6.0；热水提取条件为：提取温度100℃，提取时间2h；同时将本优化工艺与传统热水法、超声波提取法、复合酶（木聚糖酶:果胶酶Y-23=1:2，M/M）提法和复合酶结合超声波提取法进行了对比，具体说明如下。

1、酶种类对菠萝皮渣多糖得率的影响：取菠萝皮渣干粉9份，每份1g，分别置于100mL三角瓶中，以蒸馏水为提取剂，控制料液比为1:30g/mL，向每份样品中加入2.0%的木瓜蛋白酶、果胶酶Y-23、纤维素酶、木聚糖酶、中性蛋白酶、复合酶1（纤维素酶:木聚糖酶=1:1）、复合酶2（果胶酶Y-23:木聚糖酶=1:1）、复合酶3（纤维素酶:果胶酶Y-23=1:1），保持浸提液自然pH(6.0)，在旋转蒸发仪上50℃水浴酶解2h，后将其转移至沸水浴中灭酶10min，离心，收集上清液和残渣。向残渣中继续加入30mL蒸馏水，沸水浸提2h，离心，收集上清液和残渣，残渣重复热水提取1次。合并上述上清液，经浓缩、醇沉、脱蛋白和脱色后，收集冻干粉测定多糖含量，并计算多糖得率（以同条件下热水浸提法为参考）。

结果表明，复合酶法提取可以显著提高菠萝皮渣多糖得率，通过比较不同酶的作用效果，最终选用复合酶2（果胶酶Y-23:木聚糖酶=1:1）作为本试验的用酶（图1）。

2、复合酶配比对菠萝皮渣多糖得率的影响：固定复合酶添加量2.0%、酶解时间2h、酶解温度50℃、pH5.5，分别探讨复合酶比例3:1、2:1、1:1、1:2、1:3对菠萝皮渣多糖得率的影响，进而确定复合酶的最佳比例。

结果表明，当复合酶配比即木聚糖酶与果胶酶Y-23比例为3:1~1:2时，菠萝皮渣多糖得率随着复合酶配比中果胶酶Y-23比例的增大不断增大，当复合酶配比为1:2时，菠萝皮渣多糖得率达到最大，此后继续增加果胶酶Y-23用量，菠萝皮渣多糖得率反而有所下降。因此确定木聚糖酶与果胶酶Y-23的复合酶配比为1:2（图2）。

3、复合酶辅助提取菠萝皮渣多糖的工艺参数确定

（1）不同浸提条件对菠萝皮渣多糖得率的影响：单因素试验设定因素为复合酶添加量、酶解温度、酶解时间、pH，分别考察4个因素对菠萝皮渣多糖得率的影响。固定酶解时间2h、酶解温度50℃、pH5.5，复合酶添加量分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0%；固定复合酶添加量2.0%、酶解时间2h、pH5.5，酶解温度分别为40、45、50、55、60、65℃；固定复合酶添加量2.0%，酶解时间2h，酶解温度50℃，酶解时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h；固定复合酶添加量2.0%、酶解时间2h、酶解温度50℃，pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0。

结果表明，当复合酶用量为0.5~2.0%时，菠萝皮渣多糖得率逐渐增大，当添加量为2.0%时，菠萝皮渣多糖得率达到最大，此后继续增加复合酶添加量，菠萝皮渣多糖得率反而开始下降。这可能是因为随着复合酶添加量的增加，酶与底物接触的机会增加，多糖更快的被分离出来；当复合酶添加量达到一定程度后，酶分子已经饱和，一部分酶分子没有机会与底物结合，底物被水解的速度降低，进而影响多糖的得率。故选择2.0%为最适复合酶用量（图3）。菠萝皮渣多糖得率随着提取温度的升高逐渐增大，当温度为50℃时，多糖得率达到最大，此后继续升高温度，多糖得率逐渐降低。这可能是因为酶是一类具有最适反应温度范围的物质，在较低温度时升温可以提高酶的活性，而温度过高则会导致酶受热变性而失活，因此最佳提取温度应控制在50℃（图4）。酶解时间为0.5~2.0h时，多糖得率随着酶解时间的延长不断增大，当时间为2.0h时，菠萝皮渣多糖得率达到最大，此后继续延长酶解时间，多糖得率逐渐下降。酶解时间过短，酶解不充分，多糖得率较低；酶解时间过长，提取出的多糖长时间暴露在环境中，易于分解或结构发生变化，进而导致多糖得率开始下降。因此选择2.0h为较优酶解时间（图5）。当pH为4.0~6.0时，多糖得率随着pH的增加而增大，当pH为6.0时，菠萝皮渣多糖得率达到最大。此后，随着pH的增加，多糖得率开始下降。这可能是因为当pH低于6.0时，随着pH的增加，酶活力逐渐增大，酶解越来越充分，在pH为6.0时，酶活力最大，多糖得率达到最大；此后继续增加pH，过碱的环境破坏了酶的活性，最终造成多糖得率降低。综合考虑，选择pH为6.0（图6）。

