CN102680105A - 一种纳米纤维膜血铅颜色传感器及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米纤维膜血铅颜色传感器及其检测方法。所述纳米纤维膜血铅颜色传感器的制备方法为：将硝化纤维素溶解于溶剂中，进行电纺制备纳米纤维，将纤维沉积到载片容器上；制备蛋白改性纳米金胶体，点板于纳米纤维膜中心，干燥后即可。检测方法为：将上述纳米纤维膜血铅颜色传感器与标准液作用，作出铅离子浓度标准曲线图；将上述纳米纤维膜血铅颜色传感器与待测血样作用，测量其光谱信息变化，从而得到其铅离子的浓度值。本发明直观、高效、灵敏的检测，呈现出一定规律的颜色变化；生产设备简单，成本低，样品不需要预处理，检测物质范围广，无有害物质，并可进行实时检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种新颖的纳米纤维膜血铅颜色传感器及其检测方法，属于纳米功能材料技术领域。
背景技术
铅是一种不可降解的重金属，由于其具有高密度、良抗蚀性、熔点低、柔软、易加工等特性，因此在许多工业领域中得到应用。我国是较早使用铅的国家之一，而今铅在为人类服务的同时，也给人类带来了许多可怕的麻烦，其广泛存在于家具、玩具、油漆等日常用品甚至是食品以及食品包装中。众多研究表明铅能够在人体内积聚而引起铅中毒，并且该中毒过程相当缓慢而且毒性隐蔽，毒性发作之前不易察觉。据世界卫生组织研究报道称，人体一旦被已遭铅污染的物质侵袭，铅就会在人体逐渐积聚，乃至发展到对机体的各个系统造成伤害，如血液系统、神经系统、泌尿系统、免疫系统等，深度铅中毒甚至会引发癌症。特别是对于儿童而言，由于其神经系统处于快速的生成和成熟时期，避免引起神经毒性作用的重要防御结构未发育完全，因此儿童对铅的吸收率及在体内滞留时间是成人5-8倍，铅对儿童的毒性作用，不仅表现在高浓度接触的状况下，即便是低剂量水平下，也会对儿童的健康成长造成很大的影响。针对上述现象，除了要加大国家食品卫生监测、环境监测、生活用品卫生安全监测的力度进行初级防御以外，还需要提供一种能够快速便捷的进行血铅检测的方法，降低血铅浓度检测极限，尽早察觉血铅中毒，从而采取有效的治疗措施，避免造成血铅深度中毒。
目前，国际上最常用的方法是原子吸收光谱法(AAS)，该方法是根据处于气态的基态原子在特定波长光的辐射下，原子外层电子对光的特征吸收这一现象建立起来的一种光谱分析方法。具有选择性强、干扰较小、准确度较高、分析速度快等优点；在使用原子发射光谱分析(AES)进行血铅检测时，可根据组成物质的气态原子或离子受激发后产生的光谱，从而建立的分析方法。该方法灵敏度高、准确度高、选择性好。此外还有微分电位溶出分析法(DPSA)、原子荧光分光光度法(AFS)、毛细管电泳法(CE)等血铅分析技术。但这些现有的检测方法都存在一些不足，所用仪器均属于大型紧密仪器，需要专业的技术人员才能完成测试，且仪器的费用相对较高，另外样品必须经过高温硝化或萃取，操作繁琐，无法实现实时检测，所以很难满足基层单位及环境样品的快速检测。专利CN1458515A制备出了一种铅检测试纸，该试纸是利用浸渍显色剂的滤纸与基板固定后进行铅离子检测，并与比色卡进行比对，从而得出铅离子浓度。但该种方法中使用的显色物质为玫瑰红酸钠，该溶液性质不稳定，使用使必须新鲜配制。此外，该种试纸的基板采用的是塑料材质，在检测过后存在会对环境造成二次污染的问题；德国MN公司也发明了铅离子检测试纸，但该种试纸存在预处理过程繁琐，重复实验困难，误差较大的缺点。上述试纸都只适用于食品、水质等铅检测，并不能在用于人体血液中铅含量的检测，因而急需研制一种可对铅中毒进行早期筛查和及时干预，具有操作简便、结果直观、易于分析、价格低廉、并且能够保证测试效果的血铅测试器件。
金纳米粒子作为一种对于多样的纳米尺度应用如化学感应、电化学、光学和生物领域等很有潜能的模块日益引起广泛的关注。由于其高表面能量，使得其会变得不稳定，需要通过合适的表面修饰来阻止沉积。而纳米金胶体能够稳定又迅速的吸附蛋白质，一方面纳米金胶体的稳定性得到了提高，与此同时蛋白质的生物活性并不会因此受到影响。由此制备的金探针可以依据结合蛋白不同定性对某种物质进行分析检测，采用裸眼即可观察，简单易行，成本低廉，已被成功应用于艾滋病病毒(HIV)抗体的定性检测、DNA识别与检测、生物传感器等领域。本发明将修饰蛋白后的纳米金粒子，通过疏水力、氢键以及静电作用固定于硝化纤维膜上，利用铅离子会加速纳米金的浸取反应，制备出颜色传感器，有望用于血铅检测。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种纳米纤维膜血铅颜色传感器，响应速度快，检测灵敏度高。
为达到上述目的，本发明提供了一种纳米纤维膜血铅颜色传感器，其特征在于，通过以下步骤制得：
第一步：在搅拌釜中将硝化纤维素原料溶于溶剂中，配制成质量百分比为0.5％-20％的硝化纤维素溶液，搅拌转速为50-200rpm，搅拌时间为6-7h；
第二步：在相对湿度20％-60％条件下，将第一步得到的硝化纤维素溶液以0.1-4mL/h的流速输入到静电纺丝设备的喷丝头上，同时将喷丝头连接10-40kV电源进行静电纺丝，将纺出的纳米纤维沉积到载片容器上，干燥后，得到纳米硝化纤维素膜；
第三步：将氯金酸原料溶于去离子水中，配制成浓度为1mM的氯金酸溶液，搅拌速度为20-100rpm；
第四步：将柠檬酸钠原料溶于去离子水中，配制成浓度为38.8mM的柠檬酸钠溶液；
第五步：将第三步得到的氯金酸溶液加热至100℃-150℃，待其沸腾后，迅速加入第四步得到的柠檬酸钠溶液，得到粒径为13-15nm的呈酒红色的纳米金胶体溶液，PH值调节至5-7；
