CN105121630A

CN105121630A - 定量重链和轻链多肽对的方法

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Publication number: CN105121630A
Application number: CN201380063081.3A
Authority: CN
Inventors: 贾森·巴德斯内斯; 毛伦·奥康诺麦考特; 安德斯·奥尔恩; 亚当·路易斯·科珀; G·Y·K·吴; 安托尼奥斯·萨米奥塔基斯; Y-C·周
Original assignee: National Research Council of Canada; Zymeworks Inc Canada
Current assignee: Enzymatic British Columbia Ltd
Priority date: 2012-10-03
Filing date: 2013-10-03
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2033-10-03
Also published as: EP2904093A4; AU2013326974A1; EP2904093B1; CA2886422A1; JP6581505B2; CA2886422C; WO2014055784A1; US9771573B2; JP2015533089A; US20150211001A1; EP2904093A1; AU2013326974B2; CN105121630B

Abstract

本发明提供当重链和两条独特轻链共表达时定量确定个别IgG重链与特定IgG轻链选择性配对的能力的方法。所述方法以合理通量来提供结果并且是稳健和准确的。所述共表达的重链和轻链不需要分离和纯化，从而使得能够更有效筛选。

Description

定量重链和轻链多肽对的方法

交叉引用

本申请要求2012年10月3日提交的美国临时申请No.61/744,911的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文以用于所有目的。

背景

此前已描述了识别并量化重链和轻链的共表达产物的方法。例如，液相色谱-质谱法(LC-MS)和离子交换色谱法(IEX)已经用于描述双特异性抗体构建体的纯度(参见例如Strop等(2012)J.Mol.Biol.420:204-219)。基于的活性夹心ELISA也已经用于高通量筛选来选择分泌高产量的具有良好纯度的双特异性抗体的稳定细胞系。(参见例如vanderNeutKolfschonten等(2007),Science317:1554-1557)。也已经描述使用酵母来展示抗体的方法(参见例如Chao等,NatProtoc.2006；1(2):755-68)。使用例如亲和色谱来分离或纯化抗体的方法在本领域中是熟知的并且亲和力纯化柱是可购得的。

定量免疫球蛋白重链/轻链免疫测定，(HLC,TheBindingSiteGroup,Birmingham,UK)，是可购得的，并且包括测量IgGκ/IgGλ对的步骤。此测定用于量化患有疾病例如像多发性骨髓瘤的患者的单株免疫球蛋白。

发明概述

双特异性IgG(呈接近于野生型IgG的格式)通常通过两条独特抗体重链和两条独特抗体轻链的细胞内同时表达来形成。正确形成此类型双特异性格式是具有挑战性的，因为抗体重链已经演化成以相对混杂的方式结合至抗体轻链。因此，当两条独特抗体重链和两条独特抗体轻链共表达时，产生多个抗体分子，其中所需双特异性抗体通常少量形成。避免此问题的一种方法是使用选择性配对以形成所需双特异性抗体的抗体重链和抗体轻链。因此，需要允许识别选择性彼此配对的IgG重链和IgG轻链的筛选测定。

提供适用于确定是否特定免疫球蛋白(例如，IgG)重链选择性结合至特定免疫球蛋白(例如，IgG)轻链的测定和分析工具。

本文提供高通量量化重链多肽与至少一个轻链多肽配对的选择性的方法、测定、系统和试剂盒。还提供确定在竞争重链或轻链多肽或其组合存在下含有Fab的构建体的选择性形成的方法、系统和试剂盒。还提供使用本文所述测定来设计或制造二互补位抗体构建体的方法。还提供确定抗体异源二聚体形成的方法。

提供量化与至少一个轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：(a)共表达一组构建体：包含VH和CH1区的第一重链多肽；包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽；和包含第二VL和第二CL区的第二轻链多肽；其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)将包含与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和(c)在重链配对多肽产物中，定量与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的选择性。

在这类方法的一个实施方案中，第一或第二重链多肽还包括Fc区。在这类方法的另一个实施方案中，第一和第二重链多肽还包括Fc区。在这类方法的另一个实施方案中，第一或第二重链多肽包括Fc区和Fv区。在这类方法的另一个实施方案中，第一和第二重链多肽包括Fc区和Fv区。

应了解可进行此过程来将至少一个轻链多肽与至少第一重链多肽和第二重链多肽配对。

在所述方法的一个实施方案中，步骤(c)包括量化在捕获HC:LC1:LC2的表面检测到的HC:LC1:LC2之间的配对，其中所述方法包括捕获和检测方法例如像ELISA、SPR芯片、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS),荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)、或其组合；并且针对一个或多个所述单元与所述环境之间的相互作用来筛选所述表面。

本文提供量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：(a)共表达一组构建体包含：包含VL和CL区的第一轻链多肽；包含第一VH和第一CH1区的第一重链多肽；和包含第二VH和第二CH1区的第二重链多肽；其中表达所述轻链多肽和所述重链多肽以使得轻链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)将包括与所述第一或第二重链多肽配对的轻链多肽的轻链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和(c)在轻链配对多肽产物中，与所述第一重链多肽配对的轻链多肽的量，和与所述第二重链多肽配对的轻链多肽的量；其中与另一个重链多肽相比，与所述第一或第二重链多肽中的一个重链多肽配对的轻链多肽的较大量指示与所述第一或第二重链多肽配对的轻链多肽的选择性。

本文提供量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：(a)共表达一组构建体包含：包含VH、CH1、CH2和CH3区的第一重链多肽；包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽；和包含第二VL和第二CL区的第二轻链多肽；其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)将包含与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和(c)在重链配对多肽产物中，与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的选择性。

本文提供量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：(a)共表达一组构建体包含：包含VH、CH1、CH2和CH3区的全长重链多肽；包含CH2区和CH3区的重链多肽；包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽；和包含第二VL和第二CL区的第二轻链多肽；其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得全长重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)将包含与包含CH2区和CH3区的重链多肽与所述第一或第二轻链多肽配对的全长重链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和(c)在重链配对多肽产物中，与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的选择性。

配对可通过量化可检测部分来检测。可检测部分可为例如蛋白质结合位点、配体结合位点或包含另一个可检测部分的标签。检测可检测部分可包括测量荧光、淬灭、放射性或化学发光。在一个实施方案中，包含HC:LC1:LC2的环境是复杂分子混合物、细胞上清液、宿主细胞的细胞质或其组合。具有具体轻链标签的抗体的质量可通过分离重链部分的量来标准化。可评估对照抗体的当量质量比。两个质量比的比率等于具有特定标签的分离抗体的百分比。

在所公开方法的一个实施方案中，所述方法包括与L2与H配对的相对配对倾向相比，确定L1与H配对的相对配对倾向。

所述方法可还包括选择产生超过HL2物质的较高相对量HL1物质的配对多肽。比较比率可根据以下计算来完成：

R = \frac{[H L 1]}{[H L 2]}

S = l o g \frac{[H L 1]}{[H L 2]}

P 1 = 100 \cdot \frac{[H L 1]}{[H L 1] + [H L 2]}

P 2 = 100 \cdot \frac{[H L 2]}{[H L 1] + [H L 2]}

其中R是两个Fab物质的量的比率；S是R的对数，并且与L1与H和L2与H配对之间的自由能差异成比例；并且P1和P2分别是所需和不需要物质的百分比以使得

在另一方面，本文提供量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：(a)共表达一组构建体包含：包含VH区、CH1区和第一可检测标记(标签)的重链多肽；包含第一VL、第一CL区和第二可检测标记的第一轻链多肽；和包含第二VL、第二CL区和第三可检测标记的第二轻链多肽；其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得全长重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)使用重链多肽上的第一可检测标记，将包含重链多肽与所述第一或第二轻链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和(c)在重链配对多肽产物中，确定与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的选择性。

在一个实施方案中，第一可检测标记是6xHis标签。在另一个实施方案中，第二可检测标签不同于所述第三可检测标签。

确定可包括ELISA、SPR、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS)、荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)、或其组合。

可检测标记可为蛋白质结合位点、配体结合位点或包含另一个可检测部分的标签。检测可检测标记可包括测量荧光、淬灭、放射性或化学发光。

在另一方面，本文提供量化与重链多肽配对的轻链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：(a)共表达一组构建体包含：包含VL区和CL区的轻链多肽；包含第一VH、第一CH1区和至少一个可检测标记的第一重链多肽；和包含第二VH、第二CH1区和至少一个可检测标记的第二重链多肽；其中表达所述轻链多肽和所述重链多肽以使得轻链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)将包含轻链多肽与所述第一或第二重链多肽的轻链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和(c)在轻链配对多肽产物中，确定与所述第一重链多肽配对的轻链多肽的量，和与所述第二重链多肽配对的轻链多肽的量；其中与另一个重链多肽相比，与所述第一或第二重链多肽中的一个重链多肽配对的轻链多肽的较大量指示与所述第一或第二重链多肽配对的轻链多肽的选择性。

在一个实施方案中，第一重链多肽用两个标记来标记。

在另一个实施方案中，第一重链多肽用6xHis标签和第二标记来标记。

在另一个实施方案中，第二重链多肽用两个标记来标记。

在另一个实施方案中，第二重链多肽用6xHis标签和第二标记来标记。

在另一方面，本文提供量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：(a)共表达一组构建体包含：包含VH、CH1、CH2和CH3区的全长重链多肽；包含CH2区和CH3区的重链多肽；包含第一VL、第一CL区和第一可检测标记的第一轻链多肽；和包含第二VL、第二CL区和第二可检测标记的第二轻链多肽；其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得全长重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)使用抗Fc抗体来分离重链配对多肽产物；和(c)在重链配对多肽产物中，确定与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的选择性。

在一个实施方案中，第一可检测标记不同于第二可检测标记。

在另一方面，本文提供量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：(a)共表达一组构建体包含：包含VH、CH1、CH2和CH3区的全长重链多肽；包含第一VL、第一CL区和第一可检测标记的第一轻链多肽；和包含第二VL、第二CL区和第二可检测标记的第二轻链多肽；其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得全长重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)使用抗Fc抗体来分离重链配对多肽产物；和(c)在重链配对多肽产物中，确定与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的选择性。

在另一方面，本文提供量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：(a)共表达一组构建体包含：包含VH区、CH1区和可检测标记的第一重链多肽；包含VH区、CH1区和可检测标记的第二重链多肽；包含第一VL、第一CL区和可检测标记的第一轻链多肽；和包含第二VL、第二CL区和可检测标记的第二轻链多肽；其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；(b)将包含与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和(c)在重链配对多肽产物中，确定与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的选择性。

在一个实施方案中，每个所述可检测标记是独特的。

通过所述方法获得的数据可传输至通用计算机并且数据的输出包括将结果存储在数据载体上。

在一些情况下，所述方法可任选地包括分析HC-LC结果。替代地或附加地，所述方法可还包括建立配对重链多肽和轻链多肽的LCCA文库。

在任何所描述方法的某些实施方案中，重链多肽和第一和第二轻链多肽以约0.25:1:1的预定比率表达。在选定实施方案中，重链多肽和第一和第二轻链多肽以约1:2:2的预定比率表达。在一些实施方案中，重链多肽和第一和第二轻链多肽以约1:3:3的预定比率表达。在某些其它实施方案中，第一和第二轻链以不同相对量表达。举例来说，在一些实施方案中，重链多肽和第一和第二轻链多肽以约2:1:3或约2:3:1的预定比率表达。在一个实施方案中，重链多肽(HC)与第一轻链多肽(LC1)和第二轻链多肽(LC2)的转染比率，即，HC:LC1:LC2为3:1:1以在一些情况下确定是否LC1和LC2相等地表达。应了解其它比率可使用并且在本文中涵盖。在非限制性实例中，HC:LC1:LC2的LCCA剂量验证比率可为(50:75:25、50:50:50和50:25:75)或(50:40:60、50:50:50和50:60:40)。

在任何所描述方法的某些实施方案中，轻链多肽和第一和第二重链多肽以约0.25:1:1的预定比率表达。在选定实施方案中，轻链多肽和第一和第二重链多肽以约1:2:2的预定比率表达。在一些实施方案中，轻链多肽和第一和第二重链多肽以约1:3:3的预定比率表达。在某些其它实施方案中，第一和第二重链以不同相对量表达。举例来说，在一些实施方案中，轻链多肽和第一和第二重链多肽以约2:1:3或约2:3:1的预定比率表达。在一个实施方案中，轻链多肽(LC)与第一重链多肽(HC1)和第二重链多肽(HC2)的转染比率，即，LC:HC1:HC2为3:1:1以在一些情况下确定是否HC1和HC2相等地表达。应了解其它比率可使用并且在本文中涵盖。在非限制性实例中，LC:HC1:HC2的LCCA剂量验证比率可为(50:75:25、50:50:50和50:25:75)或(50:40:60、50:50:50和50:60:40)。

在某些实施方案中，共表达是在宿主细胞中。在一些实施方案中，共表达是在体外非细胞表达系统中。

在实施方案中，本文提供的方法包括在表达之后将所表达的多肽从表达培养基中分离的步骤。在一些实施方案中，多肽通过离心分离。在一些其它实施方案中，多肽通过使用纯化柱来分离。

在本文描述的方法的一些实施方案中，包含VH和CH1区的第一重链多肽还包括CH3区。在一些实施方案中，所述方法还包括共表达包含CH3区的第二重链多肽。在某些实施方案中，至少一个重链多肽包括CH2区或其片段。

在某些实施方案中，本文描述的方法还包括使用定量对照标准。在一个实施方案中，所述方法包括在不存在其它轻链多肽的情况下，在至少一个宿主细胞中或在体外系统中，表达所述重链多肽和所述第一和第二轻链多肽中的一个轻链多肽；分离包含重链多肽和轻链多肽的重链配对多肽产物；和定量所述产物的量，其中所述量充当所述重链多肽与所述轻链多肽的最大可检测结合的对照标准。在一些实施方案中，包括重链多肽和所需轻链多肽的产物提供阳性对照标准。在实施方案中，包括重链多肽和不太需要轻链多肽的产物提供阴性对照标准。

在一些情况下，本文描述的方法还可包括将任何未结合多肽从包含分离构建体的混合物中移除的步骤。

提供量化与至少一个轻链多肽配对的重链多肽的选择性的方法，其中至少一个轻链多肽包括可检测部分。可检测部分可为蛋白质结合位点、配体结合位点或包含另一个可检测部分的标签。在某些实施方案中，每个轻链多肽用包含不同可检测部分的不同标签来标记。在一些实施方案中，重链多肽用标签标记。在一个实施方案中，标记所述重链多肽的标签能够捕获至包含相互作用表面层的表面上，并且通过设备来进一步检测并量化。设备可用于检测并量化所述第一和第二轻链多肽中的至少一个轻链多肽上的可检测部分。在一些实施方案中，设备能够高通量。检测可检测部分可包括使用检测标记的任何常规方法来测量，包括但不限于ELISA、SPR芯片、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS)、荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)、或其组合。在一些实施方案中，检测可检测部分包括测量荧光、淬灭、放射性或化学发光.

在某些实施方案中提供确定在竞争重链或轻链多肽或其组合存在下含有Fab的构建体的选择性形成的方法，所述方法包括：在体外或在宿主细胞中共表达一组构建体：包含VH和CH1区的第一重链多肽；和包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽；其中所述第一轻链多肽选择性地与所述重链多肽缔合以形成所需Fab构建体；一个或多个其它重链多肽、轻链多肽或其组合；分离包含所述第一重链多肽或所述第一轻链多肽的每个Fab构建体；和与其它Fab构建体相比，检测所需Fab构建体的量；其中所需Fab构建体的较大量展示形成所述Fab构建体的较高选择性。在一些情况下，第一重链多肽和轻链多肽用包含不同可检测部分的标签来标记。

提供确定合理设计Fab构建体在其它重链或轻链多肽存在下自动缔合的能力的方法，包括本文描述的量化与至少一个轻链多肽配对的重链多肽的选择性的方法，其中所述第一重链多肽和所述第一轻链多肽缔合以形成所设计的Fab构建体。

提供量化与至少一个轻链多肽配对的重链多肽的选择性的方法，其中所述多肽在宿主细胞中共表达。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是COS、CHO、BHK、HEK-293、NSO、3T3细胞及其衍生物中的至少一个。

提供本文描述的方法，其中至少一条重链或轻链多肽包括选自6xHis、FLAG、HA、c-myc、s-FLAG、SBP、V5和ABD的至少一个标签。

提供设计异源多聚体抗体构建体的方法，包括：a)在体外或在宿主细胞中共表达一组构建体：包含第一免疫球蛋白重链区的第一重链多肽；包含第一免疫球蛋白轻链区的第一轻链多肽，所述第一轻链多肽能够与所述第一重链多肽缔合以形成第一Fab构建体；并且包含第二免疫球蛋白轻链区的第二轻链多肽能够与包含第二免疫球蛋白重链区的第二重链多肽缔合以形成第二Fab构建体，其中所述第一和第二重链多肽能够形成包含变体CH3区的异源多聚体；b)检测包含所述第一重链多肽和所述轻链多肽中的任何一个轻链多肽的所形成的Fab构建体的量；c)在宿主细胞中表达：所述第二重链多肽、第一轻链多肽和第二轻链多肽；d)检测包含所述第二重链多肽和所述轻链多肽中的任何一个轻链多肽的所形成的Fab构建体的量；其中与其它Fab构建体相比，步骤b)中的第一Fab构建体的较大量和步骤d)中的第二Fab构建体的较大量展示多肽可自动组装以形成异源多聚体抗体构建体。

提供高通量筛选多肽以设计异源多聚体抗体的方法，包括：a)获得：包含第一免疫球蛋白重链区的第一重链多肽；包含第一免疫球蛋白轻链区的第一轻链多肽，所述第一轻链多肽能够与所述第一重链多肽缔合以形成第一Fab构建体；包含第二免疫球蛋白重链区的第二重链多肽，其中所述第一和第二重链多肽能够形成包含变体CH3区的异源多聚体；并且包含第二免疫球蛋白轻链区的第二轻链多肽能够与所述第二重链多肽缔合以形成第二Fab构建体；b)在溶液中使所述第一重链多肽与所述第一和第二轻链多肽接触；c)在来自步骤b)的溶液中检测包含所述第一重链多肽和所述轻链多肽中的任何一个轻链多肽的所形成的Fab构建体的量；d)在另一溶液中使所述第二重链多肽与所述第一和第二轻链多肽接触；e)在来自步骤d)的溶液中检测包含所述第二重链多肽和所述轻链多肽中的任何一个轻链多肽的所形成的Fab构建体的量；其中与其它Fab构建体相比，步骤c)中的第一Fab构建体的较大量和步骤e)中的第二Fab构建体的较大量展示多肽可自动组装以形成异源多聚体抗体构建体。

在某些实施方案中，每个轻链多肽和每个重链多肽用包含不同可检测部分的不同标签来标记。在一些实施方案中，每条重链标签能够由包含相互作用表面层的设备来捕获。在一些实施方案中，设备能够定量识别每个轻链多肽上的标签。在某些实施方案中，设备能够高通量。在一个实施方案中，可检测部分通过ELISA、SPR芯片、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS)、荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)、或其组合来测量而可量化地检测。可检测部分可通过测量荧光、淬灭、放射性或化学发光来可量化地检测。

提供确定与至少一个轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：获得：包含免疫球蛋白重链区的重链多肽；包含第一免疫球蛋白轻链区的第一轻链多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链区的至少一个第二轻链多肽；在溶液中使所述重链多肽和所述轻链多肽以预先确定的比率接触以使得重链多肽的总量具有限制性；分离包含与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的重链配对多肽产物；和定量与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的选择性。