（2）提取工艺参数优化：在单因素试验的基础上，以复合酶添加量、酶解温度、酶解时间、pH为自变量，以多糖得率为响应值，根据Box-Behnken试验设计的方法，进行4因素3水平的响应面优化试验，以确定最佳的提取工艺，因素水平见表1。

利用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行二次回归分析，得到二次多项回归方程为：Y=-56.756+0.500A+2.685B+2.285C+13.521D+0.0310AB+5.000×10^-3 AC+1.000×10^-3 AD+0.080BC-0.030BD+0.050CD-5.513×10^-3 A ²-1.026B ²-0.696C ²-1.141D ²。式中：Y代表菠萝皮渣多糖得率；A代表酶解温度，B代表酶解时间，C代表复合酶添加量，D代表pH。对二元回归方程的模型进行显著性检验及方差分析，结果见表3。

由表3可知，回归模型P<0.0001，达到极显著（p<0.01），在统计学上有意义。失拟项的P>0.05，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。模型的校正决定系数R ² =0.9443，说明模型拟合程度较好，能够准确可靠地预测和分析多糖得率的大小。方程的一次项A、C，二次项A ²、B ²、C ² 、D ²对多糖得率影响极显著，一次项B对多糖得率影响显著，交互项AB、AC、AD、BC、BD、CD对多糖得率均无显著影响。4个因素对多糖得率的影响主次顺序为A>C>B>D，即酶解温度>复合酶添加量>酶解时间>pH。

由图7a可知，酶解温度对应的曲线比酶解时间对应的曲线陡峭，表明酶解温度对菠萝皮渣多糖得率的影响比酶解时间显著；等高线非椭圆形，说明两个因素的交互作用不显著。由图7b可知，酶解温度对菠萝皮渣多糖得率的影响比复合酶添加量显著；依次比较后得出影响菠萝皮渣多糖得率的影响因素大小顺序依次为：A>C>B>D，即酶解温度>复合酶添加量>酶解时间>pH。由图7可知，当酶解时间不变时，随着酶解温度的升高菠萝皮渣多糖得率呈先增大后减小趋势，当酶解温度不变时，随着酶解时间的延长菠萝皮渣多糖得率也呈现先增大后减小的趋势，由此可见，酶解温度和酶解时间对菠萝皮渣多糖得率的交互影响存在极大值，但两个因素的交互作用影响不显著。以此类推，分别比较酶解温度、酶解时间、复合酶添加量和pH这四个因素中每两个因素的交互作用对菠萝皮渣多糖得率的影响结果，均先升高后降低，响应值均呈抛物线形趋势，因此回归方程有极大值。但各因素的交互作用均不显著，对多糖得率的影响由强到弱依次为AB>BC>AC>CD>BD>AD。

通过软件分析，得到菠萝皮渣多糖提取的最佳条件为：酶解温度53℃，酶解时间2.1h，复合酶（木聚糖酶:果胶酶Y-23=1:2）添加量=2.2%，pH6.0，在此条件下，预测多糖得率为2.10%。为了证实该方程的准确性和实用性，进行验证实验。验证试验结果表明，在最佳提取条件下，菠萝皮渣粗多糖的提取率为2.07%，与预测值相差不大，说明该方程与实际情况的拟合较好，充分证实了所建模型的正确性，说明响应面法适用于菠萝皮渣粗多糖物质提取工艺进行回归分析和参数优化。