第六步：在50-60℃条件下，将蛋白进行水浴退火，无搅拌条件下，将退火后的蛋白与去离子水配制成3μM的蛋白溶液；
第七步：将第六步得到的蛋白溶液加入到第五步得到的纳米金胶体溶液中，反应20-30分钟，得到蛋白改性后的纳米金溶液；
第八步：将第二步得到的纳米硝化纤维素膜裁剪成1cm×1cm的方块，用移液枪取5μL-30μL第七步得到的纳米金溶液，点板于裁剪好的纳米硝化纤维素膜中心，在室温下干燥15-20分钟；
第九步：取流动等离子水洗去第八步得到的纳米硝化纤维素膜上未牢固结合的改性胶体金溶液，在60-80℃条件下，真空干燥5分钟，得到中心有半径为0.5mm-3mm粉红色圆形印记的复合纳米硝化纤维素膜，即纳米纤维膜血铅检测颜色传感器。
优选地，所述的第一步中的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、四乙二醇、丙酮、甲基正丁基酮、甲基正戊基酮、甲基正乙基酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸正丁酯中的任意一种或几种的混合物。
优选地，所述的第二步中的干燥方法为60℃条件下，真空干燥1-2小时。
优选地，所述的第五步中的氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的质量比为10∶1。
优选地，所述的第六步中的蛋白为牛血清蛋白、小牛血清蛋白、牛血清蛋白结合肽、牛血清蛋白结合胰岛素、葡萄球菌A蛋白、羊抗人IgG、McAb、链霉亲和素、链霉抗生物素蛋白、羊抗兔IgG、卵白蛋白、亲和层析IgG、大豆凝集素或麦胚凝集素。
优选地，所述的第七步中的蛋白溶液与纳米金胶体溶液的质量比为1∶1。
本发明还提供了上述纳米纤维膜血铅颜色传感器的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
第一步：室温20-25℃条件下，将PbCl2与HNO3以1∶1的质量比，配制成不同浓度的铅离子溶液，作为标准液样本；
第二步：红外加热温度为60-70℃条件下，配制含有150mM氯化钠、5nM氯化钾、1mM氯化镁、1mM氯化钙、50-100mM硫代硫酸钠和200mM-250mM 3-巯基-1，2-丙二醇的混合反应溶液，即模拟人体血液环境；
第三步：红外加热温度为60-70℃条件下，将第一步得到的标准液样本分别加入到第二步得到的混合反应溶液中，然后将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于其中，反应10-15分钟；
第四步：取出第三步得到的纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以60-80Ib/in2速度处理1-2分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记随着铅离子浓度的升高而逐渐变淡；
第五步：利用光纤光谱测量系统检测其反射和吸收光谱，采用RGB颜色模式计算未检测空白样与第四步得到的标准液样本的Gabs颜色变化值，得到铅离子浓度与Gabs变化值(ΔGabs)之间线性关系，作出铅离子浓度标准曲线图；
第六步：在室温20-25℃条件下，取患者指腹的血样1mL，用8mL去离子水稀释后，加入1mL浓硝酸处理1-2小时；
第七步：将第六步得到的待测血样经离心后，取上层清液作为待检测样本；
第八步：红外加热温度为60-70℃条件下，将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于第七步得到的待检测样本中，反应10-15分钟；取出纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以60-80Ib/in2速度处理1-2分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记随着铅离子浓度的升高而逐渐变淡；利用光纤光谱仪检测其反射光谱，同时采用Lab颜色模式和RGB颜色模式计算，依据测试得到的反射强度值，并将该值与其对应波长进行积分计算，通过与国际照明委员会(CIE)颁布的颜色标准进行比对，计算出相应的颜色变化值，并与第四步得到的铅离子浓度标准曲线图进行比对，从而获得铅离子的具体浓度值。
优选地，所述的第一步中的铅离子水溶液的浓度为0.1μM-5pM。
进一步地，所述的第一步中的铅离子水溶液的浓度分别为0.1μM、0.05μM、0.01μM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM和5pM。
优选地，所述的第七步中的离心方法为置于离心器中2-5分钟，离心器的转速为4000rpm。
与现有技术相比，本发明的优点是：
(1)本发明采用溶液静电纺丝技术，从而实现了硝化纤维素形成纳米尺度的纤维，极大的提高了硝化纤维素纳米纤维膜的疏水力，显示出极好的对蛋白改性胶体金的吸附性，改性胶体金均匀的分散在纳米纤维膜中，使得纤维膜中心粉红显色均匀，色彩饱和度高，有利于光谱信息的准确测量。基于铅离子加速纳米金浸取反应，从而使得纤维膜依据血液中铅离子浓度不同实现一系列的颜色变化。
(2)本发明采用硝化纤维素纳米纤维膜为传感材料，比普通实心膜的比表面积提高1-2个数量级，增大了胶体金与铅离子之间的相互作用，提高了传感器的响应速度与检测灵敏度，对血铅的检测范围可达0.1μM-5pM，也适用于儿童血铅检测标准。
(3)本发明采用的生产设备简单，价格低廉，检测过程中不产生有害物质，结果直观干扰因素少并可进行实时检测，患者可直接通过观察试纸颜色，判断自身是否存在铅中毒现象，进行及时治疗。