提供高通量筛选重链多肽与至少一个轻链多肽的选择性配对的系统，其包括：一种或多种宿主细胞或体外机制以表达：重链多肽，其包含免疫球蛋白重链(HC)区和能够由包含相互作用表面层的设备捕获的标签；包含第一免疫球蛋白轻链区的第一轻链多肽(L1)；和包含第二免疫球蛋白轻链区的至少一个第二轻链(L2)多肽；其中所述重链多肽和所述轻链多肽以预先确定的比率来表达以使得HC<(L1+L2)；并且其中所述第一和第二轻链多肽用可检测部分加标签；和检测设备，其包含能够捕获所述重链多肽的相互作用表面层，其中所述设备进一步能够检测每个所述轻链多肽上的可检测部分；其中包含重链多肽和所述第一或第二轻链多肽的构建体由所述一种或多种宿主细胞来表达，并且与所述检测设备接触，并且其中所述检测设备适用于检测包含重链多肽和第一轻链多肽的第一构建体的量，和包含重链多肽和第二轻链多肽的第二构建体的量，以使得与第二构建体相比，第一构建体的较大量证实与第二轻链多肽相比，重链多肽与第一轻链多肽配对的较高选择性。

在一些实施方案中，所述系统还包括在与所述检测设备接触之前将所述构建体与所述一种或多种宿主细胞分离的机制。在一个实施方案中，所述重链多肽和第一和第二轻链多肽的预定比率为约0.25:1:1。在一个实施方案中，所述重链多肽和第一和第二轻链多肽的预定比率为约0.5:1:1。在一些实施方案中，所述重链多肽和第一和第二轻链多肽的预定比率为约1:2:2。在某些实施方案中，所述重链多肽和第一和第二轻链多肽的预定比率为约1:3:3。在某些其它实施方案中，第一和第二轻链以不同相对量表达。举例来说，在一些实施方案中，重链多肽和第一和第二轻链多肽以约2:1:3或约2:3:1的预定比率表达。

提供高通量设计异源多聚体抗体的试剂盒，其包含本文所述系统，和使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包括一个或多个小瓶、导管、容器、试剂和/或缓冲剂。在某些实施方案中，试剂盒还包括纯化重链和轻链多肽的机构。分离或纯化多肽的机构在本领域中为已知的并且在以下描述。

在本发明的一方面，提供确定至少一个修饰重链在共表达测定中与特定修饰轻链选择性配对的能力的方法，所述方法包括：a.在细胞中以一定比率共表达至少一个修饰重链和两个不同修饰轻链以使得修饰重链为限制配对反应物，其中共表达蛋白质从细胞中分泌；b.任选地将共表达分泌蛋白质从细胞中分离；c.将结合至修饰重链的轻链多肽与分泌蛋白质的其余部分分离以产生分离重链配对部分；d.检测分离重链部分中的每个不同修饰轻链的量；和e.分析分离重链部分中的每个不同修饰轻链的相对量以确定至少一条重链与一条轻链选择性配对的能力。

附图简述

图1提供评估变体的测定要求的流程图。

图2提供使用轻链加标签群体的SPR读出的测定的关键步骤的示意性描述。

图3A和3B示出示例性轻链竞争测定，其中图3A示出SPR基于夹心测定并且图3B示出抗-His标签表面。

图4描绘掺杂实验的绘图，其中已知比率的100％HC：LC-HA或100％HC：LC-FLAG以预定比率混合。在相对于LC-FLAG或LC-HA的比率作图时，抗标签抗体的读出大约为线性的。

图5示出随着共表达中的L1和L2的相对量而变化的两个Fab物质的相对量的理论依赖性。示出三个不同配对倾向的关系。

图6示出随着共表达中的L1和L2的相对量而变化的两个Fab物质的相对量的理论依赖性。示出三个不同配对倾向的关系。

图7描绘通常在LCCA中使用的SPR芯片的示意图，其中五个变体同时运行并且可使用多达五个不同二级抗体。每个细胞通过所示两要素坐标来指示。

图8A-F代表工作LCCA文库的示例性合理设计。首先，建立设计(即，设计1…设计N)的计算机“LCCA文库”(图8A)；文库工程化以使得HC优选与LC1而非LC2配对(即，HC-LC1>>HC-LC2)。这些设计然后在体外测试。为此目的，文库设计个别地克隆至表达载体中(参见步骤2；图8B)。随后，LCCA设计(例如，HC₁，LC1₁，和LC2₁…HC_N、LC1_N和LC2_N)瞬时表达于哺乳动物细胞中(例如，CHO；参见步骤3；图8C)。转染后七天，收获CHO细胞上清液，并且使用SPR读出，针对每个LCCA设计来量化HC-LC1:HC-LC2群体(步骤4；图8D)。然后，工作设计基于设定标准来排序(例如，HC-LC1:HC-LC2>＝75:25)；成功设计成为“工作LCCA文库”的一部分。当处理较大数据集时，可利用任选数据挖掘步骤(#5；图8E)。在此步骤期间，执行“HC-LC配对结果的整体分析”。此步骤可为相当有益的，因为它潜在允许数据中的非平凡和非明显模式/趋势得以辨识。最后，编译工作LCCA文库(图8F)。

图9提供其中HC受限制的示例性LCCA的动画描述。

图10提供其中LC受限制的示例性HCCA的动画描述。

图11提供其中全长HC多肽受限制的示例性LCCA的动画描述。

图12提供其中全长HC多肽受限制的示例性ORCA的动画描述(使用HET_FC)。

图13描绘代表轻链竞争测定数据的图表的一部分。

图14示出十七个“Fab配对设计”的LCCAFab1(即，HC1:LC1:LC2；x轴)和Fab2(即，HC2:LC1:LC2；y轴)结果。在两个Fab臂上运作良好的设计(即，展示正确配对fab的较高百分比)可在绘图的顶部最右边象限中发现。执行不太有效的设计(例如，一个Fab臂未良好运作)在绘图的底部左侧示出。野生型格式的Fab配对设计的性能由数据点的着色来指示(参见图例)。

图15提供描绘所述方法如何在LCCA实施方案(LCCA-1)中执行的实例的线图。在此图中，重链和轻链各自独特地加标签(参见图例)。

图16提供描绘所述方法如何在HCCA实施方案中执行的实例的线图。在此图中，仅重链独特地加标签(参见图例)。

图17提供描绘所述方法如何在ORCA实施方案中执行的实例的线图。在此图中，仅轻链独特地加标签(参见图例)。

图18提供描绘所述方法如何在LCCA-2实施方案中执行的实例的线图。在此图中，仅轻链独特地加标签(参见图例)。

详述

本文提供确定免疫球蛋白(IgG)重链或免疫球蛋白轻链分别与特定IgG轻链或IgG重链选择性配对的能力的定量方法。在一个实施方案中，所述方法用于确定是否当重链和独特轻链共表达时，一个具体IgG重链与两个独特IgG轻链中的任何一个选择性配对。测定是灵活的，因为共表达的IgG重链和轻链可呈“Fab”格式，或其中重链也包括Fc区的格式。

所述方法可以高通量测定来执行并且是灵敏的，因为它测量IgG重链和轻链的氨基酸序列的较小变化的效应。所述方法是通用的，因为它能够在没有显著修改的情况下量化大多数重链-轻链配对。

在一个实施方案中，所述方法用于筛选已经修饰以驱动特定重链-轻链配对的合理设计IgG多肽的文库。另外，当所述方法使用非野生型格式，例如Fab格式的IgG多肽来执行时，选择性配对的定量预测野生型格式的IgG多肽的选择性配对。因此，所述方法可用于识别适用于制备双特异性抗体的Fab模块。

在另一个实施方案中，本文提供分析较大组测量结果的图解法，藉以发现尤其有益于选择性配对的IgG重链和IgG轻链的组合。因此，分析方法使得能够有效加工从测定数据的高通量产生所获得的数据。

根据本申请，可使用本领域技能范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这类技术在文献中得到完全解释。参见例如Sambrook等,"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(1989)；"CurrentProtocolsinMolecularBiology"VolumesI-III[Ausubel,R.M.编(1994)]；"CellBiology:ALaboratoryHandbook"VolumesI-III[J.E.Celis编(1994))]；"CurrentProtocolsinImmunology"VolumesI-III[Coligan,J.E.编(1994)]；"OligonucleotideSynthesis"(M.J.Gait编1984)；"NucleicAcidHybridization"[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985)]；"TranscriptionAndTranslation"[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1984)]；"AnimalCellCulture"[R.I.Freshney编(1986)]；"ImmobilizedCellsAndEnzymes"[IRLPress,(1986)]；B.Perbal,"APracticalGuideToMolecularCloning"(1984)，各自具体以引用方式整体并入本文。

提供高通量筛选方法和设备，其能够执行重复、精确测定筛选，并且以极小体积来操作以设计并识别适用于构建抗体构建体的FAB模块。在一些实施方案中，所构建的抗体构建体是二互补位的。一些抗体构建体是双特异性的。

抗体术语

如本文使用，术语“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)，不论天然或部分或全部合成产生。此术语也包括具有为或与抗原结合域同源的结合域的任何多肽或蛋白质。此术语还包括“抗原结合片段”和如以下描述的类似结合片段的其它可互换术语。互补决定区(CDR)枝接抗体和其它人源化抗体(包括CDR修饰和框架区修饰)也由此术语涵盖。

天然抗体和天然免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，包含两条相同轻(L)链和两条相同重(H)链。每一轻链通常借助一个共价二硫键连接到一条重链，但不同免疫球蛋白同种型的重链中二硫键的数量不同。各重链和轻链还具有规律间隔的链内二硫桥键。各重链在一端具有可变结构域(“VH”或“V_H”)，继而为多个恒定结构域(“CH”或“C_H”)。各轻链在一端具有可变域(“VL”或“V_L”)且在它的另一端具有恒定域(“CL”或“C_L”)；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对准，且轻链可变域与重链的可变域对准。据悉，特定的氨基酸残基形成了轻链可变域与重链可变域之间的界面。

如本文使用，术语“合成多核苷酸”、“合成基因”或“合成多肽”是指相应多核苷酸序列或其一部分，或氨基酸序列或其一部分，从与等效天然发生序列相比，设计或重新合成或修饰的序列衍生。合成多核苷酸(抗体或抗原结合片段)或合成基因可通过在本领域中已知的方法来制备，包括但不限于，核酸或氨基酸序列的化学合成。合成基因通常在氨基酸或多核苷酸水平(或两者)上不同于天然发生基因，并且通常在合成表达控制序列的情况下定位。举例来说，合成基因序列可包括例如通过置换、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸来改变的氨基酸或多核苷酸序列，从而提供不同于源序列的抗体氨基酸序列或多核苷酸编码序列。合成基因多核苷酸序列可不一定编码与天然基因相比具有不同氨基酸的蛋白质；例如，其也可包括并入不同密码子但是编码相同氨基酸的合成多核苷酸序列(即，核苷酸变化代表氨基酸水平上的沉默突变)。

相对于抗体，术语“可变域”是指在每个具体抗体针对其具体抗原的结合和特异性中所使用的抗体的可变域。然而，可变性并非在抗体的整个可变域中均匀分布。实际上，在轻链与重链可变域中，所述可变性集中在三个称为高变区(也称为CDR)的片段中。可变域的更高度保守的部分称为“框架区”或“FR”。未修饰重链和轻链的可变域各包含四个FR(FR1、FR2、FR3和FR4)，主要采用由形成环连接的三个CDR连接的β-折叠构型，且在一些情况下，形成β-折叠结构的一部分。各链的CDR由FR紧密靠近地结合在一起，且与来自其它链的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参看Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991),第647-669页)。

术语“高变区”和“CDR”当在本文中使用时是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。CDR包括来自三个序列区的氨基酸残基，其以互补方式结合至抗原并且对于VH和VL链中的每一个，被称为CDR1、CDR2和CDR3。在轻链可变域中，CDR通常对应于大约残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)，并且在重链可变域中，CDR通常对应于大约残基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)，根据Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))。应了解不同抗体的CDR可含有插入，因而氨基酸编号可不同。Kabat编号系统用编号方案来考虑到这类插入，所述编号方案利用附着至特定残基的字母(例如，轻链中的CDRL1的27A、27B、27C、27D、27E和27F)以反映不同抗体之间的编号中的任何插入。或者，在轻链可变域中，CDR通常对应于大约残基26-32(CDRL1)、50-52(CDRL2)和91-96(CDRL3)，并且在重链可变域中，CDR通常对应于大约残基26-32(CDRH1)、53-55(CDRH2)和96-101(CDRH3)，根据ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))。

如本文使用，“框架区”或“FR”是指形成抗原结合囊或槽的一部分的框架氨基酸残基。在一些实施方案中，框架残基形成作为抗原结合囊或槽的一部分的环并且环中的氨基酸残基可或可不接触抗原。框架区总体上包括CDR之间的区。在轻链可变域中，FR通常对应于大约残基0-23(FRL1)、35-49(FRL2)、57-88(FRL3)和98-109并且重链可变域FR通常对应于大约残基0-30(FRH1)、36-49(FRH2)、66-94(FRH3)和103-133，根据Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))。如以上对于轻链的Kabat编号所论述，重链也以类似方式考虑到插入(例如，重链中的CDRH1的35A、35B)。或者，在轻链可变域中，FR通常对应于大约残基0-25(FRL1)、33-49(FRL2)53-90(FRL3)和97-109(FRL4)，并且在重链可变域中，FR通常对应于大约残基0-25(FRH1)、33-52(FRH2)、56-95(FRH3)和102-113(FRH4)，根据ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))。

FR的环氨基酸可通过检查抗体重链和/或抗体轻链的三维结构来评估并确定。三维结构可针对溶剂可接近的氨基酸位置来分析，因为此类位置可能形成环且/或提供抗体可变域中的抗原接触。一些溶剂可接近的位置可耐受氨基酸序列多样性并且其它(例如，结构位置)总体上是不太多样化的。抗体可变域的三维结构可从晶体结构或蛋白质建模获得。

抗体的Fc域的恒定域未直接涉及抗体结合至抗原，而实际上，展现各种效应功能，例如抗体经由与例如Fc受体(FcR)相互作用来参与抗体依赖性细胞毒性。Fc域也可增加施用至受试者之后的抗体在循环中的生物利用率。

取决于其重链的恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归属于不同的类别。存在五个主要免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且若干这些类别可进一步分成子类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于抗体的不同类别免疫球蛋白的重链恒定域(Fc)分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是熟知的。在一个实施方案中，抗体，或本文所述抗原结合片段是IgG同种型例如像亚型IgG₁或IgG₄。重链在本文中可互换地称为“IgG重链”、“IgG重链多肽”或“重链多肽”。重链在本文中也缩写为“HC”或“H”，例如HC1和HC2，或H1和H2。

来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可基于其恒定域的氨基酸序列指定为两种明显不同类型(称为κ或(“κ”)及λ或(“λ”))中的一者。轻链在本文中可互换地称为“IgG轻链”、“IgG轻链多肽”或“轻链多肽”。轻链在本文中也缩写为“LC”或“L”例如，LC1和LC2，或L1和L2。

术语“抗体的抗原结合部分”、“抗原结合片段”、“抗原结合域”、“抗体片段”或“抗体的功能片段”在本文中可互换用于意指保持特异性结合至抗原的能力的抗体的一个或多个片段。这类术语内涵盖的抗体片段的非限制性实例包括(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，一种由两个通过二硫桥键在铰链区连接的Fab片段组成的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等,(1989)Nature341:544546)；和(vi)分离的CDR。另外包含于此定义中的是包含单一重链和单一轻链的“一半”抗体。也涵盖其它形式的单链抗体，如双功能抗体。

“F(ab')₂”和“Fab'”部分可通过用蛋白酶如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶处理Ig来产生，并且包括抗体片段通过消化接近于存在于两条重链各自铰链区之间的二硫键的免疫球蛋白来产生。举例来说，木瓜蛋白酶裂解存在于两条重链各自铰链区之间的二硫键上游的IgG以产生两个同源抗体片段，其中主要由VL和CL(轻链恒定区)组成的轻链，和主要由VH和重链的恒定区中的CHγ1(γ1)区组成的重链片段经由二硫键在其C终端区连接。这两个同源抗体片段分别称为Fab'。胃蛋白酶也裂解存在于两条重链各自铰链区之间的二硫键下游的IgG以产生比两个上述Fab'在铰链区连接的片段稍微较大的抗体片段。此抗体片段被称为F(ab')₂。

Fab片段也含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段因在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab片段。Fab'-SH是本文中的Fab'的名称，其中恒定域的半胱氨酸残基带有自由硫醇基。F(ab')₂抗体片段最初以之间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对形式产生。抗体片段的其它化学偶合也是已知的。

“Fv”是指含有完全抗原识别和抗原结合位点的抗体片段。此区由紧密、非共价或共价缔合的一条重链和一条轻链可变域的二聚体组成(二硫化物连接的Fv已经在本领域中描述，Reiter等(1996)NatureBiotechnology14:1239-1245)。在此构型中，每个可变域的三个CDR相互作用以界定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。共同地，来自每个VH和VL链的一个或多个CDR的组合将抗原结合特异性赋予抗体。举例来说，应了解，例如，CDRH3和CDRL3在转移至接受者抗体或其抗原结合片段的VH和VL链时可足以将抗原结合特异性赋予抗体，并且CDR的此组合可使用本文所述任何技术针对结合、亲和力等来测试。甚至单一可变域(或只包含对于抗原具有特异性的三个CDR的一半Fv)具有识别并结合至抗原的能力，但是与在与第二可变域组合时相比，可能在较低亲和力下。此外，尽管VL和VH为Fv片段的两个结构域，但VL和VH由单独的基因编码，其可使用重组方法通过使得能将其制成VL和VH区配对形成单价分子的单一蛋白质链的合成接头联结(所述单价分子称为单链Fv(scFv)；Bird等(1988)Science242:423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；和Osbourn等(1998)Nat.Biotechnol.16:778)。所述scFv也意图涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。特定scFv的任何VH和VL序列可连接至Fc区cDNA或基因组序列，以便产生编码完整Ig(例如，IgG)分子或其它同种型的表达载体。VH和VL也可用于使用蛋白质化学或重组DNA技术来产生Fab、Fv或Ig的其它片段。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽进一步在VH结构域与VL结构域之间包含使得scFv能够形成为抗原结合所需的结构的多肽连接子。关于sFv的综述，参见例如PluckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,RosenburgandMoore编Springer-Verlag,NewYork,第269-315页(1994)。

术语“AVIMER^TM”是指人类来源的一类治疗性蛋白质，其与抗体和抗体片段不相关，并且主要由多个模块化和可重复使用的结合域组成，所述结合域被称为A域(也称为A类模块、补体类型重复或LDL-受体A类域)。其通过体外外显子改组和噬菌体展示从人细胞外受体域产生(Silverman等,2005,Nat.Biotechnol.23:1493-1494；Silverman等,2006,Nat.Biotechnol.24:220)。所得蛋白质可含有多个独立结合域，其与单一表位结合蛋白质相比可展现改进亲和力(在一些情况下，亚纳摩尔)和特异性。参见例如美国专利申请公开号2005/0221384、2005/0164301、2005/0053973和2005/0089932、2005/0048512和2004/0175756，其各自通过引用整体并入本文。

