JP5792176B2 - シアヌル酸誘導体及びそれを用いるメラミンの検出方法 - Google Patents
シアヌル酸誘導体及びそれを用いるメラミンの検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5792176B2 JP5792176B2 JP2012531977A JP2012531977A JP5792176B2 JP 5792176 B2 JP5792176 B2 JP 5792176B2 JP 2012531977 A JP2012531977 A JP 2012531977A JP 2012531977 A JP2012531977 A JP 2012531977A JP 5792176 B2 JP5792176 B2 JP 5792176B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- melamine
- formula
- membrane
- group
- spot
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D251/00—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings
- C07D251/02—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings
- C07D251/12—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D251/26—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hetero atoms directly attached to ring carbon atoms
- C07D251/30—Only oxygen atoms
- C07D251/34—Cyanuric or isocyanuric esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D251/00—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings
- C07D251/02—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings
- C07D251/12—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D251/26—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hetero atoms directly attached to ring carbon atoms
- C07D251/30—Only oxygen atoms
- C07D251/32—Cyanuric acid; Isocyanuric acid
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
本発明の課題は、前記の従来技術の問題を克服した、標的に前処理を必要とせず、迅速、高感度、高選択的、かつ安価にメラミンを検出でき、裸眼でも容易に判定可能な検出方法並びに該検出に好適に用いられる検出材料を提供することにある。
[1]一般式(1)
式(3−a)中、R3は、水素原子、炭素原子数1ないし6の飽和炭化水素基(該飽和炭化水素基は、炭素原子数7以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。)又は炭素原子数2ないし12の不飽和炭化水素基(該不飽和炭化水素基は、炭素原子数7以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。)を表す。
式(4−a)中、R4及びR5は、各々独立して、水素原子、炭素原子数1ないし6の飽和炭化水素基(該飽和炭化水素基は、炭素原子数7以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。)又は炭素原子数2ないし12の不飽和炭化水素基(該不飽和炭化水素基は、炭素原子数7以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。)を表し、R4とR5は互いに同じであっても異なっていてもよい。)
で表される基である、[1]に記載のシアヌル酸誘導体。
i)[1]ないし[6]のいずれか1項に記載のシアヌル酸誘導体を含む溶液に検体を添加し、混合する工程、及び
ii)検体が混合された溶液に光を照射し、該溶液からの蛍光強度を測定する工程
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法。
i)検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液をメンブランにスポット付着させ、乾燥させる操作を1回為すか、又は同操作を最大10回まで繰り返す工程、
ii)工程i)で形成されたメンブラン上の付着スポットに、[1]ないし[6]のいずれか1項に記載のシアヌル酸誘導体を含む溶液をスポット付着させる工程、及び
iii)前記メンブラン上の付着スポットに光を照射し、該付着スポットからの蛍光強度を測定する工程、
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法。
i)[1]ないし[6]のいずれか1項に記載のシアヌル酸誘導体を含む溶液をメンブランにスポット付着させ、乾燥させる工程、
ii)検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液を、工程i)で形成されたメンブラン上の付着スポットにスポット付着させ、乾燥させる操作を1回為すか、又は同操作を最大10回まで繰り返す工程、及び
iii)前記メンブラン上の付着スポットに光を照射し、該付着スポットからの蛍光強度を測定する工程、
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法。
本明細書において示される各基は、具体的には以下の通りである。
その具体例としては、1−オキシ−1,3−プロピレン基、1,4,7−トリオキシノナン−1,9−ジイル基、1−オキシペンタン−1,5−ジイル基、1,4−ジオキシヘキサン−1,6−ジイル基、3−オキシペンタン−1,5−ジイル基等のオキシアルキレン基を例示することが出来る。
またハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等を例示することが出来る。
i)前述の式(1)で表されるシアヌル酸誘導体を含む溶液に検体を添加し、混合する工程、及び
ii)検体が混合された溶液に光を照射し、該溶液からの蛍光強度を測定する工程
を含むことを特徴とする。
メラミンの検出方法に用いる媒体、すなわちシアヌル酸誘導体を含む溶液に使用する溶媒の具体例しては、水、または、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル等の有機溶媒、または、これらの有機溶媒と水とを混合した混合溶媒を用いることが出来る。
なお、上記検出方法において、ii)蛍光強度を測定する工程の前に、当業者が通常使用し得る方法を用いて、検体が混合された溶液を濃縮してもよい。
i)検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液をメンブランにスポット付着させ、乾燥させる操作を1回為すか、又は同操作を最大10回まで繰り返す工程、