将采用本发明的检测结果与同位素稀释质谱法得到的结果进行比对，两者差异甚微，故本发明提供的纳米纤维膜血铅颜色传感器可用于检测血铅。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1-6中采用氯化铅、氯金酸、柠檬酸钠、硫代硫酸钠、3-巯基-1，2-丙二醇、氯化钠、氯化钾、氯化钙作为溶剂，在Sigma中国有限公司购得；采用牛血清蛋白、小牛血清蛋白、牛血清蛋白结合肽、牛血清蛋白结合胰岛素、葡萄球菌A蛋白、羊抗人Ig6、McAb、链霉亲和素、链霉抗生物素蛋白、羊抗兔IgG、卵白蛋白、亲和层析IgG、大豆凝集素、麦胚凝集素作为蛋白，从上海生物工程有限公司购得；纺丝用混纺聚合物采用硝化纤维素(上海晶纯试剂有限公司，C102939)；纺丝用溶剂采用聚四氟乙烯、N，N-二甲基甲酰胺，在上海晶纯试剂有限公司购得；高压电源采用天津东文高压电源厂生产的DW-P303-1ACD8型；输液系统采用保定兰格恒流泵有限公司生产的LSP02-113型。
实施例1
一、制备纳米纤维膜血铅颜色传感器
第一步：室温25℃条件下，在搅拌釜中将0.8g硝化纤维素以转速50rpm搅拌溶解在9.2g由聚四氟乙烯和N，N-二甲基甲酰胺以重量比为3∶2配制成的混合溶剂中，搅拌6h，使硝化纤维素完全溶解；
第二步：在室温25℃、湿度25％的条件下，将第一步制得的硝化纤维素溶液以0.2mL/h的流速输入到喷丝头上，同时将喷丝头连接10kV电源进行静电纺丝制备硝化纤维素纳米纤维；将纺出的纤维沉积到ITO导电玻璃上，ITO导电玻璃与喷丝头之间的距离为6cm；待纺丝完成后，将ITO导电玻璃放入真空烘箱中以60℃干燥1小时，得到硝化纳米纤维素膜；
第三步：在三口烧瓶中，将氯金酸原料溶解在去离子水中，搅拌速度为80rpm，配置成1mM氯金酸溶液；
第四步：在容量瓶中将柠檬酸钠原料溶解在去离子水中，配制成38.8mM的柠檬酸钠溶液；
第五步：将250g第三步得到的氯金酸溶液加热至120℃，沸腾后迅速加入25g第四步得到的柠檬酸钠溶液，得到粒径为13.3nm的酒红色纳米金胶体溶液，将PH值调节至5；
第六步：在50℃条件下，将牛血清蛋白进行水浴退火，无搅拌条件下，将退火后的牛血清蛋白与去离子水配制成3μM的蛋白溶液；
第七步：取20g第六步得到的蛋白溶液加入到20g第五步得到的纳米金胶体溶液中，反应30分钟，得到牛血清蛋白改性后的纳米金溶液；
第八步：将第二步得到的纳米硝化纤维素膜裁剪成1cm×1cm的方块，用移液枪取30μL第七步得到的牛血清蛋白改性后的纳米金溶液，点板于纳米硝化纤维素膜中心，在室温下干燥15分钟；
第九步：取流动等离子水洗去第八步得到的纳米硝化纤维素膜上未牢固结合的改性胶体金，加温至60℃，真空干燥5分钟后，得到中心有半径为0.05mm粉红色圆形印记的复合纳米硝化纤维素膜，即纳米纤维膜血铅检测颜色传感器。
二、制备铅离子浓度标准曲线图
第一步：室温20-25℃条件下，将PbCl2与HNO3以1∶1的质量比，配制成浓度分别为0.1μM、0.05μM、0.01μM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM和5pM的铅离子溶液，作为标准液样本；
第二步：红外加热温度为60-70℃条件下，配制含有150mM氯化钠、5nM氯化钾、1mM氯化镁、1mM氯化钙、50-100mM硫代硫酸钠和200mM-250mM 3-巯基-1，2-丙二醇的混合反应溶液，即模拟人体血液环境；
第三步：红外加热温度为60-70℃条件下，将第一步得到的标准液样本分别加入到第二步得到的混合反应溶液中，然后将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于其中，反应10-15分钟；
第四步：取出第三步得到的纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以60-80Ib/in2速度处理1-2分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记随着铅离子浓度的升高而逐渐变淡；
第五步：利用光纤光谱测量系统检测其反射和吸收光谱，采用RGB颜色模式计算未检测空白样与第四步得到的标准液样本的Gabs颜色变化值，得到铅离子浓度与Gabs变化值(ΔGabs)之间线性关系，作出铅离子浓度标准曲线图；
三、血铅检测过程
第一步：在室温25℃条件下，取患者指腹的血样1mL，用8mL去离子水稀释后，加入1mL浓硝酸处理1小时；
第二步：将第一步得到的待测血样在转速为4000rpm的条件下进行离心，取上层清液作为待检测样本，离心时间为2min；
第三步：红外加热温度为60℃条件下，将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于第二步得到的待检测样本中，反应10分钟；取出纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以60Ib/in2速度处理1分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记逐渐变淡；利用光纤光谱仪检测其反射光谱，同时采用Lab颜色模式和RGB颜色模式计算，依据测试得到的反射强度值，并将该值与其对应波长进行积分计算，通过与国际照明委员会(CIE)颁布的颜色标准进行比对，将计算出的相应颜色变化值与标准曲线进行比对，测得该患者血液中的铅离子浓度为0.1μM。
实施例2
一、制备纳米纤维膜血铅颜色传感器
第一步：室温25℃条件下，在搅拌釜中将0.8g硝化纤维素以转速80rpm搅拌溶解在9.2g由四乙二醇和N，N-二甲基甲酰胺以重量比为3∶2配制成的混合溶剂中，搅拌6h，使硝化纤维素完全溶解；
