CN105158225B - 一种双光子激发荧光检测三聚氰胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双光子激发荧光检测三聚氰胺的方法。本方法利用双光子激发荧光方法检测三聚氰胺，而双光子激发荧光具有深穿透性，因此本方法能够在复杂环境中进行三聚氰胺的检测，应用范围广。本发明在复杂环境中三聚氰胺的检测方面具有巨大的应用潜力，可为三聚氰胺的监管提供新的检测手段。

Description

一种双光子激发荧光检测三聚氰胺的方法

技术领域

本发明属于化学分析领域，具体涉及一种双光子激发荧光检测三聚氰胺的方法。

背景技术

三聚氰胺(英文名：Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，简称三胺，又叫蜜胺，三聚氰酰胺，氰脲三酰胺，其含氮量为66％，是牛奶含氮量的4倍。

三聚氰胺是一种国家严禁用于宠物和人食品及动物饲料的化学物质，人或动物食用后诱发肾衰甚至死亡。2007年3月,美国发生多起因食用宠物食品而导致宠物中毒死亡事件。2008年9月，中国发生因食用三鹿婴幼儿奶粉导致婴幼儿产生肾结石病症的严重事件。两起事件的原因都是在食品或饲料中非法添加大剂量三聚氰胺。随着三聚氰胺引发的一系列食品安全事件的曝光，关于三聚氰胺的分析检测方法引起有关部门和科研工作者的高度重视。国家科技部于2008年9月28日向社会公开征集液态奶中三聚氰胺快速检测技术和产品。

2008年10月7日，国家标准委员会发布原料乳和乳制品中三聚氰胺的检测方法，规定了液相色谱、气相色谱质谱法、液相色谱质谱法三种标准测定方法。

超高效液相色谱法：在奶粉样品中加入三氯乙酸和醋酸铅溶液使蛋白质部分沉淀，过混合型阳离子交换柱(MCX)纯化,离心后用0.45μm滤膜过滤,用超高效液相色谱-质谱-质谱联用仪(UPLC2MS2MS)分析测定。与用相同溶剂配置的一组标准溶液测定的标准曲线对照读出三聚氰胺含量。优缺点：本法测定低含量三聚氰胺成份灵敏、结果准确，但仪器昂贵。

气相色谱-质谱联用法：样品经三氯乙酸使蛋白沉淀离心后过MCX固相萃取柱净化,氮气吹干、硅烷化衍生,再由气相色谱-质谱联用仪检测。优缺点：试剂用量少，精确度高，安全可行，但必须经过复杂的衍生步骤，操作繁琐，工作效率低。

离子色谱-紫外检测测定法：用乙腈为4:5(V/V)的比例沉降蛋白，用IonPac CS17色谱柱进行分离，配制三聚氰胺不同浓度的系列标准溶液，测其紫外光谱图，以标准品质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，同时用最小二乘法进行线性回归，得标准曲线回归方程为Y＝1.8697X－0.0050(r＝0.99995)，用样品的峰面积对照标准曲线回归方程即得样品浓度。优缺点：精确度高，无色谱干扰，重现性良好，但试验成本较高，柱子易污染，操作较复杂。

以上方法虽然各有其优点，但是均需要大型精密仪器，复杂的样品前处理和专业操作人员。根据我国对乳制品进行批批检测的规定要求，上述方法不能满足乳制品行业检测需求，开发快速、简便的检测方法非常重要。

除此之外，还有酶联免疫吸附法：取样品粉碎过20目分级筛并混合均匀，加甲醇后离心取上清液，用氮气吹干,加入PBS溶液充分溶解,用三聚氰胺定量检测试剂盒，混合三聚氰胺酶反应后在450nm波长下测量OD值。配置一组三聚氰胺标准溶液在酶标仪上测得的吸光度值绘制成标准曲线,对照标准曲线即可得三聚氰胺含量。优缺点：选择性好、灵敏度高、结果判断客观准确、实用性强、经济、安全，但不能够同时分析多种成分。

比色法：通过金纳米粒子与三聚氰胺结合形成复合物而发生团聚，导致金纳米粒子粒径变大，颜色发生变化，从而反映待测样品中三聚氰胺的含量。例如公开号为CN101846631A的中国专利通过金纳米粒子的制备、冠醚的衍生化、金纳米粒子偶联冠醚、运用金纳米粒子自组装和分子识别检测三聚氰胺；实际样品检测等步骤。根据金纳米粒子体系的颜色变化，可检测奶粉中的三聚氰胺含量。

然而，想要检测复杂环境中(如生物体内)三聚氰胺的含量，上述的这些方法受体内复杂环境的影响较大，难以实施。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种双光子激发荧光检测三聚氰胺的方法，用以解决现有技术在复杂环境中检测三聚氰胺实施难度较大的问题。

技术方案：本发明提供一种双光子激发荧光检测三聚氰胺的方法，按以下步骤进行：

步骤1，将HAuCl₄溶液加入到去离子水中，去离子水的加入量与HAuCl₄溶液体积比为80:0.25～120:0.25，优选100:0.25，加热至沸腾，然后，将柠檬酸钠溶液加入到沸腾液中，柠檬酸钠溶液的加入量与HAuCl₄溶液体积比为5.5:1～7.5:1，优选6:1，反应结束后停止搅拌，静置冷却至室温，得到含金纳米粒子的溶液；