ii)工程i)で形成されたメンブラン上の付着スポットに、前記式(1)で表されるシアヌル酸誘導体を含む溶液をスポット付着させる工程、及び
iii)前記メンブラン上の付着スポットに光を照射し、該付着スポットからの蛍光強度を測定する工程、
を含むことを特徴とするメラミンの検出方法に関する。
i)前記式(1)で表されるシアヌル酸誘導体を含む溶液をメンブランにスポット付着させ、乾燥させる工程、
ii)検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液を、工程i)で形成されたメンブラン上の付着スポットにスポット付着させ、乾燥させる操作を1回為すか、又は同操作を最大10回まで繰り返す工程、及び
iii)前記メンブラン上の付着スポットに光を照射し、該付着スポットからの蛍光強度を測定する工程、
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法に関する。
本発明で使用可能なメンブランは、例えば、市販の標準ろ紙(例えばアドバンテック社製など)、低蛍光ポリフッ化ビニリデン(PolyVinylidene DiFluoride;PVDF)メンブラン(例えばGEヘルスケア社製など)、ナイロンメンブラン(例えばワットマン社(現:GEヘルスケア社)製など)、及び酵素漂白コーヒーフィルタ(例えば(株)カリタ製など)を使用することが挙げられる。これらの中でも好ましくは、PVDFメンブランである。
したがって、本発明の検出方法において、前記工程iii)の前に、メンブラン表面上に前記溶媒をさらにスポット付着させるか、或いは、該メンブランを密閉容器(例えば、プラスチック製容器、バイアル、セル)に入れることにより、該メンブラン表面の乾燥を防ぐ工程をさらに含んでいてもよい。
光照射に用いる検出は、一般に裸眼による目視でも容易に行えるが、蛍光光度計を用いることにより定量的データを得ることも出来る。
尚、検出に用いる蛍光の好ましい波長範囲としては、例えば、430nmないし600nm、また、460nmないし550nmの範囲等が挙げられる。
なお、実施例中の記載に使用されている略号の意味を以下に説明する。
DBU=1,8−ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデカー7−エン
THF=テトラヒドロフラン
DMF=N,N−ジメチルホルムアミド。
白色粉末(シス体とトランス体の混合物)、158.1℃(分解)。
1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 1.64 (br, 16H, OCH2CH2 + NCH2CH2), 3.66 (br, 8H, NCH2), 3.87 (br, 8H, OCH2), 6.65 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 4H, ArH), 6.69 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 4H, ArH), 6.81 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 4H, ArH), 6.85 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 4H, ArH), 6.92 ? 6.97 (m, 8H, ArH), 7.06 ? 7.17 (m, 12H, ArH), 11.40 (s, 8H, NH)
13C NMR (75 MHz, DMSO?d6) δ 24.3 (× 2), 26.1 (× 2), 67.0 (× 2), 113.7 (× 2), 126.3 (× 2), 127.8 (× 2), 127.9 (× 2), 130.8 (× 2), 132.0 (× 2), 135.6 (× 2), 139.3 (× 2), 143.8 (× 2), 148.8 (× 2), 150.0 (× 2), 157.0 (× 2).
高分解能MS (FAB, マトリックス=3?ニトロベンジルアルコール) C40H38N6O8 ([M]+) としての計算値 m/z 730.2751, 実測値 730.2740.
黄色固体、融点110.4-111.3℃。
1H NMR (THF-d8, 300 MHz) δ 1.69 (br, 8H, CH2N), 3.62 (t, J = 6.0 Hz, 8H, ArOCH2CH2), 3.70 (t, J = 4.8 Hz, 8H, CH2CH2N), 3.92 (t, J = 6.0 Hz, 8H, ArOCH2), 6.59 (d, J = 8.1 Hz, 8H, ArH), 6.84 (d, J = 8.1 Hz, 8H, ArH), 10.4 (s, 8H, NH)
13C NMR (THF-d8, 75 MHz) δ 40.4, 68.0, 68.1, 69.7, 114.2, 133.1, 137.7, 139.2, 148.8, 150.4, 158.2
高分解能MS (FAB, マトリックス=3−ニトロベンジルアルコール) C54H56N12O20 ([M+])としての計算値 m/z 1192.3734, 実測値1192.3728.
黄色固体(シス体とトランス体の混合物)、融点51.6-65.7℃。
1H NMR (THF-d8, 300 MHz) δ 1.67 (br, 8H, CH2N, cis + trans), 3.52-3.59 (m, 24H, ArOCH2CH2OCH2 + ArOCH2CH2OCH2CH2 + CH2CH2N, cis + trans), 3.67 (t, J = 4.5 Hz, 4H, OCH2CH2, cis or trans), 3.68 (t, J = 4.5 Hz, 4H, OCH2CH2, cis or trans), 3.92 (t, J = 4.5 Hz, 4H, OCH2, cis or trans), 3.98 (t, J = 4.5 Hz, 4H, OCH2, trans or cis), 6.58 (AA'BB', J = 9.0 Hz, 4H, ArH, cis or trans), 6.59 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 4H, ArH, cis or trans), 6.82 (AA'BB', J = 9.0 Hz, 4H, ArH, cis or trans), 6.83 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 4H, ArH, cis or trans), 6.90-7.04 (m, 20H, ArH, cis + trans)
13C NMR (THF-d8, 75 MHz) δ 26.2 (× 2), 68.0, 68.1, 70.4 (× 2), 70.9 (× 2), 71.4 (× 2), 114.2, 114.3, 126.67, 126.73, 128.1, 128.2, 132.0, 132.1, 133.07, 133.10, 137.00, 137.03, 140.5 (× 2), 145.18, 145.24, 148.9 (× 2), 150.4 (× 2), 158.42, 158.45
高分解能MS (FAB, マトリックス=3−ニトロベンジルアルコール) C44H46N6O12 ([M]+)としての計算値m/z 850.3174, 実測値850.3162.