已知217人A域中的每一个包括～35氨基酸(～4kDa)；并且这些域通过平均五个氨基酸长度的连接子来分隔。天然A域迅速并有效地折叠成主要通过钙结合和二硫化物形成来介导的均匀、稳定结构。此共同结构需要仅12个氨基酸的保守支架基元。最终结果是含有多个域的单一蛋白质链，每个域代表单独功能。蛋白质的每个域独立地结合并且每个域的能量贡献是相加的。这些蛋白质被称为来自亲合力多聚体的“AVIMERs^TM”。

术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含于同一多肽链(VH-VL)中与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)。通过使用太短而不允许在同一链上的两个域之间配对的连接子，迫使这些域与另一链的互补域配对并建立两个抗原结合位点。双功能抗体更充分描述于例如EP404,097、WO93/11161和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:64446448(1993)中。

抗原结合多肽也包括重链二聚体例如像，来自骆驼科和鲨鱼的抗体。骆驼科和鲨鱼抗体包括V样和C样域的两个链的同源二聚体对(两者都不具有轻链)。由于骆驼科中的重链二聚体IgG的VH区不需要与轻链进行疏水性相互作用，因此通常接触轻链的重链区改变成骆驼科中的亲水氨基酸残基。重链二聚体IgG的VH域被称为VHH域。鲨鱼Ig-NAR包括一个可变域(被称为V-NAR域)和五个C样恒定域(C-NAR域)的同型二聚体。在骆驼科中，抗体谱的多样性通过VH或VHH区中的CDR1、2和3来确定。骆驼VHH区中的CDR3通过平均16个氨基酸的其相对较长长度来表征(Muyldermans等,1994,ProteinEngineering7(9):1129)。这与许多其它物种的抗体的CDR3区形成对比。举例来说，小鼠VH的CDR3具有平均9个氨基酸。保持骆驼科的可变区的体内多样性的骆驼科衍生抗体可变区文库可例如通过美国专利申请号20050037421中公开的方法来产生。

“人源化”形式的非人(例如啮齿动物)抗体包括含有源于非人Ig的最小序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是人Ig(接受者抗体)，其中接受者的一个或多个CDR置换成来自非人物种抗体(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的CDR，其具有所需特异性、亲和力和结合功能。在一些情况下，人Ig的一个或多个FR氨基酸残基置换成相应非人氨基酸残基。此外，人源化抗体可包含未见于接受者抗体或供体抗体中的残基。如果需要，可产生这些修饰来细化抗体性能。人源化抗体可包含实质上所有至少一个且在一些情况下两个可变域，其中所有或实质上所有高变区都对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或实质上所有FR都是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。更多细节参见Jones等,Nature321:522-525(1986)；Reichmann等,Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。

人源化抗体还包括以下抗体，其中重链和轻链的部分或全部CDR从非人单克隆抗体衍生，可变区的基本上所有其余部分从人可变区(重链和轻链两者)衍生，并且恒定区从人恒定区衍生。在一个实施方案中，重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3区从非人抗体衍生。在另一个实施方案中，重链和轻链的至少一个CDR(例如，CDR3)从非人抗体衍生。CDR1、CDR2和CDR3的各种组合可从非人抗体衍生并且在本文中涵盖。在一个非限制性实例中，区重链和轻链各自CDR1、CDR2和CDR3中的一个或多个从本文提供的序列衍生。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指自大致上均质抗体的群体获得的抗体，即除可以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成所述群体的个别抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，从而针对单一抗原位点。此外，与可包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂不同，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体是从实质上均质的抗体群体获得的特性，且不应解释为需要通过任何特定方法来产生所述抗体。例如，单克隆抗体可通过最初由Kohler等,Nature256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)制备。在某些实施方案中，单克隆抗体可使用例如Clackson等,Nature352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库分离。

抗体可通过饱和硫酸铵沉淀、优球蛋白沉淀方法、己酸方法、辛酸方法、离子交换色谱法(DEAE或DE52)或使用抗-Ig柱或蛋白质A、G或L柱的亲和色谱从上述培养上清液或腹水分离并纯化，如以下更详细描述。

用于本文描述的组合物和方法中的示例性抗体是完整免疫球蛋白分子，例如像，人源化抗体或含有抗原结合位点(即，互补位)或单一重链和单一轻链的人源化Ig分子的部分，包括在本领域中已知的部分，如Fab、Fab′、F(ab)′、F(ab′)₂、Fd、scFv、可变重链域、可变轻链域、可变NAR域、双特异性scFv、双特异性Fab2、三特定Fab₃和单链结合多肽和也称为抗原结合片段的其它部分。当构建免疫球蛋白分子或其片段时，可变区或其一部分可融合、连接或另外连接至一个或多个恒定区或其一部分以产生任何本文所述抗体或其片段。这可在本领域中已知的各种方法来完成，包括但不限于，分子克隆技术或直接合成编码分子的核酸。构建这些分子的示例性非限制性方法也可在本文描述实例中发现。

制造双特异性或其它多特异性抗体的方法在本领域中为已知的并且包括化学交联，使用亮氨酸拉链(Kostelny等,J.Immunol.148:1547-1553,1992)；双功能抗体技术(Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-48,1993)；scFv二聚体[Gruber等,J.Immunol.152:5368,1994]，线性抗体(Zapata等,ProteinEng.8:1057-62,1995)；和螯合重组抗体(Neri等,JMolBiol.246:367-73,1995)。

“线性抗体”包括一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可为双特异性或单特异性(Zapata等ProteinEng.8:1057-62(1995))。

另外，本文公开的抗体还可构建以折叠成多价形式，其可改进结合亲和力、特异性和/或增加血液中的半衰期。多价形式的抗体可通过在本领域中已知的技术来制备。

双特异性或多特异性抗体包括交联或“异源偶联物”抗体。举例来说，异源偶联物中的一个抗体可连接至抗生物素蛋白，另一个抗体可连接至生物素。异源偶联物抗体可使用任何便利的交联方法来制成。合适交联剂在本领域中是熟知的，并且与许多交联技术一起在美国专利号4,676,980中公开。设计另一种方法以通过在scFv的C-末端添加链霉抗生物素蛋白编码序列来制得四聚体。链霉抗生物素蛋白主要由四个亚基组成，因此在scFv-链霉抗生物素蛋白折叠时，四个亚基缔合以形成四聚体(Kipriyanov等,HumAntibodiesHybridomas,6(3):93-101(1995)，所述公开以引用方式整体并入本文)。

如本文使用，“maxibody”是指共价连接至免疫球蛋白的Fc区的二价scFv，参见例如Fredericks等,ProteinEngineering,Design&Selection,17:95-106(2004)和Powers等,JournalofImmunologicalMethods,251:123-135(2001)。

如本文使用，“胞内抗体”是指单链抗体，其展示细胞内表达并且可操纵细胞内蛋白质功能(Biocca等,EMBOJ.9:101-108,1990；Colby等,ProcNatlAcadSciUSA.101:17616-21,2004)。包括将抗体构建体保持在细胞内区中的细胞信号序列的胞内抗体可如Mhashilkar等(EMBOJ14:1542-51,1995)和Wheeler等(FASEBJ.17:1733-5.2003)中所描述来产生。Transbodies是细胞渗透性抗体，其中蛋白质转导域(PTD)与单链可变片段(scFv)抗体融合Heng等,(MedHypotheses.64:1105-8,2005)。

另外在本文中涵盖作为SMIP或对于靶标蛋白质具有特异性的结合域免疫球蛋白融合蛋白质的抗体。这些构建体是单链多肽，其包含融合至执行抗体效应功能所需要的免疫球蛋白域的抗原结合域。参见，例如，WO03/041600，美国专利公布20030133939和美国专利公布20030118592，其通过引用并入本文。

抗体和抗原结合其片段的人源化可经由在本领域中已知并且本文描述的各种方法来完成。类似地，产生人源化抗体也可经由在本领域中已知并且本文描述的方法来完成。

在一个示例性实施方案中，本申请涵盖具有重链可变区和/或轻链可变区的单链结合多肽，其结合本文所述表位并且任选地具有免疫球蛋白Fc区。这类分子是单链可变片段(scFv)，其经由免疫球蛋白Fc区的存在而任选地具有效应功能或增加的半衰期。制备单链结合多肽的方法在本领域中为已知的(例如，美国专利申请号2005/0238646)。

抗体或其抗原结合片段的结合亲和力和/或亲合力可通过修饰框架区来改进。修饰框架区的方法在本领域中为已知的并且在本文中涵盖。选择一个或多个相关框架氨基酸位置来修饰取决于各种标准。选择相关框架氨基酸来改变的一种标准可为供体与受体分子之间的氨基酸框架残基的相对差异。使用此方法来选择将要改变的相关框架位置具有避免残基确定方面的任何主观偏差或残基的CDR结合亲和力影响方面的任何偏差的优势。

如本文使用，“免疫反应”是指对于氨基酸残基序列(“结合位点”或“表位”)具有特异性的抗体或其抗原结合片段。术语“结合”是指在生理条件下归因于例如共价、静电、疏水性和离子和/或氢键相互作用的两个分子之间的直接缔合，并且包括相互作用如盐桥键和水桥键和任何其它常规结合手段。术语“优选结合”意味着结合剂与它结合至不相关的氨基酸序列相比，以更大亲和力结合至结合位点。优选地与结合剂对于不相关的氨基酸序列的亲和力相比，这类亲和力大至少1倍、大至少2倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大10倍、大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍或大至少1000倍。术语“免疫反应”和“优选结合”在本文中可互换使用。

如本文使用，术语“亲和力”是指两个试剂的可逆结合的平衡常数并且以Kd表示。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段展现所需特性如如通过K_D(平衡解离常数)所测量的对于靶标抗原的在1×10^-6M或以下的范围内，或小至10^-16M或以下的范围内(例如，约10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12、10^-13、10^-14、10^-15、10^-16M或更小)的结合亲和力。平衡解离常数可在溶液平衡测定中使用BIAcore和/或KinExA来确定。如本文使用，术语“亲合力”是指在稀释之后，两种或更多种试剂的复合物对于解离的抗性。表观亲和力可通过方法如酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的任何其它技术来确定。亲合力可通过方法如斯卡查德分析或本领域技术人员熟悉的任何其它技术来确定。

当需要抗体的增加亲和力时，转化抗体的CDR内的残基可另外使用通常已知方法以其它氨基酸来取代。典型地，CDR中的不超过四个氨基酸残基改变，并且最通常CDR中的不超过两个残基改变，除了重链CDR2以外，其中多达十个(10)残基可改变。亲和力的变化可通过常规如本文描述的方法(例如，Biacore)来测量。修饰抗体的活性可使用常规测定基于特定靶标抗原来确定。

“表位”是指抗原或能够与抗体的可变区结合囊形成结合相互作用的其它大分子的部分。这类结合相互作用可表现为与一个或多个CDR的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。抗原结合可涉及例如CDR3或CDR3对或在一些情况下VH和VL链的多达所有六个CDR的相互作用。表位可为线性肽序列(即，“连续”)或可主要由不连续氨基酸序列(即，“构象”或“不连续”)组成。抗体可辨识一个或多个氨基酸序列；因此表位可界定一个以上独特氨基酸序列。由抗体辨识的表位可通过肽作图和本领域技术人员熟知的序列分析技术来确定。结合相互作用表现为与CDR的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。

术语“特异性”是指除了含有由抗体辨识的表位的抗原以外，抗体不展示任何显著结合至分子的情况。当例如抗原结合域对于由许多抗原携带的具体表位具有特异性时，此术语也可适用，在此情况下，携带抗原结合域的抗体或其抗原结合片段能够结合至携带表位的各种抗原。术语“优选结合”或“特异性结合”意味着抗体或其片段与它结合至不相关的氨基酸序列相比以更大亲和力结合至表位，并且如果可与含有表位的其它多肽交叉反应，那么在其配制以施用供人使用的水平下没有毒性。在一方面，与抗体或其片段对于不相关的氨基酸序列的亲和力相比，这类亲和力大至少1倍、大至少2倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大10倍、大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍或大至少1000倍。术语“免疫反应”、“结合”、“优选结合”和“特异性结合”可在本文中互换使用。术语“结合”是指在生理条件下归因于例如共价、静电、疏水性和离子和/或氢键相互作用的两个分子之间的直接缔合，并且包括相互作用如盐桥键和水桥键和任何其它常规结合手段。

如本文使用，术语“重链多肽对于轻链多肽的选择性”是指当重链多肽和两个轻链多肽共表达并且重链具有限制性时，重链多肽与两个轻链多肽中的一个优先配对。在本文所述方法的情况下，当重链多肽和两个轻链多肽共表达时，当与所述轻链多肽配对的重链多肽的所得量大于与另一个轻链多肽配对的重链多肽的所得量时，证实重链多肽对于一个轻链多肽超过另一个轻链多肽的选择性。在一个实例中，轻链相等地表达。

类似地，如本文使用，术语“轻链多肽对于重链多肽的选择性”是指当轻链多肽和两个重链多肽共表达，其中轻链具有限制性时，轻链多肽与两个重链多肽中的一个优先配对。在本文所述方法的情况下，当轻链多肽和两个重链多肽共表达时，当与所述重链多肽配对的轻链多肽的所得量大于与另一个重链多肽配对的轻链多肽的所得量时，证实轻链多肽对于一个重链多肽超过另一个重链多肽的选择性。在一个实例中，重链相等地表达。抗体可通过在本领域中已知的方法来针对结合亲和力筛选，所述方法包括但不限于凝胶转变测定、蛋白质印迹、放射性标记竞争测定、共分级色谱、共沉淀、交联、ELISA等，描述于例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(1999)JohnWiley&Sons,NY中，以引用方式整体并入本文。

结合至靶标抗原上的所需表位的抗体可在可执行的如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中描述的常规交叉阻断测定中筛选。还可使用常规竞争结合测定，其中未知抗体通过它的抑制靶标结合至本发明靶标特异性抗体的能力来表征。可使用完整抗原、其片段如细胞外域或线性表位。表位作图描述于Champe等,J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995)中。

抗体可为例如单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。

在一方面，本文提供抗体或其抗原结合片段包括重链可变区框架区；和轻链可变区框架区。抗体或其抗原结合片段可还包括CH2、CH2和/或CH3区中的一个或多个。在一个实施方案中，重链多肽包括VH区和CH1区；任选地，重链多肽可还包括CH2区。任选地，重链多肽可还包括CH2区和CH3区。在一个实施方案中，轻链多肽包含VL区和CL区。

抗原结合片段可为例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段、Fv片段、scFv片段、单链结合多肽、Fd片段、可变重链、可变轻链或dAb片段。抗原结合片段可为例如AVIMER、双功能抗体或重链二聚体。重链二聚体可为例如骆驼科或鲨鱼重链构建体。

本文还提供分离核酸分子，其包含编码本文所述抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。本文还提供表达载体，其包含可操作地连接至调控控制序列的核酸分子。本文还提供宿主细胞，其包含本文提供的载体或核酸分子。本文还提供使用宿主细胞来产生抗体的方法，包括在合适条件下培养宿主细胞以使得表达核酸以产生抗体。

量化重链多肽对于轻链多肽的选择性：

在操作上，如本文使用，HTS是指利用自动化的方法，例如，高密度阵列、液体处理设备、检测器和高数据包处理以迅速测定很多化合物的生物或生物化学活性。

表面等离子体共振(SPR)和ELISA可为高通量或低通量的，取决于是否采用上述元件。还考虑到评估的参数。其它高通量测定类型在本文中别处描述并且可用于本文描述的方法。

在一个实施方案中，提供量化与至少一个轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括以下步骤：在体外或在宿主细胞中共表达一组构建体：包含VH和CH1区的第一重链多肽；包含第一VL区和第一CL区的第一轻链多肽；和包含第二VL区和第二CL区的第二轻链多肽；其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；将包含与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和在重链配对多肽产物中，定量与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的选择性。

在实施方案中，重链多肽的总量具有限制性。因此，在过量轻链多肽存在下，所形成的重链-轻链构建体的量受重链多肽的量限制，因为没有它不能形成构建体。在一些实施方案中，重链多肽和第一和第二轻链多肽以约0.25:1:1的预定比率表达。

在一些实施方案中，重链多肽和第一和第二轻链多肽以约0.5:1:1的预定比率表达。在一个实施方案中，重链多肽和第一和第二轻链多肽以约1:2:2的预定比率表达。在其它实施方案中，重链多肽和第一和第二轻链多肽以约1:3:3的预定比率表达。

在实施方案中，轻链多肽的总量具有限制性。因此，在过量重链多肽存在下，所形成的轻链-重链构建体的量受轻链多肽的量限制，因为没有它不能形成构建体。在一些实施方案中，轻链多肽和第一和第二重链多肽以约0.25:1:1的预定比率表达。

在其它实施方案中，轻链多肽和第一和第二重链多肽以约0.5:1:1的预定比率表达。在选定实施方案中，轻链多肽和第一和第二重链多肽以约1:2:2的预定比率表达。在一些实施方案中，轻链多肽和第一和第二重链多肽以约1:3:3的预定比率表达。

在某些实施方案中，量化还包括确定重链多肽与每个轻链多肽相互作用的对照标准。在某些实施方案中，量化对照标准包括以下步骤：在不存在其它轻链多肽的情况下，在体外或在宿主细胞中，共表达所述重链多肽和所述第一和第二轻链多肽中的一个轻链多肽；分离包含重链多肽和所述轻链多肽的构建体；并且定量所述构建体的量，其中所述量充当所述重链多肽与所述轻链多肽的最大可检测结合的对照标准。

本文提供在重链多肽和至少两条独特轻链多肽共表达时定量确定个别IgG重链多肽与特定IgG轻链多肽选择性配对的方法。所述方法允许在共表达蛋白质的混合物中重链与特定轻链配对的定量分析。在一个实施方案中，所述方法可用于确定是否当重链和轻链共表达时，一个具体IgG重链与两个IgG轻链中的任何一个选择性缔合。在另一个实施方案中，所述方法可用于在重链和轻链共表达时确定是否两个不同重链各自与两条轻链中的一个选择性配对。

在某些实施方案中，提供一种方法，所述方法包括以下步骤：在细胞中以一定比率共表达至少一条重链和两个不同轻链以使得重链为限制配对反应物；任选地将分泌蛋白质从细胞中分离；将结合至重链的轻链多肽与分泌蛋白质的其余部分分离以产生分离重链配对部分；检测分离重链部分中的每个不同轻链的量；并且分析分离重链部分中的每个不同轻链的相对量以确定至少一条重链与一条轻链选择性配对的能力。

提供确定与至少一个轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，包括获得以下的步骤：包含免疫球蛋白重链区的重链多肽；包含第一免疫球蛋白轻链区的第一轻链多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链区的至少一个第二轻链多肽；在溶液中使所述重链多肽和所述轻链多肽以预先确定的比率接触以使得重链多肽的总量具有限制性；将包含与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和定量与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的重链多肽的选择性。

在本文提供的方法和测定的某些实施方案中，重链多肽还包括CH3区。在一些实施方案中，重链多肽也包括CH2区或其片段。在一些实施方案中，CH2和CH3区中的至少一个包括至少一个氨基酸突变。在一个具体实施方案中，CH3区包括至少一个氨基酸突变以使得CH3区优选与包含CH3区的另一个重链多肽形成异源二聚体。