步骤2，将上述得到的金纳米粒子溶液加入去离子水中，去离子水的加入量与金纳米粒子溶液体积比为1:1～1.2，优选1:1，加入不同浓度的三聚氰胺，混合均匀后，室温下放置10～15min，优选10min，得到混合溶液；

步骤3，将上述混合溶液加入去离子水，去离子水的加入量与混合溶液体积比为1:3.5～4，优选1:3.8，得到待测试样品；

步骤4，将激光束聚焦在待测试样品上，样品发出的发射光被与激发光源成直角的光纤收集，光纤连着单色器和计算机系统，在光谱仪之前放置一个短波通过750nm的过滤器，最大限度降低从激发光产生的散射。

步骤5，将所得双光子荧光信号对三聚氰胺浓度做曲线，从曲线上读出检测限以及检测范围。

上述步骤1中的HAuCl₄溶液的浓度为0.1mol/L；所述柠檬酸钠溶液的浓度为0.1g/mL。

上述步骤1中反应结束的判断方法为：加入柠檬酸钠溶液后，溶液5s后变成浅蓝色，1min后变成酒红色，继续反应15min后，反应结束。

在步骤1中，通过调节所加入柠檬酸钠溶液的体积，可以控制所得到的金纳米粒子的粒径，研究中发现，金纳米粒子的粒径不同，对三聚氰胺浓度的检测限不同，对准确度也有一定影响。金纳米粒子15nm时，背景信号小，噪音小，故样品的双光子荧光增强倍数较高，检测限较好，检测准确度更高。金纳米粒子50nm时，背景信号大，噪音大，故样品的双光子荧光增强倍数较低，检测限较差，检测准确度更低。因此，我们确定最合适的金纳米粒子粒径的范围是15～50nm。

在步骤1中，通过调节去离子水与HAuCl₄溶液的体积比，可以控制所得到的金纳米粒子溶液的浓度10.4～16.3nmol/L，研究中发现，金纳米粒子的浓度改变，主要会影响三聚氰胺的检测限和检测范围，理论上，金纳米粒子的浓度越大，检测限越好，检测范围越窄；金纳米粒子的浓度越小，检测限越差，检测范围越宽。

实际上，本发明所述检测方法可以根据实际检测需要改变金纳米粒子的浓度，从而改变三聚氰胺检测的检测限及检测范围。

上述步骤4中所述的激光束是用Avesta TiF-100M femtosecond Ti:sapphire振荡器做双光子荧光激发光源，其中输出激光脉冲中心波长在810nm，脉冲持续时间80fs，重复率84.5MHz。研究中发现，激光的功率对检测结果的影响是激光功率太小，双光子荧光信号太弱，检测的误差较大；激光功率适中，双光子荧光信号强，检测的误差较小；激光功率太大，金纳米粒子部分熔化，双光子荧光信号弱，检测的误差较大。积分时间对检测结果的影响同激光的功率，过短，双光子信号弱，误差大；适中，双光子荧光信号强，误差小；过长，金纳米粒子部分熔化，双光子荧光信号弱，检测的误差较大。因此，我们确定较合适的激光功率为功率为20～60mW，优选40mW；较合适的积分时间为2～10s，优选5s。

有益效果：本发明利用双光子激发荧光方法检测三聚氰胺，而双光子激发荧光具有深穿透性，因此本方法能够在复杂环境中进行三聚氰胺的检测，应用范围广。本发明在复杂环境中三聚氰胺的检测方面具有巨大的应用潜力，可为三聚氰胺的监管提供新的检测手段。

附图说明

图1为本发明实施例1所制得的金纳米粒子TEM图。

图2为本发明实施例1所得到的标准信号曲线图。

具体实施方式：

实施例1：

步骤1，制备金纳米粒子

所用的玻璃仪器都经过王水浸泡，蒸馏水清洗，烘干备用。0.25mL浓度为0.1mol/LHAuCl₄溶液加入到100mL去离子水中，加热至沸腾。1.88mL浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液加入到沸腾液中，溶液5s后变成浅蓝色，1min后变成酒红色。继续反应15min，停止搅拌，静置冷却至室温。得到浓度为13nmol/L的，粒径为15nm金纳米粒子溶液。金纳米粒子TEM图如图1所示。

步骤2，得到背景信号

取0.2mL上述步骤制备的金纳米粒子溶液用去离子水稀释1倍，加入0mL三聚氰胺，混合均匀后，放置10min。然后，取0.1ml样品，用0.38ml去离子水稀释，得到被测样品，将激光束聚焦在被测样品上，样品发出的发射光被与激发光源成直角的光纤收集，光纤连着单色器和计算机系统，在光谱仪之前放置一个短波通过750nm的过滤器，最大限度降低从激发光产生的散射，飞秒激光的功率为40mW，积分时间为5s。即得到背景信号。背景信号值为3。

