CN105123528A

CN105123528A - 新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法

Info

Publication number: CN105123528A
Application number: CN201510599550.4A
Authority: CN
Inventors: 贾桂霞; 李玉帆; 韩秀丽; 田晓明; 周艳萍; 张铭芳; 张锡庆; 汪莲娟; 崔祺; 高雪
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2015-09-18
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-09-18
Also published as: CN105123528B

Abstract

本发明属于植物的组织培养领域，具体提供一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，具体步骤如下：1)新铁炮百合远缘杂交后，取子房进行灭菌消毒；2)授粉后5d-25d发育阶段胚拯救为将子房切片培养得到胚珠后，胚珠组织培养，得到杂交组培苗；授粉后35d-40d发育阶段胚拯救为进行胚珠离体培养或胚离体培养，得到杂交组培苗。本发明还提供所述新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法在百合育种中的应用。本发明的新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，可克服新铁炮百合与东方百合杂种系间远缘杂交受精后不亲和的障碍，获得有胚胚珠和杂种苗。

Description

新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法

技术领域

本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法。

背景技术

百合杂交育种技术包括种系内杂交和种系间杂交，种系间杂交即远缘杂交，不仅存在受精前障碍，如花粉管在花柱内不能正常萌发，还存在很严重的受精后障碍，难以获得杂种苗。受精后障碍主要由于胚或胚乳和母体生理机能的不协调，受精后胚不能正常生长发育所致，通常在发育40d左右开始败育，导致杂交失败。幼胚的胚拯救技术是克服受精后障碍的主要方法，而胚拯救开始的时间和相应的拯救措施与方式是影响百合胚拯救的关键技术。(VanTuyl,J.M.,VanDieM.P.,VanCreij,M.G.M.,VanKleinwee,T.C.M.,Franken,J.,Bino,R.J..Applicationofinvitropollination,ovaryculture,ovuleculture,andembryorescueforovercomingincongruitybarriersininterspecificLiliumcrosses[J].PlantSci.1991，74：115-126.)虽然胚拯救技术如子房切片培养、胚珠培养、胚培养等可克服受精后幼胚发育障碍，但不同的远缘杂交组合，不同胚龄的幼胚所需的技术手段和培养基配方不同。矮牵牛早期胚拯救研究中显示，Nitsch培养基中较低浓度的氮盐(500mg/LKNO₃和80mg/LNH₄NO₃)比其它高浓度氮盐的培养基更有利于促进授粉后3d幼胚的发育，并且硝态氮(NO₃ ^-)和铵态氮(NH₄ ⁺)的质量比为11：1时适合胚的发育(Nitsch,J.P.&Nitsch,C.Auxin-dependentgrowthofexeisedHelianthustuberosustissueI[J].Amer.J.Bot..1956,43:831.)。

国内在百合胚拯救方面，主要是针对种系内杂交，种间杂交的胚拯救研究较少，进行胚拯救的时间又较晚，一般在授粉后40-60天后才对子房进行剥胚离体培养(雷家军，阮冰洁.大花卷丹与亚洲百合、东方百合种间杂交及胚培养研究[J].东北农业大学学报.2011，42(4)：66-67.)。

在百合胚拯救技术方面，国外文献有报道显示，BA抑制胚发生，为使胚培养得到长度1mm以上的胚，子房培养以不添加生长调节剂为宜(李思义译.百合子房培养胚培养及杂种鉴定[J].译自农业技术，1990，45(8)：361-366.)。YumiObata等(YumiObata，YoshijiNiimi，MasaruNakano，KeiichiOkazaki，IchiroMiyajima.InterspecifichybridsbetweenLiliumnobilissimumandL.regaleproducedviaovules-with-placental-tissueculture[J].ScientiaHorticulturae.2000，84：191-204.)用B₅基本培养基附加质量百分含量5％的蔗糖，对种间远缘杂交组合Liliumnobilissimum和Liliumregale授粉后30d和40d的子房进行子房切段培养，授粉后30d的子房切段有3％的胚珠成苗，授粉后40d的子房切段有9％的胚珠成苗。