本文提供的方法和测定的某些实施方案还包括共表达包含CH3区的第二重链多肽。在一些实施方案中，第二重链多肽也包括CH2区或其片段。在一些实施方案中，所述CH2和CH3区中的至少一个包括至少一个氨基酸突变。在一个具体实施方案中，CH3区包括至少一个氨基酸突变以使得CH3区优选与包含CH3区的第一重链多肽形成异源二聚体。包含至少一个氨基酸突变的合适CH3域在本领域中为已知的并且包括，例如，在国际专利公布号WO2012/058768和美国专利号5,821,333和7,695,936中描述的域。促进第一重链与第二重链优先形成的CH3区中的额外氨基酸突变描述于国际专利公布号WO96/027011(knobsintoholes)、Gunasekaran等((2010)JBiolChem.285,19637-46,electrostaticdesigntoachieveselectiveheterodimerization)、Davis等((2010)ProtEngDesSel；23(4):195-202,strandexchangeengineereddomain(SEED)technology)、和Moore等,(2011)Mabs3:6,546-557中。

测定含有Fab的构建体的选择性形成

提供确定在竞争重链或轻链多肽或其组合存在下含有Fab的构建体的选择性形成的方法，所述方法包括：在体外或在宿主细胞中共表达包含VH和CH1区的第一重链多肽；包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽；其中所述第一轻链多肽选择性地与所述重链多肽缔合以形成所需Fab构建体；和一个或多个其它重链多肽、轻链多肽或其组合；分离包含所述第一重链多肽或所述第一轻链多肽的每个Fab构建体；和与其它Fab构建体相比，检测所需Fab构建体的量；其中所需Fab构建体的较大量展示形成所述Fab构建体的较高选择性。在某些实施方案中，所述方法适用于测试在其它重链或轻链多肽存在下合理设计Fab构建体的自缔合。

修饰多肽

在某些实施方案中，本文所述方法、测定和系统使用重链多肽和轻链多肽，其通过添加包括可检测部分(标记)的标签来修饰。本文描述的方法可有利地转移至标准抗体Fab轻链和重链对，除非蛋白质域和标签以非特异性方式相互作用。因此，本文提供的方法可用于任何重链或轻链，只要它可加标签而不干扰重链或轻链的功能或稳定性。换句话说，添加标签不应干扰重链结合至轻链的能力，它也不应影响例如它在细胞中的表达或分泌。同样地，添加标签不应干扰轻链结合至重链的能力，它也不应影响它在细胞中的表达或分泌。

在一个实施方案中，共表达重链和轻链多肽中的至少一个通过添加允许检测和/或纯化蛋白质混合物中的重链或轻链的标签来修饰。在一些实施方案中，共表达重链和轻链多肽各自包含不同于其它共表达重链和轻链的标签。在一个实施方案中，IgG重链多肽包含允许重链和结合至重链的多肽从多肽混合物中纯化的标签，同时每条轻链包含标签，包括允许对其进行检测的检测部分。

标签和/或检测部分可添加于氨基或羧基末端，只要标签和/或检测部分可检测到并且标签和/或检测部分的位置不干扰重链或轻链的功能和/或稳定性。举例来说，重链可在氨基末端加标签，并且轻链可在羧基末端加标签，或反之亦然。标签充当所测试的重链和两个不同轻链的独特标记物。标签可互换使用，只要在重链和两个不同轻链上的标签都是独特的。重链和轻链的合适标签的实例包括但不限于6XHis、FLAG、HA、c-myc、sFLAG、V5、SBP(链霉抗生物素蛋白结合肽)。

在某些实施方案中，其中重链和轻链之间的大小差异对于重链与轻链之间的分化是重要的，例如在其中重链片段与轻链共表达的实施方案中，一个链可用增加其大小的标签来修饰。在一个示例性实施方案中，合适标签是白蛋白结合域。在一些实施方案中，重链或其一部分通过添加增加其大小的标签来修饰。

重链和轻链多肽的表达

本文所述多肽可容易地根据已知方法来制备。举例来说，使用重组DNA技术来标记重链多肽和/或轻链多肽的方法为熟知的。另外，在宿主细胞中表达并共表达抗体多肽的方法也为熟知的。本文提供适合于表达重链和轻链多肽的表达载体和宿主细胞。

重链和轻链多肽的重组表达需要构建含有编码本文所述重链或轻链多肽的多核苷酸的表达载体。一旦获得编码重链或轻链的多核苷酸，产生重链或轻链多肽的载体可通过重组DNA技术来产生。因此，本文中描述通过表达含有重链或轻链多肽编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。可以使用本领域中的技术人员熟知的方法来构建含有重链或轻链编码序列和适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。本文提供可复制载体，其包含可操作地连接至启动子的编码重链或轻链多肽的核苷酸序列。

表达载体通过常规技术转移至宿主细胞并且转染细胞然后通过常规技术培养以产生用于本发明的方法的重链或轻链多肽。在具体实施方案中，用于方法的重链和轻链多肽在宿主细胞中共表达，如下详述。

各种宿主表达载体系统可用于表达本文提供的重链和轻链多肽。所述宿主表达载体系统代表可借以产生并随后纯化目标编码序列的媒介，而且还代表在用适当核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达重链和轻链的细胞。这些载体系统包括但不限于微生物如细菌例如，但是不限于大肠杆菌和枯草杆菌，其用含有修饰重链和轻链编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体来转化；酵母例如，但是不限于毕赤酵母，其用含有重链和轻链多肽编码序列的重组酵母表达载体来转化；用含有重链和轻链多肽编码序列的重组病毒表达载体，例如，但是不限于杆状病毒来感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体，例如，但是不限于花椰菜花叶病毒，CaMV感染的植物细胞系统；烟草花叶病毒，TMV，或用含有重链和轻链多肽编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化；或哺乳动物细胞系统例如COS、CHO、BHK、HEK-293、NSO、3T3细胞和其组合和变体，容纳含有从哺乳动物细胞的基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)衍生的启动子的重组表达构建体。在某些实施方案中，细菌细胞如大肠杆菌，或真核细胞用于共表达重链和轻链多肽。在一些实施方案中，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞，CHO)与载体(如来自人巨细胞病毒的主要极早期基因启动子元件)的结合是本文所述轻链和重链多肽的共表达的有效表达系统(Foecking等,1986,Gene45:101；和Cockett等,1990,Bio/Technology8:2)。在具体实施方案中，编码重链和轻链多肽的核苷酸序列的表达通过组成性启动子、可诱导启动子或组织特异性启动子来调控。

在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，相关重链和轻链多肽编码序列可连接至腺病毒转录/翻译控制复合物(例如晚期启动子和三联前导序列)。随后可通过体外或体内重组将此嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区(例如区E1或E3)中将产生活的且能够在受感染宿主中表达重链和轻链多肽的重组病毒(例如参见Logan&Shenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:355-359)。也可需要特定起始信号来有效翻译插入的抗体编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框架同相以确保翻译全部插入物。这些外源翻译控制信号和起始密码子可具有多种来源，天然与合成两者均可。表达效率可通过纳入适当转录增强子元件、转录终止子等进行增强(参见例如Bittner等,1987,MethodsinEnzymol.153:516-544)。

本文所述重链和轻链多肽的表达可通过在本领域中已知的任何启动子或增强子元件来控制。可用于控制编码重链和轻链多肽的基因的表达的启动子包括但不限于SV40早期启动子区(BernoistandChambon,1981,Nature290:304-310)，包含于劳斯肉瘤病毒的3'长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等,1980,Cell22:787-797)，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78.1441-1445)，金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等,1982,Nature296:39-42)，四环素(Tet)启动子(Gossen等,1995,Proc.Nat.Acad.Sci.USA89:5547-5551)；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731)，或tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25；也参见"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"inScientificAmerican,1980,242:74-94)；植物表达载体，其包含胭脂碱合成酶启动子区(Herrera-Estrella等,Nature303:209-213)或花椰菜花叶病毒35SRNA启动子(Gardner等,1981,Nucl.AcidsRes.9:2871)，和光合成酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等,1984,Nature310:115-120)；来自酵母或其它真菌的启动子元件如Gal4启动子，ADC(醇脱氢酶)启动子，PGK(磷酸甘油激酶)启动子，碱性磷酸酶启动子，和展现组织特异性并且用于转基因动物中的以下动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等,1984,Cell38:639-646；Ornitz等,1986,ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50:399-409；MacDonald,1987,Hepatology7:425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan,1985,Nature315:115-122)，在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等,1984,Cell38:647-658；Adames等,1985,Nature318:533-538；Alexander等,1987,Mol.Cell.Biol.7:1436-1444)，在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳瘤病毒控制区(Leder等,1986,Cell45:485-495)，在肝中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等,1987,GenesandDevel.1:268-276)，在肝中有活性的α-胎蛋白基因控制区(Krumlauf等,1985,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648；Hammer等,1987,Science235:53-58；在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等,1987,GenesandDevel.1:161-171)，在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等,1985,Nature315:338-340；Kollias等,1986,Cell46:89-94；在大脑少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等,1987,Cell48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani,1985,Nature314:283-286)；在神经元细胞中有活性的神经元特异性烯醇化酶(NSE)(Morelli等,1999,Gen.Virol.80:571-83)；在神经元细胞中有活性的大脑衍生神经营养因子(BDNF)基因控制区(Tabuchi等,1998,Biochem.Biophysic.Res.Com.253:818-823)；在星形细胞中有活性的神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)启动子(Gomes等,1999,BrazJMedBiolRes32(5):619-631；Morelli等,1999,Gen.Virol.80:571-83)和在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等,1986,Science234:1372-1378)。

此外，可选择调节插入序列的表达或以所需特定方式修饰并加工基因产物的宿主细胞株。从某些启动子的表达可在一定诱导剂存在下升高；因而，可控制遗传工程化融合蛋白质的表达。此外，不同宿主细胞具有翻译和翻译后加工和修饰的特性和特定机制(例如，蛋白质的糖基化、磷酸化)。可选择适当细胞系或宿主系统以确保对表达的外来蛋白质进行所需修饰和加工。举例来说，在细菌系统中的表达产生去糖基化产物并且在酵母中的表达产生糖基化产物。可使用具有用于适当加工基因产物的初级转录物(例如糖基化及磷酸化)的细胞机制的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、HEK-293、3T3、WI38、NSO并且尤其神经元细胞系例如像，SK-N-AS、SK-N-FI、SK-N-DZ人成神经细胞瘤(Sugimoto等,1984,J.Natl.CancerInst.73:51-57)、SK-N-SH人成神经细胞瘤(Biochim.Biophys.Acta,1982,704:450-460)、Daoy人小脑髓母细胞瘤(He等,1992,CancerRes.52:1144-1148)DBTRG-05MG成胶质细胞瘤细胞(Kruse等,1992,InVitroCell.Dev.Biol.28A:609-614)、IMR-32人成神经细胞瘤(CancerRes.,1970,30:2110-2118)、1321N1人星形细胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1977,74:4816)、MOG-G-CCM人星形细胞瘤(Br.J.Cancer,1984,49:269)、U87MG人成胶质细胞瘤-星形细胞瘤(ActaPathol.Microbiol.Scand.,1968,74:465-486)、A172人成胶质细胞瘤(Olopade等,1992,CancerRes.52:2523-2529)、C6大鼠神经胶质瘤细胞(Benda等,1968,Science161:370-371)、Neuro-2a小鼠成神经细胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1970,65:129-136)、NB41A3小鼠成神经细胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1962,48:1184-1190)、SCP绵羊脉络膜丛(Bolin等,1994,J.Virol.Methods48:211-221)、G355-5、PG-4Cat正常星形胶质细胞(Haapala等,1985,J.Virol.53:827-833)、Mpf雪貂大脑(Trowbridge等,1982,InVitro18:952-960)和正常细胞系例如像，CTXTNA2大鼠正常皮质大脑(Radany等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6467-6471)例如像CRL7030和Hs578Bst。此外，不同载体/宿主表达系统可在不同程度上实现加工反应。

对于长期、高产量产生重链和轻链多肽，可使用稳定表达系统。举例来说，稳定表达本文所述重链和轻链多肽的细胞系可工程化。可以用受适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择标记转化宿主细胞，而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。在引入外源DNA后，可使工程改造的细胞在富集培养基中生长1至2天，并接着转换到选择性培养基。重组质粒中的可选择标记赋予选择抗性并允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中，并且生长以形成基因座，细胞转而可进行克隆并扩增成细胞系。

可使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等,1977,Cell11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:2026)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等,1980,Cell22:817)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。另外，抗代谢物抗性可用作选择赋予甲氨蝶呤抗性的dhfr(Wigler等,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:3567；O'Hare等,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1527)；赋予麦可酚酸抗性的gpt(Mulligan&Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072)；赋予氨基糖苷类G-418抗性的neo(Colberre-Garapin等,1981,J.Mol.Biol.150:1)；和赋予潮霉素(Santerre等,1984,Gene30:147)基因抗性的hygro的基础。

在某些实施方案中，无细胞蛋白质表达系统用于在不使用活细胞的情况下共表达重链和轻链多肽。替代地，将DNA转录至RNA并且将RNA翻译至蛋白质(例如，核糖体、tRNA、酶、辅助因子、氨基酸)所需要的所有组分在溶液中提供在体外使用。在某些实施方案中，体外表达需要(1)编码重链和轻链多肽的遗传模板(mRNA或DNA)和(2)含有必需转录和翻译分子机制的反应溶液。在某些实施方案中，细胞提取物基本上供应反应溶液组分，例如：用于mRNA转录的RNA聚合酶、用于多肽翻译的核糖体、tRNA、氨基酸、酶辅助因子、能量源和适当蛋白质折叠所必需的细胞组分。无细胞蛋白质表达系统可使用从细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、人细胞或其组合衍生的裂解物来制备。这类细胞裂解物提供翻译所需的酶和结构单元的正确组成和比例。在一些实施方案中，移除细胞膜以只留下细胞的细胞质和细胞器组分。

一些无细胞蛋白质表达系统在本领域中为已知的，如在Carlson等(2012)Biotechnol.Adv.30:1185-1194中综述。举例来说，可获得基于原核或真核细胞的无细胞蛋白质表达系统。原核无细胞表达系统的实例包括来自大肠杆菌的表达系统。可获得基于来自例如兔网织红细胞、麦芽和昆虫细胞的提取物的真核无细胞蛋白质表达系统。这类原核和真核无细胞蛋白质表达系统可从公司如Roche、Invitrogen、Qiagen和Novagen购得。本领域技术人员容易能够选择产生能够彼此配对的重链和轻链多肽的合适无细胞蛋白质表达系统。此外，无细胞蛋白质表达系统也可补充有伴侣蛋白(例如，BiP)和异构酶(例如，二硫化物异构酶)以便改进IgG折叠效率。

在一些实施方案中，无细胞表达系统用于共表达来自DNA模板(转录和翻译)或mRNA模板(只翻译)的重链和轻链多肽。

在一个实施方案中，所述方法使用经由典型二硫化物桥连接的重链和轻链来执行。在其它实施方案中，所述方法使用未经由典型二硫化物桥连接的重链和轻链多肽来执行。

共表达重链和轻链多肽

编码将要测试的重链和轻链多肽的一组构建体共表达于宿主细胞或无细胞蛋白质表达系统中并且从培养或反应培养基回收。共表达一组构建体产生一组多肽产物。在某些实施方案中，从细胞中分泌的一组多肽产物可包括与轻链配对的重链，以及轻链单体和二聚体。

在本文提供的某些实施方案中，宿主细胞用化学计算量的编码两条轻链的DNA转染，而编码重链的DNA的量受限制。LCCA比率可通过筛选来确定。在一个实施方案中，重链多肽(HC)与第一轻链多肽(LC1)和第二轻链多肽(LC2)的转染比率，即，HC:LC1:LC2为1:1:1。在一个实施方案中，重链多肽(HC)与第一轻链多肽(LC1)和第二轻链多肽(LC2)的转染比率，即，HC:LC1:LC2为3:1:1以在一些情况下确定是否LC1和LC2相等地表达。在另一个实施方案中，重链多肽(HC)与第一轻链多肽(LC1)和第二轻链多肽(LC2)的转染比率，即，HC:LC1:LC2为0.5:1:1。在一些实施方案中，重链多肽和第一和第二轻链多肽以约1:2:2的预定比率表达。在一个实施方案中，一定比率的重链多肽和第一和第二轻链多肽以约1:3:3的预定比率表达。应了解其它比率可使用并且在本文中涵盖。在非限制性实例中，HC:LC1:LC2的LCCA剂量验证比率可为(50:75:25、50:50:50和50:25:75)或(50:40:60、50:50:50和50:60:40)。

在其中一组构建体共表达于无细胞蛋白质表达系统中的某些实施方案中，编码两条轻链和重链的DNA的比率类似于其中一组构建体共表达于宿主细胞中的情况。

在本文提供的某些实施方案中，宿主细胞用化学计算量的编码两条重链的DNA转染，而编码轻链的DNA的量受限制。在一个实施方案中，轻链多肽(LC)与第一重链多肽(HC1)和第二重链多肽(HC2)的转染比率，即，LC:HC1:HC2为1:1:1。在另一个实施方案中，轻链多肽(LC)与第一重链多肽(HC1)和第二重链多肽(HC2)的转染比率，即，LC:HC1:HC2为0.5:1:1。在一些实施方案中，轻链多肽和第一和第二重链多肽以约1:2:2的预定比率表达。在一个实施方案中，一定比率的轻链多肽和第一和第二重链多肽以约1:3:3的预定比率表达。

在其中一组构建体共表达于无细胞蛋白质表达系统中的某些实施方案中，编码两条重链和轻链的DNA的比率类似于其中一组构建体共表达于宿主细胞中的情况。

在某些实施方案中，本文描述的量化与至少一个轻链多肽配对的重链多肽的选择性的方法包括表达至少两个对照样品以便允许数据分析。在某些实施方案中，获得并量化对照样品的方法包括：在不存在其它轻链多肽的情况下，共表达重链多肽和第一和第二轻链多肽中的一个；分离包含重链多肽和轻链多肽的任何构建体；并且定量所述构建体的量，其中所述量充当所述重链多肽与所述轻链多肽的最大可检测结合的对照标准。在某些实施方案中，对照是其中重链与具有用于标记的两条轻链标签中的一个标签的轻链一起表达的抗体。这些对照表达产生蛋白质混合物，其中具有不同标签的轻链的比率受实验而非受重链与轻链之间的物理相互作用控制。

一旦重链、轻链和对照样品共表达并且从细胞中分泌，其可任选地从培养的细胞中分离，如下所述。

将分泌蛋白质从细胞中分离

本文所述方法和测定的某些实施方案使用从细胞中共表达的重链和轻链多肽。取决于测定格式，可包括将分泌蛋白质从其表达的细胞中分离的任选步骤。在某些实施方案中，对于使用表面等离子体共振(SPR)或FACS的测定，可包括将分泌蛋白质从细胞中分离的任选步骤。在某些实施方案中，在使用例如双分子荧光互补的格式下，可能不需要包括将分泌蛋白质从细胞中分离的步骤。

将分泌蛋白质从细胞中分离的方法在本领域中是熟知的。在一个实施方案中，离心用于将分泌蛋白质从细胞中分离。在一个替代实施方案中，柱纯化用于将分泌蛋白质从细胞中分离。

分泌蛋白质随后用于制备分离重链部分。

取决于测定设计，一组配对多肽产物中的产物的组成变化。图9描绘在其中一组构建体包括一条重链和两条独特轻链的一个实施方案中，当一组构建体在全细胞中共表达时的分泌至培养基中的一些预期产物。图10描绘在其中一组构建体包括两个独特重链和一条轻链的一个实施方案中，当一组构建体在全细胞中共表达时的分泌至培养基中的一些预期产物。图11描绘在其中一组构建体包括一个全长重链和两条独特轻链的一个实施方案中，当一组构建体在全细胞中共表达时的分泌至培养基中的一些预期产物。图12描绘在其中一组构建体包括一个全长重链、包含CH2区和CH3区的一条重链片段和两条独特轻链的一个实施方案中，当一组构建体在全细胞中共表达时分泌至培养基中的一些预期产物。