第二步：在室温25℃、湿度20％的条件下，将第一步制得的硝化纤维素溶液以0.1mL/h的流速输入到喷丝头上，同时将喷丝头连接15kV电源进行静电纺丝制备硝化纤维素纳米纤维；将纺出的纤维沉积到铝箔上，铝箔与喷丝头之间的距离为10cm；待纺丝完成后，将铝箔放入真空烘箱中以60℃干燥2小时，得到硝化纳米纤维素膜；
第三步：在三口烧瓶中，将氯金酸原料溶解在去离子水中，搅拌速度为70rpm，配置成1mM氯金酸溶液；
第四步：在容量瓶中将柠檬酸钠原料溶解在去离子水中，配制成38.8mM的柠檬酸钠溶液；
第五步：将250g第三步得到的氯金酸溶液加热至120℃，沸腾后迅速加入25g第四步得到的柠檬酸钠溶液，得到粒径为13.3nm的酒红色纳米金胶体溶液，将PH值调节至5；
第六步：在50℃条件下，将牛血清蛋白进行水浴退火，无搅拌条件下，将退火后的牛血清蛋白与去离子水配制成3μM的蛋白溶液；
第七步：取20g第六步得到的蛋白溶液加入到20g第五步得到的纳米金胶体溶液中，反应30分钟，得到牛血清蛋白改性后的纳米金溶液；
第八步：将第二步得到的纳米硝化纤维素膜裁剪成1cm×1cm的方块，用移液枪取30μL第七步得到的牛血清蛋白改性后的纳米金溶液，点板于纳米硝化纤维素膜中心，在室温下干燥15分钟；
第九步：取流动等离子水洗去第八步得到的纳米硝化纤维素膜上未牢固结合的改性胶体金，加温至60℃，真空干燥5分钟后，得到中心有半径为0.1mm粉红色圆形印记的复合纳米硝化纤维素膜，即纳米纤维膜血铅检测颜色传感器。
二、制备铅离子浓度标准曲线图
第一步：室温20-25℃条件下，将PbCl2与HNO3以1∶1的质量比，配制成浓度分别为0.1μM、0.05μM、0.01μM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM和5pM的铅离子溶液，作为标准液样本；
第二步：红外加热温度为60-70℃条件下，配制含有150mM氯化钠、5nM氯化钾、1mM氯化镁、1mM氯化钙、50-100mM硫代硫酸钠和200mM-250mM 3-巯基-1，2-丙二醇的混合反应溶液，即模拟人体血液环境；
第三步：红外加热温度为60-70℃条件下，将第一步得到的标准液样本分别加入到第二步得到的混合反应溶液中，然后将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于其中，反应10-15分钟；
第四步：取出第三步得到的纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以60-80Ib/in2速度处理1-2分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记随着铅离子浓度的升高而逐渐变淡；
第五步：利用光纤光谱测量系统检测其反射和吸收光谱，采用RGB颜色模式计算未检测空白样与第四步得到的标准液样本的Gabs颜色变化值，得到铅离子浓度与Gabs变化值(ΔGabs)之间线性关系，作出铅离子浓度标准曲线图；
三、血铅检测过程
第一步：在室温25℃条件下，取患者指腹的血样1mL，用8mL去离子水稀释后，加入1mL浓硝酸处理1小时；
第二步：将第一步得到的待测血样在转速为4000rpm的条件下进行离心，取上层清液作为待检测样本，离心时间为3min；
第三步：红外加热温度为60℃条件下，将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于第二步得到的待检测样本中，反应15分钟；取出纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以65Ib/in2速度处理1分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记逐渐变淡；利用光纤光谱仪检测其反射光谱，同时采用Lab颜色模式和RGB颜色模式计算，依据测试得到的反射强度值，并将该值与其对应波长进行积分计算，通过与国际照明委员会(CIE)颁布的颜色标准进行比对，将计算出的相应颜色变化值与标准曲线进行比对，测得该患者血液中的铅离子浓度为0.01μM。
实施例3
一、制备纳米纤维膜血铅颜色传感器
第一步：室温25℃条件下，在搅拌釜中将0.8g硝化纤维素以转速50rpm搅拌溶解在9.2g由丙酮和甲基正丁基酮以重量比为1∶1配制成的混合溶剂中，搅拌7h，使硝化纤维素完全溶解；
第二步：在室温25℃、湿度30％的条件下，将第一步制得的硝化纤维素溶液以1mL/h的流速输入到喷丝头上，同时将喷丝头连接12kV电源进行静电纺丝制备硝化纤维素纳米纤维；将纺出的纤维沉积到卡纸上，卡纸与喷丝头之间的距离为10cm；待纺丝完成后，将卡纸放入真空烘箱中以60℃干燥1小时，得到硝化纳米纤维素膜；
第三步：在三口烧瓶中，将氯金酸原料溶解在去离子水中，搅拌速度为20rpm，配置成1mM氯金酸溶液；
第四步：在容量瓶中将柠檬酸钠原料溶解在去离子水中，配制成38.8mM的柠檬酸钠溶液；
第五步：将250g第三步得到的氯金酸溶液加热至120℃，沸腾后迅速加入25g第四步得到的柠檬酸钠溶液，得到粒径为13.3nm的酒红色纳米金胶体溶液，将PH值调节至6；
第六步：在55℃条件下，将链霉抗生物素蛋白进行水浴退火，无搅拌条件下，将退火后的链霉抗生物素蛋白与去离子水配制成3μM的蛋白溶液；
第七步：取20g第六步得到的蛋白溶液加入到20g第五步得到的纳米金胶体溶液中，反应30分钟，得到链霉抗生物素蛋白改性后的纳米金溶液；
第八步：将第二步得到的纳米硝化纤维素膜裁剪成1cm×1cm的方块，用移液枪取30μL第七步得到的链霉抗生物素蛋白改性后的纳米金溶液，点板于纳米硝化纤维素膜中心，在室温下干燥15分钟；
