CN106979973A - 一种细胞内环境下蛋白质相互作用组学的分析方法 - Google Patents

一种细胞内环境下蛋白质相互作用组学的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞内环境下蛋白质相互作用组学的分析方法，将静电纺丝技术与生物质谱技术相结合，首先利用静电纺丝技术为MALDI质谱分析制备大量所需样品，然后使用蛋白质组学数据库对所得数据进行检索分析，明确各样品颗粒内蛋白质的组成成分，最后利用蛋白质组学数据统计分析软件对各样品颗粒内蛋白质的组成成分进行统计，明确细胞内不同种蛋白质相互作用的几率，最终为构建细胞内各生物分子间的三维相互作用图提供云数据支持。本发明方法操作简便，可实现高通量检测分析，不需要使研究物种被基因修饰，克服了一般质谱方法灵敏度低和需要基质分子促使分析对象发生离子化的缺陷。

Description

一种细胞内环境下蛋白质相互作用组学的分析方法
技术领域
本发明属于蛋白质组学技术领域，具体涉及一种细胞内环境下蛋白质相互作用组学的分析方法。
背景技术
相互作用组学的研究对象是特定细胞内部所发生直接相互作用的蛋白，这些蛋白质往往通过非共价作用相互吸引。相互作用组学(interactomics)目前的实验数据来源主要是来自酵母双杂交(yeast two hybrid,Y2H)或者亲和纯化与质谱联用技术(Affinity purification/mass spectrometry,AP/MS)。这两种技术目前虽然可以以所谓高通量的方法开展，但是具有非常明显的局限性。
酵母双杂交技术是基于酵母表达系统的通过基于一对重组蛋白的相互作用导致报告基因表达的一项生物技术。这项技术虽然较亲和纯化与质谱联用技术有更大的通量，但是存在以下缺陷：1)异源重组蛋白在酵母表达系统中的折叠环境与原有系统差异很大，如分子伴侣系统不同，定位的信号不能被识别，通常会因为折叠错误而导致假阳性和假阴性；2)酵母双杂交技术是简单的把基因组编码的所有蛋白强制性的成对的检验可能的相互作用，完全没有考虑蛋白的表达在细胞中受到空间和时间上的严格调控，被双杂交系统认定为相互作用的蛋白质也许在原有细胞环境中根本就没用同时存在的可能性；3)依靠酵母双杂交技术无法对于细胞生理过程中相互作用的动态变化进行监控。比如，同样是高通量的酵母全蛋白质组的相互作用分析，Uetz和Ito两个工作小组分别对酵母蛋白质组进行研究时，用了相似的文库阵列进行筛选，但是得到的结果中却只有一小部分(141个蛋白质相互作用对)是重叠的，分别占筛出的相互作用蛋白质对总量的21.6％和16.9％(Ito T,Chiba T,Ozawa R,et al.A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(8):4569～4574)。再如，同样是在基因组范围内筛选与拼接蛋白LSM2，LSM4和LSM8相互作用的蛋白，分别采用阵列筛选和文库筛选两种策略，结果得到的“猎物”蛋白系列也就只有一小部分是重叠的(Uetz P,Giot L,Cagney G,et al.A comprehensive analysis of pro-tein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae.Nature,2000,403(6770):623～627)。造成这种差异的原因在于酵母双杂交系统本身存在大量的假阴性和假阳性问题。因此酵母双杂交体系无论从数据的可信程度以及所获得的数据量上都不令人满意。
亲和纯化与质谱联用技术相对于酵母双杂交系统而言，假阳性和假阴性出现的概率降低很多，是目前最为准确的实验方法。但是，亲和纯化首先要求研究物种可以被基因修饰，并且亲和标记末端的插入不会影响目标蛋白的生理生化活性。从需要的工作量和获得的数据量而言，此项技术还是存在于传统的分子生物学范畴，所获得的数据与后基因组时代完全不相称，同时也无法完成对病体检验或者实时监控等潜在的未来医学临床研究。
发明内容
针对传统蛋白质组学研究方法中的质谱方法缺少所需的灵敏度、需要基质分子促使分析对象发生离子化的缺陷、通量低和要求被研究物种能够被基因修饰等缺点，本发明提供一种细胞内环境下蛋白质相互作用组学的分析方法，能够实现蛋白质相互作用组学的高通量检测分析。
本发明的技术方案如下：一种细胞内环境下蛋白质相互作用组学的分析方法，首先利用静电纺丝技术构建含氟聚合物的多孔硅基底和待分析蛋白的纳米颗粒，其中纺丝溶剂为质量体积百分比为1％～10％的PLGA溶液，然后利用基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱技术对纳米颗粒内蛋白质间的作用关系进行分析，其中样品靶采用含氟聚合物的多孔硅材料作为基底，之后通过蛋白质组学数据库检索软件对所得质谱数据进行分析确定各样品颗粒中的蛋白质的组成成分，最后利用蛋白质组学数据统计分析软件对所得数据进行统计，确定细胞内不同种蛋白质相互作用的几率，具体包括以下步骤：
步骤1，待分析蛋白样品的获取：将细胞或菌体破碎、离心、沉淀后得到待分析蛋白样品；
步骤2，含氟聚合物的多孔硅基底的制备：以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和丙酮的混合溶液作为纺丝溶剂，然后将聚偏氟乙烯(PVDF)溶于纺丝溶剂中得到纺丝溶液，再将纺丝溶液进行静电纺丝，以多孔硅材料为接收装置，纺丝结束后真空干燥，得到含氟聚合物的多孔硅基底；
步骤3，待分析蛋白样品颗粒的制备：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)溶于有机溶剂中配制纺丝溶剂，将步骤1得到的待分析蛋白样品溶于纺丝溶剂中得到纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，以步骤2制备的含氟聚合物的多孔硅基底为接收装置，得到铺排于含氟聚合物的多孔硅材料基底的待分析蛋白样品颗粒；