黄色固体(シス体とトランス体の混合物)、106.0℃(分解)。
1H NMR (acetone-d6, 300 MHz) δ 3.67 (t, J = 6.3 Hz, 4H, CH2N, cis or trans), 3.71 (t, J = 6.0 Hz, 4H, CH2N, cis or trans), 3.77 (t, J = 4.2 Hz, 4H, ArOCH2CH2, cis or trans), 3.80 (t, J = 3.6 Hz, 4H, ArOCH2CH2, cis or trans), 3.69-4.05 (m, 16H, CH2CH2N + ArOCH2, cis + trans), 6.69 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 8H, ArH, cis + trans), 6.91 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 8H, ArH, cis + trans), 6.99-7.15 (m, 20H, ArH, cis + trans), 10.3 (brs, 8H, NH, cis + trans)
13C NMR (acetone-d6, 75 MHz) δ 40.3, 40.4, 67.68 (× 2), 67.72 (× 2), 69.5 (× 2), 114.1, 114.2, 126.7, 126.8, 128.1, 128.2, 131.69, 131.72, 132.8, 132.9, 136.8, 136.9, 140.3 (× 2), 144.8, 144.9, 148.5, 148.6, 150.16, 150.19, 157.99, 158.01
高分解能MS (FAB, マトリックス=3−ニトロベンジルアルコール) C40H38N6O10 ([M]+)としての計算値 m/z 762.2649, 実測値762.2644.
アセトニトリルに化合物(5)を10μMの濃度で溶解し、ここにメラミンをその濃度が1μM(実施例5)、5μM(実施例6)、7.7μM(実施例7)、10μM(実施例8)、15μM(実施例9)、又は20μM(実施例10)となるように加えた。
各溶液を超音波照射によって混合しながら、励起波長350nmにて蛍光スペクトルを測定した。図1に、メラミン添加後の超音波照射時間(横軸)に対して、波長500nmにおける蛍光強度(励起波長:350nm)(縦軸)を示した図を示す。
図1に示す通り、メラミン濃度が1μM(実施例5)では、5時間経過後も蛍光強度の増大は認められなかったが、5μM以上(実施例6〜10)では1.5時間以上の超音波照射で蛍光強度の著しい増大が認められ、その傾向はメラミンが高濃度であるほど著しくなった。なお、実施例7のメラミン濃度7.7μMは米国食品医薬品局の定めた幼児用粉ミルク中に許容される最大メラミン濃度1ppmに相当し、この一連の実施例は、それより低濃度のメラミン(例えば実施例6)であっても、時間をかけることで、メラミンが検出可能であることを示している。
実施例5〜10と同様に、化合物(5)を10μMの濃度で溶解したアセトニトリル溶液に対して、濃度が1μM(0.13ppm相当:実施例11)、2μM(0.26ppm相当:実施例12)、3μM(0.39ppm相当:実施例13)、5μM(0.65ppm相当:実施例14)、7.7μM(1.0ppm相当:実施例15)、10μM(1.3ppm相当:実施例16)、15μM(1.9ppm相当:実施例17)、20μM(2.6ppm相当:実施例18)、50μM(6.5ppm相当:実施例19)、100μM(13ppm相当:実施例20)、200μM(26ppm相当:実施例21)、1540μM(200ppm相当:実施例22)、7700μM(1000ppm相当:実施例23)、23100μM(3000ppm相当:実施例24)又は46200μM(6000ppm相当:実施例25)となるようにメラミンを加えて、3時間超音波照射し、その後蛍光スペクトルを測定した。
図2に、メラミン濃度(対数目盛、横軸)に対して、波長500nmにおける蛍光強度(励起波長:350nm)(縦軸)をプロットした図を示す。また、図3には、実施例11〜18及び実施例25の、波長370nmから600nmの蛍光スペクトル(励起波長350nm)を示す。
図2において点線で示す1ppmの濃度は、米国食品医薬品局の定めた幼児用粉ミルク中に許容される最大メラミン濃度であり、メラミン濃度7.7μMに相当する。図2に示すように、1ppm(7.7μM)の前後(5〜20μM)でちょうど蛍光強度の立ち上がりが観測されており、米国食品医薬品局の許容基準によくマッチした検出感度であるとする結果が得られた。また、それより遙かに高濃度のメラミンを含む場合であっても、メラミンのない場合に比べて極めて大きな蛍光強度を示しており、本発明の検出方法が広い範囲のメラミン濃度に対応する検出能力を持っていることが確認された。
メラミンを1ppm含む検体を以下のように調製した。市販品の調製粉乳(明治ほほえみらくらくキューブ、(株)明治)を調乳方法に従い、粉乳(1ブロック)を蒸留水(40mL)に溶解した。ここにメラミン(4.00mg、0.317μmol)を加えて、30分間超音波を照射した。その後、このうち2.0mLを量りとり、アセトニトリル(78mL)を加えて抽出操作を行った。アセトニトリルに不溶な白色沈殿物が析出するため、3000rpmで30分間遠心分離し、無色の上澄み液(2.0mL)を0.45μmのメンブレンフィルターを用いて濾過し、メラミンを含む調製粉乳抽出アセトニトリル溶液を得た。濾液を減圧留去した後、ここに化合物(5)の濃度が100μMとなるようにアセトニトリルに溶解したストックソリューション(0.50mL)およびアセトニトリル(4.5mL)を加えて3時間超音波照射することにより、メラミンを1ppm含む検体を得た。この検体をIIIとする。
同様の方法で、メラミンを10ppm、300ppm、又は3000ppm含む検体を得た。これらの検体をそれぞれIV、V、VIとする。なお、対照試料として、メラミンを含まないサンプルI、IIも同様の手順にて準備した。準備した6種の検体の詳細は以下のとおりである。