制备分离重链配对多肽产物

重链配对多肽产物与一组多肽产物分离。如本文使用，术语“重链配对多肽产物”是指与重链配对的表达多肽，例如，与第一轻链多肽或与第二轻链多肽配对的第一重链多肽。在一个实施方案中，其中一组构建体包括一条重链和第一和第二轻链，结合至搭配物轻链多肽的重链多肽可通过利用重链标签上的识别部分对于具体蛋白质分离阶段的亲和力来分离。或者，重链配对多肽产物可使用特异性识别重链的抗体来分离。这类抗体在本领域中为已知的并且包括，例如，针对重链多肽的CH1区的抗体。分离重链配对多肽产物具有重链多肽和结合至它的轻链多肽。作为特定非限制性实例，如果重链用6Xhis标签加标签，镍可用于将重链与混合物中的其它蛋白质分离。镍可结合至载体，如例如，柱或芯片。

一旦重链配对多肽产物已经分离，可检测结合至重链多肽的特定轻链多肽。

检测轻链多肽

在一些实施方案中，根据在本领域中已知的方法，检测与重链多肽配对的轻链多肽基于添加至每条轻链的标签中的检测部分来执行。举例来说，如果轻链用FLAG加标签，那么轻链可用抗-FLAG抗体检测。在一些实施方案中，轻链多肽本身使用具有对于轻链多肽上的氨基酸序列的高亲和力的蛋白质来检测。在一些实施方案中，轻链多肽使用荧光、淬灭、放射性和化学发光中的一个或多个来检测。

测定格式

预期制备分离重链部分的各种格式。举例来说，分离重链配对多肽产物可通过包括但不限于以下的方法来分离：ELISA、SPR芯片、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS)、荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)和

表面等离子体共振(SPR)

在某些实施方案中，本文所述方法、测定和系统利用表面等离子体共振来定量确定重链多肽和轻链多肽的选择性配对。表面等离子体共振(SPR)提供高通量方法，其中表面等离子体在由进入金属材料和电介质材料的界面的电磁辐射激发时共振。表面等离子体共振适用于检测生物分子相互作用，如重链多肽与轻链多肽之间的相互作用。在本文描述的某些实施方案中，提供利用SPR来定量测定重链和轻链多肽的选择性配对的设备，其中所述设备包括感测芯片包括感测芯片。在一些实施方案中，感测芯片包括能够捕获重链多肽上的标签如可检测部分(标记)的相互作用表面层。在一个实施方案中，重链用6Xhis标签加标签，并且分离重链配对多肽产物通过将分泌蛋白质在SPR–镍芯片上传递来分离。在此实施方案中，包含结合至搭配物轻链的重链的分离重链配对多肽产物结合至SPR芯片。在一个替代实施方案中，分离重链配对多肽产物使用SPR以抗-his标签抗体芯片代替镍芯片来分离。

在某些实施方案中，感测芯片包括被设计来结合加组氨酸标签的重链多肽的表面层。

在一些实施方案中，表面层包括NTA螯合镍原子。重链多肽上的组氨酸的结合依赖于NTA螯合镍原子。此相互作用的亲和力普遍地足够高以允许详细分析重链-轻链结合。经由His-标签固定还具有将配体分子以均质方式定向并且允许执行固定而在偶合程序期间不显著改变pH或离子强度的优势。

然而，与许多其它亲和力标签(例如，生物素和抗原表位)一样，亲和力可随着相邻于His-标签的部分建立的微环境来变化。亲和力也可受缓冲环境，例如，pH和离子强度影响。虽然重链多肽表面上的半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和赖氨酸的侧链可参与结合至螯合金属，但是这些相互作用的亲和力通常显著低于普遍地以组氨酸标签获得的亲和力。在一些实施方案中，重链多肽浓度至少约10nM。在某些实施方案中，重链多肽浓度至少约50nM。在某些实施方案中，重链多肽浓度至少约100nM。在某些实施方案中，重链多肽浓度至少约150nM。在某些实施方案中，重链多肽浓度小于约200nM。

酶联免疫吸附–类型测定(ELISA)

如本文使用，“ELISA：是指检测事件使用抗体和基于酶的检测的手段；然而，此术语也用于描述试剂的板结合检测，即使亲和力试剂并非抗体或如果检测试剂并非酶。ELISA类型测定可以许多方式来设计。表面结合蛋白质的连接可通过被动吸附至塑料板、通过用吸附抗体捕获，或通过生物素化和抗生物素蛋白捕获来发生。第二蛋白质的检测可通过用信号产生酶直接标记蛋白质、通过酶标记抗体的结合、通过无标记的初级抗体随后标记次级抗体的结合，或通过生物素化随后酶联抗生物素蛋白来发生。检测酶可包括比色、荧光或发光反应。例如这些测定在本领域中为已知的并且可在免疫学和细胞实验方案书籍中获得，包括但不限于在Arkin等AssayGuidanceManual(Sittampalam等编,InhibitionofProtein-ProteinInteractions:Non-Cellula rAssayFormats)中阐明的测定。

ELISA利用包含相互作用表面层的设备，所述相互作用表面层适用于通过与所述重链多肽上的识别部分相互作用来使重链多肽固定。结合至重链多肽的轻链多肽通过连接至酶的抗体的结合来检测。当添加底物时，酶产生可测量读出，其与轻链多肽的量定量相关。ELISA可能非常灵敏，因为读出通过使用酶来放大。在某些实施方案中，进一步放大通过使用多个层，如次级抗体来实现。

虽然ELISA技术上意味着检测事件使用抗体和基于酶的检测；在一些实施方案中，亲和力试剂并非抗体或如果检测试剂并非酶。在一些实施方案中，非酶格式称为解离增强镧系元素荧光免疫测定(DELFIA)。在DELFIA中，检测信号是镧系元素离子例如铕的时间分辨荧光。镧系元素离子经由化学键来结合至亲和力试剂；在添加专有洗涤剂混合物后，铕发荧光，提供结合轻链多肽的浓度的高灵敏度的测量。镧系元素荧光的三个特征导致高度灵敏和选择性的测定：a)长发射寿命(毫秒)允许在多肽荧光衰变之后开始测量，b)发射在约600nm处发生，其中几乎没有生物材料吸收或发射光，并且c)镧系元素的较窄发射谱允许其多工操作。

(解离增强镧系元素荧光免疫测定)是非酶的稳健、高性能免疫检测平台，提供使得它成为常规ELISA的极好替代的益处组合。(解离增强镧系元素荧光免疫测定)是时间分辨荧光(TRF)强度技术。测定被设计来使用镧系元素螯合物标记试剂来检测化合物或生物分子的存在，使用洗涤步骤来分离未结合试剂。此技术基于镧系元素螯合物(例如，铕、钐和铽)的荧光。这些镧系元素螯合物标记的荧光衰变时间比传统荧光团长，允许有效使用时间分辨率来减少背景的自身荧光。灵敏度由于解离增强原理而增加：镧系元素螯合物解离并且新的高度荧光螯合物形成保护性胶束溶液。DELFIA镧系元素螯合物需要荧光的此解离/增强步骤(视具体镧系元素螯合物的情况，通过添加DELFIA增强溶液、DELFIA诱导剂和DELFIA增强剂来诱导)。DELFIA测定的试剂盒可从例如PerkinElmer购得。

蛋白质-蛋白质相互作用测定是灵活和灵敏、均质测定，其适用于测量较大蛋白质相互作用和直至200nm大小的复合物。基于珠粒的接近测定，测定是可购得的基于珠粒的接近测定并且提供测定生物相互作用的融合标签检测的解决方案。此技术提供用于标记蛋白质混合物的广泛范围珠粒的灵活性。

其它荧光方法

一些荧光免疫测定方法包括简单荧光标记方法、荧光共振能量转移(FRET)、时间分辨荧光(TRF)和扫描探针显微术(SPM)。简单荧光标记方法可用于受体-配体结合、使用相关荧光的酶活性，和作为各种体内生理变化如pH、离子浓度和电压的荧光指示。TRF是在其它荧光分子的发射结束之后选择性测量镧系荧光的方法。TRF可与FRET一起使用并且镧系可成为供体或受体。

在荧光偏振/各向异性(FP)中，荧光强度可用于提供样品中的具体荧光团的存在(以及可能的量)的指示。荧光各向异性可提供荧光辐射非随机极化的程度的度量，即，一个偏振取向对于其正交极化取向占优势的程度。高度各向异性信号是高度极化的(例如，线性极化)。高度各向同性信号接近随机偏振。在一个常规方法中，各向异性(r)使用以下方程来计算：其中I_VH和I_VV是水平和垂直极化(相对于垂直地极化激发光)并且G校正用于检测荧光的光学仪器的极化偏差。

测定设计

所述方法可用于确定合理设计的重链和轻链对；天然发生的重链和轻链；以及可在使用方法不限于多肽设计方法中筛选的重链和轻链对的选择性。

在宿主细胞中或在体外共表达的所述一组构建体的组成可变化。所述方法的示例性设计变化在表1中示出。

表1

LCCA：轻链竞争测定，HCCA：重链竞争测定ORCA：单臂轻链竞争测定

^#两组群体独立地量化。

*标签可用于某些情况中。

表1也总结每个设计的各种特征，例如在所述一组多肽产物内，哪些群体量化，是否所述方法使用优先彼此异源二聚体化的Fc区，以及关于在存在或不存在标签的情况下群体如何量化的细节。

在一个实施方案中，所述方法设置为轻链竞争测定(LCCA)。在此实施方案中，所述一组构建体包括一个HC加上至少两个独特LC。HC和两个独特LC呈Fab格式，即HC包括VH区和CH1区，同时每个LC包括VL区和CL区。所述一组构建体共表达以使得HC受限制。所述一组构建体在全细胞或无细胞表达系统中共表达。如上所述，在其中所述一组构建体在全细胞中共表达的情况下，假定重链产物未从细胞中分泌，除非其与轻链配对。图15提供描绘所述方法如何在LCCA实施方案(LCCA-1)中执行的实例的线图。在图15展示的实施方案中，每条重链和轻链独特地加标签。在步骤1中，HC-LC配对群体(重链配对多肽产物)通过亲和力纯化使用重链上的标签来分离。在步骤2中，将每个HC-LC对的群体量化。预期取决于所使用的检测方法，步骤1和2可组合。举例来说，当SPR格式用于测定时，步骤1和2可组合。

在另一个实施方案中，所述方法设置为重链竞争测定(HCCA)。在此实施方案中，所述一组构建体包括一个LC加上至少两个独特HC。LC和两个独特HC呈Fab格式，即HC包括VH区和CH1区，同时每个LC包括VL区和CL区。所述一组构建体共表达以使得LC受限制。所述一组构建体在全细胞或无细胞表达系统中共表达。在其中所述一组构建体在全细胞中共表达的情况下，假定重链产物未从细胞中分泌，除非其与轻链配对。图16提供描绘所述方法如何在HCCA实施方案中执行的实例的线图。在图16展示的实施方案中，仅重链独特地加标签。在步骤1中，HC-LC配对群体(重链配对多肽产物)通过亲和力纯化使用重链上的标签来分离。在步骤2中，将每个HC-LC对的群体量化。在此实施方案中，取决于量化HC-LC对的方法，也可能将步骤1和2组合。

在另一个实施方案中，所述方法设置如单臂轻链竞争测定(ORCA)。在此实施方案中，所述一组构建体包括包含VH区、CH1区、CH2区和CH3区的第一HC，包含CH2区和CH3区的第二HC，和各自包含VL区和CL区的两个独特LC。在此实施方案中，CH3区包括允许第一和第二HC优选异源二聚体化的至少一个修饰。在其中全长HC受限制的条件下，所述一组构建体在全细胞或无细胞表达系统中共表达。在其中所述一组构建体在全细胞中共表达的情况下，假定重链产物未从细胞中分泌，除非其与轻链配对。图17提供描绘所述方法如何在ORCA实施方案中执行的实例的线图。在图17展示的实施方案中，仅轻链独特地加标签。在此实施方案中，在步骤1中，HC-LC配对群体(重链配对多肽产物)通过亲和力纯化使用抗-Fc抗体来分离。在步骤2中，将每个HC-LC对的群体量化。在此实施方案中，取决于量化HC-LC对的方法，也可能将步骤1和2组合。

在仍然另一个实施方案中，所述方法设置为LCCA-1实施方案的变化(LCCA-2)。在此实施方案中，所述一组构建体包括一个HC加上至少两个独特LC，如对于LCCA-1，除了HC包括VH区、CH1区、CH2区和CH3区，同时每个LC包括VL区和CL区以外。所述一组构建体共表达以使得HC受限制。所述一组构建体在全细胞或无细胞表达系统中共表达。如上所述，在其中所述一组构建体在全细胞中共表达的情况下，假定重链产物未从细胞中分泌，除非其与轻链配对。图18提供描绘所述方法如何在LCCA-2实施方案中执行的实例的线图。在图18展示的实施方案中，仅轻链独特地加标签。在步骤1中，HC-LC配对群体(重链配对多肽产物)通过亲和力纯化使用抗-Fc抗体来分离。在步骤2中，将每个HC-LC对的群体量化。预期取决于所使用的检测方法，步骤1和2可组合。

在另一个实施方案中，所述测定设置为LCCA的另一个变化(LCCA-3)。在此实施方案中，所述一组构建体包括两个独特LC加上两个独特HC。LC和HC均呈Fab格式，即HC包括VH区和CH1区，同时每个LC包括VL区和CL区。在某些情况下，所述一组构建体可共表达以使得HC受限制。所述一组构建体在全细胞或无细胞表达系统中共表达。如上所述，在其中所述一组构建体在全细胞中共表达的情况下，假定重链产物未从细胞中分泌，除非其与轻链配对。在此实施方案中，重链和轻链各自独特地加标签。在步骤1中，HC1-LC和HC2-LC配对群体(重链配对多肽产物)通过亲和力纯化来个别地分离。在步骤2中，针对每个独特HC1或HC2群体来量化HC-LC1和HC-LC2群体。预期取决于所使用的检测方法，步骤1和2可组合。

在一个实施方案中，本文所述方法的各种实施方案可用于开发工作LCCA文库，如图8中示出。简单地说，图8示出工作LCCA文库的示例性合理设计中的步骤。首先，建立设计(即，设计1…设计N)的计算机“LCCA文库”(图8A)；文库工程化以使得HC优选与LC1而非LC2配对(即，HC-LC1>>HC-LC2)。这些设计然后在体外测试。为此目的，文库设计个别地克隆至表达载体中(参见步骤2；图8B)，如本文中别处描述并且使用在本领域中已知的克隆方法。克隆试剂盒也可例如从LifeTechnologies购得，并且预期在本文中使用。随后，LCCA设计(例如，HC₁，LC1₁，和LC2₁…HC_N、LC1_N和LC2_N)瞬时表达于哺乳动物细胞中(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)；参见步骤3；图8C)。转染后七天，收获CHO细胞上清液，并且使用SPR读出，针对每个LCCA设计来量化HC-LC1:HC-LC2群体，如本文中别处描述(步骤4；图8D)。然后，工作设计基于设定标准来排序(例如，HC-LC1:HC-LC2>＝75:25)；成功设计成为“工作LCCA文库”的一部分。当处理较大数据集时，可利用任选数据挖掘步骤(#5；图8E)。在此步骤期间，可任选地执行“HC-LC配对结果的整体分析”。此步骤可为相当有益的，因为它潜在允许数据中的非平凡和非明显模式/趋势得以辨识。最后，编译工作LCCA文库(图8F)。

分析结果

存在可藉以分析结果的多个方法。以下描述的方法代表分析的非限制实例并且本申请的实施方案不意欲限于以下描述。

在某些实施方案中，具有具体轻链可检测部分的免疫球蛋白构建体的测量质量通过分离重链部分的量来标准化。评估相应对照样品(参见上述)的当量质量比。这两个质量比的比率等于具有具体识别部分的分离免疫球蛋白构建体的百分比。对于其它轻链标签重复相同计算。由此对于给定变体获得的百分比反映一条轻链(L1)与重链(H1)配对超过另一条轻链(L2)与重链(H1)配对的特异性。指示为p^H1-L1和p^H1-L2。

在一些实施方案中，识别重链和轻链组的独特和选择性对，例如HC1:LC1和HC2:LC2对组，其中避免形成HC1:LC2或HC2:LC1的链交叉配对，适用于设计和合成二互补位抗体构建体。在一些实施方案中，二互补位构建体是双特异性构建体。在一个实施方案中，通过HC1:LC1配对衍生的Fab可靶向抗原A，而通过HC2:LC2配对衍生的Fab可靶向抗原B。重链和轻链对的选择性形成对的识别允许两条独特轻链LC1和LC2与异源二聚体重链对共表达以形成双特异性抗体。

对于重链和轻链对的许多对衍生的配对特异性数据可图形化并且使用不同数据挖掘技术来分析。举例来说，图13描绘代表轻链竞争测定数据的双向图的一部分。每个方形节点代表具体重链变体。每个圆形节点代表轻链变体的具体对。与边缘连接的两个这类节点代表轻链竞争测定的一个实验。

边缘造型随着实验结果而变化。黑色实线意味着重链具有与相应节点中的两条轻链变体中的第一个配对的较高倾向。虚线意味着重链具有与相应节点中的两条轻链变体中的第二个配对的较高倾向。节点宽度通过S的绝对值来确定，以上定义，

W = | S | = | \log \frac{P 1}{P 2} |

其中竞争物质的测量百分比通过轻链竞争测定来测量。两个百分比之间的差异越大，边缘宽度越大。

在一方面连接厚实心边缘并且另一方面连接厚虚线边缘的含有圆形节点的图部分代表当其共表达时可能形成所需产物的重链和轻链变体的组合。这类节点的子图容易地提取并且视觉容易辨识。另外，高度混杂的变体容易辨识，因为其与一个类型的多个厚边缘相关联。举例来说，在图13中，含有轻链变体K和L的节点代表在所有测定中产生链K与重链的优选配对的一对轻链。这可例如由链L的不良性质或链K的特别良好性质引起。当数据点的数量变得非常大时，图形表示允许快速识别异常数据和探索具有良好或不良性质的测定的共同设计要素。

一个方面提供使重链多肽和轻链多肽的选择性配对可视化的方法。所述方法包括在包含一个或多个处理器和存储由一个或多个处理器执行来执行方法的一个或多个程序的存储器的计算机系统上执行以下步骤。获得竞争测定数据。竞争测定数据包括多个结合测定。多个结合测定中的每个相应结合测定包括在溶液中，将第一量的选自多个重链多肽构建体的一个或多个相应重链多肽暴露于第二量的选自多个轻链多肽构建体的一个或多个相应轻链多肽，在限制溶液中的相应一个或多个重链多肽或相应一个或多个轻链多肽的条件下。当相应一个或多个重链多肽具有限制性时，一个或多个重链多肽由单一重链多肽构建体组成并且一个或多个轻链多肽由多个轻链多肽构建体组成。当相应一个或多个轻链多肽具有限制性时，一个或多个轻链多肽由单一轻链多肽构建体组成并且一个或多个重链多肽由多个重链多肽构建体组成。