第九步：取流动等离子水洗去第八步得到的纳米硝化纤维素膜上未牢固结合的改性胶体金，加温至60℃，真空干燥5分钟后，得到中心有半径为0.13mm粉红色圆形印记的复合纳米硝化纤维素膜，即纳米纤维膜血铅检测颜色传感器。
二、制备铅离子浓度标准曲线图
第一步：室温20-25℃条件下，将PbCl2与HNO3以1∶1的质量比，配制成浓度分别为0.1μM、0.05μM、0.01μM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM和5pM的铅离子溶液，作为标准液样本；
第二步：红外加热温度为60-70℃条件下，配制含有150mM氯化钠、5nM氯化钾、1mM氯化镁、1mM氯化钙、50-100mM硫代硫酸钠和200mM-250mM 3-巯基-1，2-丙二醇的混合反应溶液，即模拟人体血液环境；
第三步：红外加热温度为60-70℃条件下，将第一步得到的标准液样本分别加入到第二步得到的混合反应溶液中，然后将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于其中，反应10-15分钟；
第四步：取出第三步得到的纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以60-80Ib/in2速度处理1-2分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记随着铅离子浓度的升高而逐渐变淡；
第五步：利用光纤光谱测量系统检测其反射和吸收光谱，采用RGB颜色模式计算未检测空白样与第四步得到的标准液样本的Gabs颜色变化值，得到铅离子浓度与Gabs变化值(ΔGabs)之间线性关系，作出铅离子浓度标准曲线图；
三、血铅检测过程
第一步：在室温25℃条件下，取患者指腹的血样1mL，用8mL去离子水稀释后，加入1mL浓硝酸处理1小时；
第二步：将第一步得到的待测血样在转速为4000rpm的条件下进行离心，取上层清液作为待检测样本，离心时间为3min；
第三步：红外加热温度为70℃条件下，将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于第二步得到的待检测样本中，反应10分钟；取出纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以60Ib/in2速度处理1分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记逐渐变淡；利用光纤光谱仪检测其反射光谱，同时采用Lab颜色模式和RGB颜色模式计算，依据测试得到的反射强度值，并将该值与其对应波长进行积分计算，通过与国际照明委员会(CIE)颁布的颜色标准进行比对，将计算出的相应颜色变化值与标准曲线进行比对，测得该患者血液中的铅离子浓度为0.006μM。
实施例4
二、制备纳米纤维膜血铅颜色传感器
第一步：室温25℃条件下，在搅拌釜中将1g硝化纤维素以转速60rpm搅拌溶解在9g乙酸正丙酯中，搅拌7h，使硝化纤维素完全溶解；
第二步：在室温25℃、湿度20％的条件下，将第一步制得的硝化纤维素溶液以2mL/h的流速输入到喷丝头上，同时将喷丝头连接20kV电源进行静电纺丝制备硝化纤维素纳米纤维；将纺出的纤维沉积到ITO导电玻璃上，ITO导电玻璃与喷丝头之间的距离为10cm；待纺丝完成后，将ITO导电玻璃放入真空烘箱中以60℃干燥1小时，得到硝化纳米纤维素膜；
第三步：在三口烧瓶中，将氯金酸原料溶解在去离子水中，搅拌速度为100rpm，配置成1mM氯金酸溶液；
第四步：在容量瓶中将柠檬酸钠原料溶解在去离子水中，配制成38.8mM的柠檬酸钠溶液；
第五步：将250g第三步得到的氯金酸溶液加热至120℃，沸腾后迅速加入25g第四步得到的柠檬酸钠溶液，得到粒径为13.3nm的酒红色纳米金胶体溶液，将PH值调节至5；
第六步：在55℃条件下，将葡萄球菌A蛋白进行水浴退火，无搅拌条件下，将退火后的葡萄球菌A蛋白与去离子水配制成3μM的蛋白溶液；
第七步：取20g第六步得到的蛋白溶液加入到20g第五步得到的纳米金胶体溶液中，反应30分钟，得到葡萄球菌A蛋白改性后的纳米金溶液；
第八步：将第二步得到的纳米硝化纤维素膜裁剪成1cm×1cm的方块，用移液枪取30μL第七步得到的葡萄球菌A蛋白改性后的纳米金溶液，点板于纳米硝化纤维素膜中心，在室温下干燥15分钟；
第九步：取流动等离子水洗去第八步得到的纳米硝化纤维素膜上未牢固结合的改性胶体金，加温至60℃，真空干燥5分钟后，得到中心有半径为0.18mm粉红色圆形印记的复合纳米硝化纤维素膜，即纳米纤维膜血铅检测颜色传感器。
二、制备铅离子浓度标准曲线图
第一步：室温20-25℃条件下，将PbCl2与HNO3以1∶1的质量比，配制成浓度分别为0.1μM、0.05μM、0.01μM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM和5pM的铅离子溶液，作为标准液样本；
第二步：红外加热温度为60-70℃条件下，配制含有150mM氯化钠、5nM氯化钾、1mM氯化镁、1mM氯化钙、50-100mM硫代硫酸钠和200mM-250mM 3-巯基-1，2-丙二醇的混合反应溶液，即模拟人体血液环境；
第三步：红外加热温度为60-70℃条件下，将第一步得到的标准液样本分别加入到第二步得到的混合反应溶液中，然后将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于其中，反应10-15分钟；
第四步：取出第三步得到的纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以60-80Ib/in2速度处理1-2分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记随着铅离子浓度的升高而逐渐变淡；