浅野义人(浅野义人.百合种间远缘杂交之研究[J].园艺学会杂志.1977，46(2)：267-273.)认为在MS培养基中加入1.0×10^－4～1.0×10^－2mg/LNAA对幼胚直接发芽有效，而高浓度的生长调节剂则有抑制有胚发育的作用，并且可诱导幼胚产生愈伤组织。不同发育时期的幼胚对酸碱度的要求不同，随着幼胚体积的变大，pH值由高逐渐变低，即由中性变为偏酸性，一般情况下，pH值5.0-6.0适于大多数胚的生长(周传恩，夏光敏.小麦远缘杂交胚拯救技术[J].麦类作物学报.2005,25(3):88～92)。

新铁炮百合是1928年日本育种学家Mr.Nishimura用麝香百合和台湾百合反复杂交而来的新品种，具有播种繁殖一年开花的特性(OkazakiK.LiliumspeciesnativetoJapan,andbreedingandproductionofLiliuminJapan[C].InternationalSymposiumontheGenusLilium414.1994，81-92.)。这一特性在百合中罕见，能解决种球繁殖中种球退化和病毒感染的问题；而且新铁炮百合耐热性强，花期在7月至10月，正是百合鲜切花供应困难的时候。但新铁炮百合花色和花型单一，分别为白色和喇叭型，为培育生育期短、花色和花型丰富的百合新品种，需要将其和其他百合杂种系的品种进行远缘杂交，但这一远缘杂交存在严重的受精后障碍，在授粉后40d胚败育之前采取有效的早期胚拯救措施可大幅度提高杂交的成功率。目前国内外还未有相关报道。

发明内容

为了建立一套完整的新铁炮百合远缘杂交受精后障碍的早期胚拯救技术，本发明的目的在于提供一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，具体步骤如下：

1)新铁炮百合远缘杂交后，取子房进行灭菌消毒；

2)按授粉后5d-25d、授粉后35d-40d两个不同发育阶段进行胚拯救得到杂交组培苗：

A授粉后5d-25d发育阶段胚拯救

子房切片培养得到胚珠后，胚珠组织培养，得到杂交组培苗；

B授粉后35d-40d发育阶段胚拯救

胚珠离体培养或胚离体培养，得到杂交组培苗。

其中，步骤1)所述新铁炮百合远缘杂交，为以新铁炮百合为母本，与东方百合进行远缘杂交。

所述东方百合优选为百合品种‘索邦’。

其中，步骤1)所述灭菌消毒的具体方法为：将摘取的子房用体积百分含量75％的酒精擦拭表面消毒，再以有效氯1％的次氯酸钠浸泡后无菌水冲洗。

其中，A所述子房切片培养所用的培养基为：以B₅或1/2B₅培养基为基本培养基，含有蔗糖的质量百分含量为6％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基。

其中，A所述胚珠组织培养所用的培养基为：以B₅或1/2B₅培养基为基本培养基，含有蔗糖的质量百分含量为6-9％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基。

其中，A所述授粉后5d-25d发育阶段胚拯救，最优选为以授粉后10d的子房进行子房切片培养，得到胚珠后进行胚珠组织培养，子房切片培养和胚珠培养所用的培养基均为：以B₅培养基为基本培养基，含有蔗糖的质量百分含量为6％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基。

其中，B所述胚珠离体培养，所用培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有NAA(萘乙酸)的浓度为0.01mg/L、蔗糖的质量百分含量为3％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基。

其中，B所述胚离体培养，所用培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有NAA的浓度为0.001mg/L、6-BA(6-苄氨基嘌呤)的浓度为0.1mg/L、蔗糖的质量百分含量为3％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基。