在所述方法中，构建包含多个节点的图表。多个节点包括第一节点子集和第二节点子集。第一节点子集中的每个相应节点以第一图形格式来展示并且独特地代表多个结合测定中的一个或多个结合测定中的一个或多个相应重链多肽。第二节点子集中的每个相应节点以第二图形格式来展示并且独特地代表多个结合测定中的一个或多个结合测定中的一个或多个相应轻链多肽。第一节点子集共同地代表在多个结合测定中使用的所有重链多肽。第二节点子集共同地代表在多个结合测定中使用的所有轻链多肽。

在所述方法中，图表填充有多个边缘。多个边缘中的每个相应边缘代表多个结合测定中的相应结合测定并且将代表相应结合测定中的一个或多个重链多肽的第一节点子集中的第一节点连接至代表相应结合测定中的一个或多个轻链多肽的第二节点子集中的第二节点。多个边缘中的每个边缘的第一图形样式指示是否相应结合测定中的限制多肽具有对于相应结合测定中的一个非限制性多肽的偏向。

在一些实施方案中，多个边缘中的每个边缘的第二图形样式通过相应结合测定中的限制多肽具有对于相应结合测定中的一个非限制性多肽的偏向的量来确定。在一些实施方案中，第一图形样式是点线并且第二图形样式是线宽。在一些实施方案中，多个边缘中的边缘的线宽通过相应结合测定中的限制多肽具有对于相应结合测定中的一个非限制性多肽的偏向的量来确定，其中相应结合测定中的限制多肽具有对于相应结合测定中的一个非限制性多肽的偏向的量越大，边缘线宽越大。

在一些实施方案中，第一图形格式是第一二维闭型形状并且第二图形格式是除了第一二维闭型形状以外的第二二维闭型形状。在一些实施方案中，第一图形格式是第一二维地理形状并且第二图形格式是除了第一二维地理形状以外的第二二维地理形状。例如，在一些实施方案中，第一二维地理形状或第二二维地理形状选自由以下组成的组：n角形，其中n是3或更大的整数，圆形，或椭圆形。

在一些实施方案中，多个结合测定中的每个结合测定中的相应一个或多个重链多肽由包含VH区和CH1区的单一重链多肽构建体组成。此外，多个结合测定中的每个结合测定中的一个或多个轻链多肽由第一轻链多肽构建体和第二轻链多肽构建体组成，其中第一轻链多肽构建体由第一VL区和第一CL区组成，并且第二轻链多肽构建体包括第二VL区和第二CL区。在这些实施方案中，多个边缘中的每个边缘的线宽(W)通过相应结合测定中的单一重链多肽构建体具有对于第一轻链多肽构建体或第二轻链多肽构建体的偏向的量来确定。此量由下式确定：

W = | f (\frac{P 1}{P 2}) |

其中，f是线性或非线性函数，P1是与第一轻链多肽构建体配对的单一重链多肽构建体的量，其通过(i)与第一轻链多肽构建体配对的单一重链多肽构建体的量和(ii)与第二轻链多肽构建体配对的单一重链多肽构建体的量的组合来标准化，并且P2是与第二轻链多肽构建体配对的单一重链多肽构建体的量，其通过(i)与第一轻链多肽构建体配对的单一重链多肽构建体的量和(ii)与第二轻链多肽构建体配对的单一重链多肽构建体的量的组合量来标准化。

在一些此类实施方案中，f是对数或指数函数。在一些此类实施方案中，当单一重链多肽构建体优选结合至第一轻链多肽构建体时，第一图形样式是实线，并且当单一重链多肽构建体优选结合至第二轻链多肽构建体时，第一图形样式是虚线。

在一些实施方案中，多个结合测定中的每个结合测定中的相应一个或多个重链多肽由包含第一VH和第一CH1区的第一重链多肽构建体以及包含第二VH和第二CH1区的第二重链多肽构建体组成。在这些实施方案中，多个结合测定中的每个结合测定中的一个或多个轻链多肽由轻链多肽构建体组成，其中轻链多肽构建体包括VL和CL区。在一些此类实施方案中，多个边缘中的每个边缘的线宽(W)通过相应结合测定中的单一轻链多肽构建体具有对于第一重链多肽构建体或第二重链多肽构建体的偏向的量来确定，其中此量由下式确定：

W = | f (\frac{P 1}{P 2}) |

其中，f是线性或非线性函数，P1是与第一重链多肽构建体配对的单一轻链多肽构建体的量，其通过(i)与第一重链多肽构建体配对的单一轻链多肽构建体的量和(ii)与第二重链多肽构建体配对的单一轻链多肽构建体的量的组合来标准化，并且P2是与第二重链多肽构建体配对的单一轻链多肽构建体的量，其通过(i)与第一重链多肽构建体配对的单一轻链多肽构建体的量和(ii)与第二重链多肽构建体配对的单一轻链多肽构建体的量的组合量来标准化。

在一些此类实施方案中，f是对数或指数函数。在一些此类实施方案中，当单一轻链多肽构建体优选结合至第一重链多肽构建体时，第一图形样式是实线，并且当单一轻链多肽构建体优选结合至第二重链多肽构建体时，第一图形样式是虚线。在一些此类实施方案中，

在一些实施方案中，多个结合测定中的每个结合测定中的相应一个或多个重链多肽由包含VH区、CH1区、CH2区和CH3区的单一重链多肽构建体组成。此外，多个结合测定中的每个结合测定中的一个或多个轻链多肽由第一轻链多肽构建体和第二轻链多肽构建体组成，其中第一轻链多肽构建体包括第一VL和第一CL区，并且第二轻链多肽构建体包括第二VL和第二CL区。在一些此类实施方案中，多个结合测定中的每个结合测定还包括溶液中的由CH2区和CH3区组成的额外分子实体。在一些此类实施方案中，多个边缘中的每个边缘的线宽(W)通过相应结合测定中的单一重链多肽构建体具有对于第一轻链多肽构建体或第二轻链多肽构建体的偏向的量来确定，其中此量由下式确定：

W = | f (\frac{P 1}{P 2}) |

在一些实施方案中，多个结合测定中的结合测定中的暴露通过共表达一个或多个相应重链多肽和一个或多个相应轻链多肽来执行。

高通量

如本文使用的高通量是指大规模和/或快速执行本文所述方法和测定。在某些实施方案中，本文所述系统适合于高通量筛选重链多肽和轻链多肽的选择性配对。在某些实施方案中，适用于本文所述方法和测定的设备能够每周加工至少50个不同选择性重链-轻链对。在一些实施方案中，适用于方法或本文所述测定的设备能够每周加工多达500个不同选择性重链-轻链对。还提供设备能够每周加工至少50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或1000个不同选择性重链-轻链对。

在某些实施方案中，提供具有高通量的方法和测定。在一些情况下，本文描述方法或测定适用于每周每个设备筛选至少50个不同选择性对。在一些情况下，本文描述方法或测定适用于每周每个设备筛选至少100个不同选择性对。在一些情况下，方法或测定适用于每周每个设备筛选至少150个不同选择性对。在一些情况下，方法或测定适用于每周每个设备筛选至少200个不同选择性对。本文描述的一些方法可用于每周每个设备筛选至少300个不同选择性对。

本文所述高通量方法、测定和系统是稳健的。在某些实施方案中，本文所述方法、测定和系统耐受可变流动速率。在某些实施方案中，本文所述方法和测定耐受流动速率的5％变化。在一些实施方案中，方法和测定耐受流动速率的10％变化。在一些实施方案中是耐受流动速率的15％变化的方法和系统。还提供耐受流动速率的20％变化的方法和测定。还提供耐受流动速率的25％变化的方法和测定。

提供可测量较小变化对于蛋白质序列的效应的测定。较大表面区上的混杂的蛋白质–蛋白质、域-域、链–链相互作用通常需要多个突变(互换)以便引入选择性。在一些实施方案中，本文描述的方法不需要分离或进一步纯化抗体构建体，从而使得能够更有效筛选。本文所述测定是灵敏的，即测定可以在某些情况下可低至飞克/孔的灵敏度来检测例如HC:LC对。

系统和试剂盒：

提供执行本文描述的方法的系统和试剂盒。在一些实施方案中，是包含高通量筛选重链和轻链多肽的选择性结合的设备的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括适用于本文所述测定的试剂。在一些实施方案中，试剂冻干。在一些实施方案中，试剂盒和系统提供本文所述重链和轻链多肽表达系统。

提供高通量筛选重链多肽与至少一个轻链多肽的选择性配对的系统，其包括：一种或多种宿主细胞，其用以表达：重链多肽，其包含免疫球蛋白重链区和能够由包含相互作用表面层的设备捕获的标签；包含第一免疫球蛋白轻链区的第一轻链多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链区的至少一个第二轻链多肽；其中所述重链多肽和所述轻链多肽以预先确定的比率来表达以使得重链多肽的量受限制；并且其中所述第一和第二轻链多肽用可检测部分加标签；和检测设备，其包含能够捕获所述重链多肽的相互作用表面层，其中所述设备进一步能够检测每个所述轻链多肽上的可检测部分；其中包含重链多肽和所述第一或第二轻链多肽的构建体由所述一种或多种宿主细胞来表达，并且与所述检测设备接触，并且其中所述检测设备适用于检测包含重链多肽和第一轻链多肽的第一构建体的量，和包含重链多肽和第二轻链多肽的第二构建体的量，以使得与第二构建体相比，第一构建体的较大量证实与第二轻链多肽相比，重链多肽与第一轻链多肽配对的较高选择性。

实施例

给出以下实施例以便阐明本发明的实践。其不意欲限制或界定本发明的整个范围。

实施例1：轻链竞争检定(LCCA)

图1示出形成双特异性Mab(单克隆抗体)的工程化要求，和量化重链轻链对所需要的测定要求的高水平示意性概述。工程化具有高纯度(即，几乎没有错配H-L缔合)的双特异性Mab的设计目的可通过合理工程化(经由引入特定氨基酸突变)两个独特重链与其独特同源轻链的优先配对来实现。此过程示意性地展示；在本文中，H1工程化以与L1而非L2优选配对。同样地，H2工程化以与L2而非L1优选配对。双特异性Mab设计的实验筛选需要能够同时量化H1-L1:H1-L2和H2-L2:H2-L1的测定。这些测定要求可通过假定每个双特异性Fab臂可独立地工程化来简化。在这种情况下，测定只需要量化H1-L1:H1-L2或H2-L2:H2-L1，而非同时量化两者。

以下协议提供使用加轻链标签群体的SPR读出的测定的关键步骤的描述。图2示出示例性全细胞表达：轻链竞争测定：

轻链竞争测定：

HC限制：HC限制。H:L1:L2＝1:1:1。轻链为重链竞争

在初始变体中未观察到H-L二硫化物键。

轻链竞争测定量化一条重链与至少两条独特轻链的相对配对。测定和前述步骤可总结如下：1.重链和轻链的同时表达，其中重链呈限制量(例如，HC:LC1:LC2＝1:1:1)，2.分离HC-LC复合物-经由his-标签下拉使重链结合至SPR芯片来实现，和3)量化相对HC-LC群体(即，H1-L1:H1-L2)。在SPR格式中，对于独特加轻链标签群体具有特异性的抗体用于量化。注意：此测定可在存在或不存在H-L二硫化物的情况下执行。

图3A和3B提供测定如何在SPR芯片上设置的示意性描述，和另外如何计算每条轻链加标签群体的百分比的方法的实施例。

利用SPR基于夹心的测定(图3A)，其中：

1.捕获Fab(His-标签捕获)—量化

2.捕获对照Fab(WTHC+100％WTFLAG-LC或100％WTHA-LC)-量化

3.捕获抗标签Ab—量化

4.标准化每100个RU结合Fab的抗标签Ab捕获

*计算抗标签Fab群体(％)

*计算：

1.(标准抗-FlagAbRU/标准抗-FLAGAbRU[对照])x100＝％抗-FLAGFab。

2.(标准抗-HAAbRU/标准抗-FLAGAbRU(对照))x100＝％抗-HAFab。

在图3A中，示出ProteOnXPR36芯片的示意图。每个芯片主要由6×6个栅格细胞组成，其中每个细胞能够监测结合反应。对于LCCA，变体和对照在垂直方向上注射至整个芯片并且经由抗-his标签Ab结合至芯片(关于更多细节，参见图3B和实施例5)。在洗涤步骤之后，将抗-LC标签Ab水平地注射(在分离细胞中)至整个芯片上。相对于适当Fab对照(只具有100％LC1或LC2)的所捕获的每个抗-LC标签Ab的量允许对于每个变体计算HC-LC1和HC-LC2的相对群体。计算前述群体所需要的步骤在以上相对于计算来展示。

图4例示掺杂实验的绘图，其中已知比率的100％HC:HA-LC或100％HC:FLAG-LC以预定比率混合。纯化HC:HA-LC和HC:FLAG-LC以已知比率混合。将Fab混合物负载至SPR芯片上并且读出HA和FLAG的信号。在相对于LC-FLAG或LC-HA的比率作图时，抗-标签抗体的读出大约为线性的。信号相比于LC群体的线性性质提供量化HC-LC1:HC-LC2群体的简单方法。

实施例2：轻链竞争测定的理论

反应定义和平衡行为

一条重链H和两条轻链L1和L2的共表达，以下反应是可能的：

H + L 1 &LeftRightArrow; H L 1

H + L 2 &LeftRightArrow; H L 2

L 1 + L 2 &LeftRightArrow; L 1 L 2

L 1 + L 1 &LeftRightArrow; L 1 L 1

L 2 + L 2 &LeftRightArrow; L 2 L 2

H + H &LeftRightArrow; H H

对于这些反应中的每一个，存在缔合和解离速率常数，其中预期后者反应比前者慢。

将要测定的所需特性是L1与H配对相对于L2与H配对的相对倾向。产生超过HL2物质的较高相对量HL1物质的设计是具有需要性质的设计。因此，核心数量是以下比率：

R = \frac{[H L 1]}{[H L 2]}

S = l o g \frac{[H L 1]}{[H L 2]}

P 1 = 100 \cdot \frac{[H L 1]}{[H L 1] + [H L 2]}

P 2 = 100 \cdot \frac{[H L 2]}{[H L 1] + [H L 2]}

R是两个Fab物质的量的比率。S是R的对数，并且与L1与H配对以及L2与H配对之间的自由能差异成比例。P1和P2分别是所需和不需要物质的百分比。从此方程式，可见：

S = \log \frac{P 1}{P 2}

为了使得以上定义的比率代表所感兴趣的给定设计的物理性质，表达中的L1和L2的量必需相对于H的量是过量的。在这类条件下，配对变成竞争并且相对于HL2量的HL1量预期分别反映L1与H配对和L2与H配对的相对适合度或相容性。

为了了解如何解译实验输出，在理论上计算上述比率，方法是将不同值分配至缔合和解离速率常数并且将由此定义的化学动力学问题求解。为了解决问题我们假定稳态反应动力学是有效的。这意味着对于所形成的物质的量，仅缔合与解离速率常数之间的比率，换句话说平衡常数是重要的。

首先，假定所有反应具有零概率，除了形成Fab的前两个反应以外。随着共表达中的L1和L2的相对量而变化的HL1和HL2相对量之间的关系在图5中计算并示出。关系是简单的并且与垂直轴的相交等于配对倾向比率的对数。显示数据的替代方法是将关系转换成x轴上的百分比L1和y轴上的百分比HL1。此关系在图6中示出，其中使用与图5相同配对倾向比率。如可以看出，趋势看似不同，尤其配对倾向差异越大，对于相同量的L1获得更大量的HL1，并且所有曲线接近下和上限的相同点。

在轻链二聚体也以非零概率形成的条件下，剂量缩放曲线稍微变化。举例来说，可证实如果对于L1和L2，形成轻链二聚体的配对倾向相等，那么斜率减小，但是定性趋势保留。

实施例3：分析LCCA的设置

如在别处描述，在LCCA中，不同地加标签HL1和HL2的混合物最初捕获于芯片上，随后通过将所捕获的次级抗标签抗体的量转换成光学信号来量化两种Fab物质。典型SPR芯片在图7中示出，并且也引入用于以下分析中的细胞的标记。

在序列中，采用以下步骤来执行LCCA：(1)从以变体DNA转染的细胞中排出的材料从芯片底部的入口流至顶部，图7示出。在进行此举时，水平通道闭合。(2)垂直通道闭合。(3)负载至每个细胞的材料的质量以RU为单位来评估。(4)水平通道开启。(5)_各种次要抗体，如抗-HA、抗-FLAG和Fab的可溶性抗原左侧入口流至右侧，图7示出。添加质量以RU为单位来评估。

使指示从变体v1细胞中排出的材料中的Fab的总量。使ρ^Fab指示Fab数量和Fab质量之间的转换系数。在实验的精确度内，所有Fab具有相同转换系数。使d^i_垂直指示量化第i行的分子浓度和沿着纵向流动的源溶液中的浓度之间差异程度的系数，图7。如果在SPR芯片上的流动完全平衡，此系数对于所有细胞是一致的。因此，以下关系有效：

使指示为物质HL1的变体v1的Fab部分。使指示HL2的相应数量。

对于水平流动，引入与纵向流动类似的数量，并且制定以下关系：

其中引入以下数量：表示量化在细胞i和插入溶液之间次级抗体浓度差异的系数；n^s1是次级抗体的数量，ρ^s1是次级的密度。对于所捕获的Fab的量的依赖性来自于次级只结合至Fab。也产生次级抗体s1结合至HL1标签的任意分配。

对于SPR，测得与量和成正比的信号具有一定的误差，该误差来自于SPR机器的不精确性。机器误差，e(σ)，假定正常分布，集中于零并且具有一些标准偏差σ。

两个质量的比率是：

其中认为误差足够小以在分母中忽略；C是常数。

运行对照样品，其中HL1量已知为100％，换句话说相应质量比表示为R_s1，100％。因此，质量比的比率为

只要次级抗体的分布沿着水平尺寸是几乎均匀的，对于含有变体的通道和含有对照的通道，次级抗体的浓度是几乎相同的，此比率返回所感兴趣的数量，其为给定样品的HL1部分。即使此假设并非有效，但是对照变体总是在相同通道中运行，获得以下关系：

\frac{R_{s 1}^{v 1}}{R_{s 1, 100 %}} / \frac{R_{s 2}^{v 1}}{R_{s 2, 100 %}} = \frac{r_{v 1}^{H L 1}}{r_{v 1}^{H L 2}} + e (σ) / C^{''}

在实验误差内，右手侧的数量等于浓度部分由此使得能够计算反应定义的较早部分中所描述的数量。

实施例中使用的试剂可购得或可使用在本领域中已知的可购得仪器、方法或试剂来制备。前述实施例阐明本发明的各种方面和本发明方法的实践。实例并非意欲提供本发明的许多不同实施方案的无遗漏的描述。因此，虽然出于清晰理解目的，前述本发明经由说明和实例较详细地描述，但是本领域普通技术人员容易认识到可对其进行许多变化和改进而不背离附加权利要求的精神或范围。

实施例4：制备编码D3H44IGG重链和D3H44IgG轻链的构建体

用于本文所述方法的抗组织因子抗体D3H44的重链和轻链如下制备。D3H44Fab轻链(AJ308087.1)和重链(AJ308086.1)序列从GenBank获得(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。包含一条重链和两个不同轻链的共表达组被设计来在重链和轻链序列的Fab区中产生至少一个突变来驱动重链与一条轻链选择性配对。