步骤3，得到不同浓度的三聚氰胺的双光子荧光信号

重复步骤2，所不同的是加入三聚氰胺的量由0mL变为4μL浓度为1μmol/L，测其双光子荧光信号，即浓度为0.01μmol/L的三聚氰胺的信号。该信号值为3.3。

重复步骤2，所不同的是加入三聚氰胺的量由0mL变为1.2μL浓度为1μmol/L，即得浓度为0.03μmol/L的三聚氰胺的信号。该信号值为9。

重复步骤2，所不同的是加入三聚氰胺的量由0mL变为2.4μL浓度为1μmol/L，即得浓度为0.06μmol/L的三聚氰胺的信号。该信号值为18。

重复步骤2，所不同的是加入三聚氰胺的量由0mL变为4μL浓度为200μmol/L，即得浓度为2μmol/L的三聚氰胺的信号。该信号值为600。

如上所述，通过改变三聚氰胺的量及浓度，得到不同浓度的三聚氰胺的若干信号值。

步骤4，得到标准信号曲线

将所得到的双光子荧光信号对三聚氰胺浓度做曲线(纵坐标为双光子荧光增强倍数，即样品的双光子荧光信号除以背景信号值)，曲线方程：Y＝1.477+96.13X,R²＝0.9957,如图2所示。从图中可以读出本实施例的检测限为0.01μmol/L；检测范围为0.01-2μmol/L。

步骤5，通过检测待测样品的双光子信号值，对应上述曲线，得到样品中三聚氰胺的浓度。

实施例2

按实施例1所述步骤获得标准曲线，不同之处在于改变金纳米粒子的粒径为30nm。

实施例3

按实施例1所述步骤获得标准曲线，不同之处在于改变金纳米粒子的粒径为50nm。

实施例4

按实施例1所述步骤获得标准曲线，不同之处在于改变金纳米粒子的浓度为10.4nmol/L。

实施例5

按实施例1所述步骤获得标准曲线，不同之处在于改变金纳米粒子的浓度为16.3nmol/L。

实施例6

按实施例1所述步骤获得标准曲线，不同之处在于改变激光的功率及积分时间，分别为20mW、2s

实施例7

按实施例1所述步骤获得标准曲线，不同之处在于改变激光的功率及积分时间，分别为60mW、10s

实施例1～7的结果列表如下

	检测限(μmol/L)	检测范围(μmol/L)
			实施例1	0.01	0.20
实施例2	0.02	0.18
			实施例3	0.05	0.16
实施例4	0.04	0.25
			实施例5	0.01	0.18
实施例6	0.05	0.15
			实施例7	0.02	0.2

实施例8(应用试验)

以实施例1所得到标准信号曲线为例，对不同的浓度的三聚氰胺进行检测。结果如下：

由此可见，本发明所提供的检测方法，可以检测三聚氰胺的含量，而且误差率几乎为零。此外，本发明还可以检测复杂环境的三聚氰胺的含量，例如生物体内的三聚氰胺浓度。

Claims (5)

1.一种双光子激发荧光检测三聚氰胺的方法，其特征在于按以下步骤进行：

步骤1，将HAuCl₄溶液加入到去离子水中，去离子水的加入量与HAuCl₄溶液体积比为80:0.25～120:0.25，加热至沸腾，然后，将柠檬酸钠溶液加入到沸腾液中，柠檬酸钠溶液的加入量与HAuCl₄溶液体积比为5.5:1～7.5:1，反应结束后停止搅拌，静置冷却至室温，得到含金纳米粒子的溶液；

步骤2，将上述得到的金纳米粒子溶液加入去离子水中，去离子水的加入量与金纳米粒子溶液体积比为1:1～1.2，加入不同浓度的三聚氰胺，混合均匀后，室温下放置10～15min，得到混合溶液；

步骤3，将上述混合溶液加入去离子水，去离子水的加入量与混合溶液体积比为1:3.5～4，得到待测试样品；

步骤4，将激光束聚焦在待测试样品上，样品发出的发射光被与激发光源成直角的光纤收集，光纤连着单色器和计算机系统，在光谱仪之前放置一个短波通过750nm的过滤器，最大限度降低从激发光产生的散射；

步骤5，将所得双光子荧光信号对三聚氰胺浓度做曲线，从曲线上读出检测限以及检测范围；

所述步骤1中得到的金纳米粒子的粒径为15～50nm；

所述步骤1中得到的金纳米粒子溶液的浓度为10.4～16.3nmol/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1中的HAuCl₄溶液的浓度为0.1mol/L；所述柠檬酸钠溶液的浓度为0.1g/mL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1中反应结束的判断方法为：加入柠檬酸钠溶液后，溶液5s后变成浅蓝色，1min后变成酒红色，继续反应15min后，反应结束。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的激光束是用Avesta TiF-100Mfemtosecond Ti:sapphire振荡器做双光子荧光激发光源，其中输出激光脉冲中心波长在810nm，脉冲持续时间80fs，重复率84.5MHz。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于激光的功率为20～60mW；积分时间为2～10s。