其中，所述培养的条件为温度25±1℃，暗培养。

其中，所述新铁炮百合，优选为新铁炮百合品种‘Augusta’或‘雷山3号’。

本发明还提供所述的新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法在百合育种中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明的新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，可克服新铁炮百合与东方百合杂种系间远缘杂交受精后不亲和的障碍，获得有胚胚珠和杂种苗，为培育花色和花型多样、且同时具有一年开花等优良特性的百合新品种提供可能。

附图说明

图1是实施例1中授粉早期5-25d子房切片培养的组培照片；

图2是实施例2中授粉早期5-25d子房切片培养后胚珠离体培养的组培照片；

图3是实施例3中授粉后35d-40d胚珠直接离体培养的组培照片；

图4是实施例4中授粉后35d-40d胚直接离体培养的组培照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1授粉早期5d-25d不同时期子房切片培养条件筛选

1.材料与方法

(1)分别摘取新铁炮百合‘Augusta’为母本，东方百合‘索邦’为父本，授粉后5d、10d、15d、20d、25d的子房；(2)将摘取的子房用绵球蘸取体积百分含量75％的酒精擦拭表面消毒，有效氯1％的次氯酸钠浸泡20min，边浸泡边摇动容器，使其充分接触；再用无菌水冲洗3次，每次2min；(3)用锋利的手术刀将子房切成2-3mm的薄片水平放置在培养基上；(4)筛选的培养基配方为基本培养基B₅、1/2B₅、MS、1/2MS(pH＝5.8,琼脂质量百分浓度0.8％)分别附加3％、6％、9％或12％不同质量百分浓度的蔗糖，形成共12种处理组合，每处理重复3次；(5)培养条件为温度25±1℃，暗培养，40d后统计子房段上胚珠的发育情况。

2.结果与分析

授粉早期5d-25d不同发育时期子房切片培养条件的筛选结果如表1所示：

表1基本培养基和蔗糖浓度对不同发育时期子房切片培养的影响

结果表明，采用以上方法对新铁炮百合‘Augusta’为母本，东方百合‘索邦’为父本的授粉早期5-25d不同时期的子房进行切片培养，发现授粉后5d-25d的子房切片培养，以B₅或1/2B₅培养基为基本培养基，含有蔗糖的质量百分含量为6％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基均能较好地培养得到胚珠。其中，授粉后5d、10d、15d、20d子房切片培养的最佳培养基配方为B₅培养基、6％蔗糖、pH＝5.8、琼脂0.8％，含成活胚珠的子房片数分别为50％、75％、66.7％、43.3％。授粉后25d子房切片培养的最佳培养基配方为1/2B₅培养基、6％蔗糖、pH＝5.8、琼脂0.8％，含成活胚珠的子房片数为34.3％。授粉后的10d是百合子房切片培养的最佳时期，含成活胚珠的子房片数最高，最高百分比达75％。图1为授粉早期5-25d子房切片培养的组培图，所示子房切片中有的胚珠已成活并萌发。

实施例2子房切片培养所获有胚胚珠离体培养条件筛选

1.材料与方法

(1)将由实施例1中不同时期子房培养较佳条件下获得的有胚胚珠接种到相应一致的培养基中继续培养；(2)培养基配方与之前子房切片培养对应一致，即基本培养基B₅、1/2B₅、MS、1/2MS(pH＝5.8，琼脂质量百分浓度0.8％)分别附加3％、6％、9％或12％不同质量百分浓度的蔗糖，形成共12种处理组合筛选适于不同时期获得的有胚胚珠进一步培养的最佳培养基配方；(3)培养条件为温度25±1℃，暗培养，观察统计胚珠的成苗情况。