第五步：利用光纤光谱测量系统检测其反射和吸收光谱，采用RGB颜色模式计算未检测空白样与第四步得到的标准液样本的Gabs颜色变化值，得到铅离子浓度与Gabs变化值(ΔGabs)之间线性关系，作出铅离子浓度标准曲线图；
三、血铅检测过程
第一步：在室温25℃条件下，取患者指腹的血样1mL，用8mL去离子水稀释后，加入1mL浓硝酸处理1小时；
第二步：将第一步得到的待测血样在转速为4000rpm的条件下进行离心，取上层清液作为待检测样本，离心时间为4min；
第三步：红外加热温度为60℃条件下，将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于第二步得到的待检测样本中，反应10分钟；取出纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以60Ib/in2速度处理1分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记逐渐变淡；利用光纤光谱仪检测其反射光谱，同时采用Lab颜色模式和RGB颜色模式计算，依据测试得到的反射强度值，并将该值与其对应波长进行积分计算，通过与国际照明委员会(CIE)颁布的颜色标准进行比对，将计算出的相应颜色变化值与标准曲线进行比对，测得该患者血液中的铅离子浓度为1200pM。
实施例5
一、制备纳米纤维膜血铅颜色传感器
第一步：室温25℃条件下，在搅拌釜中将0.8g硝化纤维素以转速50rpm搅拌溶解在9.2g由乙酸甲酯和乙酸乙酯以重量比为1∶1配制成的混合溶剂中，搅拌6h，使硝化纤维素完全溶解；
第二步：在室温25℃、湿度25％的条件下，将第一步制得的硝化纤维素溶液以0.5mL/h的流速输入到喷丝头上，同时将喷丝头连接10kV电源进行静电纺丝制备硝化纤维素纳米纤维；将纺出的纤维沉积到铝箔上，铝箔与喷丝头之间的距离为10cm；待纺丝完成后，将铝箔放入真空烘箱中以60℃干燥2小时，得到硝化纳米纤维素膜；
第三步：在三口烧瓶中，将氯金酸原料溶解在去离子水中，搅拌速度为70rpm，配置成1mM氯金酸溶液；
第四步：在容量瓶中将柠檬酸钠原料溶解在去离子水中，配制成38.8mM的柠檬酸钠溶液；
第五步：将250g第三步得到的氯金酸溶液加热至120℃，沸腾后迅速加入25g第四步得到的柠檬酸钠溶液，得到粒径为13.3nm的酒红色纳米金胶体溶液，将PH值调节至7；
第六步：在60℃条件下，将卵白蛋白进行水浴退火，无搅拌条件下，将退火后的卵白蛋白与去离子水配制成3μM的蛋白溶液；
第七步：取20g第六步得到的蛋白溶液加入到20g第五步得到的纳米金胶体溶液中，反应30分钟，得到卵白蛋白改性后的纳米金溶液；
第八步：将第二步得到的纳米硝化纤维素膜裁剪成1cm×1cm的方块，用移液枪取30μL第七步得到的卵白蛋白改性后的纳米金溶液，点板于纳米硝化纤维素膜中心，在室温下干燥15分钟；
第九步：取流动等离子水洗去第八步得到的纳米硝化纤维素膜上未牢固结合的改性胶体金，加温至60℃，真空干燥5分钟后，得到中心有半径为0.23mm粉红色圆形印记的复合纳米硝化纤维素膜，即纳米纤维膜血铅检测颜色传感器。
二、制备铅离子浓度标准曲线图
第一步：室温20-25℃条件下，将PbCl2与HNO3以1∶1的质量比，配制成浓度分别为0.1μM、0.05μM、0.01μM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM和5pM的铅离子溶液，作为标准液样本；
第二步：红外加热温度为60-70℃条件下，配制含有150mM氯化钠、5nM氯化钾、1mM氯化镁、1mM氯化钙、50-100mM硫代硫酸钠和200mM-250mM 3-巯基-1，2-丙二醇的混合反应溶液，即模拟人体血液环境；
第三步：红外加热温度为60-70℃条件下，将第一步得到的标准液样本分别加入到第二步得到的混合反应溶液中，然后将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于其中，反应10-15分钟；
第四步：取出第三步得到的纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以70Ib/in2速度处理1分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记随着铅离子浓度的升高而逐渐变淡；
第五步：利用光纤光谱测量系统检测其反射和吸收光谱，采用RGB颜色模式计算未检测空白样与第四步得到的标准液样本的Gabs颜色变化值，得到铅离子浓度与Gabs变化值(ΔGabs)之间线性关系，作出铅离子浓度标准曲线图；
三、血铅检测过程
第一步：在室温25℃条件下，取患者指腹的血样1mL，用8mL去离子水稀释后，加入1mL浓硝酸处理1小时；
第二步：将第一步得到的待测血样在转速为4000rpm的条件下进行离心，取上层清液作为待检测样本，离心时间为5min；
第三步：红外加热温度为65℃条件下，将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于第二步得到的待检测样本中，反应12分钟；取出纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以70Ib/in2速度处理1分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记逐渐变淡；利用光纤光谱仪检测其反射光谱，同时采用Lab颜色模式和RGB颜色模式计算，依据测试得到的反射强度值，并将该值与其对应波长进行积分计算，通过与国际照明委员会(CIE)颁布的颜色标准进行比对，将计算出的相应颜色变化值与标准曲线进行比对，测得该患者血液中的铅离子浓度为150pM。