将共表达组基因合成并且针对哺乳动物表达来密码子优化。将由5’-EcoRI切割位点–HLA-A信号肽–HA或FLAG标签–轻链克隆–TGA终止–BamH1切割位点-3’组成的轻链载体插入物连接至pTT5载体中(DurocherY等,Nucl.AcidsRes.2002；30,No.2e9)。将所得载体+插入物测序以证实正确的阅读框架和编码DNA的序列。同样地，将由5’-EcoR1切割位点–HLA-A信号肽–重链克隆–ABD2-His6tag–TGA终止–BamH1切割位点-3’组成的重链载体插入物连接至pTT5载体(ABD；白蛋白结合域)。也将所得载体+插入物测序以证实正确的阅读框架和编码DNA的序列。

实施例5：评估包括D3H44IgG轻和/或重链中的修饰的共表达组中的异源二聚体的优选配对

在根据实施例4制备的包含具有修饰Fab域的D3H44重链和轻链的共表达组中，异源二聚体优选配对的能力加以确定并且结果在图5中示出。十五个共表达组各自包含与两个独特D3H44轻链构建体共表达的一个D3H44重链构建体并且测试相对轻链配对特异性(例如，H1_L1:H1_L2)。在一些情况下，验证步骤可任选地包括于所述方法中以证实获得相符序列并且提供设计稳健性的评估。对于竞争测定筛选和验证，重链(HC)保持于限制数量(即，HC<L1+L2)。方法执行如下。

转染方法

包含如实施例4描述来制备的一条重链和两条轻链构建体的共表达组转染至CHO-3E7细胞如下。CHO-3E7细胞在37℃下培养于FreeStyleTMF17培养基(Invitrogencat#A-1383501)中，其补充有4mM谷氨酰胺和0.1％普鲁兰尼克F-68(Invitrogencat#24040-032)。2ml生长培养基中的两百万细胞(CHO-3E7)用总共2μgDNA使用PEI-pro(Polypluscat#115-010)以1:2.5的DNA:PEI比率来转染。添加DNA-PEI混合物之后二十四小时，细胞转移至32℃。在第7天通过非还原SDS-PAGE分析测试上清液的表达，随后考马斯蓝染色来使条带可视化。HC:LC比率如表2中指示。用于LCCA筛选和验证的示例性HC:LC1:LC2比率。还提供用于转染每个2mlCHO/HEK细胞培养物的DNA的相对量。注意：“用于转染的DNA数量”包括载体以及插入物(例如HC)

表2：

^#HC：重链，L1：轻链1，L2：轻链2

^充填DNA：_PTT5载体没有DNA插入物。

竞争测定SPR方法

在共表达组中，与D3H44重链的优先D3H44轻链配对程度使用位于每条轻链的N-末端的独特表位标签的基于SPR读出来评估。

表面等离子体共振(SPR)供应。GLM传感器芯片，BioradProteOn胺偶合试剂盒(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺(sNHS)和乙醇胺)，和10mM乙酸钠缓冲液购自Bio-RadLaboratories(Canada)Ltd.(Mississauga,ON)。重组Her-2蛋白质购自eBioscience(SanDiego,CA)。4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、乙二胺四醋酸(EDTA)和NaCl购自Sigma-Aldrich(Oakville,ON)。10％Tween20溶液购自Teknova(Hollister,CA)。

SPR生物传感器测定。所有表面等离子体共振测定使用BioRadProteOnXPR36仪器(Bio-RadLaboratories(Canada)Ltd.(Mississauga,ON))以PBST电泳缓冲液(具有0.05％Tween20的PBSTeknovaInc)在25℃温度下执行。抗-pentaHis捕获表面使用通过在分析物(水平)方向上在100μL/min下注射140s的标准BioRadsNHS/EDC溶液的1:5稀释注液活化的GLM传感芯片来产生。在活化之后，抗-pentaHis抗体(QiagenInc.)于10mMNaOAcpH4.5中的25μg/mL溶液立即在分析物(垂直)方向上以25μL/min的流动速率注射直到固定大约3000谐振单元(RU)为止。其余活性基团在分析物方向上在100μL/min下通过140s注射1M乙醇胺来淬灭，并且这也确保产生假活化间隔点用于空白参考。

结合至抗-FLAG(SigmaInc.)和抗-HA(RocheInc.)单克隆抗体的异源二聚体的筛选在两个步骤中发生：在配体方向上间接捕获异源二聚体至抗-pentaHis表面上，随后在分析物方向上抗-FLAG和抗-HA注射。首先，在配体方向上在100uL/min下，30s的一次缓冲液注射用于稳定基线。对于每个异源二聚体捕获，细胞培养基中的未纯化异源二聚体稀释至PBST中的4％。在25μL/min流动下，一至五个异源二聚体或对照(即，含有100％HA-轻链或100％FLAG-轻链的对照)同时注射至个别配体通道240s。这导致大约300的400RU的饱和异源二聚体捕获至抗-pentaHis表面上。如果需要，第一配体通道保持清空来用作空白对照。这异源二聚体捕获步骤紧接着分析物方向上的两次缓冲液注射来稳定基线，然后5nM抗-FLAG和5nM抗-HA各自重复两次在50μL/min下注射120s，其中180s解离阶段，产生具有每个捕获异源二聚体的缓冲液参考的一组结合传感图。可能的话，异源二聚体结合的抗原也可在最后一个剩余分析物通道上作为活性对照来注射。异源二聚体通过0.85％磷酸的18s脉冲在100μL/min下再生18s来制备下一个注射循环的抗-pentaHis表面。将传感图比对并且使用缓冲液空白注射和间隔点来双重参考，并且所得传感图使用ProteOnManager软件v3.0来分析。

从SPR获得的数据如实施例2和3中描述来分析。

处理数据可从如表3示出的基于SPR测定来获得。提供具有H1或H2+La和L2的轻链竞争测定的一系列结果。实现优先H1-L1和H2-L2结合。

表3：静电的/基于立体的设计

L1和L2的总百分比应理论上合计达100％。在实际上，观察到对于一些变体，L1和L2的总量添加直至显著小于100％。总轻链百分比的此不一致被认为部分地归因于在SPR芯片上的初始异源二聚体捕获期间发生可变非特异性结合。

一个ProteOnXPR36机器上的LCCA通量通常为每天60个变体，或每周300个变体。应了解SPR机器可每周运行4或5天。此外，较高通量筛选速率可通过增加资源(例如，使用两个ProteOnXPR36机器)或转换至较高通量SPR机器来实现。

实施例6：筛选测定的结果预测“野生型格式”的选择性配对

“Fab配对设计”的LCCA结果(工作H1-L1加上H2-L2设计的组合)展示与在相应两个全长重链与两条独特轻链构建体(野生型格式)共表达时获得的结果的正相关。测试在“野生型格式”下的配对的测定如下使用在CH3区中具有突变的两条重链来执行，以使得所述重链多肽优先彼此异源二聚体化。

两个独特全长重链构建体与两条独特轻链构建体共表达，产生十个可能抗体物质：H1_L1:H1_L1、H1_L2:H1_L2、H1_L1:H1_L2、H2_L1:H2_L1、H2_L2:H2_L2、H2_L1:H2_L2、H1_L1:H2_L1、H1_L2:H2_L2、H1_L2:H2_L1和H1_L1:H2_L2。H1_L1:H2_L2物质是正确配对的异源二聚体。在优选物质H1_L1:H2_L2相比于其它物质的量方面的相对配对特异性在蛋白质A(pA)纯化之后使用LC-MS来确定。C终端LYS从重链移除来减少异质性和来自质谱法的混淆结果的风险。每当可能时，标签不包含在内；当混合物中的任何可能物质之间的质量差异低于50Da时，一个或两条轻链被设计成具有N终端HA标签融合和/或FLAG标签融合。重链(HC)保持于限制数量下(即HC<L1+L2)。

图14示出十七个“Fab配对设计”的LCCAFab1(即，HC1:LC1:LC2；x-轴)和Fab2(即，HC1:LC1:LC2；y轴)结果。在两个Fab臂上运作良好的设计(即，展示正确配对fab的较高百分比)可在绘图的顶部最右边象限中发现。执行不太有效的设计(例如，一个Fab臂未良好运作)在绘图的底部左侧示出。野生型格式的Fab配对设计的性能由数据点的着色来指示(参见图例)。正相关可明确发现；良好执行LCCAFab对设计较好转化至野生型格式(即，正确配对fab的百分比较高)。同样地，工作不佳的LCCAFab对设计在野生型格式下执行相对不佳。注意：混合LCCA结果从D3H44和培妥珠单抗的混合物获得。举例来说，Fab1LCCA为培妥珠单抗HC、培妥珠单抗LC1和D3H44LC2。

本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入一般。

Claims

1.一种量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，其包括以下步骤：

(a)共表达一组构建体，其包括：

包含VH和CH1区的第一重链多肽；

包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽；和

包含第二VL和第二CL区的第二轻链多肽；

其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得所述重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；

(b)将包含与所述第一或第二轻链多肽配对的所述重链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和

(c)在所述重链配对多肽产物中，与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的所述量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的所述量；

其中与所述另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的所述重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的所述重链多肽的选择性。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述重链多肽和第一和第二轻链多肽以约0.25:1:1的预定比率表达。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述重链多肽和第一和第二轻链多肽以约1:2:2的预定比率表达。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述重链多肽和第一和第二轻链多肽以约1:3:3的预定比率表达。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述共表达是在宿主细胞中。

6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述共表达是在体外非细胞表达系统中。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其还包括在表达之后将表达的多肽与所述表达培养基分离的步骤。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述多肽通过离心来分离。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述多肽通过使用纯化柱来分离。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中包括VH和CH1区的所述第一重链多肽还包括CH3区。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其还包括共表达第二重链多肽。

12.如权利要求10至11中任一项所述的方法，其中至少一个重链多肽包括CH2区或其片段。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其还包含以下步骤：

在不存在其它轻链多肽的情况下，在至少一个宿主细胞中表达所述重链多肽和所述第一和第二轻链多肽中的一个轻链多肽；

分离包含所述重链多肽和所述轻链多肽的重链配对多肽产物；和

定量所述产物的量，其中所述量充当所述重链多肽与所述轻链多肽的最大可检测结合的对照标准。

14.如权利要求13所述的方法，其中包含所述重链多肽和所述所需轻链多肽的产物提供所述阳性对照标准。

15.如权利要求13所述的方法，其中包含所述重链多肽和所述不太需要轻链多肽的产物提供所述阴性对照标准。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其还包括将任何未结合多肽从所述分离构建体中移除的步骤。

17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中至少一个轻链多肽包括可检测部分。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述可检测部分是蛋白质结合位点、配体结合位点或包含另一个可检测部分的标签。

19.如权利要求18所述的方法，其中每个轻链多肽用包含不同可检测部分的不同标签来标记。

20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中至少一个轻链多肽包含标签，所述标签能够捕获至包含相互作用表面层的表面上，并且通过设备来进一步检测并量化。

21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述重链多肽用标签来标记。

22.如权利要求21所述的方法，其中标记所述重链多肽的所述标签能够捕获至包含相互作用表面层的表面上，并且通过设备来进一步检测并量化。

23.如权利要求20和22中任一项所述的方法，其中所述设备能够检测并量化所述第一和第二轻链多肽中的至少一个轻链多肽上的可检测部分。

24.如权利要求20、22至23中任一项所述的方法，其中所述设备能够具有高通量。

25.如权利要求17至24中任一项所述的方法，其中可检测部分的所述检测包括通过ELISA、SPR芯片、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS)、荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)、或其组合来测量。

26.如权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述可检测部分的所述检测包括测量荧光、淬灭、放射性或化学发光。

27.一种用于确定在竞争重链或轻链多肽或其组合存在下含有Fab的构建体的选择性形成的方法，所述方法包括：

共表达：

包含VH和CH1区的第一重链多肽；和

包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽；

其中所述第一轻链多肽与所述重链多肽选择性缔合以形成所需Fab构建体；

一个或多个其它重链多肽、轻链多肽或其组合；

分离包含所述第一重链多肽或所述第一轻链多肽的每个Fab构建体；和

与其它Fab构建体相比，检测所需Fab构建体的所述量；

其中所需Fab构建体的较大量证实形成所述Fab构建体的较高选择性。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述第一重链多肽和所述轻链多肽用包含不同可检测部分的标签来标记。

29.一种用于确定合理设计Fab构建体在其它重链或轻链多肽存在下自动缔合的能力的方法，其包括如权利要求27至28中任一项所述的方法，其中所述第一重链多肽和所述第一轻链多肽缔合以形成所设计Fab构建体。

30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述共表达是在作为细菌细胞的宿主细胞中。

31.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述共表达是在作为酵母细胞的宿主细胞中。

32.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述共表达是在作为哺乳动物细胞的宿主细胞中。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是COS、CHO、BHK、HEK-293、NSO、3T3细胞及其衍生物中的至少一个。

34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其包括选自以下的至少一个所述重链和轻链多肽的至少一个标签：6xHis、FLAG、HA、c-myc、s-FLAG、SBP、V5和ABD。

35.如权利要求1至29中任一项所述的方法在选择Fab构建体以形成二互补位抗体构建体中的用途。

36.如权利要求30所述的用途，其中所述二互补位抗体构建体是双特异性抗体构建体。

37.如权利要求30所述的用途，其中所述二互补位抗体构建体结合同一抗原上的两个不同位点。

38.如权利要求1至34中任一项所述的用于设计异源多聚体抗体构建体的方法，其包括：

a)共表达：

包含第一免疫球蛋白重链区的第一重链多肽；

包含第一免疫球蛋白轻链可变区的第一轻链多肽，所述第一轻链多肽能够与所述第一重链多肽缔合以形成第一Fab构建体；和

包含第二免疫球蛋白轻链区的第二轻链多肽，其能够与包含第二免疫球蛋白重链区的第二重链多肽缔合以形成第二Fab构建体，其中所述第一和第二重链多肽包含变体CH3区，以使得所述重链多肽优先彼此异源二聚体化；

b)检测包含所述第一重链多肽和所述轻链多肽中的任何一个轻链多肽的所形成的Fab构建体的量；

c)在宿主细胞中表达：

所述第二重链多肽、第一轻链多肽和第二轻链多肽；

d)检测包含所述第二重链多肽和所述轻链多肽中的任何一个轻链多肽的所形成的Fab构建体的量；

其中与其它Fab构建体相比，步骤b)中的所述第一Fab构建体的较大量和步骤d)中的所述第二Fab构建体的较大量证实所述多肽可自动组装以形成所述异源多聚体抗体构建体。

39.一种用于高通量筛选多肽以设计异源多聚体抗体的方法，其包括：

a)获得：

包含第一免疫球蛋白重链可变区的第一重链多肽；

包含第一免疫球蛋白轻链可变区的第一轻链多肽，所述第一轻链多肽能够与所述第一重链多肽缔合以形成第一Fab构建体；

包含第二免疫球蛋白重链可变区的第二重链多肽，其中所述第一和第二重链多肽能够形成包含变体CH3可变区的异源多聚体；和

包含第二免疫球蛋白轻链可变区的第二轻链多肽，其能够与所述第二重链多肽缔合以形成第二Fab构建体；

b)在溶液中使所述第一重链多肽与所述第一和第二轻链多肽接触；

c)在来自步骤b)的所述溶液中检测包含所述第一重链多肽和所述轻链多肽中的任何一个轻链多肽的所形成的Fab构建体的量；

d)在另一溶液中使所述第二重链多肽与所述第一和第二轻链多肽接触；

e)在来自步骤d)的所述溶液中检测包含所述第二重链多肽和所述轻链多肽中的任何一个轻链多肽的所形成的Fab构建体的量；

其中与其它Fab构建体相比，步骤c)中的所述第一Fab构建体的较大量和步骤e)中的所述第二Fab构建体的较大量证实所述多肽可自动组装以形成异源多聚体抗体构建体。

40.如权利要求38至39中任一项所述的方法，其中每个轻链多肽和每个重链多肽用包含不同可检测部分的不同标签来标记。

41.如权利要求40所述的方法，其中每条重链标签能够由包含相互作用表面层的设备来捕获。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述设备能够定量识别每个轻链多肽上的所述标签。

43.如权利要求41至42中任一项所述的方法，其中所述设备能够具有高通量。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述可检测部分通过ELISA、SPR芯片、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS)、荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)、或其组合来测量而可量化地检测。

45.如权利要求40所述的方法，其中所述可检测部分通过测量荧光、淬灭、放射性或化学发光来可量化地检测。

46.一种确定与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，其包括以下步骤：

获得：

包含免疫球蛋白重链可变区的重链多肽；包含第一免疫球蛋白轻链可变区的第一轻链多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链可变区的至少一个第二轻链多肽；

在溶液中使所述重链多肽和所述轻链多肽以预先确定的比率接触以使得所述重链多肽的总量具有限制性；

分离包含与所述第一或第二轻链多肽配对的所述重链多肽的重链配对多肽产物；和

定量与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的所述量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的所述量；

47.一种用于高通量筛选重链多肽与轻链多肽的选择性配对的系统，其包括：

一种或多种宿主细胞或体外机制以表达：

重链多肽，所述重链多肽包含免疫球蛋白重链可变区和能够由包含相互作用表面层的设备捕获的标签；包含第一免疫球蛋白轻链可变区的第一轻链多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链可变区的至少一个第二轻链多肽；

其中以预先确定的比率表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得重链的量大于所述第一和第二轻链多肽的和；并且其中所述第一和第二轻链多肽用可检测部分加标签；和

检测设备，其包含能够捕获所述重链多肽的相互作用表面层，其中所述设备进一步能够检测每个所述轻链多肽上的可检测部分；

其中包含所述重链多肽和所述第一或第二轻链多肽的构建体由所述一种或多种宿主细胞来表达，并且与所述检测设备接触，并且

其中所述检测设备适用于检测包含所述重链多肽和第一轻链多肽的第一构建体的量，和包含所述重链多肽和第二轻链多肽的第二构建体的量，以使得与所述第二构建体相比，所述第一构建体的较大量证实与所述第二轻链多肽相比，所述重链多肽与所述第一轻链多肽配对的较高选择性。

48.如权利要求47所述的系统，其中所述系统还包括在与所述检测设备接触之前将所述构建体与所述一种或多种宿主细胞分离的机制。

49.如权利要求47至48中任一项所述的系统，其中所述重链多肽和第一和第二轻链多肽的所述预定比率为约0.25:1:1。

50.如权利要求47至48中任一项所述的系统，其中所述重链多肽和第一和第二轻链多肽的所述预定比率为约1:2:2。

51.如权利要求47至48中任一项所述的系统，其中所述重链多肽和第一和第二轻链多肽的所述预定比率为约1:3:3。

52.一种用于高通量筛选重链多肽与轻链多肽的选择性配对的试剂盒，其包括如权利要求47至52中任一项所述的系统，和使用说明书。

53.如权利要求52所述的试剂盒，其还包含试剂和缓冲剂。

54.如权利要求52所述的试剂盒，其还包含纯化所述重链和轻链多肽的机制。

55.如权利要求1所述的方法，其中(c)包括量化在捕获HC:LC1:LC2的表面检测到的HC:LC1:LC2之间的配对，其中所述方法包括ELISA、SPR芯片、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS)、荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)、或其组合；并且针对一个或多个所述单元与所述环境之间的相互作用来筛选所述表面。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述配对通过量化可检测部分来检测。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述可检测部分是蛋白质结合位点、配体结合位点或包含另一个可检测部分的标签。

58.如权利要求56或57所述的方法，其中所述可检测部分的检测包括测量荧光、淬灭、放射性或化学发光。

59.如权利要求55所述的方法，其中包含所述HC:LC1:LC2的环境是复杂分子混合物、细胞上清液、宿主细胞的细胞质或其组合。

60.如权利要求1所述的方法，其中具有具体轻链标签的抗体的质量通过分离重链部分的量来标准化。

61.如权利要求60所述的方法，其中评估对照抗体的当量质量比。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述两个质量比的所述比率等于具有特定标签的分离抗体的所述百分比。