2.结果与分析

本发明较佳实施例授粉早期5-25d不同时期子房切片培养后胚珠离体培养的培养条件筛选结果表2。

表2基本培养基和蔗糖浓度对子房切片培养后所获胚珠发育的影响

采用以上方法对铁炮百合‘Augusta’为母本，东方百合‘索邦’为父本的授粉早期5-25d不同时期子房切片培养后的胚珠进行离体培养，发现以B₅或1/2B₅培养基为基本培养基，含有蔗糖的质量百分含量为6-9％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基培养，均能较好地得到杂交组培苗。其中，授粉后5d、10d、15d、25d子房切片培养后胚珠培养的最佳培养基配方为B₅培养基、6％蔗糖、pH＝5.8、琼脂0.8％，成苗率分别为44.4％、46.7％、41.7％、36.4％；授粉后20d子房切片培养后胚珠培养的最佳培养基配方为1/2B₅培养基，9％蔗糖，pH＝5.8,琼脂0.8％，成苗率为44.4％。其中授粉后10d的成苗率最高，达46.7％。图2为授粉早期5-25d子房切片培养后胚珠离体培养的组培图，图中有的胚珠已萌发。

实施例3授粉后35d-40d胚珠直接离体培养条件筛选

1.材料与方法

(1)摘取新铁炮百合‘Augusta’为母本，东方百合的‘索邦’为父本，授粉后35d-40d的子房；(2)将摘取的子房在无菌条件下用体积百分含量75％酒精棉球表面擦拭3次，有效氯1％的次氯酸钠浸泡20min，无菌水冲洗3次；(3)然后将蒴果横切，选取有胚的胚珠，接种在不同的筛选培养基上。(4)筛选培养基配方为MS为基本培养基，琼脂质量百分浓度0.8％，对不同浓度的NAA、蔗糖和培养基pH值进行筛选，并对不同处理的结果进行极差分析和方差分析。(5)培养温度为25±1℃，暗培养，每处理重复3次，每重复20～30个胚珠。

2.结果与分析

不同浓度的NAA、蔗糖及pH值对授粉后35-40d的胚珠萌发的影响实验结果见表3、表4。

表3不同浓度的NAA、蔗糖及pH值对授粉后35-40d的胚珠萌发的影响

表4不同浓度的NAA、蔗糖及pH值对授粉后35-40d的胚珠萌发的极差分析表

采用以上方法对新铁炮百合‘Augusta’为母本，东方百合的‘索邦’为父本授粉后35-40d的胚珠进行直接离体培养，最佳培养基为MS培养基、NAA0.01mg/L、3％蔗糖、pH＝5.8、琼脂0.8％，胚珠的萌发率达15％。表4的极差分析结果表明蔗糖浓度对胚珠培养的影响最大，其次是pH值。图3为胚珠直接离体培养的组培图，已长出胚根。

实施例4授粉后35d-40d胚直接离体培养条件筛选

1.材料与方法

(1)摘取新铁炮百合‘雷山3号’为母本，东方百合‘索邦’为父本，授粉后35-40d的子房；(2)将摘取的子房在无菌条件下用体积百分含量75％酒精棉球表面擦拭3次，有效氯1％的次氯酸钠浸泡20min，无菌水冲洗3次；(3)然后将蒴果横切，选取有胚胚珠在解剖镜下剥取种胚，接种在筛选培养基上；(4)筛选培养基配方为：①MS+质量百分浓度3％蔗糖，不添加任何生长调节物质；②MS+0.01mg/LNAA+质量百分浓度3％蔗糖；③MS+0.1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+质量百分浓度3％蔗糖；④MS+0.001mg/LNAA+0.1mg/L6-BA+质量百分浓度6％蔗糖。pH值5.8，琼脂质量百分浓度0.8％。(5)培养温度为25±1℃，暗培养，每处理3瓶，每瓶3-5个。

2.结果与分析

不同培养基对胚培养的影响实验结果见表5。

表5不同培养基对胚培养的影响

采用以上方法对新铁炮百合‘雷山3号’为母本，东方百合‘索邦’为父本授粉后35d-40d的杂种胚进行直接离体培养，最佳培养基为MS培养基，0.001mg/LNAA、0.1mg/L6-BA、6％蔗糖、pH值5.8、琼脂0.8％，28d后萌发率达84.6％，并证明低浓度的生长调节剂对幼胚生长有促进作用。图4为杂种胚直接离体培养的组培示意图。