实施例6
一、制备纳米纤维膜血铅颜色传感器
第一步：室温25℃条件下，在搅拌釜中将2g硝化纤维素以转速50rpm搅拌溶解在8g由四乙二醇中，搅拌6h，使硝化纤维素完全溶解；
第二步：在室温25℃、湿度30％的条件下，将第一步制得的硝化纤维素溶液以1mL/h的流速输入到喷丝头上，同时将喷丝头连接16kV电源进行静电纺丝制备硝化纤维素纳米纤维；将纺出的纤维沉积到卡纸上，卡纸与喷丝头之间的距离为10cm；待纺丝完成后，将卡纸放入真空烘箱中以60℃干燥1小时，得到硝化纳米纤维素膜；
第三步：在三口烧瓶中，将氯金酸原料溶解在去离子水中，搅拌速度为90rpm，配置成1mM氯金酸溶液；
第四步：在容量瓶中将柠檬酸钠原料溶解在去离子水中，配制成38.8mM的柠檬酸钠溶液；
第五步：将250g第三步得到的氯金酸溶液加热至120℃，沸腾后迅速加入25g第四步得到的柠檬酸钠溶液，得到粒径为13.3nm的酒红色纳米金胶体溶液，将PH值调节至5；
第六步：在60℃条件下，将羊抗人IgG进行水浴退火，无搅拌条件下，将退火后的羊抗人IgG与去离子水配制成3μM的蛋白溶液；
第七步：取20g第六步得到的蛋白溶液加入到20g第五步得到的纳米金胶体溶液中，反应30分钟，得到羊抗人IgG改性后的纳米金溶液；
第八步：将第二步得到的纳米硝化纤维素膜裁剪成1cm×1cm的方块，用移液枪取30μL第七步得到的羊抗人IgG改性后的纳米金溶液，点板于纳米硝化纤维素膜中心，在室温下干燥15分钟；
第九步：取流动等离子水洗去第八步得到的纳米硝化纤维素膜上未牢固结合的改性胶体金，加温至60℃，真空干燥5分钟后，得到中心有半径为0.3mm粉红色圆形印记的复合纳米硝化纤维素膜，即纳米纤维膜血铅检测颜色传感器。
二、制备铅离子浓度标准曲线图
第一步：室温20-25℃条件下，将PbCl2与HNO3以1∶1的质量比，配制成浓度分别为0.1μM、0.05μM、0.01μM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM和5pM的铅离子溶液，作为标准液样本；
第二步：红外加热温度为60-70℃条件下，配制含有150mM氯化钠、5nM氯化钾、1mM氯化镁、1mM氯化钙、50-100mM硫代硫酸钠和200mM-250mM 3-巯基-1，2-丙二醇的混合反应溶液，即模拟人体血液环境；
第三步：红外加热温度为60-70℃条件下，将第一步得到的标准液样本分别加入到第二步得到的混合反应溶液中，然后将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于其中，反应10-15分钟；
第四步：取出第三步得到的纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以60-80Ib/in2速度处理1-2分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记随着铅离子浓度的升高而逐渐变淡；
第五步：利用光纤光谱测量系统检测其反射和吸收光谱，采用RGB颜色模式计算未检测空白样与第四步得到的标准液样本的Gabs颜色变化值，得到铅离子浓度与Gabs变化值(ΔGabs)之间线性关系，作出铅离子浓度标准曲线图；
三、血铅检测过程
第一步：在室温25℃条件下，取患者指腹的血样1mL，用8mL去离子水稀释后，加入1mL浓硝酸处理1小时；
第二步：将第一步得到的待测血样在转速为4000rpm的条件下进行离心，取上层清液作为待检测样本，离心时间为5min；
第三步：红外加热温度为70℃条件下，将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于第二步得到的待检测样本中，反应15分钟；取出纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以80Ib/in2速度处理1分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记逐渐变淡；利用光纤光谱仪检测其反射光谱，同时采用Lab颜色模式和RGB颜色模式计算，依据测试得到的反射强度值，并将该值与其对应波长进行积分计算，通过与国际照明委员会(CIE)颁布的颜色标准进行比对，将计算出的相应颜色变化值与标准曲线进行比对，测得该患者血液中的铅离子浓度为5pμM。
Claims (10)
1.一种纳米纤维膜血铅颜色传感器，其特征在于，通过以下步骤制得：
第一步：在搅拌釜中将硝化纤维素原料溶于溶剂中，配制成质量百分比为0.5％-20％的硝化纤维素溶液，搅拌转速为50-200rpm，搅拌时间为6-7h；
第二步：在相对湿度20％-60％条件下，将第一步得到的硝化纤维素溶液以0.1-4mL/h的流速输入到静电纺丝设备的喷丝头上，同时将喷丝头连接10-40kV电源进行静电纺丝，将纺出的纳米纤维沉积到载片容器上，干燥后，得到纳米硝化纤维素膜；
第三步：将氯金酸原料溶于去离子水中，配制成浓度为1mM的氯金酸溶液，搅拌速度为20-100rpm；
第四步：将柠檬酸钠原料溶于去离子水中，配制成浓度为38.8mM的柠檬酸钠溶液；
第五步：将第三步得到的氯金酸溶液加热至100℃-150℃，待其沸腾后，迅速加入第四步得到的柠檬酸钠溶液，得到粒径为13-15nm的呈酒红色的纳米金胶体溶液，PH值调节至5-7；
第六步：在50-60℃条件下，将蛋白进行水浴退火，无搅拌条件下，将退火后的蛋白与去离子水配制成3μM的蛋白溶液；