4、不同浸提方法的比较：取菠萝皮渣干粉5份，每份1g，分别置于100mL三角瓶中，以蒸馏水为提取剂，控制料液比为1:30g/mL，分别按以下5种方法提取菠萝皮渣多糖。5种方法的具体浸提条件如下：

（1）热水提取法：浸提温度53℃、浸提时间4.1h；

（2）超声波提取法：超声功率120W、超声时间4.1h、超声水浴温度53℃；

（3）复合酶提法：复合酶（木聚糖酶:果胶酶Y-23=1:2）用量2.2%、酶解温度53℃、酶解时间2.1h、pH6.0，90℃灭酶30min；

（4）超声辅助复合酶酶提法：超声波功率120W、复合酶（木聚糖酶:果胶酶Y-23=1:2）用量2.2%、酶解温度53℃、酶解时间2.1h、pH6.0，90℃灭酶30min；

（5）复合酶辅助热水浸提法：按本发明优化的提取工艺进行。

结果表明，复合酶辅助热水浸提法所得菠萝皮渣多糖得率最大，分别比热水提取法、超声波提取法、复合酶提法、超声辅助复合酶提法高出65.70%、59.90%、25.12%和35.26%（图8）。

5、菠萝皮渣多糖清除DPPH·自由基能力测定：分别吸取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL多糖溶液各2mL，加入0.2mmol/L DPPH溶液各2mL，摇匀，在黑暗条件下避光反应30min，于517nm下比色，以Vc作阳性对照。清除率计算公式：清除率(%)=[1-(A_i-A_j)/A₀]×100%，式中：A_i为不同多糖浓度下的吸收度；A_j为用无水乙醇代替DPPH溶液测得的不同多糖溶液本底吸光度；A₀为用水代替多糖样品时测得的空白对照吸光度；每个浓度平行做3次。

结果表明，在质量浓度为0.1-3.0mg/mL的范围内，菠萝皮渣多糖对DPPH·的清除能力与多糖质量浓度呈正相关，在3.0mg/mL时，菠萝皮渣多糖对DPPH·的最大清除率为92.33%，与同浓度的Vc的清除能力相当，说明本工艺提取的菠萝皮渣多糖具有良好的体外抗氧化活性（图9）。

本发明相对于现有技术具有如下有益效果：

（1）本发明采用菠萝鲜皮冻干后制粉的方式。冻干后破碎更完全，比鲜皮直接破碎提取多糖得率高，且鲜皮中营养成分损失少；

（2）本发明采用复合酶辅助热水法提取菠萝皮渣多糖，复合酶能酶解细胞壁，有利于多糖的溶出，热水法采用较高的提取温度进行浸提，可获得较高的多糖得率，两种浸提方法的结合提取，解决了多糖提取率低的问题，且过程操作简单，比热水浸提法、超声波提取法和酶提法的多糖得率高；

（3）本发明可以获得纯度较高的菠萝皮渣多糖，并具有较强的抗氧化活性，本工艺方法具有安全、高效、节能降耗等特点，属于环境友好型绿色工艺；

（4）本发明方法可为后续菠萝皮渣多糖的进一步纯化提供了理论参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1酶种类对菠萝皮渣多糖得率的影响

图2复合酶配比对菠萝皮渣多糖得率的影响

图3复合酶添加量对菠萝皮渣多糖得率的影响

图4酶解温度对菠萝皮渣多糖得率的影响

图5酶解时间对菠萝皮渣多糖得率的影响

图6pH对菠萝皮渣多糖得率的影响

图7不同浸提条件对菠萝皮渣多糖得率影响曲面图

图8不同浸提方法对菠萝皮渣多糖的影响

图9不同浓度菠萝皮渣多糖对DPPH·的清除能力。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1 取5g菠萝皮渣干粉，加入150mL蒸馏水，1.5%复合酶（木聚糖酶:果胶酶Y-23质量比=1:2），保持浸提液自然pH（6.0），于旋转蒸发仪中进行水解反应，控制酶解温度为50℃、酶解时间为2h，转速为130rpm/min，提取结束后沸水浴灭酶10min，8000rpm离心10min，取上清，残渣加入150mL蒸馏水，将其转移至水浴锅中于100℃浸提2h，提取结束后5000rpm离心10min，取上清液，残渣重复提取1次。利用减压蒸发将提取液体积浓缩至原体积1/5，加入浓缩液4倍体积95%的乙醇，4℃条件下静置过夜，以转速5000r/min离心10min，收集沉淀并冷冻干燥；将冻干粉复溶于少许蒸馏水中，用三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白，用X-5大孔树脂脱色，透析48h后冻干即得菠萝皮渣多糖。此时菠萝皮渣多糖得率为2.09%。