由上述实施例可以得出以下结果：

(1)发现授粉后5d-25d的子房切片培养，以B₅或1/2B₅培养基为基本培养基，含有蔗糖的质量百分含量为6％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基均能较好地培养得到胚珠。其中，授粉早期5d、10d、15d、20d子房切片培养的最佳培养基配方为B₅培养基、6％蔗糖、pH＝5.8、琼脂0.8％，含成活胚珠的子房切片数分别为50％、75％、66.7％、43.3％。授粉早期25d子房切片培养的最佳培养基配方为1/2B₅培养基、6％蔗糖、pH＝5.8、琼脂0.8％，含成活胚珠的子房切片数为34.3％。

(2)发现授粉后5d-25d的子房切片培养后胚珠培养，以B₅或1/2B₅培养基为基本培养基，含有蔗糖的质量百分含量为6-9％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基均能较好地培养得到杂交组培苗。其中，授粉早期5d、10d、15d、25d子房切片培养后胚珠培养的最佳培养基配方为B₅培养基、6％蔗糖、pH＝5.8、琼脂0.8％，成苗率分别为44.4％、46.7％、41.7％、36.4％；授粉早期20d子房切片培养后胚珠培养的最佳培养基配方为1/2B₅培养基、9％蔗糖、pH＝5.8、琼脂0.8％，成苗率为44.4％。

(3)授粉后35d-40d胚珠直接离体培养的最佳培养基配方为MS培养基、琼脂0.8％、NAA0.01mg/L、3％蔗糖、pH＝5.8，胚珠的萌发率达15％。极差分析结果表明蔗糖浓度对胚珠培养的影响最大，其次是pH值。

(4)授粉后35d-40d杂种胚直接离体培养的最佳培养基配方为MS培养基、0.001mg/LNAA、0.1mg/L6-BA、6％蔗糖、pH值5.8、琼脂0.8％，培养28d后开始萌发，萌发率达84.6％。并证明低浓度的生长调节剂对幼胚生长有促进作用，但不添加任何生长调节剂的MS培养基上的胚萌发率最低，为30.0％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)新铁炮百合远缘杂交后，取子房进行灭菌消毒；

A授粉后5d-25d发育阶段胚拯救

B授粉后35d-40d发育阶段胚拯救

胚珠离体培养或胚离体培养，得到杂交组培苗。

2.如权利要求1所述一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，其特征在于，步骤1)所述新铁炮百合远缘杂交，为以新铁炮百合为母本，与东方百合进行远缘杂交。

3.如权利要求2所述一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，其特征在于，所述东方百合为百合品种‘索邦’。

4.如权利要求1所述一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，其特征在于，A所述子房切片培养所用的培养基为：以B₅或1/2B₅培养基为基本培养基，含有蔗糖的质量百分含量为6％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基。

5.如权利要求1所述一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，其特征在于，A所述胚珠组织培养所用的培养基为：以B₅或1/2B₅培养基为基本培养基，含有蔗糖的质量百分含量为6-9％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基。

6.如权利要求1所述一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，其特征在于，A所述授粉后5d-25d发育阶段胚拯救，最优选为以授粉后10d的子房进行子房切片培养，得到胚珠后进行胚珠组织培养，子房切片培养和胚珠培养所用的培养基均为：以B₅培养基为基本培养基，含有蔗糖的质量百分含量为6％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基。

7.如权利要求1所述一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，其特征在于，B所述胚珠离体培养，所用培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有NAA的浓度为0.01mg/L、蔗糖的质量百分含量为3％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基。

8.如权利要求1所述一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，其特征在于，B所述胚离体培养，所用培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有NAA的浓度为0.001mg/L、6-BA的浓度为0.1mg/L、蔗糖的质量百分含量为3％、琼脂的质量百分含量为0.8％、pH值为5.8的培养基。

9.如权利要求1所述一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，其特征在于，所述新铁炮百合，为新铁炮百合品种‘Augusta’或‘雷山3号’。

10.权利要求1-9任一项所述的一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，在百合育种中的应用。