步骤4，MALDI质谱分析：对步骤3制备的待分析蛋白样品颗粒进行MALDI质谱分析，得到各样品颗粒的质谱图数据；
步骤5，将各样品颗粒获得的质谱图数据在蛋白质组学数据库中进行检索，确定样品颗粒内的蛋白质组成成分；
步骤6，统计分析各蛋白质相互作用的几率：利用蛋白质组学统计软件对步骤5得到的样品颗粒内的蛋白质组成成分进行统计，确定细胞内不同种蛋白质相互作用的几率。
优选地，步骤2中，N，N-二甲基甲酰胺和丙酮的体积比为7～18:3，聚偏氟乙烯与纺丝溶剂的质量体积比为20％～30％，纺丝参数为喷丝针头内径为0.22mm，电压为8kV，接收距离为9cm，推进速度为0.4mL/h。
优选地，步骤3中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物与有机溶剂的质量体积比为1％～10％，所述的有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿或乙醇；纺丝参数为喷丝针头内径为0.22mm，电压为5～15kV，接收距离为6～15cm，推进速度为0.2～1mL/h。
优选地，步骤4中，MALDI质谱分析时，分子量小于4000的样品颗粒采用反射模式(linear)，分子量大于4000的样品颗粒采用线性模式(reflection)，激光能量为10～60J。
本发明将静电纺丝技术与质谱技术相结合，利用纳米级多孔层制备技术(2微米厚度，体积气孔率为55％)将含氟聚合物聚集到多孔硅表面(孔径为10纳米左右)，再将分析物分子铺排于其上，由于聚合物分子在受到激光或离子束照射时会猛烈爆发，从而释放出离子化的分析物用于检测，解决了离子化过程对基质的依赖。本发明利用激光或离子束从纳米尺度的小囊中气化材料，克服了一般质谱方法灵敏度低和需要基质分子促使分析对象发生离子化的缺陷，而且利用静电纺丝技术制备的样品数量多，实现了组学分析中的高通量数据要求，且准确率较高，最终为构建细胞内各生物分子间的三维相互作用图提供云数据支持。
附图说明
图1为本发明的一种细胞内环境下蛋白质相互作用组学的分析方法的流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1
步骤一：大肠杆菌膜蛋白的获取
样品来源：经过基因重组技术获得表达EmrE膜蛋白的重组大肠杆菌，然后通过菌体培养，细胞裂解后超速离心等步骤获得含有EmrE蛋白的细胞膜碎片。具体实施步骤为：
1)将培养的菌体离心后取菌体沉淀重悬于适量PBS+1mM PMSF+5mMβ-Me的缓冲液中，然后使用均质机进行菌体破碎；
2)将破碎后的样品20,000g，4℃离心25min，离心结束后取上清；
3)将上清100,000g，4℃离心2h；
4)离心结束后取上述步骤中的沉淀用高浓度的去污剂(DDM，1％)溶解沉淀，4℃搅拌至少2h，使其完全溶解，然后再20,000g，4℃离心25min，将未溶解部分沉淀下来，取上清，得到细胞膜碎片。
步骤二：利用静电纺丝技术制备含氟聚合物的多孔硅基底并将分析物分子铺排于其上
具体实施步骤为：
1)含氟聚合物的多孔硅基底制备：以N，N-二甲基甲酰胺和丙酮作为纺丝溶剂，DMF/丙酮体积比4：1，将聚偏氟乙烯(PVDF)(美国Elf Atochem公司，商品名Kynar PVDF)溶于纺丝溶剂中，得无色透明的粘稠液体，其中PVDF所占比例为20％(g/ml)，将配制好的含氟聚合物溶液吸入注射器中，用电纺装置进行纺丝，纺丝的接收装置为多孔硅材料，喷丝针头内径为0.22mm，电压为8kV，接收距离为9cm，推进速度为0.4mL/h纺丝结束后将其真空干燥，得到含氟聚合物的多孔硅基底；
2)样品颗粒的制备：用乙醇配制质量体积比为5％浓度的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液作为纺丝溶剂，然后将步骤一中获得的细胞膜碎片与PLGA溶液混合均匀后再离心出去溶液中的气泡得到纺丝溶液，以含氟聚合物的多孔硅(孔径为10纳米左右)材料作为接收装置，进行静电纺丝，喷丝针头内径为0.22mm，电压为5kV，接收距离为8cm，推进速度为0.2mL/h。
步骤三：样品颗粒的MALDI质谱仪分析
将步骤二制备好的装载有样品颗粒的样品靶经加热或风吹烘干形成共结晶后放入离子源内，选择反射模式(linear)，激光能量为20J，当激光照射到靶点上时，多孔硅材料基底吸收了激光的能力跃迁到激发态，导致蛋白质电离和汽化，电离的结果通常是基底的质子转移到蛋白质上，然后由高电压将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器 内，再经离子检测器和数据处理得到质谱图。
步骤四：使用蛋白质组学数据库检索软件GPM(X！tandem)对数据进行检索
将每个样品颗粒获得的质谱图数据利用蛋白质组学数据库检索软件GPM(X！tandem)进行检索，检索数据库为Sequest数据库，编辑蛋白质可能存在的乙酰化、甲酰化及泛素化修饰及潜在的氧化、磷酸化修饰，Trypsin及Glu-C酶切位点等参数后运行GPM中的X！Tandem得出结果，明确样品靶内每一个样品颗粒内蛋白质的组成成分。
步骤五：利用蛋白质组学数据统计分析软件TPP对所得数据进行统计
Trans-Proteomic Pipeline(TPP)是用于LC/MS/MS蛋白质组学数据分析的软件。TPP包含一系列蛋白质鉴定和定量分析的模块，能够对经Sequest数据库搜索引擎得到的结果进行筛选过滤，从而达到蛋白质鉴定和测序的目的，本步骤中采用分析软件TPP对上述步骤中所得每一个样品颗粒内蛋白质的组成成分的大量数据进行统计，运行ProteinProphet，得到最终结果，明确细胞内不同种蛋白质相互作用的几率，最终为构建细胞内各生物分子间的三维相互作用图提供云数据支持。

Claims (4)

1.一种细胞内环境下蛋白质相互作用组学的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，待分析蛋白样品的获取：将细胞或菌体破碎、离心、沉淀后得到待分析蛋白样品；
步骤2，含氟聚合物的多孔硅基底的制备：以N，N-二甲基甲酰胺和丙酮的混合溶液作为纺丝溶剂，然后将聚偏氟乙烯溶于纺丝溶剂中得到纺丝溶液，再将纺丝溶液进行静电纺丝，以多孔硅材料为接收装置，纺丝结束后真空干燥，得到含氟聚合物的多孔硅基底；
步骤3，待分析蛋白样品颗粒的制备：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂中配制纺丝溶剂，将步骤1得到的待分析蛋白样品溶于纺丝溶剂中得到纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，以步骤2制备的含氟聚合物的多孔硅基底为接收装置，得到铺排于含氟聚合物的多孔硅材料基底的待分析蛋白样品颗粒；
步骤4，MALDI质谱分析：对步骤3制备的待分析蛋白样品颗粒进行MALDI质谱分析，得到各样品颗粒的质谱图数据；
步骤5，将各样品颗粒获得的质谱图数据在蛋白质组学数据库中进行检索，确定样品颗粒内的蛋白质组成成分；
步骤6，统计分析各蛋白质相互作用的几率：利用蛋白质组学统计软件对步骤5得到的样品颗粒内的蛋白质组成成分进行统计，确定细胞内不同种蛋白质相互作用的几率。
2.根据权利要求1所述的一种细胞内环境下蛋白质相互作用组学的分析方法，其特征在于，步骤2中，N，N-二甲基甲酰胺和丙酮的体积比为7～18:3，聚偏氟乙烯与纺丝溶剂的质量体积比为20％～30％，纺丝参数为喷丝针头内径为0.22mm，电压为8kV，接收距离为9cm，推进速度为0.4mL/h。
3.根据权利要求1所述的一种细胞内环境下蛋白质相互作用组学的分析方法，其特征在于，步骤3中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物与有机溶剂的质量体积比为1％～10％，所述的有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿或乙醇；纺丝参数为喷丝针头内径为0.22mm，电压为5～15kV，接收距离为6～15cm，推进速度为0.2～1mL/h。
4.根据权利要求1所述的一种细胞内环境下蛋白质相互作用组学的分析方法，其特征在于，步骤4中，MALDI质谱分析时，分子量小于4000的样品颗粒采用反射模式，分子量大于4000的样品颗粒采用线性模式，激光能量为10～60J。
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