アセトニトリル−水(1:1)混合溶媒に、化合物(5)を10μMの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が0μM(実施例32)、500μM(実施例33)、1000μM(実施例34)又は5000μM(実施例35)となるように加えた試料を用意し、これらの蛍光スペクトルを測定した(励起波長:350nm)。得られた結果を図6に示す。
図6に示すように、メラミンの濃度が1000μM(631ppm)で蛍光強度が増加しはじめ、5000μMでは著しく高くなり、高濃度のメラミンを検出できるとする結果が得られた。
THFに化合物(5)を10μMの濃度で溶解し、メラミンをその濃度が500μMとなるように加えた試料(実施例36)、及び、対照データとして、メラミンを加えない試料(実施例37)を用意し、励起波長350nmで励起した際の蛍光スペクトルを測定した。得られた結果を図7に示す。
図7に示すように、溶媒がTHFの場合においてもメラミンの存在により蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。
エタノールに化合物(5)を100μMの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が0ppm(実施例38)、1ppm(実施例39)、2ppm(実施例40)、4ppm(実施例41)、6ppm(実施例42)、8ppm(実施例43)、又は10ppm(実施例44)になるように加えた試料を用意し、2時間超音波照射後に蛍光スペクトルを測定した(励起波長350nm)。得られた結果を図8に示す。
図8に示すように、溶媒がエタノールの場合においてもメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。
エチレングリコールジメチルエーテルに化合物(5)を100μMの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が0ppm(実施例45)、1ppm(実施例46)、2ppm(実施例47)、4ppm(実施例48)、6ppm(実施例49)、8ppm(実施例50)、又は10ppm(実施例51)になるように加えた試料を用意し、2時間超音波照射後に蛍光スペクトルを測定した(励起波長350nm)。得られた結果を図9に示す。
図9に示すように、溶媒がエチレングリコールジメチルエーテルの場合においてもメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。
アセトンに化合物(5)を10μMの濃度で溶解し、ここにメラミンを0ppm(実施例52)とした試料、またはメラミンを1ppmを加えた試料を2時間、超音波照射(実施例53)、撹拌(実施例54)あるいは静置(実施例55)し、蛍光スペクトルを測定した(励起波長350nm)。得られた結果を図10に示す。
図10に示すように、溶媒としてアセトンを用いた場合でも、静置又は撹拌によってメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。
化合物(5)(3.65mg,5.00μmol)をアセトン(25mL)に溶解し、200μMの溶液を調製した。また市販品の調製粉乳(明治ほほえみらくらくキューブ、(株)明治)(1.35g)にメラミン(0.103g:10ppmに相当)を添加し、次いでアセトン(5mL)を加え、3分間激しく撹拌した。上澄み溶液を、脱脂綿を詰めたパスツールピペットで濾過し、この濾液(2.0mL)に先に調製した化合物(5)の溶液を2.0mL加え、室温で3時間静置した後に蛍光スペクトルを測定し、またUV光(365nm)照射下での写真を撮影した(実施例56)。なお、対照試料として、メラミンを含まないサンプルも同様に作成し、蛍光スペクトル測定及び写真撮影を行った(実施例57)。得られた結果を図11(蛍光スペクトル)及び図12(UV光照射下の写真)に示す。
図11に示すように、メラミンが混入した粉ミルクのサンプルでは、蛍光強度の著しい増加が観測され、また図12に示すように目視によっても青色蛍光が観測されることから、アセトン中でも調製粉乳に混入したメラミンの検出が出来るとする結果が得られた。
メラミンと類似構造を持つアンメリン(参考例3)、アンメリド(参考例4)、ウラシル(参考例5)、シトシン(参考例6)、チミン(参考例7)について、それぞれの濃度が100μMとなるように化合物(5)の10μMアセトニトリル溶液に加え、3時間超音波を照射した。同様に、アンメリン、アンメリド、ウラシル、シトシン、チミン、メラミンのいずれをも加えないブランクの試料(参考例1)、および、メラミンを加えた試料(参考例2)も調製したが、メラミンについてはその濃度が10μMとなるように加えた。これらの試料について蛍光スペクトルを測定(励起波長:350nm)し、また、UV光(365nm)照射下での写真を撮影した。図13の上段に波長500nmでの各試料の蛍光強度を、図13の下段に各試料の蛍光の写真を示す。
図13に示すように、メラミン以外は波長500nm付近の青色蛍光は実質的にほとんど観測されず、本発明の検出方法がメラミンを特異的に検出できるとする結果が得られた。
尚、上記の化合物の構造は以下の通りである。
THFに、化合物(6)を10μMの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が0μM(実施例58)、10μM(実施例59)、20μM(実施例60)、50μM(実施例61)、又は100μM(実施例62)となるように加えた試料を用意し、3時間超音波照射後に蛍光スペクトルを測定した(励起波長350nm)。得られた結果を図14に示す。
図14に示すように、化合物(6)を用いた場合においてもメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。
アセトニトリルに、化合物(7)を10μMの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が0ppm(実施例63)、1ppm(実施例64)、10ppm(実施例65)、20ppm(実施例66)、30ppm(実施例67)、40ppm(実施例68)、又は50ppm(実施例69)となるように加えた試料を用意し、3時間超音波照射後に蛍光スペクトルを測定した(励起波長350nm)。得られた結果を図15に示す。