63.如权利要求55至62中任一项所述的方法，其中将通过所述方法获得的数据传输至通用计算机并且其中所述数据的输出包括将所述结果存储在数据载体上。

64.如权利要求63所述的方法，其任选地包括分析HC-LC结果。

65.如权利要求64所述的方法，其还包括建立配对重链多肽和轻链多肽的LCCA文库。

66.一种量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，其包括以下步骤：

(a)共表达一组构建体，其包括：

包含VL和CL区的第一轻链多肽；

包含第一VH和第一CH1区的第一重链多肽；和

包含第二VH和第二CH1区的第二重链多肽；

其中表达所述轻链多肽和所述重链多肽以使得所述轻链多肽的所述总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；

(b)将包括与所述第一或第二重链多肽配对的所述轻链多肽的轻链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和

(c)在所述轻链配对多肽产物中，与所述第一重链多肽配对的轻链多肽的量，和与所述第二重链多肽配对的轻链多肽的量；

其中与另一个重链多肽相比，与所述第一或第二重链多肽中的一个重链多肽配对的所述轻链多肽的较大量指示与所述第一或第二重链多肽配对的所述轻链多肽的选择性。

67.如权利要求1所述的方法，其中所述第一或所述第二重链多肽还包括Fc区。

68.如权利要求1所述的方法，其中所述第一和所述第二重链多肽还包括Fc区。

69.如权利要求1所述的方法，其中所述第一或所述第二重链多肽包括Fc区和Fv区。

70.如权利要求1所述的方法，其中所述第一和所述第二重链多肽包括Fc区和Fv区。

71.如权利要求66所述的方法，其中所述第一或所述第二重链多肽还包括Fc区。

72.如权利要求66所述的方法，其中所述第一和所述第二重链多肽还包括Fc区。

73.如权利要求66所述的方法，其中所述第一或所述第二重链多肽包括Fc区和Fv区。

74.如权利要求66所述的方法，其中所述第一和所述第二重链多肽包括Fc区和Fv区。

75.一种量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，其包括以下步骤：

(a)共表达一组构建体，其包括：

包含VH、CH1、CH2和CH3区的第一重链多肽；

包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽；和

包含第二VL和第二CL区的第二轻链多肽；

76.一种量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，其包括以下步骤：

(a)共表达一组构建体，其包括：

包含VH、CH1、CH2和CH3区的全长重链多肽；

包含CH2区和CH3区的重链多肽；

包含第一VL和第一CL区的第一轻链多肽；和

包含第二VL和第二CL区的第二轻链多肽；

其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得所述全长重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；

(b)将重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离，所述重链配对多肽产物包括与包含CH2区和CH3区的所述重链多肽与所述第一或第二轻链多肽配对的所述全长重链多肽；和

(c)在所述重链配对多肽产物中，确定与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的量；

其中与另一个轻链多肽相比，与所述第一或第二轻链多肽中的一个轻链多肽配对的所述重链多肽的较大量指示与所述第一或第二轻链多肽配对的所述重链多肽的选择性。

77.如权利要求1所述的方法，其包括与L2与H配对的相对配对倾向相比，确定L1与H配对的相对配对倾向。

78.如权利要求77所述的方法，其还包括选择产生超过HL2物质的较高相对量HL1物质的配对多肽。

79.如权利要求78所述的方法，其包括根据以下计算来比较所述比率：

R = \frac{[H L 1]}{[H L 2]}

S = \log \frac{[H L 1]}{[H L 2]}

P 1 = 100 \cdot \frac{[H L 1]}{[H L 1] + [H L 2]}

P 2 = 100 \cdot \frac{[H L 2]}{[H L 1] + [H L 2]}

其中R是所述两种Fab物质的量的比率；S是R的对数，并且与L1和H配对以及L2和H配对之间的自由能差异成比例；并且P1和P2分别是所需和不需要物质的百分比，以使得

80.一种量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，其包括以下步骤：

(a)共表达一组构建体，其包括：

包含VH区、CH1区和第一可检测标记(标签)的重链多肽；

包含第一VL、第一CL区和第二可检测标记的第一轻链多肽；和

包含第二VL、第二CL区和第三可检测标记的第二轻链多肽；

(b)使用所述重链多肽上的所述第一可检测标记，将包含所述重链多肽与所述第一或第二轻链多肽的重链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和

81.如权利要求80所述的方法，其中所述第一可检测标记是6xHis标签。

82.如权利要求80所述的方法，其中所述第二可检测标记不同于所述第三可检测标记。

83.如权利要求80所述的方法，其中(c)的确定包括ELISA、SPR、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS)、荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)、或其组合。

84.如权利要求80所述的方法，其中所述可检测部分是蛋白质结合位点、配体结合位点或包含另一个可检测部分的标签。

85.如权利要求84所述的方法，其中所述可检测标记的检测包括测量荧光、淬灭、放射性或化学发光。

86.一种量化与重链多肽配对的轻链多肽的选择性的高通量方法，其包括以下步骤：

(a)共表达一组构建体，其包括：

包含VL区和CL区的轻链多肽；

包含第一VH、第一CH1区和至少一个可检测标记的第一重链多肽；和

包含第二VH、第二CH1区和至少一个可检测标记的第二重链多肽；

其中表达所述轻链多肽和所述重链多肽以使得所述轻链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；

(b)将包含所述轻链多肽与所述第一或第二重链多肽的轻链配对多肽产物与所述一组多肽产物分离；和

(c)在所述轻链配对多肽产物中，确定与所述第一重链多肽配对的轻链多肽的量，和与所述第二重链多肽配对的轻链多肽的量；

87.如权利要求86所述的方法，其中(c)的确定包括ELISA、SPR、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS)、荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)、或其组合。

88.如权利要求86所述的方法，其中所述第一重链多肽用两个标记来标记。

89.如权利要求86所述的方法，其中所述第一重链多肽用6xHis标签和第二标记来标记。

90.如权利要求86所述的方法，其中所述第二重链多肽用两个标记来标记。

91.如权利要求86所述的方法，其中第二重链多肽用6xHis标签和第二标记来标记。

92.如权利要求86所述的方法，其中所述可检测部分是蛋白质结合位点、配体结合位点或包含另一个可检测部分的标签。

93.如权利要求92所述的方法，其中所述可检测标记的检测包括测量荧光、淬灭、放射性或化学发光。

94.一种量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，其包括以下步骤：

(a)共表达一组构建体，其包括：

包含VH、CH1、CH2和CH3区的全长重链多肽；

包含CH2区和CH3区的重链多肽；

包含第一VL、第一CL区和第一可检测标记的第一轻链多肽；和

包含第二VL、第二CL区和第二可检测标记的第二轻链多肽；

(b)使用抗Fc抗体来分离重链配对多肽产物；和

95.如权利要求94所述的方法，其中(c)的确定包括ELISA、SPR、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS)、荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)、或其组合。

96.如权利要求94所述的方法，其中所述第一可检测标记不同于所述第二可检测标记。

97.如权利要求94所述的方法，其中所述可检测部分是蛋白质结合位点、配体结合位点或包含另一个可检测部分的标签。

98.如权利要求97所述的方法，其中所述可检测标记的检测包括测量荧光、淬灭、放射性或化学发光。

99.一种量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，其包括以下步骤：

(a)共表达一组构建体，其包括：

包含VH、CH1、CH2和CH3区的全长重链多肽；

包含第一VL、第一CL区和第一可检测标记的第一轻链多肽；和

包含第二VL、第二CL区和第二可检测标记的第二轻链多肽；

(b)使用抗Fc抗体来分离重链配对多肽产物；和

100.如权利要求99所述的方法，其中(c)的确定包括ELISA、SPR、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS)、荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)、或其组合。

101.如权利要求99所述的方法，其中所述第一可检测标记不同于所述第二可检测标记。

102.如权利要求99所述的方法，其中所述可检测部分是蛋白质结合位点、配体结合位点或包含另一个可检测部分的标签。

103.如权利要求102所述的方法，其中所述可检测标记的检测包括测量荧光、淬灭、放射性或化学发光。

104.一种量化与轻链多肽配对的重链多肽的选择性的高通量方法，其包括以下步骤：

(a)共表达一组构建体，其包括：

包含VH区、CH1区和可检测标记的第一重链多肽；

包含VH区、CH1区和可检测标记的第二重链多肽；

包含第一VL、第一CL区和可检测标记的第一轻链多肽；和

包含第二VL、第二CL区和可检测标记的第二轻链多肽；

其中表达所述重链多肽和所述轻链多肽以使得重链多肽的总量具有限制性；并且其中共表达所述一组构建体产生一组多肽产物；

(c)在所述重链配对多肽产物中，确定与所述第一轻链多肽配对的重链多肽的所述量，和与所述第二轻链多肽配对的重链多肽的所述量；

105.如权利要求104所述的方法，其中每个所述可检测标记是独特的。

106.如权利要求104所述的方法，其中(c)的确定包括ELISA、SPR、双分子荧光互补读出、荧光活化细胞分选(FACS)、荧光偏振/各向异性(FP)、荧光/Foerster共振能量转移(FRET、TR-FRET、HTRF)、或其组合。

107.如权利要求104所述的方法，其中所述可检测部分是蛋白质结合位点、配体结合位点或包含另一个可检测部分的标签。

108.如权利要求107所述的方法，其中所述可检测标记的检测包括测量荧光、淬灭、放射性或化学发光。

109.一种使重链多肽和轻链多肽的选择性配对可视化的方法，其包括：

在包含一个或多个处理器和存储由一个或多个处理器执行来执行所述方法的一个或多个程序的存储器的计算机系统上，所述方法包括：

(a)获得包括多个结合测定的竞争测定数据，所述多个结合测定中的每个相应结合测定包括在溶液中，将第一量的选自多个重链多肽构建体的一个或多个相应重链多肽暴露于第二量的选自多个轻链多肽构建体的一个或多个相应轻链多肽，在限制溶液中的所述相应一个或多个重链多肽或所述相应一个或多个轻链多肽的条件下进行，其中：

当所述相应一个或多个重链多肽具有限制性时，所述一个或多个重链多肽由单一重链多肽构建体组成并且所述一个或多个轻链多肽由多个轻链多肽构建体组成；并且

当所述相应一个或多个轻链多肽具有限制性时，所述一个或多个轻链多肽由单一轻链多肽构建体组成并且所述一个或多个重链多肽由多个重链多肽构建体组成；

(b)构建包含多个节点的图表，其中：

所述多个节点包括第一节点子集和第二节点子集；

所述第一节点子集中的每个相应节点以第一图形格式来展示并且独特地代表所述多个结合测定中的一个或多个结合测定中的一个或多个相应重链多肽；

所述第二节点子集中的每个相应节点以第二图形格式来展示并且独特地代表所述多个结合测定中的一个或多个结合测定中的一个或多个相应轻链多肽；

所述第一节点子集共同地代表在所述多个结合测定中使用的所有重链多肽；并且

所述第二节点子集共同地代表在所述多个结合测定中使用的所有轻链多肽；和

(c)用多个边缘来填充所述图表，其中：

所述多个边缘中的每个相应边缘代表所述多个结合测定中的相应结合测定并且将代表所述相应结合测定中的所述一个或多个重链多肽的所述第一节点子集中的第一节点连接至代表所述相应结合测定中的所述一个或多个轻链多肽的所述第二节点子集中的第二节点；并且

所述多个边缘中的每个边缘的第一图形样式指示是否所述相应结合测定中的所述限制多肽具有对于所述相应结合测定中的一个所述非限制性多肽的偏向。

110.如权利要求109所述的方法，其中所述多个边缘中的每个边缘的第二图形样式通过所述相应结合测定中的所述限制多肽具有对于所述相应结合测定中的一个所述非限制性多肽的偏向的量来确定。

111.如权利要求110所述的方法，其中所述第一图形样式是点线并且所述第二图形样式是线宽。

112.如权利要求111所述的方法，其中所述多个边缘中的一个边缘的所述线宽通过所述相应结合测定中的所述限制多肽具有对于所述相应结合测定中的一个所述非限制性多肽的偏向的量来确定，其中所述相应结合测定中的所述限制多肽具有对于所述相应结合测定中的一个所述非限制性多肽的偏向的量越大，所述边缘的所述线宽越大。

113.如权利要求109所述的方法，其中所述第一图形格式是第一二维闭型形状并且所述第二图形格式是除了所述第一二维闭型形状以外的第二二维闭型形状。

114.如权利要求109所述的方法，其中所述第一图形格式是第一二维地理形状并且所述第二图形格式是除了所述第一二维地理形状以外的第二二维地理形状。

115.如权利要求114所述的方法，其中所述第一二维地理形状或所述第二二维地理形状选自由以下组成的组：n角形，其中n是3或更大的整数，圆形，或椭圆形。

116.如权利要求109所述的方法，其中：

所述多个结合测定中的每个结合测定中的所述相应一个或多个重链多肽由包含VH区和CH1区的单一重链多肽构建体组成；并且

所述多个结合测定中的每个结合测定中的所述一个或多个轻链多肽由第一轻链多肽构建体和第二轻链多肽构建体组成，其中所述第一轻链多肽构建体由第一VL区和第一CL区组成，并且所述第二轻链多肽构建体包括第二VL区和第二CL区。

117.如权利要求116所述的方法，其中，

所述多个边缘中的每个边缘的线宽(W)通过所述相应结合测定中的所述单一重链多肽构建体具有对于所述第一轻链多肽构建体或所述第二轻链多肽构建体的偏向的量来确定，其中所述量由下式确定

W = | f (\frac{P 1}{P 2}) |

其中：

f是线性或非线性函数；

P1是与所述第一轻链多肽构建体配对的所述单一重链多肽构建体的量，其通过(i)与所述第一轻链多肽构建体配对的所述单一重链多肽构建体的量和(ii)与所述第二轻链多肽构建体配对的所述单一重链多肽构建体的量的组合来标准化；并且

P2是与所述第二轻链多肽构建体配对的所述单一重链多肽构建体的量，其通过(i)与所述第一轻链多肽构建体配对的所述单一重链多肽构建体的量和(ii)与所述第二轻链多肽构建体配对的所述单一重链多肽构建体的量的组合量来标准化。

118.如权利要求117所述的方法，其中f是对数函数。

119.如权利要求117所述的方法，其中：

当所述单一重链多肽构建体优选结合至所述第一轻链多肽构建体时，所述第一图形样式是实线；并且

当所述单一重链多肽构建体优选结合至所述第二轻链多肽构建体时，所述第一图形样式是虚线。

120.如权利要求109所述的方法，其中：

所述多个结合测定中的每个结合测定中的所述相应一个或多个重链多肽由包含第一VH和第一CH1区的第一重链多肽构建体以及包含第二VH和第二CH1区的第二重链多肽构建体组成，并且

所述多个结合测定中的每个结合测定中的所述一个或多个轻链多肽由轻链多肽构建体组成，其中所述轻链多肽构建体包括VL和CL区。

121.如权利要求120所述的方法，其中：

所述多个边缘中的每个边缘的线宽(W)通过所述相应结合测定中的所述单一轻链多肽构建体具有对于所述第一重链多肽构建体或所述第二重链多肽构建体的偏向的量来确定，其中所述量由下式确定：

W = | f (\frac{P 1}{P 2}) |

其中：

f是线性或非线性函数；

122.如权利要求121所述的方法，其中f是对数函数。

123.如权利要求121所述的方法，其中：

当所述单一轻链多肽构建体优选结合至所述第一重链多肽构建体时，所述第一图形样式是实线；并且

当所述单一轻链多肽构建体优选结合至所述第二重链多肽构建体时，所述第一图形样式是虚线。

124.如权利要求109所述的方法，其中：

所述多个结合测定中的每个结合测定中的所述相应一个或多个重链多肽由包含VH区、CH1区、CH2区和CH3区的单一重链多肽构建体组成；并且

所述多个结合测定中的每个结合测定中的所述一个或多个轻链多肽由第一轻链多肽构建体和第二轻链多肽构建体组成，其中所述第一轻链多肽构建体包括第一VL和第一CL区，并且第二轻链多肽构建体包括第二VL和第二CL区。

125.如权利要求124所述的方法，其中所述多个结合测定中的每个结合测定还包括所述溶液中的由CH2区和CH3区组成的额外分子实体。

126.如权利要求124所述的方法，其中所述多个边缘中的每个边缘的线宽(W)通过所述相应结合测定中的所述单一重链多肽构建体具有对于所述第一轻链多肽构建体或所述第二轻链多肽构建体的偏向的量来确定，其中所述量由下式确定：

W = | f (\frac{P 1}{P 2}) |

其中：

f是线性或非线性函数；

127.如权利要求126所述的方法，其中f是对数函数。

128.如权利要求124所述的方法，其中：

129.如权利要求109所述的方法，其中所述多个结合测定中的一个结合测定中的所述暴露通过共表达所述一个或多个相应重链多肽和所述一个或多个相应轻链多肽来执行。

130.如权利要求110或111所述的方法，其中所述第一图形样式是线颜色并且所述第二图形样式是线宽。

131.如权利要求110或111所述的方法，其中所述第一图形样式是线颜色与点线的组合并且所述第二图形样式是线宽。

132.一种用于使重链多肽与轻链多肽的选择性配对可视化的系统，其包括：

一个或多个处理器；和

存储器，所述存储器存储由所述一个或多个处理器执行的一个或多个程序；所述一个或多个程序包括用于执行以下步骤的指令：

当所述相应一个或多个重链多肽具有限制性时，所述一个或多个重链多肽由单一重链多肽构建体组成并且所述一个或多个轻链多肽由多个轻链多肽构建体组成，

当所述相应一个或多个轻链多肽具有限制性时，所述一个或多个轻链多肽由单一轻链多肽构建体组成并且所述一个或多个重链多肽由多个重链多肽构建体组成，

(b)构建包含多个节点的图表，其中：

所述多个节点包括第一节点子集和第二节点子集，

所述第一节点子集中的每个相应节点以第一图形格式来展示并且独特地代表所述多个结合测定中的一个或多个结合测定中的一个或多个相应重链多肽，

所述第二节点子集中的每个相应节点以第二图形格式来展示并且独特地代表所述多个结合测定中的一个或多个结合测定中的一个或多个相应轻链多肽，

所述第一节点子集共同地代表在所述多个结合测定中使用的所有重链多肽，

所述第二节点子集共同地代表在多个结合测定中使用的所有轻链多肽，

(c)用多个边缘来填充所述图表，其中：

所述多个边缘中的每个相应边缘代表所述多个结合测定中的相应结合测定并且将代表所述相应结合测定中的所述一个或多个重链多肽的所述第一节点子集中的第一节点连接至代表所述相应结合测定中的所述一个或多个轻链多肽的所述第二节点子集中的第二节点，并且

133.一种非暂时性计算机可读存储介质，其存储一个或多个计算机程序供计算机系统执行以使重链多肽与轻链多肽的选择性配对可视化，所述一个或多个计算机程序包含用于执行以下步骤的指令：

(b)构建包含多个节点的图表，其中：

所述多个节点包括第一节点子集和第二节点子集，

所述第一节点子集共同地代表在所述多个结合测定中使用的所有重链多肽，并且

(c)用多个边缘来填充所述图表，其中：

134.根据权利要求1所述的方法，其中与所述第一或第二轻链多肽配对的所述重链多肽的选择性通过根据权利要求109至133中任一项所述的方法来可视化。