实施例2 取5g菠萝皮渣干粉，加入150mL蒸馏水，2.0%复合酶（木聚糖酶:果胶酶Y-23质量比=1:2），保持浸提液自然pH（6.0），于旋转蒸发仪中进行水解反应，控制酶解温度为50℃、酶解时间为1.5h，转速为130rpm/min，提取结束后沸水浴灭酶10min，6000rpm离心10min，取上清，残渣加入200mL蒸馏水，将其转移至水浴锅中于100℃浸提2h，提取结束后5000rpm离心10min，取上清液，残渣重复提取1次。利用减压蒸发将提取液体积浓缩至原体积1/5，加入浓缩液4倍体积95%的乙醇，4℃条件下静置过夜，以转速4500r/min离心10min，收集沉淀并冷冻干燥；将冻干粉复溶于少许蒸馏水中，用三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白，用X-5大孔树脂脱色，透析48h后冻干即得菠萝皮渣多糖。此时菠萝皮渣多糖得率为1.97%。

实施例1-2中所使用的菠萝皮渣干粉按如下步骤制得：将经过筛选的新鲜菠萝皮渣进行冷冻干燥：温度为-50℃，压力为10Pa，冷冻时间为36h，将冻干后的菠萝皮渣打粉并过60目筛。

实施例1-2中菠萝皮渣干粉的脱脂方法为：用沸程规格30~60℃的石油醚回流提取2次，收集滤渣，自然晾干后备用。

实施例1-2中三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白的步骤如下：配制三氯乙酸（20%）-正丁醇混合溶液（1:10，v/v），将其与多糖溶液以2:1的体积比混合，置于30℃恒温摇床中，在185rpm/min条件下振荡2h，室温静置2h后将水相和有机相分开，保留下层水相。操作过程中蛋白质出现在两相界面处，弃掉蛋白质。

实施例1-2中X-5大孔吸附树脂法脱色步骤为：将新买的树脂经前处理后，以10%的添加量加入到脱蛋白后的多糖溶液中，于恒温摇床中以30℃、185rpm/min的条件振荡24h，抽滤，得脱色多糖溶液。

实施例1-2中透析方法为：将脱色后的多糖溶液转移至截留量为8-14kDa的透析袋，流动蒸馏水透析48h。

实施例3采用以下步骤实现本发明：

（1）预处理：将经过筛选的菠萝皮渣进行冷冻干燥后打粉，过40目筛，得菠萝皮渣干粉；冷冻干燥条件：温度-40℃，压力6Pa，时间24h；

（2）脱脂：将步骤（1）所得菠萝皮渣干粉置于容器中，加入沸程规格30~60℃的石油醚回流提取3次，收集滤渣，自然晾干后备用；

（3）原料酶解：向步骤（2）制得的菠萝皮渣粉末中以1:40g/mL料液比加入蒸馏水，同时加入2.2%的复合酶（木聚糖酶:果胶酶Y-23质量比=1:3），在53℃，pH6.0的水浴条件下在转速为130r/min的旋转蒸发仪中进行酶解2.1h，酶解结束后沸水浴灭酶10min；将酶解液以4000r/min的条件离心20min，分别收集上清液和滤渣；

（4）残渣水提：向步骤（3）所得滤渣中加入20倍重量的水，100℃热水浸提1h，以转速5000r/min离心10min，分别收集上清液和滤渣；滤渣重复提取1~2次，得上清液；