図15に示すように、化合物(7)を用いた場合においてもメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。
アセトンに、化合物(8)を10μMの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が0ppm(実施例70)、1ppm(実施例71)、2ppm(実施例72)、3ppm(実施例73)、4ppm(実施例74)、5ppm(実施例75)、又は10ppm(実施例76)となるようにを加えた試料を用意し、これを3時間静置した後、蛍光スペクトルを測定した(励起波長350nm)。得られた結果を図16に示す。
図16に示すように、アセトン中で化合物(8)を用いた場合においてもメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。
アセトニトリルに、化合物(8)を10μMの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が0ppm(実施例77)、1ppm(実施例78)、2ppm(実施例79)、3ppm(実施例80)、4ppm(実施例81)、5ppm(実施例82)、又は10ppm(実施例83)となるように加えた試料を用意し、3時間超音波照射後に蛍光スペクトルを測定した(励起波長350nm)。得られた結果を図17に示す。
図17に示すように、アセトニトリル中で化合物(8)を用いた場合においてもメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。
化合物(5)を用い、以下の方法1又は2に示す方法により試験片を作製し、メンブラン上でメラミンを検出する実験を行った。メンブランとしては、標準ろ紙(アドバンテック社製 No.2、サイズ:6Φあるいは5mm×5mm)、低蛍光ポリフッ化ビニリデン(PolyVinylidene DiFluoride;PVDF)メンブラン(GEヘルスケア社製、Hybond−LFP、サイズ:6Φ)、ナイロンメンブラン(ワットマン社(現:GEヘルスケア社)製、Nytran N、サイズ:6Φ)、酵素漂白コーヒーフィルタ((株)カリタ製、サイズ:6Φ)を使用した。
<方法1>
各濃度のメラミンのエタノール溶液をメンブランにパスツールピペット(又はマイクロピペット)で2滴(1滴≒10μL)スポット付着させた後、メンブランを乾燥させた。この操作を5回繰り返し、メンブラン上に合計10滴分のメラミンの溶液をスポット付着させた。次いで、メラミンの溶液をスポット付着させた上記メンブランに、化合物(5)のエタノール溶液(100μM)をパスツールピペットで2滴滴下し、バイアル(高さ5.5cm、底の直径1.6cm)中で蓋をして静置、又はメンブランをスライドガラスに載せ、そのまま静置した。
<方法2>
化合物(5)のエタノール溶液(100μM)をパスツールピペット(又はマイクロピペット)でメンブランに2滴(1滴≒10μL)滴下し、メンブランを乾燥させた。次いで、各濃度のメラミンのエタノール溶液をパスツールピペット(又はマイクロピペット)を用いてメンブランに2滴(1滴≒10μL)スポット付着させ、そのまま静置した。メンブランの種類に応じて、メラミンのエタノール溶液をさらにスポット付着させた後、乾燥させる工程を1〜4回繰り返した。繰り返し操作の最終回においては、乾燥させずに、メンブランをスライドガラスに載せ、そのまま静置した。
また、上記方法に準じて、溶媒としてエタノールに代えてアセトンを使用する場合には、まず化合物(5)のアセトン溶液(100μM)をメンブランに滴下し、乾燥させた。次いで、メラミンのアセトン溶液をスポット付着させ、乾燥させる工程を全5回行った(メンブラン上に合計10滴のメラミンのアセトン溶液を滴下したことになる)。その後、メンブランをスライドガラスに載せ、乾いたメンブランを濡らすために、エタノールをパスツールピペット(又はマイクロピペット)で1滴滴下し、そのまま静置した。
なお、<方法1>および<方法2>のいずれの場合も、メラミン濃度が0ppmの対照試料として、メラミン溶液をメンブランにスポット付着させずに化合物(5)のエタノール溶液のみをスポット付着させた試験片を作製した。
乳児用調製粉乳(1.35g)にメラミン(0.101mg)を添加し、次いでエタノール(10mL)を加え、室温で5分間撹拌した。得られた上澄み溶液を、綿を詰めたパスツールピペットを用いてろ過し、ろ液を検体として用いた。この検体と、化合物(5)(100μM)のエタノール溶液を用い、前述の<方法2>と同じ操作を行い、試験片を作製した。
なお、アセトンを溶液の溶媒とした用いた場合、アセトンの気化が早く乾いた状態ではメラミンの有無にかかわらず蛍光が観測されるため、調製粉乳のアセトン溶液のろ液をスポット付着させた後、メンブランにエタノールを1滴スポット付着させたものを試験片として用いた。
また、メラミン0ppmの対照試料として、調製粉乳にメラミンを混入させず先と同様にろ過したろ液を用いた。
方法1を用いて、メラミン検出における各メンブランの効果と、各種メラミン濃度に対する蛍光強度の変化を経時的に調べた。使用したメンブランは、標準ろ紙とPVDFメンブランである。各メンブランに、0又は10ppmのメラミン溶液を用いて方法1によって作製した試験片をバイアル中に3時間静置し、365nmのUV光を照射して写真を撮影した。得られた結果を図18と19に示す。
ろ紙を使用した場合(図18)、メラミン0ppmの試験片でろ紙自体の蛍光が観測されるものの、10ppmのメラミン溶液をスポット付着させた試験片がより明るく蛍光を示していることから容易に識別でき、メラミンを検出可能であるとする結果が得られた。同様に、PVDFメンブランを用いた場合(図19)においても、10ppmのメラミン溶液をスポット付着させた試験片がより強く蛍光を示しており、メラミンを検出可能であるとする結果が得られた。