第七步：将第六步得到的蛋白溶液加入到第五步得到的纳米金胶体溶液中，反应20-30分钟，得到蛋白改性后的纳米金溶液；
第八步：将第二步得到的纳米硝化纤维素膜裁剪成1cm×1cm的方块，用移液枪取5μL-30μL第七步得到的纳米金溶液，点板于裁剪好的纳米硝化纤维素膜中心，在室温下干燥15-20分钟；
第九步：取流动等离子水洗去第八步得到的纳米硝化纤维素膜上未牢固结合的改性胶体金溶液，在60-80℃条件下，真空干燥5分钟，得到中心有半径为0.5mm-3mm粉红色圆形印记的复合纳米硝化纤维素膜，即纳米纤维膜血铅检测颜色传感器。
2.如权利要求1所述的纳米纤维膜血铅颜色传感器，其特征在于，所述的第一步中的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、四氢呋哺、四乙二醇、丙酮、甲基正丁基酮、甲基正戊基酮、甲基正乙基酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸正丁酯中的任意一种或几种的混合物。
3.如权利要求1所述的纳米纤维膜血铅颜色传感器的制备方法，其特征在于，所述的第二步中的干燥方法为60℃条件下，真空干燥1-2小时。
4.如权利要求1所述的纳米纤维膜血铅颜色传感器，其特征在于，所述的第五步中的氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的质量比为10∶1。
5.如权利要求1所述的纳米纤维膜血铅颜色传感器，其特征在于，所述的第六步中的蛋白为牛血清蛋白、小牛血清蛋白、牛血清蛋白结合肽、牛血清蛋白结合胰岛素、葡萄球菌A蛋白、羊抗人IgG、McAb、链霉亲和素、链霉抗生物素蛋白、羊抗兔IgG、卵白蛋白、亲和层析IgG、大豆凝集素或麦胚凝集素。
6.如权利要求1所述的纳米纤维膜血铅颜色传感器，其特征在于，所述的第七步中的蛋白溶液与纳米金胶体溶液的质量比为1∶1。
7.权利要求1所述的纳米纤维膜血铅颜色传感器的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
第一步：室温20-25℃条件下，将PbCl2与HNO3以1∶1的质量比，配制成不同浓度的铅离子溶液，作为标准液样本；
第二步：红外加热温度为60-70℃条件下，配制含有150mM氯化钠、5nM氯化钾、1mM氯化镁、1mM氯化钙、50-100mM硫代硫酸钠和200mM-250mM 3-巯基-1，2-丙二醇的混合反应溶液，即模拟人体血液环境；
第三步：红外加热温度为60-70℃条件下，将第一步得到的标准液样本分别加入到第二步得到的混合反应溶液中，然后将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于其中，反应10-15分钟；
第四步：取出第三步得到的纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以60-80Ib/in2速度处理1-2分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记随着铅离子浓度的升高而逐渐变淡；
第五步：利用光纤光谱测量系统检测其反射和吸收光谱，采用RGB颜色模式计算未检测空白样与第四步得到的标准液样本的Gabs颜色变化值，得到铅离子浓度与Gabs变化值(ΔGabs)之间线性关系，作出铅离子浓度标准曲线图；
第六步：在室温20-25℃条件下，取患者指腹的血样1mL，用8mL去离子水稀释后，加入1mL浓硝酸处理1-2小时；
第七步：将第六步得到的待测血样经离心后，取上层清液作为待检测样本；
第八步：红外加热温度为60-70℃条件下，将纳米纤维膜血铅颜色传感器浸渍于第七步得到的待检测样本中，反应10-15分钟；取出纳米纤维膜血铅颜色传感器，用去离子水冲洗，再用吹气枪以60-80Ib/in2速度处理1-2分钟，纳米消化纤维膜中心的粉红色圆形印记随着铅离子浓度的升高而逐渐变淡；利用光纤光谱仪检测其反射光谱，同时采用Lab颜色模式和RGB颜色模式计算，依据测试得到的反射强度值，并将该值与其对应波长进行积分计算，通过与国际照明委员会颁布的颜色标准进行比对，计算出相应的颜色变化值，并与第四步得到的铅离子浓度标准曲线图进行比对，从而获得铅离子的具体浓度值。
8.如权利要求7所述的纳米纤维膜血铅颜色传感器的检测方法，其特征在于，所述的第一步中的铅离子水溶液的浓度为0.1μM-5pM。
9.如权利要求8所述的纳米纤维膜血铅颜色传感器的检测方法，其特征在于，所述的第一步中的铅离子水溶液的浓度分别为0.1μM、0.05μM、0.01μM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM和5pM。
10.如权利要求7所述的纳米纤维膜血铅颜色传感器的检测方法，其特征在于，所述的第七步中的离心方法为置于离心器中2-5分钟，离心器的转速为4000rpm。
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| CN113883997B (zh) * | 2021-09-24 | 2023-10-27 | 昆明理工大学 | 基于碳纤维膜微薄片的柔性电阻式应变传感器 |
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| Publication number | Publication date |
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| CN102680105B (zh) | 2014-10-15 |
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