（5）浓缩：合并步骤（3）和（4）所得的上清液~，真空减压浓缩至原体积的1/6，得浓缩液；

（6）醇沉：向浓缩液中缓慢加入5倍体积的95%乙醇溶液进行沉淀并不断搅拌，4℃静置醇析过夜，以转速5000r/min离心5~10min，收集沉淀，再用95%乙醇洗涤1~2次，得菠萝皮渣多糖沉析物；

（7）干燥：将洗涤后的菠萝皮渣多糖沉析物进行冷冻干燥，然后粉碎，过100目筛，得粗多糖；

（8）脱蛋白：将步骤（7）得到的粗多糖配制成5mg/mL的多糖溶液，加入三氯乙酸-正丁醇混合溶液，室温振荡4h，将其转移至分液漏斗中，室温静置2h后取下层溶液，得脱蛋白多糖溶液；其中，三氯乙酸-正丁醇混合溶液是由三氯乙酸溶液与正丁醇按体积比1:5混合制得，其中，三氯乙酸溶液浓度10%；所述三氯乙酸-正丁醇混合溶液与多糖溶液体积比为1:1；

（9）脱色素：向步骤（8）得到的脱蛋白多糖溶液中加入25%（m/v）的大孔吸附树脂X-5，混匀，在恒温摇床中进行室温振荡脱色12h，转速为200r/min，振荡结束，抽滤，得脱色多糖溶液；

（10）将步骤（9）得到的脱色多糖溶液采用装有流动蒸馏水、分子截留量为8-14kDa的透析袋透析60h，后经冷冻干燥得到菠萝皮渣多糖。

实施例4采用以下步骤实现本发明：

（1）预处理：将经过筛选的菠萝皮渣进行冷冻干燥后打粉，过50目筛，得菠萝皮渣干粉；冷冻干燥条件：温度-60℃，压力15Pa，时间30h；

（2）脱脂：将步骤（1）所得菠萝皮渣干粉置于容器中，加入沸程规格30~60℃的石油醚回流提取4次，收集滤渣，自然晾干后备用；

（3）原料酶解：向步骤（2）制得的菠萝皮渣粉末中以1:20g/mL料液比加入蒸馏水，同时加入3.0%的复合酶（木聚糖酶:果胶酶Y-23质量比=3:1），在40~65℃，pH4.0~7.0的水浴条件下进行酶解3h，酶解结束后沸水浴灭酶10min；将酶解液以8000r/min的条件离心5min，分别收集上清液和滤渣；

（4）残渣水提：向步骤（3）所得滤渣中加入40倍重量的水，90℃热水浸提3h，以转速3000r/min离心20min，分别收集上清液和滤渣；滤渣重复提取1~2次，得上清液；

（5）浓缩：合并步骤（3）和（4）所得的上清液~，真空减压浓缩至原体积的1/4，得浓缩液；

（6）醇沉：向浓缩液中缓慢加入3倍体积的95%乙醇溶液进行沉淀并不断搅拌，4℃静置醇析过夜，以转速4000r/min离心5~10min，收集沉淀，再用95%乙醇洗涤1~2次，得菠萝皮渣多糖沉析物；

（7）干燥：将洗涤后的菠萝皮渣多糖沉析物进行冷冻干燥，然后粉碎，过100目筛，得粗多糖；

（8）脱蛋白：将步骤（7）得到的粗多糖配制成5mg/mL的多糖溶液，加入三氯乙酸-正丁醇混合溶液，室温振荡1h，将其转移至分液漏斗中，室温静置3h后取下层溶液，得脱蛋白多糖溶液；其中，三氯乙酸-正丁醇混合溶液是由三氯乙酸溶液与正丁醇按体积比1:15混合制得，其中，三氯乙酸溶液浓度15%；所述三氯乙酸-正丁醇混合溶液与多糖溶液体积比为1.5:1；

（9）脱色素：向步骤（8）得到的脱蛋白多糖溶液中加入5%（m/v）的大孔吸附树脂X-5，混匀，在恒温摇床中进行室温振荡脱色24h，转速为150r/min，振荡结束，抽滤，得脱色多糖溶液；

（10）将步骤（9）得到的脱色多糖溶液转入装有流动蒸馏水、分子截留量为8-14kDa的透析袋透析72h，后经冷冻干燥得到菠萝皮渣多糖。

Claims (10)

1.一种菠萝皮渣多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）预处理：将经过筛选的菠萝皮渣经冷冻干燥后打粉，得菠萝皮渣干粉；

（2）脱脂：将步骤（1）所得菠萝皮渣干粉置于容器中，加入沸程规格30~60℃的石油醚回流提取1~4次，收集滤渣，自然晾干后备用；

（3）原料酶解：向步骤（2）制得的菠萝皮渣粉末中以1:20~1:40g/mL料液比加入蒸馏水，同时加入0.5~3.0%的复合酶，在40~65℃，pH4.0~7.0的水浴条件下进行酶解0.5~3.0h，酶解结束后加热灭活复合酶；将酶解液以4000~8000r/min的条件离心5~20min，分别收集上清液和滤渣；

（4）残渣水提：向步骤（3）所得滤渣中加入20~40倍重量的水，热水浸提1~3h，以转速3000~5000r/min离心5~20min，分别收集上清液和滤渣；滤渣重复提取1~2次，得上清液；

（5）浓缩：合并步骤（3）和（4）所得的上清液~，真空减压浓缩至原体积的1/4~1/6，得浓缩液；

（6）醇沉：向浓缩液中缓慢加入3~5倍体积的95%乙醇溶液进行沉淀并不断搅拌，4℃静置醇析过夜，以转速4000~5000r/min离心5~10min，收集沉淀，再用95%乙醇洗涤1~2次，得菠萝皮渣多糖沉析物；

（7）干燥：将洗涤后的菠萝皮渣多糖沉析物进行冷冻干燥，然后粉碎，过100目筛，得粗多糖；

（8）脱蛋白：将步骤（7）得到的粗多糖配制成质量浓度为5~10mg/mL的多糖溶液，加入三氯乙酸-正丁醇混合溶液，室温振荡1~4h，将其转移至分液漏斗中，室温静置2~3h后取下层溶液，得脱蛋白多糖溶液；

（9）脱色素：向步骤（8）得到的脱蛋白多糖溶液中加入5~25%的大孔吸附树脂，混匀，室温振荡4~24h，抽滤，得脱色多糖溶液；

（10）将步骤（9）得到的脱色多糖溶液采用流动蒸馏水透析48~72h，后经冷冻干燥得到菠萝皮渣多糖。

2.根据权利要求1所述的菠萝皮渣多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述菠萝皮渣冷冻干燥处理条件如下：温度为-40~-60℃，压力为6-15Pa，时间为24~36h，所述菠萝皮渣干粉目数为40~60目。

3.根据权利要求1所述的一种菠萝皮渣多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所述复合酶为木聚糖酶和果胶酶Y-23的混合物，其中木聚糖酶和果胶酶Y-23的质量配比为3:1~1:3。

4.根据权利要求1所述的菠萝皮渣多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中，原料酶解条件为：复合酶添加量2.2%、酶解时间2.1h、酶解温度53℃、pH6.0，整个酶解过程在旋转蒸发仪中进行，转速为130r/min。

5.根据权利要求1所述的菠萝皮渣多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（4）中，热水浸提温度为90~100℃。

6.根据权利要求1所述的菠萝皮渣多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（8）中，所述三氯乙酸-正丁醇混合溶液由三氯乙酸溶液与正丁醇按体积比1:5~1:15混合制得，其中，三氯乙酸溶液浓度为10~20%；所述三氯乙酸-正丁醇混合溶液与粗多糖溶液体积比为2:1~1:2。

7.根据权利要求1或6所述的菠萝皮渣多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（8）中，所述三氯乙酸-正丁醇混合溶液由三氯乙酸溶液与正丁醇按体积比1:10混合制得，其中，三氯乙酸溶液浓度为10%；所述三氯乙酸-正丁醇混合溶液与粗多糖溶液体积比为2:1。

8.根据权利要求1所述的菠萝皮渣多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（9）中，所述大孔吸附树脂为X-5，所述脱色素过程在恒温摇床中进行，转速为150~200r/min。

9.根据权利要求1所述的菠萝皮渣多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（10）中，所述透析袋的分子截留量为8-14kDa。

10.根据权利要求1-9任一项制得的菠萝皮渣多糖在制备功能性食品或化妆品上的应用。