両メンブランを比較すると、PVDFメンブランの方がバックグランドの蛍光(0ppm)が殆どなく、メラミンの検出において検出感度が優れていると言える。そこで、さらに、PVDFメンブランを用いて、メラミン溶液の濃度を変化させた場合の検出限界について検討した。0ppm、1ppm、10ppm、50ppm、100ppm又は1000ppmのメラミン溶液を用い、方法1にてPVDFメンブランにスポット付着させた試験片を用意し、それらをバイアル中に3時間静置した後、365nmのUV光を照射して蛍光観察を行った。得られた結果を図20に示す。図20から明らかなように、1ppm以上のメラミン溶液を用いて作製した試験片の蛍光が目視により確認でき、メラミンが検出可能であるとする結果が得られた。
次に、上記の各種濃度のメラミン溶液を用いて作製した試験片における蛍光強度の経時変化を静置直後からのUV光照射下での写真のデータの画像解析により算出した。得られた結果を図21に示す。図21に示すように、メラミン濃度が10ppm以上の試験片では、数分から数十分以内で蛍光強度の増加が観察された。一方、メラミン濃度が1ppmの試験片では、1時間以上経過してようやく蛍光強度が増加しているものの、120分程度経過後であれば十分に蛍光強度の増加を観察することができた。
方法2を用いて、メラミン検出における各メンブランの効果を調べた。使用したメンブランは、PVDFメンブラン、ナイロンメンブラン、及びコーヒーフィルタ(酵素漂白)である。メラミン溶液として濃度を0ppm、1ppm又は10ppmに調製したものを用いて各メンブランに滴下(10滴)した試験片を作製し、1分経過した試験片に365nmのUV光を照射して写真を撮影した。得られた結果を図22(PVDFメンブラン)、図23(ナイロンメンブラン)、図24(コーヒーフィルタ)に示す。
図22〜図24に示すように、いずれの試験片においても、10ppmのメラミン溶液をスポット付着させた試験片が蛍光を示していることがはっきりと確認でき、メラミンを検出することができた。特にPVDFメンブランを用いた試験片(図22)では、メラミン濃度が1ppmであっても、方法1と同様にはっきりとメラミンを検出することができた。
方法2において、PVDFメンブランと、エタノールの代りにアセトンを抽出溶媒として用いた0ppm、1ppm又は10ppmのメラミン溶液を用いて試験片を作製し、その後、アセトンの気化により乾燥した表面を濡らすためにエタノールをスポット付着させた。図27に、エタノールのスポット直後に365nmのUV光照射下で撮影した写真を示す。図27に示すように、1ppm又は10ppmメラミン溶液をスポット付着させた試験片が蛍光を示していることからアセトンを溶媒として用いた場合でもメラミンを検出可能であるとする結果が得られた。
Claims (10)
- 一般式(1)
該共役化合物A’が、一般式(2)
- 基Aが、下記式(2−a)又は式(2−a’)
で表される基である、請求項1に記載のシアヌル酸誘導体。 - 一般式(1)で表される化合物が、式(5)、式(6)、式(7)又は式(8)
- 検体に含まれるメラミンの検出方法であって、
i)請求項1ないし請求項3のいずれか1項に記載のシアヌル酸誘導体を含む溶液に検体を添加し、混合する工程、及び
ii)検体が混合された溶液に光を照射し、該溶液からの蛍光強度を測定する工程
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法。 - 検体に含まれるメラミンの検出方法であって、
i)検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液をメンブランにスポット付着させ、乾燥させる操作を1回為すか、又は同操作を最大10回まで繰り返す工程、
ii)工程i)で形成されたメンブラン上の付着スポットに、請求項1ないし請求項3のいずれか1項に記載のシアヌル酸誘導体を含む溶液をスポット付着させる工程、及び
iii)前記メンブラン上の付着スポットに光を照射し、該付着スポットからの蛍光強度を測定する工程、
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法。 - 検体に含まれるメラミンの検出方法であって、
i)請求項1ないし請求項3のいずれか1項に記載のシアヌル酸誘導体を含む溶液をメンブランにスポット付着させ、乾燥させる工程、
ii)検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液を、工程i)で形成されたメンブラン上の付着スポットにスポット付着させ、乾燥させる操作を1回為すか、又は同操作を最大10回まで繰り返す工程、及び
iii)前記メンブラン上の付着スポットに光を照射し、該付着スポットからの蛍光強度を測定する工程、
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法。 - 前記工程iii)の前に、該メンブランを密閉容器に入れるか、又は該メンブラン表面上に溶媒をスポット付着させることにより、メンブラン表面の乾燥を防ぐ工程をさらに含む、請求項5又は請求項6に記載の方法。
- 前記シアヌル酸誘導体を含む溶液に使用する溶媒、及び、検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液に使用する溶媒が、水、有機溶媒又は水と有機溶媒の混合溶媒である、請求項4ないし請求項7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記光が紫外線である、請求項4ないし請求項8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記蛍光強度を測定する工程が、目視により行われるか又は蛍光光度計を用いて行われる、請求項4ないし請求項9のいずれか1項に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012531977A JP5792176B2 (ja) | 2010-09-02 | 2011-09-02 | シアヌル酸誘導体及びそれを用いるメラミンの検出方法 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010196987 | 2010-09-02 | ||
JP2010196987 | 2010-09-02 | ||
JP2012531977A JP5792176B2 (ja) | 2010-09-02 | 2011-09-02 | シアヌル酸誘導体及びそれを用いるメラミンの検出方法 |
PCT/JP2011/070056 WO2012029955A1 (ja) | 2010-09-02 | 2011-09-02 | シアヌル酸誘導体及びそれを用いるメラミンの検出方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2012029955A1 JPWO2012029955A1 (ja) | 2013-10-31 |
JP5792176B2 true JP5792176B2 (ja) | 2015-10-07 |
Family
ID=45773029
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012531977A Active JP5792176B2 (ja) | 2010-09-02 | 2011-09-02 | シアヌル酸誘導体及びそれを用いるメラミンの検出方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5792176B2 (ja) |
WO (1) | WO2012029955A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105158225B (zh) * | 2015-09-16 | 2017-11-17 | 盐城工学院 | 一种双光子激发荧光检测三聚氰胺的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04210973A (ja) * | 1990-01-11 | 1992-08-03 | Bayer Ag | 三置換1,3,5−トリアジン−2,4,6−トリオン、その製法、それを含む有害生物防除剤、該防除剤の製法及び有害生物の防除方法 |
JP2004249635A (ja) * | 2003-02-21 | 2004-09-09 | Mitsui Chemicals Inc | 光記録媒体および1,3,5−トリアジントリオン誘導体 |
WO2010090751A2 (en) * | 2009-02-05 | 2010-08-12 | The Regents Of The University Of California | Methods and materials for the detection of melamine |
JP2012051816A (ja) * | 2010-08-31 | 2012-03-15 | Tokyo Institute Of Technology | 生体アミンの判別方法 |
-
2011
- 2011-09-02 JP JP2012531977A patent/JP5792176B2/ja active Active
- 2011-09-02 WO PCT/JP2011/070056 patent/WO2012029955A1/ja active Application Filing
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04210973A (ja) * | 1990-01-11 | 1992-08-03 | Bayer Ag | 三置換1,3,5−トリアジン−2,4,6−トリオン、その製法、それを含む有害生物防除剤、該防除剤の製法及び有害生物の防除方法 |
JP2004249635A (ja) * | 2003-02-21 | 2004-09-09 | Mitsui Chemicals Inc | 光記録媒体および1,3,5−トリアジントリオン誘導体 |
WO2010090751A2 (en) * | 2009-02-05 | 2010-08-12 | The Regents Of The University Of California | Methods and materials for the detection of melamine |
JP2012051816A (ja) * | 2010-08-31 | 2012-03-15 | Tokyo Institute Of Technology | 生体アミンの判別方法 |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
JPN6011056196; KLOK,H. et al: 'Self-Assembly of Rodlike Hydrogen-Bonded Nanostructures' J. Am. Chem. Soc. Vol.121, No.30, 1999, p.7154-5 * |
JPN6011056197; CHOI,I.S. et al: 'Self-Assembly of Hydrogen-Bonded Polymeric Rods Based on the Cyanuric Acid?Melamine Lattice' Chem. Mater. Vol.11, No.3, 1999, p.684-690 * |
JPN6011056198; HONG,Y. et al.: 'Aggregation-induced emission: phenomenon, mechanism and application' Chem. Comm. , 2009, p.4332-53 * |
JPN6011056199; 中村光孝ら: '凝集誘起型発光特性を利用したメラミン検出センサーの開発' 日本化学会講演予稿集 Vol.91st, No.4, 20110311, p.1484 * |
JPN6015014513; PLATER M.J. et al.: Tetrahedron Vol.60, 2004, p.6385-94 * |
JPN6015014514; AI K. et al.: J. Am. Chem. Soc. Vol.131, No.27, 2009, p.9496-7 * |
JPN6015014516; DARZAC M. et al.: Journal of Chemical Research, Synopses Vol.8, 2002, p.359-360 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2012029955A1 (ja) | 2013-10-31 |
WO2012029955A1 (ja) | 2012-03-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Qiu et al. | An unusual AIE fluorescent sensor for sequentially detecting Co2+-Hg2+-Cu2+ based on diphenylacrylonitrile Schiff-base derivative | |
Jiang et al. | Double-detecting fluorescent sensor for ATP based on Cu2+ and Zn2+ response of hydrazono-bis-tetraphenylethylene | |
Li et al. | A near-infrared fluorescent probe for Cu2+ in living cells based on coordination effect | |
CN106084873B (zh) | 一种高效近红外荧光材料及其生物应用 | |
CN111253935B (zh) | 一种双通道检测极性和粘度的双光子荧光探针及其制备方法和用途 | |
Nie et al. | Two novel six-coordinated cadmium (II) and zinc (II) complexes from carbazate β-diketonate: crystal structures, enhanced two-photon absorption and biological imaging application | |
CN107556305B (zh) | 一种用于检测铝离子荧光探针、制备方法及应用 | |
CN105801479A (zh) | 一种双光子黏度荧光探针及其制备方法和用途 | |
Staneva et al. | Ultrasonic synthesis and spectral characterization of a new blue fluorescent dendrimer as highly selective chemosensor for Fe3+ cations | |
CN110684523A (zh) | 一种用于检测硫化氢的近红外荧光分子探针及其制备方法和应用 | |
US20150079625A1 (en) | Naphthalene-based two-photon fluorescent probes, preparation method and use thereof | |
CN105670608B (zh) | 一种可检测活细胞线粒体中镍离子的高选择性荧光探针及其制备方法 | |
CN109456250B (zh) | 热激活延迟荧光(tadf)纳米探针及其制备方法和在生物成像中的应用 | |
JP5773377B2 (ja) | カルバゾールで端部キャップされているビピリジン化合物及びそれらの調製のための方法 | |
JP5792176B2 (ja) | シアヌル酸誘導体及びそれを用いるメラミンの検出方法 | |
CN111533761B (zh) | 一类具有细胞器或蛋白质靶向功能的比率型pH探针及应用 | |
CN110357896A (zh) | 一类化合物及制备与其在检测二价铜离子和强酸pH中的应用 | |
Chow | Two-photon induced emissive thiophene donor–acceptor systems as molecular probes for in vitro bio-imaging: synthesis, crystal structure, and spectroscopic properties | |
Xu et al. | 2, 2′-Bipyridine derivatives containing aza-crown ether: Structure, two-photon absorption and bioimaging | |
US20230159819A1 (en) | Neutral fluorescent mitochondrial marker as amide derivative, and preparation method and use thereof | |
CN107043353A (zh) | 一种咪唑苯甲醛缩对苯二胺双席夫碱及其制备方法 | |
CN112321492A (zh) | 监测线粒体自噬的荧光粘度探针及制备和应用 | |
CN110669350A (zh) | 一种哌啶基bodipy类红光荧光染料及其制备方法和应用 | |
CN113121566B (zh) | 一种芘衍生物荧光分子及其制备方法和应用 | |
CN113512009B (zh) | 一种人类毛发红色素衍生物及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20140822 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140825 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20140822 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150415 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150602 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150708 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150805 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5792176 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |