JP2015533089A - 重鎖および軽鎖ポリペプチドの対を定量化する方法 - Google Patents

重鎖および軽鎖ポリペプチドの対を定量化する方法 Download PDF

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Abstract

ＩｇＧ重鎖および２つの固有ＩｇＧ軽鎖が同時発現する場合に個別のＩｇＧ重鎖が特定のＩｇＧ軽鎖と選択的に対合する能力を定量的に決定する方法が、提供される。本方法は、妥当なスループットにより結果を提供し、堅固で正確である。同時発現した重鎖および軽鎖は、単離や精製される必要がなく、これによって、より効率的なスクリーニングが可能になる。

Description

相互参照
本出願は、本明細書に参照によってその全体があらゆる目的のために組み込まれる、２０１２年１０月０３日に出願された米国仮出願第６１／７４４，９１１号の利益を主張する。
重鎖および軽鎖の同時発現の生成物を同定し、定量化する方法は、以前に記載されている。例えば、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）およびイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）が、二重特異性抗体構築物の純度を特徴付けるために使用されている（例えば、Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４−２１９（非特許文献1）を参照されたい）。活性に基づくサンドイッチＥＬＩＳＡもまた、良好な純度を有する高収率の二重特異性抗体を分泌する安定した細胞系統を選択するためのハイスループットスクリーニングとして使用されている。（例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈｏｎｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ３１７：１５５４−１５５７（非特許文献2）を参照されたい）。酵母を使用して抗体を提示する方法もまた、記載されている（例えば、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（２）：７５５−６８（非特許文献3）を参照されたい）。例えば、親和性クロマトグラフィーを使用して抗体を単離する、または精製する方法は、当該技術分野において既知であり、親和性精製カラムは商業的に入手可能である。
定量的免疫グロブリン重鎖／軽鎖イムノアッセイ、Ｈｅｖｙｌｉｔｅ（登録商標）（ＨＬＣ，Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）は、商業的に入手可能であり、ＩｇＧκ／ＩｇＧλ対を測定するステップを含む。このアッセイは、例えば、多発性骨髄腫などの疾患を有する患者におけるモノクローナル免疫グロブリンを定量化するために使用される。
Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４−２１９ ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈｏｎｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ３１７：１５５４−１５５７ Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（２）：７５５−６８
（野生型ＩｇＧに近い形式の）二重特異性ＩｇＧは、２つの固有抗体重鎖および２つの固有抗体軽鎖の細胞内随伴性発現によって典型的に形成される。抗体重鎖は、抗体軽鎖を比較的無差別な方法で結合するように発展しているため、この型の二重特異性形式を正確に形成することは、困難である。結果として、２つの固有抗体重鎖および２つの固有抗体軽鎖が同時発現する場合、複数の抗体分子が生成し、所望の二重特異性抗体は典型的に少量で形成される。この問題を回避する１つの方法は、所望の二重特異性抗体を形成するように選択的に対合する抗体重鎖および抗体軽鎖を使用することであろう。したがって、互いを選択的に対合するＩｇＧ重鎖およびＩｇＧ軽鎖の同定を可能にするスクリーニングアッセイに対する必要性が存在する。
特定の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）重鎖が、特定の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）軽鎖に選択的に結合するかどうかを決定するために有用な、アッセイおよび分析ツールが提供される。
少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性のハイスループットの定量化のための方法、アッセイ、システム、およびキットが、本明細書で提供される。競合重鎖または軽鎖ポリペプチド、またはこれらの組み合わせの存在下での、Ｆａｂ含有構築物の選択的形成を決定するための方法、システム、およびキットもまた提供される。本明細書に記載されるアッセイを使用して二パラトープ抗体構築物を設計する、または製造する方法もまた提供される。抗体ヘテロ二量体形成を決定する方法もまた提供される。
少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法が提供され、本方法は、（ａ）ＶＨおよびＣＨ１領域を含む第１の重鎖ポリペプチド、第１のＶＬおよび第１のＣＬ領域を含む第１の軽鎖ポリペプチド、ならびに第２のＶＬおよび第２のＣＬ領域を含む第２の軽鎖ポリペプチド、の一連の構築物を同時発現させるステップであって、該重鎖ポリペプチドおよび該軽鎖ポリペプチドが、重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、（ｂ）該第１または第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を、一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、（ｃ）重鎖対合ポリペプチド生成物において、該第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および該第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を定量化するステップと、を含み、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を示す。
そのような方法の一実施形態において、第１または第２の重鎖ポリペプチドは、Ｆｃ領域を更に含む。そのような方法の別の実施形態において、第１および第２の重鎖ポリペプチドは、Ｆｃ領域を更に含む。そのような方法の更に別の実施形態において、第１または第２の重鎖ポリペプチドは、Ｆｃおよび領域およびＦｖ領域を含む。そのような方法の更に別の実施形態において、第１および第２の重鎖ポリペプチドは、Ｆｃ領域およびＦｖ領域を含む。
この工程は、少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドを、少なくとも１つの第１の重鎖ポリペプチドおよび１つの第２の重鎖ポリペプチドと対合するために実施され得ることが理解されるであろう。
本方法の一実施形態において、ステップ（ｃ）は、ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２を捕捉する表面上に検出されるＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２間の対合を定量化することを含み、本方法は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲチップ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせなどの捕捉および検出方法、ならびに該ユニットのうちの１つ以上と該環境との間の相互作用について該表面をスクリーニングすることを含む。
軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法が、本明細書で提供され、本方法は、（ａ）ＶＬおよびＣＬ領域を含む第１の軽鎖ポリペプチド、第１のＶＨおよび第１のＣＨ１領域を含む第１の重鎖ポリペプチド、ならびに第２のＶＨおよび第２のＣＨ１領域を含む第２の重鎖ポリペプチド、を含む一連の構築物を同時発現させるステップであって、該軽鎖ポリペプチドおよび該重鎖ポリペプチドが、軽鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、（ｂ）該第１または第２の重鎖ポリペプチドと対合した軽鎖ポリペプチドを含む軽鎖対合ポリペプチド生成物を、一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、（ｃ）軽鎖対合ポリペプチド生成物において、該第１の重鎖ポリペプチドと対合した軽鎖ポリペプチドの量、および該第２の重鎖ポリペプチドと対合した軽鎖ポリペプチドの量のステップと、を含み、該第１または第２の重鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した軽鎖ポリペプチドの、他方の重鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、該第１または第２の重鎖ポリペプチドとの対合についての軽鎖ポリペプチドの選択性を示す。
そのような方法の一実施形態において、第１または第２の重鎖ポリペプチドは、Ｆｃ領域を更に含む。そのような方法の別の実施形態において、第１および第２の重鎖ポリペプチドは、Ｆｃ領域を更に含む。そのような方法の別の実施形態において、第１または第２の重鎖ポリペプチドは、Ｆｃ領域およびＦｖ領域を含む。そのような方法の更に別の実施形態において、第１および第２の重鎖ポリペプチドは、Ｆｃ領域およびＦｖ領域を含む。
軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法が、本明細書で提供され、本方法は、（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む第１の重鎖ポリペプチド、第１のＶＬおよび第１のＣＬ領域を含む第１の軽鎖ポリペプチド、ならびに第２のＶＬおよび第２のＣＬ領域を含む第２の軽鎖ポリペプチド、を含む一連の構築物を同時発現させるステップであって、該重鎖ポリペプチドおよび該軽鎖ポリペプチドが、重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、（ｂ）該第１または第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を、一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、（ｃ）重鎖対合ポリペプチド生成物において、該第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および該第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量のステップと、を含み、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を示す。
軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法が、本明細書で提供され、本方法は、（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む完全長の重鎖ポリペプチド、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む重鎖ポリペプチド、第１のＶＬおよび第１のＣＬ領域を含む第１の軽鎖ポリペプチド、ならびに第２のＶＬおよび第２のＣＬ領域を含む第２の軽鎖ポリペプチド、を含む一連の構築物を同時発現させるステップであって、該重鎖ポリペプチドおよび該軽鎖ポリペプチドが、完全長の重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、（ｂ）該第１または第２の軽鎖ポリペプチドを有する、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む重鎖ポリペプチドと対合した完全長の重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を、一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、（ｃ）重鎖対合ポリペプチド生成物において、該第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および該第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量のステップと、を含み、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を示す。
対合は、検出可能な部分を定量化することによって検出され得る。検出可能な部分は、例えば、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または更なる検出可能な部分を含むタグであり得る。検出可能な部分の検出は、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含み得る。一実施形態において、ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２を含む環境は、複合分子混合物、細胞上清、宿主細胞の細胞質、またはこれらの組み合わせである。特定の軽鎖タグを有する抗体の質量は、単離された重鎖画分の量によって正規化され得る。等価質量比は、対照抗体に対して評価され得る。２つの質量比の比率は、特定のタグを有する単離された抗体の百分率に等しい。
開示される方法の一実施形態において、本方法は、Ｈと対合するＬ１の相対対合傾向を、Ｈと対合するＬ２の相対対合傾向と比較して決定するステップを含む。
本方法は、ＨＬ２種よりも高いＨＬ１種の相対量を生成する対合したポリペプチドを選択するステップを更に含み得る。比率を比較するステップは、以下の計算式に従って達成され得る：
Figure 2015533089
式中、Ｒは、２つのＦａｂ種の量の比率であり、ＳはＲの対数であって、Ｌ１のＨとの対合とＬ２のＨとの対合の間の自由エネルギー差に比例し、Ｐ１およびＰ２は、
Figure 2015533089
であるような、それぞれ所望のおよび不所望の種の百分率である。
別の態様において、軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法が、本明細書で提供され、本方法は、（ａ）ＶＨ領域、ＣＨ１領域、および第１の検出可能な標識（タグ）を含む重鎖ポリペプチド、第１のＶＬ、第１のＣＬ領域、および第２の検出可能な標識を含む第１の軽鎖ポリペプチド、ならびに第２のＶＬ、第２のＣＬ領域、および第３の検出可能な標識を含む第２の軽鎖ポリペプチド、を含む一連の構築物を同時発現させるステップであって、該重鎖ポリペプチドおよび該軽鎖ポリペプチドが、完全長の重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、（ｂ）該第１または第２の軽鎖ポリペプチドを有する重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を、一連のポリペプチド生成物から、重鎖ポリペプチド上の第１の検出可能な標識を使用して単離するステップと、（ｃ）重鎖対合ポリペプチド生成物において、該第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および該第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を決定するステップと、を含み、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を示す。
一実施形態において、第１の検出可能な標識は、６×Ｈｉｓタグである。別の実施形態において、第２の検出可能な標識は、該第３の検出可能な標識とは異なる。
決定は、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせを含み得る。
検出可能な標識は、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または更なる検出可能な部分を含むタグであり得る。検出可能な標識の検出は、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含み得る。
別の態様において、重鎖ポリペプチドとの対合についての軽鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法が、本明細書で提供され、本方法は、（ａ）ＶＬ領域およびＣＬ領域を含む軽鎖ポリペプチド、第１のＶＨ、第１のＣＨ１領域、および少なくとも１つの検出可能な標識を含む第１の重鎖ポリペプチド、ならびに第２のＶＨ、第２のＣＨ１領域、および少なくとも１つの検出可能な標識を含む第２の重鎖ポリペプチド、を含む一連の構築物を同時発現させるステップであって、該軽鎖ポリペプチドおよび該重鎖ポリペプチドが、軽鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、（ｂ）該第１または第２の重鎖ポリペプチドを有する軽鎖ポリペプチドを含む軽鎖対合ポリペプチド生成物を、一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、（ｃ）軽鎖対合ポリペプチド生成物において、該第１の重鎖ポリペプチドと対合した軽鎖ポリペプチドの量、および該第２の重鎖ポリペプチドと対合した軽鎖ポリペプチドの量を決定するステップと、を含み、該第１または第２の重鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した軽鎖ポリペプチドの、他方の重鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、該第１または第２の重鎖ポリペプチドとの対合についての軽鎖ポリペプチドの選択性を示す。
決定は、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせを含み得る。
一実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドは、２つの標識で標識されている。
別の実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドは、６×Ｈｉｓタグおよび第２の標識で標識されている。
別の実施形態において、第２の重鎖ポリペプチドは、２つの標識で標識されている。
別の実施形態において、第２の重鎖ポリペプチドは、６×Ｈｉｓタグおよび第２の標識で標識されている。
検出可能な標識は、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または更なる検出可能な部分を含むタグであり得る。検出可能な標識の検出は、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含み得る。
別の態様において、軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法が、本明細書で提供され、本方法は、（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む完全長の重鎖ポリペプチド、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む重鎖ポリペプチド、第１のＶＬ、第１のＣＬ領域、および第１の検出可能な標識を含む第１の軽鎖ポリペプチド、ならびに第２のＶＬ、第２のＣＬ領域、および第２の検出可能な標識を含む第２の軽鎖ポリペプチド、を含む一連の構築物を同時発現させるステップであって、該重鎖ポリペプチドおよび該軽鎖ポリペプチドが、完全長の重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、（ｂ）抗Ｆｃ抗体を有する重鎖対合ポリペプチド生成物を単離するステップと、（ｃ）重鎖対合ポリペプチド生成物において、該第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および該第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を決定するステップと、を含み、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を示す。
決定は、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせを含み得る。
一実施形態において、第１の検出可能な標識は、第２の検出可能な標識とは異なる。
検出可能な標識は、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または更なる検出可能な部分を含むタグであり得る。検出可能な標識の検出は、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含み得る。
別の態様において、軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法が、本明細書で提供され、本方法は、（ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む完全長の重鎖ポリペプチド、第１のＶＬ、第１のＣＬ領域、および第１の検出可能な標識を含む第１の軽鎖ポリペプチド、ならびに第２のＶＬ、第２のＣＬ領域、および第２の検出可能な標識を含む第２の軽鎖ポリペプチド、を含む一連の構築物を同時発現させるステップであって、該重鎖ポリペプチドおよび該軽鎖ポリペプチドが、完全長の重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、（ｂ）抗Ｆｃ抗体を有する重鎖対合ポリペプチド生成物を単離するステップと、（ｃ）重鎖対合ポリペプチド生成物において、該第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および該第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を決定するステップと、を含み、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を示す。
決定は、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせを含み得る。
一実施形態において、第１の検出可能な標識は、第２の検出可能な標識とは異なる。
検出可能な標識は、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または更なる検出可能な部分を含むタグであり得る。検出可能な標識の検出は、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含み得る。
別の態様において、軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法が、本明細書で提供され、本方法は、（ａ）ＶＨ領域、ＣＨ１領域、および検出可能な標識を含む第１の重鎖ポリペプチド、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、および検出可能な標識を含む第２の重鎖ポリペプチド、第１のＶＬ、第１のＣＬ領域、および検出可能な標識を含む第１の軽鎖ポリペプチド、ならびに第２のＶＬ、第２のＣＬ領域、および検出可能な標識を含む第２の軽鎖ポリペプチド、を含む一連の構築物を同時発現させるステップであって、該重鎖ポリペプチドおよび該軽鎖ポリペプチドが、重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、（ｂ）該第１または第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を、一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、（ｃ）重鎖対合ポリペプチド生成物において、該第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および該第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を決定するステップと、を含み、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を示す。
一実施形態において、該検出可能な標識のうちのそれぞれは固有である。
決定は、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせを含み得る。
検出可能な標識は、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または更なる検出可能な部分を含むタグであり得る。検出可能な標識の検出は、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含み得る。
本方法によって取得されたデータは、汎用コンピュータに送信されてもよく、データの出力は、結果をデータ記憶媒体上に記憶することを含む。
本方法は、いくつかの例において、ＨＣ−ＬＣ結果を分析するステップを任意に含み得る。あるいは、または加えて、本方法は、対合した重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドのＬＣＣＡライブラリを構築するステップを更に含み得る。
記載される方法のうちのいずれかの特定の実施形態において、重鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドは、約０．２５：１：１の所定の比率で発現する。選択された実施形態において、重鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドは、約１：２：２の所定の比率で発現する。いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドは、約１：３：３の所定の比率で発現する。特定の他の実施形態において、第１および第２の軽鎖は、異なる相対量で発現する。例えば、いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドは、約２：１：３、または約２：３：１の所定の比率で発現する。一実施形態において、重鎖ポリペプチド（ＨＣ）対第１の軽鎖ポリペプチド（ＬＣ１）および第２の軽鎖ポリペプチド（ＬＣ２）の遺伝子移入の比率、すなわち、ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２は、いくつかの例において、ＬＣ１およびＬＣ２が等しく発現するかどうかを決定するために、３：１：１である。他の比率が使用されてもよく、本明細書で意図されることが、理解されるであろう。非限定的な一例において、ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２のＬＣＣＡ用量検証比率は、（５０：７５：２５、５０：５０：５０、および５０：２５：７５）または（５０：４０：６０、５０：５０：５０、および５０：６０：４０）であり得る。
記載される方法のうちのいずれかの特定の実施形態において、軽鎖ポリペプチド、第１および第２の重鎖ポリペプチドは、約０．２５：１：１の所定の比率で発現する。選択された実施形態において、軽鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の重鎖ポリペプチドは、約１：２：２の所定の比率で発現する。いくつかの実施形態において、軽鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の重鎖ポリペプチドは、約１：３：３の所定の比率で発現する。特定の他の実施形態において、第１および第２の重鎖は、異なる相対量で発現する。例えば、いくつかの実施形態において、軽鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の重鎖ポリペプチドは、約２：１：３、または約２：３：１の所定の比率で発現する。一実施形態において、軽鎖ポリペプチド（ＬＣ）対第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣ１）および第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣ２）の遺伝子移入の比率、すなわち、ＬＣ：ＨＣ１：ＨＣ２は、いくつかの例において、ＨＣ１およびＨＣ２が等しく発現するかどうかを決定するために、３：１：１である。他の比率が使用されてもよく、本明細書で意図されることが、理解されるであろう。非限定的な例において、ＬＣ：ＨＣ１：ＨＣ２のＬＣＣＡ用量検証比率は、（５０：７５：２５、５０：５０：５０、および５０：２５：７５）または（５０：４０：６０、５０：５０：５０、および５０：６０：４０）であり得る。
特定の実施形態において、同時発現は、宿主細胞内においてである。いくつかの実施形態において、同時発現は、インビトロ無細胞発現系内にある。
実施形態において、本明細書で提供される方法は、発現後に、発現したポリペプチドを発現培地から分離するステップを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、遠心分離によって分離される。いくつかの更なる実施形態において、ポリペプチドは、精製カラムの使用によって分離される。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、ＶＨおよびＣＨ１領域を含む第１の重鎖ポリペプチドは、ＣＨ３領域を更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＣＨ３領域を含む第２の重鎖ポリペプチドの同時発現を更に含む。特定の実施形態において、少なくとも１つの重鎖ポリペプチドは、ＣＨ２領域またはその断片を含む。
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、定量的対照標準の使用を更に含む。一実施形態において、本方法は、該重鎖ポリペプチド、ならびに該第１および第２の軽鎖ポリペプチドのうちの１つを、少なくとも１つの宿主細胞内またはインビトロ系内で、他の軽鎖ポリペプチドの不在下で発現させるステップと、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を単離するステップと、該生成物の量を定量化するステップであって、該量が、該重鎖ポリペプチドの該軽鎖ポリペプチドとの最大の検出可能な結合のための対照標準としての役割を果たす、ステップと、を含む。いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチドおよび所望の軽鎖ポリペプチドを含む生成物は、陽性対照標準を提供する。実施形態において、重鎖ポリペプチドおよびあまり所望でない軽鎖ポリペプチドを含む生成物は、陰性対照標準を提供する。
本明細書に記載される方法はまた、いくつかの例において、全ての未結合のポリペプチドを、単離された構築物を含む混合物から除去するステップを含み得る。
少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化する方法が提供され、少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドは、検出可能な部分を含む。検出可能な部分は、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または更なる検出可能な部分を含むタグであり得る。特定の実施形態において、各軽鎖ポリペプチドは、異なる検出可能な部分を含む異なるタグで標識されている。いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチドは、タグで標識されている。一実施形態において、重鎖ポリペプチドを標識しているタグは、相互作用表面層を含む表面上に捕捉されかつ更に装置によって検出および定量化されることができる。装置は、該第１および第２の軽鎖ポリペプチドのうちの少なくとも１つ上の検出可能な部分を検出し、定量化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、装置は、ハイスループットが可能である。検出可能な部分の検出は、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲチップ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせを含むが、これに限定されない、標識を検出する任意の従来の手段を使用する測定を含み得る。いくつかの実施形態において、検出可能な部分の検出は、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含む。
競合重鎖または軽鎖ポリペプチドまたはこれらの組み合わせの存在下での、Ｆａｂ含有構築物の選択的形成を決定するための方法が、特定の実施形態において提供され、本方法は、ＶＨおよびＣＨ１領域を含む第１の重鎖ポリペプチド、第１のＶＬおよび第１のＣＬ領域を含む第１の軽鎖ポリペプチド、ならびに１つ以上の他の重鎖ポリペプチド、軽鎖ポリペプチド、またはこれらの組み合わせの一連の構築物を、インビトロまたは宿主細胞内で同時発現させるステップであって、該第１の軽鎖ポリペプチドが該重鎖ポリペプチドと選択的に結合して、所望のＦａｂ構築物を形成する、ステップと、該第１の重鎖ポリペプチドまたは第１の軽鎖ポリペプチドを含む各Ｆａｂ構築物を単離するステップと、所望のＦａｂ構築物の量を、他のＦａｂ構築物と比較して検出するステップであって、所望のＦａｂ構築物のより多い量が、該Ｆａｂ構築物のより高い選択性を示す、ステップと、を含む。いくつかの場合、第１の重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、異なる検出可能な部分を含むタグで標識されている。
合理的に設計されたＦａｂ構築物の、他の重鎖または軽鎖ポリペプチドの存在下で自己結合する能力を決定するための方法が提供され、本方法は、本明細書に記載される少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化する方法を含み、該第１の重鎖ポリペプチドおよび該第１の軽鎖ポリペプチドが結合して、設計されたＦａｂ構築物を形成する。
少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化する方法が提供され、該ポリペプチドは宿主細胞内で同時発現する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は細菌細胞である。一実施形態において、宿主細胞は酵母細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ−２９３、ＮＳＯ、３Ｔ３細胞、およびこれらの派生物のうちの少なくとも１つである。
少なくとも１つの重鎖または軽鎖ポリペプチドが、６×Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｃ−ｍｙｃ、ｓ−ＦＬＡＧ、ＳＢＰ、Ｖ５、およびＡＢＤから選択される少なくとも１つのタグを含む、本明細書に記載される方法が提供される。
ヘテロ多量体抗体構築物を設計する方法が提供され、本方法は、（ａ）第１の免疫グロブリン重鎖領域を含む第１の重鎖ポリペプチド、および第１の免疫グロブリン軽鎖領域を含む第１の軽鎖ポリペプチドの、一連の構築物を、インビトロまたは宿主細胞内で同時発現させるステップであって、該第１の軽鎖ポリペプチドが、該第１の重鎖ポリペプチドと結合して第１のＦａｂ構築物を形成することができ、第２の免疫グロブリン軽鎖領域を含む第２の軽鎖ポリペプチドが、第２の免疫グロブリン重鎖領域を含む第２の重鎖ポリペプチドと結合して第２のＦａｂ構築物を形成することができ、該第１および第２の重鎖ポリペプチドが、変異ＣＨ３領域を含むヘテロ多量体を形成することができる、ステップと、（ｂ）該第１の重鎖ポリペプチドおよびいずれか１つの該軽鎖ポリペプチドを含む、形成されたＦａｂ構築物の量を検出するステップと、（ｃ）該第２の重鎖ポリペプチド、第１の軽鎖ポリペプチド、および第２の軽鎖ポリペプチドを、宿主細胞内で発現させるステップと、（ｄ）該第２の重鎖ポリペプチドおよびいずれか１つの該軽鎖ポリペプチドを含む、形成されたＦａｂ構築物の量を検出するステップと、を含み、他のＦａｂ構築物と比較した、ステップ（ｂ）における第１のＦａｂ構築物のより多い量、およびステップ（ｄ）における第２のＦａｂ構築物のより多い量が、ポリペプチドが自己集合してヘテロ多量体抗体構築物を形成し得ることを示す。
ヘテロ多量体抗体を設計するための、ポリペプチドのハイスループットスクリーニングの方法が提供され、本方法は、（ａ）第１の免疫グロブリン重鎖領域を含む第１の重鎖ポリペプチド、第１の免疫グロブリン軽鎖領域を含む第１の軽鎖ポリペプチド、および第２の免疫グロブリン重鎖領域を含む第２の重鎖ポリペプチドを取得するステップであって、該第１の軽鎖ポリペプチドが、該第１の重鎖ポリペプチドと結合して第１のＦａｂ構築物を形成することができ、該第１および第２の重鎖ポリペプチドが、変異ＣＨ３領域を含むヘテロ多量体を形成することができ、第２の免疫グロブリン軽鎖領域を含む第２の軽鎖ポリペプチドが、該第２の重鎖ポリペプチドと結合して第２のＦａｂ構築物を形成することができる、ステップと、（ｂ）溶液中で、該第１の重鎖ポリペプチドを、該第１および第２の軽鎖ポリペプチドと接触させるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の溶液中で、該第１の重鎖ポリペプチドおよびいずれか１つの該軽鎖ポリペプチドを含んで形成されたＦａｂ構築物の量を検出するステップと、（ｄ）別の溶液中で、該第２の重鎖ポリペプチドを、該第１および第２の軽鎖ポリペプチドと接触させるステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）の溶液中で、該第２の重鎖ポリペプチドおよびいずれか１つの該軽鎖ポリペプチドを含んで形成されたＦａｂ構築物の量を検出するステップと、を含み、他のＦａｂ構築物と比較した、ステップ（ｃ）における第１のＦａｂ構築物のより多い量、およびステップ（ｅ）における第２のＦａｂ構築物のより多い量が、ポリペプチドが自己集合してヘテロ多量体抗体構築物を形成し得ることを示す。
特定の実施形態において、各軽鎖ポリペプチドおよび各重鎖ポリペプチドは、異なる検出可能な部分を含む異なるタグで標識されている。いくつかの実施形態において、各重鎖タグは、相互作用表面層を含む装置によって捕捉されることができる。いくつかの実施形態において、装置は、各軽鎖ポリペプチド上のタグを定量的に認識することができる。特定の実施形態において、装置は、ハイスループットが可能である。一実施形態において、検出可能な部分は、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲチップ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせによる測定によって、定量化可能に検出される。検出可能な部分は、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定によって、定量化可能に検出され得る。
少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を決定するハイスループット法が提供され、本方法は、免疫グロブリン重鎖領域を含む重鎖ポリペプチド、第１の免疫グロブリン軽鎖領域を含む第１の軽鎖ポリペプチド、および第２の免疫グロブリン軽鎖領域を含む少なくとも１つの第２の軽鎖ポリペプチドを取得するステップと、溶液中で、該重鎖ポリペプチドおよび該軽鎖ポリペプチドを、重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように、所定の比率で接触させるステップと、第１または第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を単離するステップと、該第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および該第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を定量化するステップと、を含み、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの１つと対合した重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を示す。
重鎖ポリペプチドの少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドとの選択的対合の、ハイスループットスクリーニングのためのシステムが提供され、本システムは、免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）領域、および相互作用表面層を含む装置によって捕捉されることができるタグを含む、重鎖ポリペプチドと、第１の免疫グロブリン軽鎖領域を含む第１の軽鎖ポリペプチド（Ｌ１）と、第２の免疫グロブリン軽鎖領域を含む少なくとも１つの第２の軽鎖（Ｌ２）ポリペプチドと、を発現させるための、１つ以上の宿主細胞またはインビトロ機構であって、該重鎖ポリペプチドおよび該軽鎖ポリペプチドが、ＨＣ＜（Ｌ１＋Ｌ２）であるように、所定の比率で発現し、該第１および第２の軽鎖ポリペプチドが、検出可能な部分でタグ付けされる、宿主細胞またはインビトロ機構と、該重鎖ポリペプチドを捕捉することができる相互作用表面層を含む検出装置であって、該検出装置が各該軽鎖ポリペプチド上の検出可能な部分を検出することが更に可能であり、重鎖ポリペプチドおよび該第１または第２の軽鎖ポリペプチドを含む構築物が、該１つ以上の宿主細胞によって発現し、かつ該検出装置と接触し、該検出装置が、重鎖ポリペプチドおよび第１の軽鎖ポリペプチドを含む第１の構築物の量と、重鎖ポリペプチドおよび第２の軽鎖ポリペプチドを含む第２の構築物の量とを、第２の構築物と比較してより多い第１の構築物の量が、第２の軽鎖ポリペプチドと比較してより高い第１の軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を示すように検出するために有用である、検出装置と、を含む。
いくつかの実施形態において、システムは、該検出装置と接触させる前に、該構築物を該１つ以上の宿主細胞から単離するための機構を更に含む。一実施形態において、該重鎖ポリペプチドならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドの所定の比率は、約０．２５：１：１である。一実施形態において、該重鎖ポリペプチドならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドの所定の比率は、約０．５：１：１である。いくつかの実施形態において、該重鎖ポリペプチドならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドの所定の比率は、約１：２：２である。特定の実施形態において、該重鎖ポリペプチドならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドの所定の比率は、約１：３：３である。特定の他の実施形態において、第１および第２の軽鎖は、異なる相対量で発現する。例えば、いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドは、約２：１：３、または約２：３：１の所定の比率で発現する。
本明細書に記載されるシステム、および使用説明書を含む、ヘテロ多量体抗体のハイスループット設計のためのキットが提供される。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上のバイアル、チューブ、容器、試薬、および／または緩衝剤を更に含む。特定の実施形態において、キットは、重鎖および軽鎖ポリペプチドを精製するための手段を更に含む。ポリペプチドを単離する、または精製するための手段は、当該技術分野において既知であり、以下に記載される。
発明の一態様において、以下のステップを含む、同時発現アッセイにおいて少なくとも１つの変更された重鎖が特定の変更された軽鎖に選択的に対合する能力を決定する方法が提供される：ａ．少なくとも１つの変更された重鎖および２つの異なる変更された軽鎖を、細胞内で、変更された重鎖が限定的な対合反応体となるような比率で同時発現させるステップであって、同時発現したタンパク質が、細胞から分泌される、ステップと、ｂ．同時発現した分泌されたタンパク質を、細胞から任意で分離するステップと、ｃ．変更された重鎖に結合する軽鎖ポリペプチドを、残りの分泌されたタンパク質から分離して、単離された重鎖対合画分を生成するステップと、ｄ．単離された重鎖画分中の、各異なる変更された軽鎖の量を検出するステップと、ｅ．単離された重鎖画分中の、各異なる変更された軽鎖の相対量を分析して、少なくとも１つの重鎖が、軽鎖のうちの１つと選択的に対合する能力を決定するステップ。
変異体を評価するためのアッセイ必要条件の流れ図を提供する。 軽鎖タグ付けされた群のＳＰＲ読み取りを使用する、アッセイの重要なステップの概略的記載を提供する。 図３Ａおよび３Ｂは、例示的な軽鎖競合アッセイを図示し、図３ＡはＳＰＲサンドイッチに基づくアッセイを図示し、図３Ｂは抗Ｈｉｓタグ表面を図示する。 １００％ＨＣ：ＬＣ−ＨＡまたは１００％ＨＣ：ＬＣ−ＦＬＡＧの既知の比率が、所定の比率で混合される、ドーピング実験のプロットを描写する。抗タグ抗体の読み取りは、ＬＣ−ＦＬＡＧまたはＬＣ−ＨＡの比率に対してプロットされる場合、およそ線形である。 同時発現におけるＬ１およびＬ２の相対量の関数としての、２つのＦａｂ種の相対量の理論的な依存性を示す。３つの異なる対合傾向の関係を示す。 同時発現におけるＬ１およびＬ２の相対量の関数としての、２つのＦａｂ種の相対量の理論的な依存性を示す。３つの異なる対合傾向の関係を示す。 ５つの変異体が並行して実行され、最大５つの異なる二次抗体が使用され得る、ＬＣＣＡ内で典型的に使用されるＳＰＲチップの概略表現を描写する。各細胞は、示されるように、２つの要素座標によって示される。 実用的ＬＣＣＡライブラリの例示的な合理的設計を表す。まず、コンピュータ内で、設計（すなわち、設計１．．．設計Ｎ）の「ＬＣＣＡライブラリ」を作成し（図８Ａ）、ライブラリを、ＨＣがＬＣ２ではなくＬＣ１と優先的に対合する（すなわち、ＨＣ−ＬＣ１＞＞ＨＣ−ＬＣ２）ように操作する。これらの設計を、その後インビトロで試験する。この目的のために、ライブラリ設計を、発現ベクターに個別にクローン化する（ステップ２を参照されたい、図８Ｂ）。 図８−１の続きの図である。次に、ＬＣＣＡ設計（例えば、ＨＣ１、ＬＣ１１、およびＬＣ２１．．．ＨＣＮ、ＬＣ１Ｎ、およびＬＣ２Ｎ）を、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ、ステップ３を参照されたい、図８Ｃ）内で一時的に発現させる。遺伝子移入の７日後、ＣＨＯ細胞上清を採取し、ＳＰＲ読み取りを使用して、各ＬＣＣＡ設計のＨＣ−ＬＣ１：ＨＣ−ＬＣ２群を定量化する（ステップ４、図８Ｄ）。その後、実用的設計を、設定基準（例えば、ＨＣ−ＬＣ１：ＨＣ−ＬＣ２＞＝７５：２５）に基づいて順位付けし、好結果の設計は、その後「実用的ＬＣＣＡライブラリ」の一部となる。より大きいデータセットを扱う場合、任意のデータマイニングステップ（＃５、図８Ｅ）が利用可能である。このステップ中、「ＨＣ−ＬＣ対合結果の大域分析」が行われる。このステップは、それがデータ内の非自明かつ非明白なパターン／傾向を認識することを潜在的に可能にするため、かなり有益であり得る。最後に、実用的ＬＣＣＡライブラリをコンパイルする（図８Ｆ）。 ＨＣが限定的である、例示的なＬＣＣＡの下絵描写を提供する。 ＬＣが限定的である、例示的なＨＣＣＡの下絵描写を提供する。 完全長のＨＣポリペプチドが限定的である、例示的なＬＣＣＡの下絵描写を提供する。 完全長のＨＣポリペプチドが限定的である（ＨＥＴ＿ＦＣ使用）、例示的なＯＲＣＡの下絵描写を提供する。 軽鎖競合アッセイデータを表すためのグラフの一部を描写する。 １７種の「Ｆａｂ対設計」についてのＬＣＣＡ Ｆａｂ１（すなわち、ＨＣ１：ＬＣ１：ＬＣ２；ｘ軸）およびＦａｂ２（すなわち、ＨＣ２：ＬＣ１：ＬＣ２；ｙ軸）の結果を示す。両Ｆａｂアーム上で良好に稼動する（すなわち、高百分率の正確に対合したＦａｂを示す）設計が、プロットの第１象限に見られ得る。あまり効果的に機能しない（例えば、１つのＦａｂアームが良好に稼動していない）設計が、プロットの第３象限に示される。野生型形式におけるＦａｂ対設計の性能を、データ点の着色によって示す（凡例を参照されたい）。 ＬＣＣＡの一実施形態（ＬＣＣＡ−１）において、本方法がどのように行われるのかの一例を描写する図を提供する。この図において、重鎖および軽鎖のうちのそれぞれは、固有にタグ付けされる（凡例を参照されたい）。 ＨＣＣＡの一実施形態において、本方法がどのように行われるのかの一例を描写する図を提供する。この図において、重鎖のみが、固有にタグ付けされる（凡例を参照されたい）。 ＯＲＣＡの一実施形態において、本方法がどのように行われるのかの一例を描写する図を提供する。この図において、軽鎖のみが、固有にタグ付けされる（凡例を参照されたい）。 ＬＣＣＡ−２の一実施形態において、本方法がどのように行われるのかの一例を描写する図を提供する。この図において、軽鎖のみが、固有にタグ付けされる（凡例を参照されたい）。
免疫グロブリン（ＩｇＧ）重鎖または免疫グロブリン軽鎖が、特定のＩｇＧ軽鎖またはＩｇＧ重鎖とそれぞれ選択的に対合する能力を決定するための定量的方法が、本明細書で提供される。一実施形態において、本方法は、重鎖および固有軽鎖が同時発現する際、一特定のＩｇＧ重鎖が、２つの固有ＩｇＧ軽鎖のうちのいずれか１つと選択的に対合するかどうかを決定するために使用される。アッセイは、同時発現するＩｇＧ重鎖および軽鎖が、「Ｆａｂ」形式、または重鎖もまたＦｃ領域を含む形式であり得るという点において、柔軟である。
本方法は、ハイスループットアッセイとして実行されることができ、ＩｇＧ重鎖および軽鎖のアミノ酸配列における小さい変化の結果を測定するという点において、敏感である。本方法は、ほとんどの重鎖−軽鎖対合を大きく変更することなく定量化することができるという点において、汎用である。
一実施形態において、本方法は、特定の重鎖−軽鎖対合を駆動するために変更されている、合理的に設計されたＩｇＧポリペプチドのライブラリをスクリーニングするために使用される。加えて、本方法が非野生型形式の、例えば、Ｆａｂ形式のＩｇＧポリペプチドを使用して行われる場合、選択的対合の定量化は、野生型形式のＩｇＧポリペプチドの選択的対合を予測する。そのようなものとして、本方法は、二重特異性抗体の調製物において有用なＦａｂモジュールを同定するために使用され得る。
更なる一実施形態において、それにより選択的対合を特に助長するＩｇＧ重鎖およびＩｇＧ軽鎖の組み合わせが発見される、より大きい一連の測定の分析の図示的方法が、本明細書で提供される。したがって、本分析方法は、アッセイデータのハイスループット生成から取得されたデータの効果的処理を可能にする。
本出願に従って、従来の分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技術が、当該技術分野の範囲内で用いられ得る。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、そのそれぞれの全体が特に本明細書に参照によって組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"（１９８９）；"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）］；"Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ"Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４）］；"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）］；"Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；"Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ"［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）］；"Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ"［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］；"Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ"［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；"Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ"［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，"Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ"（１９８４）を参照されたい。
正確なアッセイスクリーニングの繰り返しを実行することができかつ抗体構築物を構築するために有用なＦＡＢモジュールを設計および同定するために非常に小さい容量で動作することができる、ハイスループットスクリーニング方法および装置が提供される。いくつかの実施形態において、構築される抗体構築物は二パラトープである。いくつかの抗体構築物は、二重特異性である。
抗体用語
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、天然にまたは部分的にもしくは完全に合成的に生成されるかに関わらず、免疫グロブリン（Ｉｇ）を指す。この用語はまた、抗原結合ドメインであるかまたはこれと相同である結合ドメインを有する、あらゆるポリペプチドまたはタンパク質を包含する。この用語は、「抗原結合断片」、および以下に記載されるような、同様の結合断片のための他の互換性のある用語を更に含む。相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体、および他のヒト化抗体（ＣＤＲ変更および骨格領域変更を含む）もまた、この用語によって意図される。
天然抗体および天然免疫グロブリンは、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に典型的に連結するが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖および軽鎖はまた、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端部に可変ドメイン（「ＶＨ」または「ＶＨ」）を、続いて多数の定常ドメイン（「ＣＨ」または「ＣＨ」）を有する。各軽鎖は、一端部に可変ドメイン（「ＶＬ」または「ＶＬ」）、および他方の端部に定常ドメイン（「ＣＬ」または「ＣＬ」）を有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成することが、既知である。
「合成ポリヌクレオチド」、「合成遺伝子」、または「合成ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、対応するポリヌクレオチド配列またはその部分、あるいはアミノ酸配列またはその部分を指し、等価の天然配列と比較して、設計されている、またはデノボ合成されている、または変更されている、配列に由来する。合成ポリヌクレオチド（抗体または抗原結合断片）または合成遺伝子は、核酸またはアミノ酸配列の化学合成を含むが、これに限定されない、当該技術分野において既知である方法によって調製され得る。合成遺伝子は、アミノ酸、またはポリヌクレオチドレベル（または両方）のいずれかで天然遺伝子と典型的に異なり、合成発現対照配列の文脈内で典型的に位置する。例えば、合成遺伝子配列は、例えば１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの置換、欠失、または付加によって変更されているアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を含むことができ、これにより、元の配列とは異なる抗体アミノ酸配列またはポリヌクレオチドコード配列を提供する。合成遺伝子ポリヌクレオチド配列は、天然遺伝子と比較して、必ずしも異なるアミノ酸を有するタンパク質をコードしなくてもよい。例えば、それらはまた、異なるコドン（しかしこれらは同一のアミノ酸をコードする（すなわち、ヌクレオチドの変化が、アミノ酸レベルでのサイレントな突然変異に相当する））を組み込んでいる、合成ポリヌクレオチド配列を包含し得る。
抗体に関して、「可変ドメイン」という用語は、各特定の抗体の、その特定の抗原のための結合および特異性において使用される抗体の可変ドメインを指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインを通して均等に分布されていない。むしろ、それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方の中の、超可変領域（別名ＣＤＲ）と呼ばれる３つの部分内に集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分は、「骨格領域」または「ＦＲ」と呼ばれる。未変更の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）を含有し、一般に、３つのＣＤＲが散在するβシート構造をとっており、これらは、βシート構造の一部を接続するループを、およびいくつかの場合βシート構造を形成する。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲによって共に近接して保持され、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１），ｐａｇｅｓ６４７−６６９を参照されたい）。
「超可変領域」および「ＣＤＲ」という用語は、本明細書で使用される際、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。ＣＤＲは、相補的な方法で抗原に結合し、ＶＨおよびＶＬ鎖のそれぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として既知の、３つの配列領域からのアミノ酸残基を含む。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）によると、軽鎖可変ドメインにおいて、ＣＤＲは、およそ残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、５０〜５６（ＣＤＲＬ２）、および８９〜９７（ＣＤＲＬ３）に典型的に対応し、重鎖可変ドメインにおいて、ＣＤＲは、およそ残基３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、５０〜６５（ＣＤＲＨ２）、および９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）に典型的に対応する。異なる抗体のＣＤＲは、挿入を含有してもよく、したがって、アミノ酸番号付けが変化してもよいことが理解される。Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、そのような挿入を、異なる抗体間の番号付けにおけるあらゆる挿入を反映させるための、特定の残基に添付される文字（例えば、軽鎖内のＣＤＲＬ１の２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃ、２７Ｄ、２７Ｅ、および２７Ｆ）を利用する番号付けスキームで説明する。あるいは、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）によると、軽鎖可変ドメインにおいて、ＣＤＲは、およそ残基２６〜３２（ＣＤＲＬ１）、５０〜５２（ＣＤＲＬ２）、および９１〜９６（ＣＤＲＬ３）に典型的に対応し、重鎖可変ドメインにおいて、ＣＤＲは、およそ残基２６〜３２（ＣＤＲＨ１）、５３〜５５（ＣＤＲＨ２）、および９６〜１０１（ＣＤＲＨ３）に典型的に対応する。
本明細書で使用される場合、「骨格領域」または「ＦＲ」とは、抗原結合ポケットまたは溝の一部を形成する骨格アミノ酸残基を指す。いくつかの実施形態において、骨格残基は、抗原結合ポケットまたは溝の一部であるループを形成し、ループ内のアミノ酸残基は、抗原に接触しても、またはしなくてもよい。骨格領域は、ＣＤＲ間領域を一般的に含む。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）によると、軽鎖可変ドメインにおいて、ＦＲは、およそ残基０〜２３（ＦＲＬ１）、３５〜４９（ＦＲＬ２）、５７〜８８（ＦＲＬ３）、および９８〜１０９に典型的に対応し、重鎖可変ドメインにおいて、ＦＲは、およそ残基０〜３０（ＦＲＨ１）、３６〜４９（ＦＲＨ２）、６６〜９４（ＦＲＨ３）、および１０３〜１３３に典型的に対応する。軽鎖のＫａｂａｔ番号付けと共に上記に説明されるように、重鎖も同様の方法で挿入を説明する（例えば、重鎖内のＣＤＲＨ１の３５Ａ、３５Ｂ）。あるいは、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）によると、軽鎖可変ドメインにおいて、ＦＲは、およそ残基０〜２５（ＦＲＬ１）、３３〜４９（ＦＲＬ２）、５３〜９０（ＦＲＬ３）、および９７〜１０９（ＦＲＬ４）に典型的に対応し、重鎖可変ドメインにおいて、ＦＲは、およそ残基０〜２５（ＦＲＨ１）、３３〜５２（ＦＲＨ２）、５６〜９５（ＦＲＨ３）、および１０２〜１１３（ＦＲＨ４）に典型的に対応する。
ＦＲのループアミノ酸は、抗体重鎖および／または抗体軽鎖の三次元構造の検査によって評価され、決定され得る。三次元構造は、溶媒が接触可能なアミノ酸位置に関して分析され得る。なぜなら、そのような位置はループ形成しやすい、および／または抗体可変ドメインにおける抗原接触を提供しやすいからである。溶媒が接触可能な位置のうちのいくつかは、アミノ酸配列の多様性を許容することができ、他（例えば、構造的位置）は、一般的にあまり多様化しない。抗体可変ドメインの三次元構造は、結晶構造またはタンパク質モデリングに由来し得る。
抗体のＦｃドメインの定常ドメインは、抗体を抗原に結合することに直接的には関与せず、むしろ、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用を介した、抗体の抗体依存的細胞毒性への関与、などの様々なエフェクター機能を呈する。Ｆｃドメインは、患者への投与に後続する循環における抗体の生物学的利用性を増加させ得る。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。５つの主要なクラスの免疫グロブリンであるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に更に分割され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメイン（Ｆｃ）は、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造、および三次元構造が既知である。一実施形態において、本明細書に記載される抗体、または抗原結合断片は、例えば、亜型ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのＩｇＧアイソタイプである。重鎖は、本明細書で互換的に「ＩｇＧ重鎖」、「ＩｇＧ重鎖ポリペプチド」、または「重鎖ポリペプチド」と称される。重鎖はまた、本明細書で「ＨＣ」または「Ｈ」、例えば、ＨＣ１およびＨＣ２、またはＨ１およびＨ２と略記される。
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」（免疫グロブリン）は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」）およびラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明白に異なる型のうちの１つに割り当てられ得る。軽鎖は、本明細書で「ＩｇＧ軽鎖」、「ＩｇＧ軽鎖ポリペプチド」、または「軽鎖ポリペプチド」と互換的に称される。軽鎖はまた、本明細書で「ＬＣ」または「Ｌ」、例えば、ＬＣ１およびＬＣ２、またはＬ１およびＬ２と略記される。
「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗体断片」または「抗体の機能断片」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の断片を指すために、本明細書で互換性に使用される。そのような用語内に含まれる抗体断片の非限定的な例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片である、Ｆａｂ断片と、（ｉｉ）ジスルフィド架橋によってヒンジ領域で連結した２つのＦａｂ断片を含有する二価の断片である、Ｆ（ａｂ'）２断片と、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片と、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを含有するＦｖ断片と、（ｖ）ＶＨドメインを含有する、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４ ５４６）と、（ｖｉ）単離されたＣＤＲと、を含むが、これに限定されない。単一重鎖および単一軽鎖を含む「２分の１」抗体がこの定義に更に含まれる。ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態もまた、本明細書で包含される。
「Ｆ（ａｂ'）２」および「Ｆａｂ'」部分は、ペプシンおよびパパインなどのタンパク質分解酵素でＩｇを処理することによって生成されることができ、２つの重鎖のそれぞれにおいてヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の近くの免疫グロブリンを消化することによって生じる抗体断片を含む。例えば、パパインは、２つの重鎖のそれぞれにおいてヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流のＩｇＧを開裂して、ＶＬおよびＣＬで構成される軽鎖（軽鎖定常領域）、ならびに重鎖の定常領域内のＶＨおよびＣＨγ１（γ１）領域で構成される重鎖断片が、ジスルフィド結合を通してそれらのＣ末端領域で接続される、２つの相同抗体断片を生じさせる。これらの２つの相同抗体断片のそれぞれは、Ｆａｂ'と呼ばれる。ペプシンもまた、２つの重鎖のそれぞれにおいてヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の下流のＩｇＧを開裂して、２つの上述のＦａｂ'がヒンジ領域で接続される断片よりもわずかに大きい抗体断片を生じさせる。この抗体断片は、Ｆ（ａｂ'）２と呼ばれる。
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメイン、および重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端におけるいくつかの残基の付加によってＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を含有しているＦａｂ'のための、本明細書での表記である。Ｆ（ａｂ'）２抗体断片は、本来は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学結合もまた、既知である。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合の部位を含有する抗体断片を指す。この領域は、緊密に非共有結合または共有結合する、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる（ジスルフィド連結されたＦｖは、当該技術分野において記載されている、Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：１２３９−１２４５）。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するのは、この構造においてである。集合的に、ＶＨおよびＶＬ鎖のそれぞれからの１つ以上のＣＤＲの組み合わせは、抗原結合特異性を抗体に付与する。例えば、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３が、例えばレシピエント抗体またはその抗原結合断片のＶＨおよびＶＬ鎖に移す場合、抗原結合特異性を抗体に付与するのに十分であり得ること、およびＣＤＲのこの組み合わせが、本明細書に記載される技術のいずれかを使用して、結合、親和性などについて試験され得ることが、理解されるであろう。第２の可変ドメインと結合される際より低い親和性である可能性が高いものの、単一可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識し、結合する能力を有する。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は、別個の遺伝子によってコードされているが、それらは、それらが単一タンパク質鎖として製造されることを可能にする合成リンカーによる組み換え法を使用して結合され得、ここで、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として既知；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３；およびＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７７８）。そのようなｓｃＦｖもまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれることが意図され、包含される。特定のｓｃＦｖの任意のＶＨおよびＶＬ配列は、完全なＩｇ（例えば、ＩｇＧ）分子、または他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生じさせるために、Ｆｃ領域ｃＤＮＡ、またはゲノム配列に連結され得る。ＶＨおよびＶＬはまた、タンパク質化学または組み換えＤＮＡ技術のいずれかを使用して、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはＩｇの他の断片の作製において使用され得る。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの再考察については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
「ＡＶＩＭＥＲ（商標）」という用語は、抗体および抗体断片には非関連でありかつＡドメインと称される（クラスＡモジュール、相補型リピート、またはＬＤＬ受容体クラスＡドメインとも称される）いくつかの再利用可能なモジュラー結合ドメインで構成される、ヒト由来の治療用タンパク質のクラスを指す。それらは、インビトロでのエキソンシャッフリングおよびファージ提示によって、ヒト細胞外受容体ドメインから開発された（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１４９３−１４９４；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２２０）。得られるタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比較して、改良された親和性（いくつかの場合、ナノモル以下）および特異性を呈し得る、複数の独立した結合ドメインを含有し得る。例えば、これによりその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５／０２２１３８４号、同第２００５／０１６４３０１号、同第２００５／００５３９７３号、および同第２００５／００８９９３２号、同第２００５／００４８５１２号、および同第２００４／０１７５７５６号を参照されたい。
既知の２１７種のヒトＡドメインのそれぞれは、約３５アミノ酸（約４ｋＤａ）を含み、これらのドメインは、平均５アミノ酸長のリンカーによって隔てられている。天然Ａドメインは、主にカルシウム結合およびジスルフィド形成によって媒介されて、均一で安定した構造に迅速かつ効率的に折り畳まれる。この共通構造のために必要なのは、わずか１２アミノ酸の保存された骨格モチーフである。最終結果は、それぞれが別個の機能を表す複数のドメインを含有する、単一タンパク質鎖である。タンパク質の各ドメインは独立して結合し、各ドメインのエネルギー的な寄与は追加的である。これらのタンパク質は、結合活性のある多量体という「ＡＶＩＭＥＲ（商標）」と呼ばれた。
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、その断片が、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一の鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするためには短すぎるリンカーを使用することで、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を作成することを強制される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４ ６４４８（１９９３）においてより十分に記載される。
抗原結合ポリペプチドはまた、例えば、ラクダ科動物またはサメ由来の抗体などの重鎖二量体を含む。ラクダ科動物およびサメの抗体は、Ｖ様ドメインおよびＣ様ドメイン（どちらも軽鎖を有さない）の２つの鎖のホモ二量体対を含む。ラクダ科動物における重鎖二量体ＩｇＧのＶＨ領域は、軽鎖と疎水性相互作用を行わなくてよいため、通常軽鎖に接触する重鎖内の領域は、ラクダ科動物において親水性アミノ酸残基に変更される。重鎖二量体ＩｇＧのＶＨドメインは、ＶＨＨドメインと呼ばれる。サメのＩｇ−ＮＡＲは、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲドメインと称される）のホモ二量体、および５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲドメイン）を含む。ラクダ科動物において、抗体レパートリーの多様性は、ＶＨまたはＶＨＨ領域内のＣＤＲ１、２、および３によって決定される。ラクダＶＨＨ領域内のＣＤＲ３は、平均すると１６のアミノ酸になる、その比較的長い長さによって特徴付けられる（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７（９）：１１２９）。これは、多くの他の種の抗体のＣＤＲ３領域と対照的である。例えば、マウスＶＨのＣＤＲ３は、平均９のアミノ酸を有する。ラクダ科動物の可変領域のインビボ多様性を維持する、ラクダ科動物由来の抗体可変領域のライブラリは、例えば、米国特許出願番号第２００５００３７４２１号に開示される方法によって製造され得る。
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒトＩｇ由来の最小限の配列を含有するキメラ抗体を含む。大部分の場合、ヒト化抗体は、レシピエントの１つ以上のＣＤＲが、所望の特異性、親和性、および結合機能を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種抗体（ドナー抗体）からのＣＤＲによって置換される、ヒトＩｇ（レシピエント抗体）である。いくつかの例において、ヒトＩｇの１つ以上のＦＲアミノ酸残基は、対応する非ヒトアミノ酸残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体内、またはドナー抗体内には見られない残基を含有し得る。これらの変更は、必要に応じて、抗体性能を改善するためになされ得る。ヒト化抗体は、超可変領域の全て、または実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、ＦＲの全て、または実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のそれらである、少なくとも１つ、いくつかの場合２つの、可変ドメインのうちの実質的に全てを含み得る。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部を任意で含み得る。詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
ヒト化抗体はまた、重鎖および軽鎖のＣＤＲのうちの一部、または全てが非ヒトモノクローナル抗体に由来し、可変領域の実質的に全ての残り部分がヒト可変領域（重鎖および軽鎖両方）に由来し、定常領域がヒト定常領域に由来する、抗体を含む。一実施形態において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は、非ヒト抗体に由来する。更に別の実施形態において、重鎖および軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）は、非ヒト抗体に由来する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の様々な組み合わせが、非ヒト抗体に由来することができ、本明細書で意図される。一非限定的な例において、重鎖および軽鎖のそれぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の１つ以上は、本明細書で提供される配列に由来する。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均質な抗体の群から、すなわち、群を構成する個々の抗体が、少量存在し得る潜在的な天然の突然変異を除いて同一である群から取得される、抗体を指す。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して向けられ、高度に特異的である。更に、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられ得る、異なる抗体を含み得る従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な群から取得されるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５）によって初めて記載された融合細胞腫法によって製造されてもよく、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって製造されてもよい。特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）、およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離され得る。
抗体は、飽和硫酸アンモニウム沈殿、ユーグロブリン沈殿法、カプロン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２）、または以下により詳細に記載される抗ＩｇカラムまたはプロテインＡ、Ｇ、またはＬカラムを使用する親和性クロマトグラフィーによって上述の培養上清または腹水から単離され、精製され得る。
本明細書に記載される組成物および方法において使用する例示的な抗体は、例えばヒト化抗体もしくは抗原結合部位を含有するヒト化Ｉｇ分子の部分（すなわち、パラトープ）などの完全免疫グロブリン分子、または、単一重鎖および単一軽鎖、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ）'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、可変ＮＡＲドメイン、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、および、抗原結合断片も称される単鎖結合ポリペプチドなどの、当該技術分野において既知である部分である。免疫グロブリン分子またはその断片を構築する際、可変領域またはその部分は、１つ以上の定常領域またはその部分に融合、接続、または他の方法で結合されて、本明細書に記載される抗体またはその断片のいずれかを生成し得る。これは、分子クローン化技術、または分子をコードする核酸の直接合成を含むが、これに限定されない、当該技術分野において既知である様々な方法において達成され得る。これらの分子を構築する、例示的な非限定的な方法はまた、本明細書に記載される実施例にも見られる。
二重特異性または他の多重特異性抗体を製造する方法は、当該技術分野において既知であり、化学架橋、ロイシンジッパーの使用（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３，１９９２）と、ディアボディ技術（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−４８，１９９３）と、ｓｃＦｖ二量体［Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８，１９９４］、線形抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１０５７−６２，１９９５）と、ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５）と、を含む。
「線形抗体」は、抗原結合領域の対を形成する直列Ｆｄ部分（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む。線形抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１０５７−６２（１９９５））。
更に、本明細書に記載される抗体は、結合親和性、特異性、および／または血液中の増加した半減期を改良し得る、多価形態に折り畳めるように構築され得る。抗体の多価形態は、当該技術分野において既知である技術によって調製され得る。
二重特異性または多重特異性抗体は、架橋した、または「ヘテロ複合体」抗体を含む。例えば、ヘテロ複合体における抗体のうちの１つは、アビジンに結合することができ、他方はビオチンに結合することができる。ヘテロ複合体抗体は、任意の従来の架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は、当該技術分野において既知であり、多数の架橋技術と共に米国特許出第４，６７６，９８０号に開示されている。別の方法が、ストレプトアビジンコード配列をｓｃＦｖのＣ末端に付加することによって四量体を製造するために設計される。ストレプトアビジンは、４つのサブユニットで構成されるため、ｓｃＦｖストレプトアビジンが折り畳まれる際、４つのサブユニットが結合して、四量体を形成する（その開示の全体が、本明細書に参照によって組み込まれる、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，６（３）：９３−１０１（１９９５））。
本明細書で使用される場合、「マキシボディ」とは、免疫グロブリンのＦｃ領域に共有結合的に添付された二価のｓｃＦｖを指す。例えば、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１７：９５−１０６（２００４）およびＰｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５１：１２３−１３５（２００１）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「イントラボディ」とは、細胞内発現を示し、細胞内タンパク質機能を操作し得る、単鎖抗体を指す（Ｂｉｏｃｃａ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．９：１０１−１０８，１９９０；Ｃｏｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０１：１７６１６−２１，２００４）。細胞内領域内で抗体構築物を保持する、細胞シグナル配列を含むイントラボディは、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ ｅｔ ａｌ．，（ＥＭＢＯ Ｊ１４：１５４２−５１，１９９５）およびＷｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（ＦＡＳＥＢ Ｊ．１７：１７３３−５．２００３）に記載されるように生成され得る。トランスボディは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）が単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体と融合される、細胞透過性抗体である、Ｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．６４：１１０５−８，２００５）。
標的タンパク質に特異的である、ＳＭＩＰまたは結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体が本明細書で更に意図される。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を行うために必要な、免疫グロブリンドメインに融合した抗原結合ドメインを含む単鎖ポリペプチドである。例えば、これにより参照によって組み込まれる、国際公開第０３／０４１６００号、米国特許公開第２００３０１３３９３９号、および米国特許公開第２００３０１１８５９２号を参照されたい。
抗体およびその抗原結合断片のヒト化は、当該技術分野において既知である、および本明細書に記載される様々な方法を介して達成され得る。同様に、ヒト化抗体の生成もまた、当該技術分野において既知である、および本明細書に記載される様々な方法を介して達成され得る。
例示的な一実施形態において、本出願は、本明細書に記載されるエピトープを結合し、任意に免疫グロブリンＦｃ領域を有する、重鎖可変領域、および／または軽鎖可変領域を有する単鎖結合ポリペプチドを意図する。そのような分子は、免疫グロブリンＦｃ領域の存在を通して、任意にエフェクター機能、または増加した半減期を有する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。単鎖結合ポリペプチドを調製する方法は、当該技術分野において既知である（例えば、米国特許出願第２００５／０２３８６４６号）。
抗体またはその抗原結合断片の結合親和性および／または結合活性は、骨格領域を変更することによって改良され得る。骨格領域の変更の方法は、当該技術分野において既知であり、本明細書で意図される。変更のための１つ以上の関連する骨格アミノ酸位置の選択は、様々な基準に依存する。変更のために関連する骨格アミノ酸を選択するための１つの基準は、供与分子と受容分子との間のアミノ酸骨格残基における相対差であり得る。この手法を使用した変更する関連する骨格位置の選択は、残基決定におけるあらゆる主観的な偏倚、および残基によるＣＤＲ結合親和性貢献におけるあらゆる偏倚を回避する利点を有する。
本明細書で使用される場合、「免疫反応性」とは、アミノ酸残基の配列に特異的な抗体またはその抗原結合断片（「結合部位」または「エピトープ」）を指す。「結合」という用語は、例えば、生理学的条件下での共有結合、静電気、疎水性、イオン性、および／または水素結合相互作用による、２つの分子間の直接結合を指し、塩架橋および水架橋ならびに任意の他の従来の結合手段などの相互作用を含む。「優先的に結合する」という用語は、結合剤が、それが非関連アミノ酸配列に結合するよりも大きい親和性で、結合部位に結合することを意味する。好適には、そのような親和性は、非関連アミノ酸配列に対する結合剤の親和性よりも、少なくとも１倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、１０倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも３０倍高い、少なくとも４０倍高い、少なくとも５０倍高い、少なくとも６０倍高い、少なくとも７０倍高い、少なくとも８０倍高い、少なくとも９０倍高い、少なくとも１００倍高い、または少なくとも１０００倍高い。「免疫反応性」および「優先的に結合する」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、２つの剤の可逆的結合のための平衡定常を指し、Ｋｄと表される。一実施形態において、抗体、またはその抗原結合断片は、１×１０−６Ｍ以下の範囲内の、または１０−１６Ｍ以下（例えば、約１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３、１０−１４、１０−１５、１０−１６Ｍ以下）まで下がる範囲の、標的抗原のＫＤ（平衡解離定常）によって測定される結合親和性などの所望の特性を呈する。平衡解離定常は、溶液平衡アッセイにおいて、ＢＩＡｃｏｒｅおよび／またはＫｉｎＥｘＡを使用して決定され得る。本明細書で使用される場合、「結合活性」という用語は、２つ以上の剤の複合体の、希釈後の解離に対する抵抗性を指す。見かけの親和性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または当業者に知られる任意の他の技術などの方法によって決定され得る。結合活性は、スッキャッチャード分析または当業者に知られる任意の他の技術などの方法によって決定され得る。
抗体の増加した親和性が所望である場合、転換された抗体のＣＤＲ内の残基が、従来既知の方法を使用して他のアミノ酸と更に置換され得る。典型的には、ＣＤＲ内の４つ以下のアミノ酸残基が変更され、最も典型的には、最大１０の残基が変更され得る重鎖ＣＤＲ２以外を除いて、ＣＤＲ内の２つ以下の残基が変更されるであろう。親和性における変化は、本明細書に記載されるものなどの従来の方法によって測定され得る（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。変更された抗体の活性は、特定の標的抗原に基づく従来のアッセイを使用して決定され得る。
「エピトープ」は、抗体のポケットを結合する可変領域と結合相互作用を形成することができる、抗原または他の高分子のその部分を指す。そのような結合相互作用は、１つ以上のＣＤＲの１つ以上のアミノ酸残基との分子間接触として現れ得る。抗原結合は、例えば、ＣＤＲ３またはＣＤＲ３対、または、いくつかの場合、ＶＨおよびＶＬ鎖の最大全ての６つのＣＤＲの相互作用に関与し得る。エピトープは、線形ペプチド配列（すなわち、「連続的」）であってもよく、または、非連続的アミノ酸配列（すなわち、「立体配座」または「非連続的」）で構成されてもよい。抗体は、１つ以上のアミノ酸配列を認識することができ、したがって、エピトープは２つ以上の異なるアミノ酸配列を定義することができる。抗体によって認識されるエピトープは、当業者に既知であるペプチドマッピングおよび配列分析技術によって決定され得る。結合相互作用は、ＣＤＲの１つ以上のアミノ酸残基との分子間接触として現れる。
「特異的」という用語は、抗体が、抗体によって認識されるエピトープを含有する抗原以外の、分子へのいかなる有意な結合をも示さない状況を指す。この用語はまた、例えば、抗原結合ドメインを含有している抗体またはその抗原結合断片が、エピトープを含有している様々な抗原に結合することができる、抗原結合ドメインが多数の抗原によって行われる特定のエピトープに特異的である場合、適用可能である。「優先的に結合する」または「特異的に結合する」という用語は、抗体またはその断片が、それが非関連アミノ酸配列に結合するよりも大きな親和性でエピトープに結合すること、および、該エピトープを含有する他のポリペプチドに対して交差反応性である場合、ヒトへの投与用途のために製剤化されるレベルでは非毒性であることを意味する。一態様において、そのような親和性は、抗体またはその断片の非関連アミノ酸配列についての親和性より少なくとも１倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、１０倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも３０倍高い、少なくとも４０倍高い、少なくとも５０倍高い、少なくとも６０倍高い、少なくとも７０倍高い、少なくとも８０倍高い、少なくとも９０倍高い、少なくとも１００倍高い、または少なくとも１０００倍高い。「免疫反応性」、「結合する」、「優先的に結合する」、および「特異的に結合する」は、本明細書で互換的に使用される。「結合」という用語は、例えば、生理学的条件下での共有結合、静電気、疎水性、イオン性、および／または水素結合相互作用による、２つの分子間の直接結合を指し、塩架橋および水架橋などの相互作用ならびに従来の結合手段を含む。
「重鎖ポリペプチドの、軽鎖ポリペプチドに対する選択性」という用語は、本明細書で使用される場合、重鎖ポリペプチドおよび２つの軽鎖ポリペプチドが同時発現し、重鎖が限定的である際の、重鎖ポリペプチドの２つの軽鎖ポリペプチドのうちの１つとの優先的対合を指す。本明細書に記載される方法の文脈において、重鎖ポリペプチドの、１つの軽鎖ポリペプチドに対する、もう一方を上回る選択性は、重鎖ポリペプチドおよび２つの軽鎖ポリペプチドが同時発現する場合、その軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの得られる量が、他の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの得られる量より多い際に、示される。一例において、軽鎖は等しく発現する。
同様に、「軽鎖ポリペプチドの、重鎖ポリペプチドに対する選択性」という用語は、本明細書で使用される場合、軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドが同時発現し、軽鎖が限定的である際の、軽鎖ポリペプチドの２つの重鎖ポリペプチドのうちの１つとの優先的対合を指す。本明細書に記載される方法の文脈において、軽鎖ポリペプチドの、１つの重鎖ポリペプチドに対する、もう一方を上回る選択性は、軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドが同時発現する場合、その重鎖ポリペプチドと対合した軽鎖ポリペプチドの得られる量が、他の重鎖ポリペプチドと対合した軽鎖ポリペプチドの得られる量より多い際に、示される。一例において、重鎖は等しく発現する。抗体は、例えば、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載される、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射線標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる共分画、共沈、架橋、ＥＬＩＳＡ、および同様物を含むが、これに限定されない、当該技術分野において既知である方法によって結合親和性についてスクリーニングされ得る。
標的抗原上の所望のエピトープに結合する抗体は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるような定期クロスブロッキングアッセイにおいてスクリーニングされることができ、実行されることができる。未知の抗体が、標的の、本発明の標的特異性抗体に対する結合を阻害するその能力によって特徴付けられる、定期競合結合アッセイもまた使用され得る。完全抗原、細胞外ドメインなどのその断片、または線形エピトープが使用され得る。エピトープマッピングは、Ｃｈａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）に記載される。
抗体は、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体であり得る。
一態様において、抗体またはその抗原結合断片が、本明細書で提供され、重鎖可変領域骨格領域および軽鎖可変領域骨格領域を含む。抗体またはその抗原結合断片は、ＣＨ２、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域のうちの１つ以上を更に含み得る。一実施形態において、重鎖ポリペプチドはＶＨ領域およびＣＨ１領域を含み、任意で、重鎖ポリペプチドはＣＨ２領域を更に含んでもよい。任意で、重鎖ポリペプチドは、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を更に含んでもよい。一実施形態において、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含む軽鎖ポリペプチド。
抗原結合断片は、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、単鎖結合ポリペプチド、Ｆｄ断片、可変重鎖、可変軽鎖、またはｄＡｂ断片であり得る。抗原結合断片は、例えば、ＡＶＩＭＥＲ、ダイアボディ、または重鎖二量体であり得る。重鎖二量体は、例えば、ラクダ科動物、またはサメ重鎖構築物であり得る。
本明細書に記載される、抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子もまた本明細書で提供される。制御対照配列に操作可能に連結された、核酸分子を含む発現ベクターもまた本明細書で提供される。本明細書で提供されるベクターまたは核酸分子を含む、宿主細胞もまた本明細書で提供される。核酸が発現して抗体を生成するような適切な条件下で、宿主細胞を培養することを含む、抗体を生成するために宿主細胞を使用する方法もまた本明細書で提供される。
重鎖ポリペプチドの、軽鎖ポリペプチドに対する選択性の定量化：
操作上、本明細書で使用される場合、ＨＴＳとは、自動化、例えば、高密度アレイ、液体取り扱い装置、検出器、および高データパケット処理を利用して、多数の化合物の生物学的または生化学的活性を迅速にアッセイする方法を指す。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）およびＥＬＩＳＡは、上記の要素が適用されるかどうかに応じて、高処理量または低処理量となり得る。評価されるパラメータもまた、考慮される。他のハイスループットアッセイ型は、本明細書の他の場所に記載され、本明細書に記載される方法で使用され得る。
一実施形態において、重鎖ポリペプチドの、少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドとの対合についての選択性を定量化するハイスループット法が提供され、本方法は、ＶＨおよびＣＨ１領域を含む第１の重鎖ポリペプチド、第１のＶＬ領域および第１のＣＬ領域を含む第１の軽鎖ポリペプチド、および第２のＶＬ領域および第２のＣＬ領域を含む第２の軽鎖ポリペプチドの一連の構築物を、インビトロまたは宿主細胞内で同時発現させるステップであって、該重鎖ポリペプチドおよび該軽鎖ポリペプチドが、重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を、一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、重鎖対合ポリペプチド構築物において、該第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および該第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を定量化するステップと、を含み、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を示す。
実施形態において、重鎖ポリペプチドの総量は限定的である。したがって、過剰な量の軽鎖ポリペプチドの存在下で、構築物はそれなくして形成され得ないため、形成される重鎖−軽鎖構築物の量は、重鎖ポリペプチドの量によって限定される。いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドは、約０．２５：１：１の所定の比率で発現する。
いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドは、約０．５：１：１の所定の比率で発現する。一実施形態において、重鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドは、約１：２：２の所定の比率で発現する。更なる実施形態において、重鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドは、約１：３：３の所定の比率で発現する。
実施形態において、軽鎖ポリペプチドの総量は限定的である。したがって、過剰な量の重鎖ポリペプチドの存在下で、構築物はそれなくして形成され得ないため、形成される軽鎖−重鎖構築物の量は、軽鎖ポリペプチドの量によって限定される。いくつかの実施形態において、軽鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の重鎖ポリペプチドは、約０．２５：１：１の所定の比率で発現する。
他の実施形態において、軽鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の重鎖ポリペプチドは、約０．５：１：１の所定の比率で発現する。選択された実施形態において、軽鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の重鎖ポリペプチドは、約１：２：２の所定の比率で発現する。いくつかの実施形態において、軽鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の重鎖ポリペプチドは、約１：３：３の所定の比率で発現する。
特定の実施形態において、定量化は、重鎖ポリペプチドの各軽鎖ポリペプチドとの相互作用のための対照標準の決定を更に含む。特定の実施形態において、対照標準の定量化は、該重鎖ポリペプチドならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドのうちの１つを、インビトロまたは宿主細胞内で、他の軽鎖ポリペプチドの不在下で同時発現させるステップと、重鎖ポリペプチドおよび該軽鎖ポリペプチドを含む構築物を単離するステップと、該構築物の量を定量的に検出するステップであって、該量が、該重鎖ポリペプチドの該軽鎖ポリペプチドとの最大の検出可能な結合のための対照標準としての役割を果たすステップ、を含む。
重鎖ポリペプチドおよび少なくとも２つの固有軽鎖ポリペプチドが同時発現する際の、個別のＩｇＧ重鎖ポリペプチドの、特定のＩｇＧ軽鎖ポリペプチドとの選択的対合を定量的に決定する方法が、本明細書で提供される。本方法は、同時発現したタンパク質の混合物内での、重鎖の特定の軽鎖との対合についての、定量的な分析を可能にする。一実施形態において、本方法は、重鎖および軽鎖が同時発現する場合、１つの特定のＩｇＧ重鎖が、２つのＩｇＧ軽鎖のうちのいずれか１つと結合するかどうかを決定するために使用され得る。別の実施形態において、本方法は、重鎖および軽鎖が同時発現する場合、２つの異なる重鎖のうちのそれぞれが、２つの軽鎖のうちの１つと選択的に対合するかどうかを決定するために使用され得る。
少なくとも１つの重鎖および２つの異なる軽鎖を、細胞内で、重鎖が限定的な対合反応体となるような比率で同時発現させるステップと、分泌されたタンパク質を、細胞から任意で分離するステップと、重鎖に結合する軽鎖ポリペプチドを残りの分泌されたタンパク質から分離して、単離された重鎖対合画分を生成するステップと、単離された重鎖画分内の各異なる軽鎖の量を検出するステップと、単離された重鎖画分内の各異なる軽鎖の相対量を分析して、少なくとも１つの重鎖の、軽鎖のうちの１つと選択的に対合する能力を決定するステップと、を含む方法が、特定の実施形態である。
重鎖ポリペプチドの、少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドとの対合についての選択性を決定するハイスループット法が提供され、本方法は、免疫グロブリン重鎖領域を含む重鎖ポリペプチド、第１の免疫グロブリン軽鎖領域を含む第１の軽鎖ポリペプチド、および第２の免疫グロブリン軽鎖領域を含む少なくとも１つの第２の軽鎖ポリペプチドを取得するステップと、溶液中で、該重鎖ポリペプチドおよび該軽鎖ポリペプチドを、重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように、所定の比率で接触させるステップと、第１または第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を、一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、該第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および該第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を定量化するステップと、を含み、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した重鎖ポリペプチドの、他の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、該第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を示す。
本明細書で提供される方法およびアッセイの特定の実施形態において、重鎖ポリペプチドは、ＣＨ３領域を更に含む。いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチドはまた、ＣＨ２領域またはその断片を含む。いくつかの実施形態において、ＣＨ２およびＣＨ３領域のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む。特定の実施形態において、ＣＨ３領域は、ＣＨ３領域が、ＣＨ３領域を含む別の重鎖ポリペプチドとヘテロ二量体を優先的に形成するような、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む。
本明細書で提供される方法およびアッセイの特定の実施形態は、ＣＨ３領域を含む第２の重鎖ポリペプチドの同時発現を更に含む。いくつかの実施形態において、第２の重鎖ポリペプチドはまた、ＣＨ２領域またはその断片を含む。いくつかの実施形態において、該ＣＨ２およびＣＨ３領域のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む。特定の実施形態において、ＣＨ３領域は、ＣＨ３領域が、ＣＨ３領域を含む第１の重鎖ポリペプチドとヘテロ二量体を優先的に形成するような、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む。少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む適切なＣＨ３ドメインが、当該技術分野において既知であり、例えば、国際特許公開第２０１２／０５８７６８号、および米国特許第５，８２１，３３３号、および同第７，６９５，９３６号に記載されるものを含む。第１の重鎖の第２の重鎖との優先的な形成を促進する、ＣＨ３領域内の追加的なアミノ酸突然変異は、国際特許公開第９６／０２７０１１号（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）に、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（（２０１０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８５，１９６３７−４６，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）に、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（（２０１０）Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ；２３（４）：１９５−２０２，ｓｔｒａｎｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に、およびＭｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｍａｂｓ３：６，５４６−５５７に記載される。
Ｆａｂ含有構築物の選択的形成のアッセイ
競合する重鎖または軽鎖ポリペプチドまたはこれらの組み合わせの存在下での、Ｆａｂ含有構築物の選択的形成を決定するためのアッセイおよび方法が提供され、本方法は、ＶＨおよびＣＨ１領域を含む第１の重鎖ポリペプチド、第１のＶＬおよび第１のＣＬ領域を含む第１の軽鎖ポリペプチド、ならびに１つ以上の他の重鎖ポリペプチド、軽鎖ポリペプチド、またはこれらの組み合わせの一連の構築物を、インビトロまたは宿主細胞内で同時発現させるステップであって、該第１の軽鎖ポリペプチドが該重鎖ポリペプチドと選択的に結合して、所望のＦａｂ構築物を形成する、ステップと、該第１の重鎖ポリペプチドまたは第１の軽鎖ポリペプチドを含む各Ｆａｂ構築物を単離するステップと、所望のＦａｂ構築物の量を、他のＦａｂ構築物と比較して検出するステップであって、所望のＦａｂ構築物のより多い量が、該Ｆａｂ構築物のより高い選択性を示す、ステップと、を含む。特定の実施形態において、本方法は、合理的に設計されたＦａｂ構築物の、他の重鎖または軽鎖ポリペプチドの存在下での自己結合を試験するのに有用である。
ポリペプチドの変更
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法、アッセイ、およびシステムは、検出可能な部分（標識）を含むタグの付加によって変更されている重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを使用する。本明細書に記載される方法は、タンパク質ドメインおよびタグが非特異的な方法で相互作用しない限り、標準的な抗体Ｆａｂの軽鎖および重鎖の対に高度に移転可能である。したがって、本明細書で提供される方法は、それが、重鎖または軽鎖の機能または安定性と干渉せずにタグ付けされ得るという条件で、あらゆる重鎖または軽鎖と共に使用され得る。言い換えると、タグの付加は、重鎖が軽鎖と結合する能力と干渉するべきではなく、例えば、細胞内でのその発現、またはそこからの分泌に影響を与えるべきでもない。同様に、タグの付加は、軽鎖が重鎖と結合する能力と干渉するべきではなく、細胞内でのその発現、またはそこからの分泌に影響を与えるべきでもない。
一実施形態において、同時発現した重鎖および軽鎖ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、タンパク質の混合物内の重鎖または軽鎖検出および／または精製を可能にするタグの付加によって変更される。いくつかの実施形態において、同時発現した重鎖および軽鎖ポリペプチドのうちのそれぞれは、他の同時発現した重鎖および軽鎖のそれとは異なるタグを含む。各軽鎖がその検出を可能にする検出部分を含むタグを含みながら、重鎖および重鎖に結合するポリペプチドが、ポリペプチドの混合物から精製されることを可能にするタグを含むＩｇＧ重鎖ポリペプチドが、一実施形態である。
タグおよび／または検出部分は、タグおよび／または検出部分が検出されることができ、タグおよび／または検出部分の位置が、重鎖または軽鎖の機能および／または安定性を干渉しないという条件で、アミノまたはカルボキシ末端部に付加され得る。例えば、重鎖はアミノ末端でタグ付けされることができ、軽鎖はカルボキシ末端でタグ付けされることができ、またはその逆でもよい。タグは、試験される１つの重鎖および２つの異なる軽鎖の固有マーカとして機能する。タグは、１つの重鎖および２つの異なる軽鎖上の１つが全て固有である限り、互換的に用いられ得る。重鎖および軽鎖の適切なタグの例は、６×Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｃ−ｍｙｃ、ｓＦＬＡＧ、Ｖ５、ＳＢＰ（ストレプトアビジン結合ペプチド）を含むが、これに限定されない。
重鎖と軽鎖との間のサイズにおける差が重鎖と軽鎖との間の区別のために重要である、特定の実施形態において、例えば、重鎖の断片が軽鎖と同時発現する実施形態において、鎖のうちの１つはそのサイズを増加させるタグで変更され得る。例示的な一実施形態において、適切なタグはアルブミン結合ドメインである。いくつかの実施形態において、重鎖またはその部分は、そのサイズを増加させるタグの付加によって変更される。
重鎖および軽鎖ポリペプチドの発現
本明細書に記載されるポリペプチドは、既知の方法に従って容易に調製され得る。例えば、組み換えＤＮＡ技術を使用して、重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドをタグ付けする方法が既知である。加えて、抗体ポリペプチドを宿主細胞内で発現させる、および同時発現させる方法もまた既知である。重鎖および軽鎖ポリペプチドの発現に適切な発現ベクターおよび宿主細胞が、本明細書で提供される。
重鎖および軽鎖ポリペプチド組み換え発現は、本明細書に記載される重鎖または軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、発現ベクターの構築を必要とする。重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドが取得されると、重鎖または軽鎖ポリペプチドの生成物のためのベクターが、組み換えＤＮＡ技術によって生成され得る。したがって、重鎖または軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製する方法が、本明細書に記載される。当業者に既知である方法が、重鎖または軽鎖ポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために、使用され得る。これらの方法は、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組み換えを含む。促進因子に操作可能に連結された、重鎖または軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターが、本明細書で提供される。
発現ベクターは従来の技術によって宿主細胞に転移され、その後遺伝子移入された細胞は従来の技術によって培養されて、本発明の方法において使用される重鎖または軽鎖ポリペプチドを生成する。特定の実施形態において、本方法において使用される重鎖および軽鎖ポリペプチドは、以下に詳述されるように、宿主細胞内で同時発現する。
様々な宿主−発現ベクター系が、本明細書で提供される重鎖および軽鎖ポリペプチドを発現させるために利用され得る。そのような宿主−発現系は、それにより関心対象のコード配列が生成され、続いて精製され得るビヒクルを意味するが、適切なヌクレオチドコード配列で変換または遺伝子移入されると、変更された重鎖および軽鎖をインサイチューで発現させ得る、細胞もまた意味する。これらは、例えば、変更された重鎖および軽鎖コード配列を含有する、組み換え細菌性ファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで変換された、大腸菌、枯草菌などであるが、これに制限されない細菌などの微生物と、例えば、重鎖および軽鎖ポリペプチドコード配列を含有する、組み換え酵母発現ベクターで変換されたサッカロミセス・ピキア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ）などであるが、これに制限されない酵母と、例えば、重鎖および軽鎖ポリペプチドコード配列を含有する、バキュロウイルスなどであるが、これに制限されない組み換えウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系と、例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ、または重鎖および軽鎖ポリペプチドコード配列を含有する組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で変換されたものなどであるが、これに制限されない組み換えウイルス発現ベクターに感染した植物細胞系と、哺乳類細胞のゲノム（例えば、メタロチオネイン促進因子）、または哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期促進因子、ワクシニアウイルス７．５Ｋ促進因子）に由来する促進因子を含有する、組み換え発現構築物を匿う、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ−２９３、ＮＳＯ、３Ｔ３細胞、ならびにその組み合わせおよび変異体などの哺乳類細胞系と、を含むが、これに限定されない。特定の実施形態において、大腸菌または真核細胞などの細菌細胞が、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同時発現のために使用される。いくつかの実施形態において、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中間初期遺伝子促進因子要素などのベクターと併用される、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳類細胞は、本明細書に記載される軽鎖および重鎖ポリペプチドの同時発現にとって効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ４５：１０１、およびＣｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２）。特定の一実施形態において、重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、構成促進因子、誘発性促進因子、または組織特異性促進因子によって制御される。
哺乳類宿主細胞において、多数のウイルスに基づいた発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、関心対象の重鎖および軽鎖ポリペプチドコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期促進因子および３部分リーダー配列に結合され得る。その後このキメラ遺伝子は、アデノウイルスゲノム内に、インビトロまたはインビボ組み換えによって挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）内の挿入は、成長可能で、重鎖および軽鎖ポリペプチドを感染宿主内で発現させることができる組み換えウイルスをもたらすであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３５５−３５９を参照されたい）。特定の開始シグナルは、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のためにもまた必要であり得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。更に、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするため、所望のコード配列の読み枠と位相があっていなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の、様々な由来のものであり得る。発現の効率は、適切な転写促進剤要素、転写停止剤、などの封入によって促進され得る（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照されたい）。
本明細書に記載される重鎖および軽鎖ポリペプチドの発現は、当該技術分野において既知である任意の促進因子または促進剤要素によって制御され得る。重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を制御するために使用され得る促進因子は、ＳＶ４０初期促進因子領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３'長末端リピートに含有される促進因子（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ２２：７８７−７９７）と、ヘルペスチミジンキナーゼ促進因子（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８．１４４１−１４４５）と、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９−４２）と、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）促進因子（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７−５５５１）と、βラクタマーゼ促進因子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃ促進因子（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５、"Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ"ｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２：７４−９４をもまた参照されたい）などの原核発現ベクターと、ノパリン合成酵素促進因子領域（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３０３：２０９−２１３）、またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡ促進因子（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：２８７１）、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼの促進因子（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ３１０：１１５−１２０）を含む植物発現ベクターと、酵母、またはＧａｌ４促進因子、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）促進因子、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）促進因子、アルカリホスファターゼ促進因子などの他の菌類、および組織特異性を呈し、遺伝子導入動物に利用されている、後続する動物転写制御領域、すなわち膵腺房細胞内で活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域からの促進因子要素（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ７：４２５−５１５）と、膵ベータ細胞内で活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１５：１１５−１２２）、リンパ系細胞内で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、精巣、乳腺、リンパ系、および肥満細胞内で活性であるマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ４５：４８５−４９５）、肝臓内で活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝臓内で活性であるアルファ胎児性タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：５３−５８と、肝臓内で活性であるアルファ１抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄細胞内で活性であるベータグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ４６：８９−９４と、脳内の乏突起神経膠細胞内で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ４８：７０３−７１２）と、骨格筋内で活性であるミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４：２８３−２８６）と、神経細胞内で活性である神経特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）（Ｍｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５７１−８３）と、神経細胞内で活性である脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）遺伝子制御領域（Ｔａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２５３：８１８−８２３）と、星状細胞内で活性であるグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）促進因子（Ｇｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ３２（５）：６１９−６３１；Ｍｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５７１−８３）、および視床下部内で活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：１３７２−１３７８）を含むが、これに限定されない。
加えて、宿主細胞株は、挿入配列の発現を調節する、または所望の特定の様式で遺伝子生成物を変更し、処理するように選択され得る。特定の促進因子による発現は、特定の誘発因子の存在により高められることができ、したがって遺伝子操作融合タンパク質の発現が制御され得る。更に、異なる宿主細胞は、翻訳および後翻訳処理および変更のための特性および特定の機構を有する（例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化）。適切な細胞系統または宿主系は、発現された外来性タンパク質の所望の変更および処理を確実にするために選択され得る。例えば、細菌系における発現は、非グリコシル化生成物を産生し、酵母における発現は、グリコシル化生成物を産生する。遺伝子生成物の一次転写物（例えば、グリコシル化およびリン酸化）の適切な処理のための細胞機構を有する、真核宿主細胞が使用され得る。そのような哺乳類宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ−２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＮＳＯ、および特に、例えば、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺヒト神経芽腫（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．７３：５１−５７）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽腫（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９８２，７０４：４５０−４６０）、Ｄａｏｙヒト小脳髄芽腫（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１１４４−１１４８）、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ神経膠芽腫細胞（Ｋｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２８Ａ：６０９−６１４）、ＩＭＲ−３２ヒト神経芽腫（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９７０，３０：２１１０−２１１８）、１３２１Ｎ１ヒト星状細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７７，７４：４８１６）、ＭＯＧ−Ｇ−ＣＣＭヒト星状細胞腫（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９８４，４９：２６９）、Ｕ８７ＭＧヒト神経膠芽腫−星状細胞腫（Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，１９６８，７４：４６５−４８６）、Ａ１７２ヒト神経膠芽腫（Ｏｌｏｐａｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２５２３−２５２９）、Ｃ６ラット神経膠腫細胞（Ｂｅｎｄａ ｅｔ ａｌ．，１９６８，Ｓｃｉｅｎｃｅ１６１：３７０−３７１）、Ｎｅｕｒｏ−２ａマウス神経芽腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７０，６５：１２９−１３６）、ＮＢ４１Ａ３マウス神経芽腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９６２，４８：１１８４−１１９０）、ＳＣＰヒツジ脈絡叢（Ｂｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４８：２１１−２２１）、Ｇ３５５−５、ＰＧ−４ネコ正常星状細胞（Ｈａａｐａｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：８２７−８３３）、Ｍｐｆフェレット脳（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ１８：９５２−９６０）、ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなどの、例えば、ＣＴＸ ＴＮＡ２ラット正常脳皮質（Ｒａｄａｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６４６７−６４７１）などの、正常細胞系統などの神経細胞系統を含むが、これに限定されない。更に、異なるベクター／発現系は、異なる程度で処理反応を実施し得る。
重鎖および軽鎖ポリペプチドの長期的で、高収率な生成のために、安定した発現系が使用され得る。例えば、本明細書に記載される重鎖および軽鎖ポリペプチドを安定して発現させる細胞系統が設計され得る。複製のウイルス由来を含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、促進因子、促進剤、配列、転写停止剤、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカによって制御されるＤＮＡによって変換され得る。外来性ＤＮＡの導入の後、操作された細胞は、濃縮培地において１〜２日間増殖することが可能であり得、次に選択培地に交換される。組み換えプラスミドにおける選択可能なマーカは、選択に対して抵抗性を付与し、細胞がプラスミドを染色体に安定して組み込み、増殖して、次には細胞系統にクローンおよび展開され得る増殖巣を形成することを可能にする。
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｃｅｌｌ１１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８：２０２６）を含むが、これに限定されない、多数の選択系が使用されてもよく、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ２２：８１７）遺伝子がｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ用いられてもよい。また、代謝拮抗抵抗性が、メトトレキセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：３５６７；Ｏ'Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１５２７）、ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２０７２）、アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）、ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ３０：１４７）遺伝子の選択の根拠として使用され得る。
特定の実施形態において、無細胞タンパク質発現系が、生細胞を使用せずに、重鎖および軽鎖ポリペプチドを同時発現させるために利用される。代わりに、ＤＮＡをＲＮＡに転写し、ＲＮＡをタンパク質に翻訳するために必要な全ての成分（例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、酵素、余因子、アミノ酸）は、インビトロでの使用のために溶液中に提供される。特定の実施形態において、インビトロ発現は、（１）重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードする遺伝子鋳型（ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）、ならびに（２）必要な転写および翻訳分子機構含有する反応溶液を必要とする。特定の実施形態において、細胞抽出物は、反応溶液の成分、例えば、ｍＲＮＡ転写のためのＲＮＡポリメラーゼ、ポリペプチド翻訳のためのリボソーム、適切なタンパク質折り畳みのために必須なｔＲＮＡ、アミノ酸、酵素余因子、エネルギー供給源、および細胞成分を実質的に供給する。無細胞タンパク質発現系は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、またはこれらの組み合わせに由来する溶解物を使用して調製され得る。そのような細胞溶解物は、酵素の正確な組成物および比、ならびに翻訳に必要である構築ブロックを提供する。いくつかの実施形態において、細胞の細胞質および細胞小器官成分のみを残すために、細胞膜は除去される。
いくつかの無細胞タンパク質発現系が、Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３０：１１８５−１１９４に再考察されるように、当該技術分野において既知である。例えば、無細胞タンパク質発現系は、原核または真核細胞に基づいて利用可能である。原核無細胞発現系の例は、大腸菌を含む。真核無細胞タンパク質発現系は、ウサギ網赤血球、コムギ胚、および昆虫細胞からの抽出物に基づいて、利用可能である。そのような原核および真核無細胞タンパク質発現系は、Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑｉａｇｅｎ、およびＮｏｖａｇｅｎなどの会社から商業的に入手可能である。当業者は、互いに対合することができる重鎖および軽鎖ポリペプチドを生成する適切な無細胞タンパク質発現系を容易に選択することができるであろう。更に、無細胞タンパク質発現系はまた、ＩｇＧ折り畳みの効率性を改良するために、シャペロン（例えば、ＢｉＰ）および異性化酵素（例えば、ジスルフィド異性化酵素）で補完され得る。
いくつかの実施形態において、無細胞発現系は、重鎖および軽鎖ポリペプチドをＤＮＡ鋳型（転写および翻訳）またはｍＲＮＡ鋳型（翻訳のみ）から同時発現させるために利用される。
一実施形態において、本方法は、標準的なジスルフィド架橋を介して連結される重鎖および軽鎖で行われ得る。他の実施形態において、本方法は、標準的なジスルフィド架橋を介して連結されない重鎖および軽鎖ポリペプチドで行われ得る。
重鎖および軽鎖ポリペプチドの同時発現
試験される重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードする、一連の構築物は、宿主細胞内で、または無細胞タンパク質発現系内で同時発現し、培養または反応培地から回収される。一連の構築物の同時発現は、一連のポリペプチド生成物をもたらす。特定の実施形態において、細胞から分泌される一連のポリペプチド生成物は、軽鎖ならびに軽鎖単量体および二量体と対合した重鎖を含み得る。
本明細書で提供される特定の実施形態において、重鎖をコードするＤＮＡの量は限定的である一方で、宿主細胞は、２つの軽鎖をコードする化学量論的量のＤＮＡで遺伝子移入される。ＬＣＣＡ比率は、スクリーニングによって決定され得る。一実施形態において、重鎖ポリペプチド（ＨＣ）対第１の軽鎖ポリペプチド（ＬＣ１）および第２の軽鎖ポリペプチド（ＬＣ２）の遺伝子移入の比率、すなわち、ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２は、１：１：１である。一実施形態において、重鎖ポリペプチド（ＨＣ）対第１の軽鎖ポリペプチド（ＬＣ１）および第２の軽鎖ポリペプチド（ＬＣ２）の遺伝子移入の比率、すなわち、ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２は、いくつかの例において、ＬＣ１およびＬＣ２が等しく発現するかどうかを決定するために、３：１：１である。別の実施形態において、重鎖ポリペプチド（ＨＣ）対第１の軽鎖ポリペプチド（ＬＣ１）および第２の軽鎖ポリペプチド（ＬＣ２）の遺伝子移入の比率、すなわち、ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２は、０．５：１：１である。いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドは、約１：２：２の所定の比率で発現する。一実施形態において、重鎖ポリペプチドならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドの比率は、約１：３：３の所定の比率で発現する。他の比率が使用されてもよく、本明細書で意図されることが、理解されるであろう。非限定的な一例において、ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２のＬＣＣＡ用量検証比率は、（５０：７５：２５、５０：５０：５０、および５０：２５：７５）または（５０：４０：６０、５０：５０：５０、および５０：６０：４０）であり得る。
一連の構築物が無細胞タンパク質発現系内で同時発現する、特定の実施形態において、２つの軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡの比率は、一連の構築物が宿主細胞内で同時発現する場合と同様である。
本明細書で提供される特定の実施形態において、軽鎖をコードするＤＮＡの量は限定的である一方で、宿主細胞は、２つの重鎖をコードする化学量論的量のＤＮＡで遺伝子移入される。一実施形態において、軽鎖ポリペプチド（ＬＣ）対第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣ１）および第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣ２）の遺伝子移入の比率、すなわち、ＬＣ：ＨＣ１：ＨＣ２は、１：１：１である。別の実施形態において、軽鎖ポリペプチド（ＬＣ）対第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣ１）および第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣ２）の遺伝子移入の比率、すなわち、ＬＣ：ＨＣ１：ＨＣ２は、０．５：１：１である。いくつかの実施形態において、軽鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の重鎖ポリペプチドは、約１：２：２の所定の比率で発現する。一実施形態において、軽鎖ポリペプチドならびに第１および第２の重鎖ポリペプチドの比率は、約１：３：３の所定の比率で発現する。
一連の構築物が無細胞タンパク質発現系内で同時発現する、特定の実施形態において、２つの重鎖および１つの軽鎖をコードするＤＮＡの比率は、一連の構築物が宿主細胞内で同時発現する場合と同様である。
特定の実施形態において、本明細書に記載される重鎖ポリペプチドの、少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドとの対合についての選択性を定量化する方法は、データの分析を可能にするために、少なくとも２つの対照試料の発現を含む。いくつかの実施形態において、対照試料を取得し、定量化する方法は、重鎖ポリペプチドならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドのうちの１つを、他の軽鎖ポリペプチドの不在下で同時発現させるステップと、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含む任意の構築物を単離するステップと、該構築物の量を定量化するステップであって、該量が、該重鎖ポリペプチドの該軽鎖ポリペプチドとの最大の検出可能な結合のための対照標準としての役割を果たす、ステップと、を含む。特定の実施形態において、対照とは、標識に使用される２つの軽鎖タグのうちの１つを有する軽鎖と共に重鎖が発現する、抗体である。これらの対照発現は、異なるタグを有する軽鎖の比率が、重鎖と軽鎖との間の物理的な相互作用ではなく実験によって制御される、タンパク質混合物を生成する。
重鎖、軽鎖、および対照試料が細胞から同時発現し、分泌されると、それらは、以下に記載される培養中の細胞から任意で分離され得る。
分泌されたタンパク質の細胞からの分離
本明細書に記載される方法およびアッセイの特定の実施形態は、細胞から同時発現する重鎖および軽鎖ポリペプチドを使用する。アッセイの形式に応じて、分泌されたタンパク質を、それらが発現した細胞から分離する任意のステップが含まれ得る。特定の実施形態において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはＦＡＣＳを利用するアッセイについて、分泌されたタンパク質を細胞から分離する任意のステップが含まれ得る。特定の実施形態において、例えば、二分子蛍光補完を使用する形式において、分泌されたタンパク質を細胞から分離するステップを含むことは必要でなくてもよい。
分泌されたタンパク質を細胞から分離する方法は、当該技術分野において既知である。一実施形態において、分泌されたタンパク質を細胞から分離するために、遠心分離が使用される。代替の実施形態において、分泌されたタンパク質を細胞から分離するために、カラム精製が使用される。
分泌されたタンパク質は、後続して単離された重鎖画分を調製するために使用される。
アッセイの設計に応じて、一連の対合したポリペプチド生成物内の生成物の組成物は、変動するであろう。図９は、一連の構築物が１つの重鎖および２つの固有軽鎖を含む実施形態において、一連の構築物が全細胞内に同時発現する際に、培地中に分泌される、予想される生成物のうちのいくつかを描写する。図１０は、一連の構築物が２つの固有重鎖および１つの軽鎖を含む実施形態において、一連の構築物が全細胞内に同時発現する際に、培地中に分泌される、予想される生成物のうちのいくつかを描写する。図１１は、一連の構築物が１つの完全長の重鎖および２つの固有軽鎖を含む実施形態において、一連の構築物が全細胞内に同時発現する際に、培地中に分泌される、予想される生成物のうちのいくつかを描写する。図１２は、一連の構築物が１つの完全長の重鎖、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む重鎖断片、ならびに２つの固有軽鎖を含む実施形態において、一連の構築物が全細胞内に同時発現する際に、培地中に分泌される、予想される生成物のうちのいくつかを描写する。
単離された重鎖対合ポリペプチド生成物の調製物
重鎖対合ポリペプチド生成物は、一連のポリペプチド生成物から単離される。本明細書で使用される場合、「重鎖対合ポリペプチド生成物」という用語は、重鎖と対合した発現したポリペプチド、例えば、第１の軽鎖ポリペプチドと、または第２の軽鎖ポリペプチドと対合した第１の重鎖ポリペプチドを指す。一連の構築物が１つの重鎖ならびに第１および第２の軽鎖を含む、一実施形態において、パートナー軽鎖ポリペプチドに結合した重鎖ポリペプチドは、特定のタンパク質分離位相に対する重鎖上のタグ上の認識部分の親和性を利用することによって単離され得る。あるいは、重鎖対合ポリペプチド生成物は、重鎖を特異的に認識する抗体を使用して単離され得る。そのような抗体は、当該技術分野において既知であり、例えば、重鎖ポリペプチドのＣＨ１領域に向けられる抗体を含む。単離された重鎖対合ポリペプチド生成物は、それに結合する重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを有するであろう。特定の非限定的な例として、重鎖が６×Ｈｉｓタグでタグ付けされる場合、重鎖を混合物内の他のタンパク質から分離するために、ニッケルが使用され得る。ニッケルは、例えば、カラムまたはチップなどの支持体に結合され得る。
重鎖対合ポリペプチド生成物が単離されると、重鎖ポリペプチドに結合した特定の軽鎖ポリペプチドが検出され得る。
軽鎖ポリペプチドの検出
いくつかの実施形態において、当該技術分野において既知である方法に従って、重鎖ポリペプチドに対合する軽鎖ポリペプチドの検出は、各軽鎖に付加されるタグ内の検出部分に基づいて行われる。例えば、軽鎖がＦＬＡＧでタグ付けされる場合、軽鎖は抗ＦＬＡＧ抗体で検出され得る。いくつかの実施形態において、軽鎖ポリペプチド自体は、軽鎖ポリペプチド上のアミノ酸配列に対して高い親和性を有するタンパク質の使用によって検出される。いくつかの実施形態において、軽鎖ポリペプチドは、蛍光、消光、放射活性、および化学発光のうちの１つ以上の使用によって検出される。
アッセイ形式
単離された重鎖画分の調製物について、様々な形式が意図される。例えば、単離された重鎖対合ポリペプチド生成物は、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲチップ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、およびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）を含むが、これに限定されない方法によって単離され得る。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法、アッセイ、およびシステムは、表面プラズモン共鳴を利用して、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの選択的対合を定量的に決定する。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、表面プラズモンが、金属材料および誘電材料の界面に入射する電磁放射による励起時に共鳴する、ハイスループット法を提供する。表面プラズモン共鳴は、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの間の相互作用などの、生体分子相互作用の検出に有用である。本明細書に記載される特定の実施形態において、センサーチップを含むセンサーチップを含む、重鎖および軽鎖ポリペプチドの選択的対合の定量的決定のためにＳＰＲを利用するための装置が提供される。いくつかの実施形態において、センサーチップは、重鎖ポリペプチド上の検出可能な部分（標識）などの、タグを捕捉することができる相互作用表面層を含む。一実施形態において、重鎖は、６×Ｈｉｓタグでタグ付けされ、単離された重鎖対合ポリペプチド生成物は、分泌されたタンパク質をＳＰＲ−ニッケルチップ上を通過させることによって単離される。この実施形態において、パートナー軽鎖に結合した重鎖を含む、単離された重鎖対合ポリペプチド生成物は、ＳＰＲチップに結合するであろう。代替の実施形態において、単離された重鎖対合ポリペプチド生成物は、ニッケルチップの代わりに抗ｈｉｓタグ抗体チップを有するＳＰＲを使用して単離される。
特定の実施形態において、センサーチップは、ヒスチジンでタグ付けされた重鎖ポリペプチドを結合するように設計された表面層を含む。
いくつかの実施形態において、表面層は、ＮＴＡキレートニッケル原子を含む。ヒスチジンの重鎖ポリペプチド上の結合は、ＮＴＡキレートニッケル原子に依存する。この相互作用の親和性
Figure 2015533089
は、重鎖−軽鎖結合の詳細な分析を可能にするのに一般的に十分に高い。Ｈｉｓタグを介した固定化はまた、リガンド分子を均質な方法で配向し、固定化が、結合手順中に、ｐＨまたはイオン強度の有意な変更なく行われることを可能にするという利点を有する。
しかしながら、多くの他の親和性タグ（例えば、ビオチンおよび抗原エピトープ）と同様に、親和性は、Ｈｉｓタグに隣接する部分によって作成される微小環境によって変動し得る。親和性はまた、緩衝剤環境、例えば、ｐＨおよびイオン強度によって影響を受け得る。重鎖ポリペプチドの表面上のシステイン、チロシン、トリプトファン、およびリシンの側鎖は、キレート材料への結合に関与し得るものの、これらの相互作用の親和性は、ヒスチジンタグで一般的に取得されるそれより典型的に有意に低い。いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチド濃度は、少なくとも約１０ｎＭである。特定の実施形態において、重鎖ポリペプチド濃度は、少なくとも約５０ｎＭである。特定の実施形態において、重鎖ポリペプチド濃度は、少なくとも約１００ｎＭである。特定の実施形態において、重鎖ポリペプチド濃度は、少なくとも約１５０ｎＭである。特定の実施形態において、重鎖ポリペプチド濃度は、約２００ｎＭ未満である。
酵素連結免疫吸着型アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
本明細書で使用される場合、「ＥＬＩＳＡ」とは、検出事象が抗体および酵素に基づく検出を使用する手段を指すが、この用語はまた、親和性試薬が抗体でない場合、または検出試薬が酵素でない場合でも、試薬の平板結合検出を記載するためにも使用される。ＥＬＩＳＡ型アッセイは、多くの方法で設計され得る。表面結合タンパク質の捕捉は、プラスチック平板への受動吸着によって、吸着された抗体での捕捉によって、またはビオチン化およびアビジン捕捉によって起こり得る。第２のタンパク質の検出は、タンパク質をシグナル産生酵素で直接標識することによって、酵素標識抗体の結合によって、非標識一次抗体および引き続く標識二次抗体の結合によって、または、ビオチン化および引き続く酵素連結アビジンによって、起こり得る。検出酵素は、比色、蛍光、または発光原反応を含み得る。これらのようなアッセイは、当該技術分野において既知であり、ＡｒｋｉｎらによるＡｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｉｔｔａｍｐａｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｎｏｎ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｓｓａｙ Ｆｏｒｍａｔｓ）に説明されるものを含むが、これに限定されない免疫学的および細胞プロトコルの書籍において入手可能である。
ＥＬＩＳＡは、該重鎖ポリペプチド上の認識部分との相互作用によって重鎖ポリペプチドを固定化するために有用な、相互作用表面層を含む装置を利用する。重鎖ポリペプチドに結合した軽鎖ポリペプチドは、酵素に連結された抗体の結合によって検出される。基質が添加されると、酵素は、軽鎖ポリペプチドの量に定量的に連結される測定可能な読み取りを生成する。ＥＬＩＳＡは、読み取りが酵素を使用することによって増幅されるため、非常に敏感であり得る。特定の実施形態において、二次抗体などの複数の層を使用することによって、更なる増幅が達成される。
ＥＬＩＳＡは、検出事象が抗体および酵素に基づく検出を使用することを技術的には意味するものの、いくつかの実施形態において、親和性試薬は抗体ではないか、または検出試薬は酵素ではない。いくつかの実施形態において、非酵素形式は、解離増感ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）と呼ばれる。ＤＥＬＦＩＡにおいて、検出シグナルは、ランタニドイオン、例えば、ユーロピウムの時間分解蛍光である。ランタニドイオンは、化学連結を通して親和性試薬に結合し、独自の洗剤混合物を添加すると、ユーロピウムは蛍光を発し、結合軽鎖ポリペプチドの濃度の高感度の測定を提供する。ランタニド蛍光の３つの特徴、ａ）長い発光寿命（ミリ秒）は、測定がポリペプチドの蛍光が減衰した後に開始することを可能にすることと、ｂ）発光は、ほとんどの生物学的材料が光を吸収または発光しない、約６００ｎｍで生じることと、ｃ）ランタニドの狭い発光スペクトルは、それらが多重化されることを可能にすることと、が高感度かつ選択的アッセイをもたらす。
ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）
ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）（解離増感ランタニド蛍光イムノアッセイ）は、それを従来のＥＬＩＳＡに対する優れた代替手段とする利益の組み合わせを提供する、非酵素の、堅固で高性能な免疫検出プラットフォームである。ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）（解離増感ランタニド蛍光イムノアッセイ）は、時間分解蛍光（ＴＲＦ）強度技術である。アッセイは、ランタニドキレート標識試薬を使用して、洗浄ステップを使用して未結合試薬を分離して、化合物または生体分子の存在を検出するように設計される。本技術は、ランタニドキレートの蛍光（例えば、ユーロピウム、サマリウム、およびテルビウム）に基づく。これらのランタニドキレート標識の蛍光減衰時間は、従来の蛍光色素分子より長く、自家蛍光バックグラウンドの低減のための時間分解能の効率的な使用を可能にする。感度は、ランタニドキレートが解離され、新しい高度蛍光キレートが保護ミセル溶液内に形成されるという、解離増感原理のため増加する。ＤＥＬＦＩＡランタニドキレートは、蛍光のためのこの解離／増感ステップ（特定のランタニドキレートに適切なＤＥＬＦＩＡ増感溶液、ＤＥＬＦＩＡ促進因子、およびＤＥＬＦＩＡ促進剤の添加によって誘発される）を必要とする。ＤＥＬＦＩＡアッセイのためのキットは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから商業的に入手可能である。
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）タンパク質間相互作用アッセイは、柔軟かつ敏感で、最大サイズで２００ｎｍの大きいタンパク質相互作用および複合体の測定に有用な均質なアッセイである。ビーズに基づく近接アッセイ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）アッセイは、商業的に入手可能で、アッセイ生物学的相互作用に対する融合タグ検出のための解決策を提供するビーズに基づく近接アッセイである。この技術は、タンパク質の混合物を標識するための広範囲のビーズの柔軟性を提供する。
他の蛍光法
蛍光イムノアッセイ法のうちのいくつかは、単純蛍光標識法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、時間分解蛍光（ＴＲＦ）、および走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）を含む。単純蛍光標識法は、受容体−リガンド結合、適切な蛍光の使用による酵素活性のため、およびｐＨ、イオン濃度、および電圧などの様々なインビボ生理学的変化の蛍光指標として使用され得る。ＴＲＦは、他の蛍光分子の発光が終了した後の、ランタニド系の蛍光を選択的に測定する方法である。ＴＲＦは、ＦＲＥＴと共に使用されてもよく、ランタニド系は、供与体または受容体となり得る。
蛍光偏光／異方性（ＦＰ）において、蛍光強度は、試料中の特定の蛍光色素分子の存在（および場合により量も）の指標を提供するために使用され得る。蛍光異方性は、蛍光放射が非ランダムに偏光する角度、すなわち、１つの偏光配向がその直交する偏光配向に対する優位を占める角度の測定を提供し得る。高度に異方性のシグナルは、高度に偏光する（例えば、直線偏光する）。高度に等方性のシグナルは、ランダム偏光に接近する。従来の一手法において、異方性（ｒ）は、以下の等式を使用して計算される：
Figure 2015533089
式中、ＩＶＨおよびＩＶＶは、（垂直に偏光する励起光に対して）水平および垂直偏光であり、Ｇは、蛍光を検出するために使用される光学機器の偏光偏倚を補正する。
アッセイ設計
本方法は、合理的に設計された重鎖および軽鎖対、天然重鎖および軽鎖、本方法を使用する際にスクリーニングされ得る重鎖および軽鎖対の選択性を決定するために使用されることができ、ポリペプチド設計方法論によって限定されない。
宿主細胞内、またはインビトロで同時発現する一連の構築物の組成物は、変動し得る。本方法のための例示的な設計変更を、表１に示す。
（表１）
Figure 2015533089
ＬＣＣＡ：軽鎖競合アッセイ、ＨＣＣＡ：重鎖競合アッセイ、ＯＲＣＡ：１アーム軽鎖競合アッセイ
＃２つのセットの群は、独立して定量化される。
＊タグは、特定の例において使用され得る。
表１はまた、一連のポリペプチド生成物内でどの群が定量化されるか、方法が互いと優先的にヘテロ二量体化するＦｃ領域を使用するかどうか、およびタグの有無で群がどのように定量化されるかに関連する詳細などの、各設計の様々な特徴を要約する。
一実施形態において、本方法は、軽鎖競合アッセイ（ＬＣＣＡ）として設定される。この実施形態において、一連の構築物は、１つのＨＣに加えて少なくとも２つの固有ＬＣを含む。ＨＣおよび２つの固有ＬＣはＦａｂ形式であり、すなわち、ＨＣがＶＨ領域およびＣＨ１領域を含む一方で、各ＬＣはＶＬ領域およびＣＬ領域を含む。一連の構築物は、ＨＣが限定的であるように同時発現する。一連の構築物は、全細胞内、または無細胞発現系内のいずれかで同時発現する。以上に示すように、一連の構築物が全細胞内で同時発現する場合、重鎖生成物は、それらが軽鎖と対合しない限り、細胞から分泌されないことが想定される。図１５は、ＬＣＣＡの一実施形態（ＬＣＣＡ−１）において、本方法がどのように行われるのかの一例を描写する図を提供する。図１５に示す実施形態において、重鎖および軽鎖のうちのそれぞれは、固有にタグ付けされる。ステップ１において、ＨＣ−ＬＣ対合群（重鎖対合ポリペプチド生成物）は、重鎖上のタグを使用して親和性精製によって単離される。ステップ２において、各ＨＣ−ＬＣ対の群が定量化される。使用される検出方法に応じて、ステップ１および２が組み合わせられ得ることが意図される。例えば、ＳＰＲ形式がアッセイに使用される場合、ステップ１および２は組み合わせられ得る。
別の実施形態において、本方法は、重鎖競合アッセイ（ＨＣＣＡ）として設定される。この実施形態において、一連の構築物は、１つのＬＣに加えて少なくとも２つの固有ＨＣを含む。ＬＣおよび２つの固有ＨＣはＦａｂ形式であり、すなわち、ＨＣがＶＨ領域およびＣＨ１領域を含む一方で、各ＬＣはＶＬ領域およびＣＬ領域を含む。一連の構築物は、ＬＣが限定的であるように同時発現する。一連の構築物は、全細胞内、または無細胞発現系内のいずれかで同時発現する。一連の構築物が全細胞内で同時発現する場合、重鎖生成物は、それらが軽鎖と対合しない限り、細胞から分泌されないことが想定される。図１６は、ＨＣＣＡの一実施形態において、本方法がどのように行われるのかの一例を描写する図を提供する。図１６に示す実施形態において、重鎖のみが固有にタグ付けされる。ステップ１において、ＨＣ−ＬＣ対合群（重鎖対合ポリペプチド生成物）は、重鎖上のタグを使用して親和性精製によって単離される。ステップ２において、各ＨＣ−ＬＣ対の群が定量化される。この実施形態において、ＨＣ−ＬＣ対を定量化する方法に応じて、ステップ１および２を組み合わせることもまた可能である。
別の実施形態において、本方法は、１アーム軽鎖競合アッセイ（ＯＲＣＡ）として設定される。この実施形態において、一連の構築物は、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む第１のＨＣと、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む第２のＨＣと、それぞれがＶＬ領域およびＣＬ領域を含む２つの固有ＬＣと、を含む。この実施形態において、ＣＨ３領域は、第１および第２のＨＣが優先的にヘテロ二量体化することを可能にする、少なくとも１つの変更を含む。一連の構築物は、完全長のＨＣが限定的であるという条件下で、全細胞内、または無細胞発現系内のいずれかで同時発現する。一連の構築物が全細胞内で同時発現する場合、重鎖生成物は、それらが軽鎖と対合しない限り、細胞から分泌されないことが想定される。図１７は、ＯＲＣＡの一実施形態において、本方法がどのように行われるのかの一例を描写する図を提供する。図１７に示す実施形態において、軽鎖のみが固有にタグ付けされる。この実施形態において、ステップ１において、ＨＣ−ＬＣ対合群（重鎖対合ポリペプチド生成物）は、抗Ｆｃ抗体を使用して親和性精製によって単離される。ステップ２において、各ＨＣ−ＬＣ対の群が定量化される。この実施形態において、ＨＣ−ＬＣ対を定量化する方法に応じて、ステップ１および２を組み合わせることもまた可能である。
更に別の実施形態において、本方法は、ＬＣＣＡ−１実施形態の変化形（ＬＣＣＡ−２）として設定される。この実施形態において、一連の構築物は、ＬＣＣＡ−１と同様に、１つのＨＣに加えて少なくとも２つの固有ＬＣを含むが、ただしＨＣがＶＨ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む一方で各ＬＣがＶＬ領域およびＣＬ領域を含む。一連の構築物は、ＨＣが限定的であるように同時発現する。一連の構築物は、全細胞内、または無細胞発現系内のいずれかで同時発現する。以上に示すように、一連の構築物が全細胞内で同時発現する場合、重鎖生成物は、それらが軽鎖と対合しない限り、細胞から分泌されないことが想定される。図１８は、ＬＣＣＡ−２の一実施形態において、本方法がどのように行われるのかの一例を描写する図を提供する。図１８に示す実施形態において、軽鎖のみが固有にタグ付けされる。ステップ１において、ＨＣ−ＬＣ対合群（重鎖対合ポリペプチド生成物）は、抗Ｆｃ抗体を使用して親和性精製によって単離される。ステップ２において、各ＨＣ−ＬＣ対の群が定量化される。使用される検出方法に応じて、ステップ１および２が組み合わせられ得ることが意図される。
更に別の実施形態において、アッセイは、ＬＣＣＡの別の変化形（ＬＣＣＡ−３）として設定される。この実施形態において、一連の構築物は、２つの固有ＬＣに加えて２つの固有ＨＣを含む。ＬＣおよびＨＣは、両方Ｆａｂ形式であり、すなわち、ＨＣがＶＨ領域およびＣＨ１領域を含む一方で、各ＬＣはＶＬ領域およびＣＬ領域を含む。特定の例において、一連の構築物は、ＨＣが限定的であるように同時発現し得る。一連の構築物は、全細胞内、または無細胞発現系内のいずれかで同時発現する。以上に示すように、一連の構築物が全細胞内で同時発現する場合、重鎖生成物は、それらが軽鎖と対合しない限り、細胞から分泌されないことが想定される。この実施形態において、重鎖および軽鎖のうちのそれぞれは、固有にタグ付けされる。ステップ１において、ＨＣ１−ＬＣおよびＨＣ２−ＬＣ対合群（重鎖対合ポリペプチド生成物）は、親和性精製によって別個に単離される。ステップ２において、ＨＣ−ＬＣ１およびＨＣ−ＬＣ２群は、それぞれ異なるＨＣ１またはＨＣ２群について定量化される。使用される検出方法に応じて、ステップ１および２が組み合わせられ得ることが意図される。
図８に示すように、本明細書に記載される方法の様々な実施形態は、一実施形態において、実用的ＬＣＣＡライブラリを開発するために使用され得る。簡潔には、図８は、実用的ＬＣＣＡライブラリの例示的な合理的設計におけるステップを図示する。まず、コンピュータ内で設計の「ＬＣＣＡライブラリ」（すなわち、設計１．．．設計Ｎ）を作成し（図８Ａ）、ライブラリを、ＨＣがＬＣ２ではなくＬＣ１と優先的に対合するように操作する（すなわち、ＨＣ−ＬＣ１＞＞ＨＣ−ＬＣ２）。これらの設計を、その後インビトロで試験する。この目的のために、本明細書の他の部分に記載されるように、当該技術分野において既知であるクローン化方法を使用して、ライブラリ設計を、発現ベクターに個別にクローン化する（ステップ２を参照されたい、図８Ｂ）。クローン化のためのキットもまた、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手可能であり、使用に関して本明細書で意図される。次に、ＬＣＣＡ設計（例えば、ＨＣ１、ＬＣ１１、およびＬＣ２１．．．ＨＣＮ、ＬＣ１Ｎ、およびＬＣ２Ｎ）を哺乳類細胞内（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ステップ３を参照されたい、図８Ｃ）で一時的に発現する。本明細書の他の部分に記載されるように、遺伝子移入の７日後、ＣＨＯ細胞上清を採取し、ＳＰＲ読み取りを使用して、各ＬＣＣＡ設計のＨＣ−ＬＣ１：ＨＣ−ＬＣ２群を定量化した（ステップ４、図８Ｄ）。その後、実用的設計を、設定基準（例えば、ＨＣ−ＬＣ１：ＨＣ−ＬＣ２＞＝７５：２５）に基づいて順位付けし、好結果の設計は、その後「実用的ＬＣＣＡライブラリ」の一部となる。より大きいデータセットを扱う場合、任意のデータマイニングステップ（＃５、図８Ｅ）が利用可能である。このステップ中、「ＨＣ−ＬＣ対合結果の大域分析」が任意で行われ得る。このステップは、それがデータ内の非自明かつ非明白なパターン／傾向を認識することを潜在的に可能にするため、かなり有益であり得る。最後に、実用的ＬＣＣＡライブラリをコンパイルする（図８Ｆ）。
結果の分析
結果が分析され得るいくつかの方法が存在する。以下に記載される方法は、分析の非限定的な例を表し、本出願の実施形態は、以下に記載に制限されることが意図されない。
特定の実施形態において、特定の軽鎖検出可能な部分を有する免疫グロブリン構築物の測定された質量を、単離された重鎖画分の量によって正規化する。等価質量比は、対応する対照試料について評価される（上記を参照されたい）。これらの２つの質量比の比率は、特定の認識部分を有する単離された免疫グロブリン構築物の百分率に等しい。他の軽鎖タグについて同一の計算が繰り返される。所与の変異についてこのように取得される百分率は、他の軽鎖（Ｌ２）の重鎖（Ｈ１）に対するよりも、軽鎖（Ｌ１）の重鎖（Ｈ１）に対する対合の特異性を反映する。ｐＨ１−Ｌ１およびｐＨ１−Ｌ２と示される。
いくつかの実施形態において、ＨＣ１：ＬＣ２またはＨＣ２：ＬＣ１を形成するための鎖の架橋対合が回避される、ＨＣ１：ＬＣ１およびＨＣ２：ＬＣ２対のセットなどの重鎖および軽鎖セットの固有かつ選択的な対を認識することは、二パラトープ抗体構築物の設計および合成に有用である。いくつかの実施形態において、二パラトープ構築物は二重特異性構築物である。一実施形態において、ＨＣ１：ＬＣ１の対合に由来するＦａｂが抗原Ａを標的とし得る一方で、ＨＣ２：ＬＣ２の対合に由来するＦａｂは抗原Ｂを標的とし得る。重鎖および軽鎖対の選択的形成対の同定は、二重特異性抗体を形成するヘテロ二量体重鎖対を有する、２つの固有軽鎖、ＬＣ１およびＬＣ２の同時発現を可能にする。
重鎖および軽鎖対の多数の対に対して導かれる対合特異性データは、図示的に、および異なるデータマイニング技術を使用して分析され得る。例えば、図１３は、軽鎖競合アッセイデータを表す二部グラフの一部を描写する。各正方形の節点は、特定の重鎖変異を表す。各円形の節点は、軽鎖変異の特定の対を表す。エッジで接続される２つのそのような節点は、軽鎖競合アッセイの１つの実験を表す。
エッジの様式は、実験の結果の関数である。実線の黒線は、重鎖が、対応する節点において、２つの軽鎖変異のうちの第１のものと対合するより高い傾向を有することを意味する。破線は、重鎖が、対応する節点において、２つの軽鎖変異のうちの第２のものと対合するより高い傾向を有することを意味する。節点の幅は、上記で定義された、Ｓの絶対値によって決定される：
Figure 2015533089
式中、競合種の測定された百分率が軽鎖競合アッセイによって測定される。２つの百分率間の差が大きいほど、エッジの幅は大きくなるであろう。
一方では太い実線エッジが添付され、他方では太い破線エッジが添付される、円形の節点を含有するグラフの一部は、それらが同時発現する際に所望の生成物を形成しやすい、重鎖および軽鎖変異の組み合わせを表す。そのような節点のサブグラフは、容易に抽出され、認識するのが視覚的に容易である。加えて、高度に無差別な変異は、それらは１つの型の複数の太いエッジと結合するため、容易に同定される。例えば、図１３において、軽鎖変異ＫおよびＬを含有する接点は、全てのアッセイにおいて、鎖Ｋの重鎖との優先的対合を生成した軽鎖の対を表す。これは、例えば、鎖Ｌの不良な特性、または鎖Ｋの非常に良好な特性によって引き起こされ得る。データ点の数が非常に大きくなると、図示表現により、異常値データの迅速な同定、および良好または不良な特性のいずれかを有するアッセイの共通設計要素の探索が可能になる。
一態様は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの選択的対合を可視化する方法を提供する。本方法は、１つ以上の処理装置と、方法を実行するために１つ以上の処理装置によって実行される１つ以上のプログラムを記憶する記憶装置とを含む、コンピュータシステム上で、以下のステップを実行することを含む。競合アッセイデータを取得する。競合アッセイデータは、複数の結合アッセイを含む。複数の結合アッセイのうちの各それぞれの結合アッセイが、溶液中で、複数の重鎖ポリペプチド構築物から選択される１つ以上の対応する重鎖ポリペプチドの第１の量を、複数の軽鎖ポリペプチド構築物から選択される１つ以上の対応する軽鎖ポリペプチドの第２の量に、溶液中の対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドまたは対応する１つ以上の軽鎖ポリペプチドのいずれかを限定する条件下で、曝露することを含む。対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドが限定的である場合、１つ以上の重鎖ポリペプチドが単一重鎖ポリペプチド構築物からなり、かつ１つ以上の軽鎖ポリペプチドが複数の軽鎖ポリペプチド構築物からなる。対応する１つ以上の軽鎖ポリペプチドが限定的である場合、１つ以上の軽鎖ポリペプチドが単一軽鎖ポリペプチド構築物からなり、かつ１つ以上の重鎖ポリペプチドが複数の重鎖ポリペプチド構築物からなる。
本方法において、グラフは複数の接点を含んで構築される。複数の節点は、節点の第１のサブセット、および接点の第２のサブセットを含む。接点の第１のサブセットにおける各それぞれの節点は、第１の図示形式で表示され、複数の結合アッセイのうちの１つ以上の結合アッセイにおける１つ以上の対応する重鎖ポリペプチドを固有に表す。接点の第２のサブセットにおける各それぞれの節点は、第２の図示形式で表示され、複数の結合アッセイのうちの１つ以上の結合アッセイにおける１つ以上の対応する軽鎖ポリペプチドを固有に表す。節点の第１のサブセットは、複数の結合アッセイにおいて使用された重鎖ポリペプチドの全てを集合的に表す。接点の第２のサブセットは、複数の結合アッセイにおいて使用された軽鎖ポリペプチドの全てを集合的に表す。
本方法において、グラフに複数のエッジを設定する。複数のエッジにおける各それぞれのエッジは、複数の結合アッセイにおける対応する結合アッセイを表し、かつ対応する結合アッセイにおける１つ以上の重鎖ポリペプチドを表す接点の第１のサブセット中の第１の節点を、対応する結合アッセイにおける１つ以上の軽鎖ポリペプチドを表す接点の第２のサブセット中の第２の接点と接続する。複数のエッジにおける各エッジの第１の図示様式は、対応する結合アッセイにおける限定的ポリペプチドが、対応する結合アッセイにおける非限定的ポリペプチドのうちの１つに対して選好を有するかどうかを示す。
いくつかの実施形態において、複数のエッジにおける各エッジの第２の図示様式は、対応する結合アッセイにおける限定的ポリペプチドが対応する結合アッセイにおける非限定的ポリペプチドのうちの１つに対して選好を有する量によって、決定される。いくつかの実施形態において、第１の図示様式は点線であり、第２の図示様式は線幅である。いくつかの実施形態において、複数のエッジにおける１つのエッジの線幅は、対応する結合アッセイにおける限定的ポリペプチドが対応する結合アッセイにおける非限定的ポリペプチドのうちの１つに対する選好を有する量によって、決定され、対応する結合アッセイにおける限定的ポリペプチドが、対応する結合アッセイにおける非限定的ポリペプチドのうちの１つに対する選好を有する量が多ければ多いほど、エッジの線幅は大きくなる。
いくつかの実施形態において、第１の図示形式は、第１の二次元閉形式の形状であり、第２の図示形式は、第１の二次元閉形式の形状以外の第２の二次元閉形式の形状である。いくつかの実施形態において、第１の図示形式は、第１の二次元地理的形状であり、第２の図示形式は、第１の二次元地理的形状以外の第２の二次元地理的形状である。例えば、いくつかの実施形態において、第１の二次元地理的形状または第２の二次元地理的形状は、ｎが３以上の整数であるｎ角形、円、または楕円からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、複数の結合アッセイのうちの各結合アッセイにおける対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含む単一重鎖ポリペプチド構築物からなる。更に、複数の結合アッセイのうちの各結合アッセイにおける１つ以上の軽鎖ポリペプチドは、第１の軽鎖ポリペプチド構築物および第２の軽鎖ポリペプチド構築物からなり、第１の軽鎖ポリペプチド構築物は、第１のＶＬ領域および第１のＣＬ領域からなり、第２の軽鎖ポリペプチド構築物は、第２のＶＬ領域および第２のＣＬ領域を含む。そのような実施形態において、複数のエッジにおける各エッジの線幅（Ｗ）は、対応する結合アッセイにおける単一重鎖ポリペプチド構築物が第１の軽鎖ポリペプチド構築物または第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対する選好を有する量によって、決定される。この量は、下記式によって決定される：
Figure 2015533089
式中、ｆは、線形または非線形関数であり、Ｐ１は、（ｉ）第１の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した単一重鎖ポリペプチド構築物の量と、（ｉｉ）第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した単一重鎖ポリペプチド構築物の量との組み合わせによって正規化された、第１の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した単一重鎖ポリペプチド構築物の量であり、Ｐ２は、（ｉ）第１の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した単一重鎖ポリペプチド構築物の量と、（ｉｉ）第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した単一重鎖ポリペプチド構築物の量との合計量によって正規化された、第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した単一重鎖ポリペプチド構築物の量である。
いくつかのそのような実施形態において、ｆは対数または指数関数である。いくつかのそのような実施形態において、単一重鎖ポリペプチド構築物が第１の軽鎖ポリペプチド構築物に優先的に結合する場合、第１の図示様式は実線であり、単一の重鎖ポリペプチド構築物が第２の軽鎖ポリペプチド構築物に優先的に結合する場合、第１の図示様式は破線である。
いくつかの実施形態において、複数の結合アッセイのうちの各結合アッセイにおける対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドは、第１のＶＨおよび第１のＣＨ１領域を含む第１の重鎖ポリペプチド構築物、ならびに第２のＶＨおよび第２のＣＨ１領域を含む第２の重鎖ポリペプチド構築物からなる。そのような実施形態において、複数の結合アッセイのうちの各結合アッセイにおける１つ以上の軽鎖ポリペプチドは、ＶＬおよびＣＬ領域を含む軽鎖ポリペプチド構築物からなる。いくつかのそのような実施形態において、複数のエッジにおける各エッジの線幅（Ｗ）は、対応する結合アッセイにおける単一軽鎖ポリペプチド構築物が第１の重鎖ポリペプチド構築物または第２の重鎖ポリペプチド構築物に対する選好を有する量によって、決定され、量は、下記式によって決定される：
Figure 2015533089
式中、ｆは、線形または非線形関数であり、Ｐ１は、（ｉ）第１の重鎖ポリペプチド構築物に対合した単一軽鎖ポリペプチド構築物の量と、（ｉｉ）第２の重鎖ポリペプチド構築物に対合した単一軽鎖ポリペプチド構築物の量との組み合わせによって正規化された、第１の重鎖ポリペプチド構築物に対合した単一軽鎖ポリペプチド構築物の量であり、Ｐ２は、（ｉ）第１の重鎖ポリペプチド構築物に対合した単一軽鎖ポリペプチド構築物の量と、および（ｉｉ）第２の重鎖ポリペプチド構築物に対合した単一軽鎖ポリペプチド構築物の量との合計量によって正規化された、第２の重鎖ポリペプチド構築物に対合した単一軽鎖ポリペプチド構築物の量である。
いくつかのそのような実施形態において、ｆは対数または指数関数である。いくつかのそのような実施形態において、単一軽鎖ポリペプチド構築物が第１の重鎖ポリペプチド構築物に優先的に結合する場合、第１の図示様式は実線であり、単一の軽鎖ポリペプチド構築物が第２の重鎖ポリペプチド構築物に優先的に結合する場合、第１の図示様式は破線である。いくつかのそのような実施形態において、
いくつかの実施形態において、複数の結合アッセイのうちの各結合アッセイにおける対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む単一重鎖ポリペプチド構築物からなる。更に、複数の結合アッセイのうちの各結合アッセイにおける１つ以上の軽鎖ポリペプチドは、第１の軽鎖ポリペプチド構築物および第２の軽鎖ポリペプチド構築物からなり、第１の軽鎖ポリペプチド構築物は、第１のＶＬおよび第１のＣＬ領域を含み、第２の軽鎖ポリペプチド構築物は、第２のＶＬおよび第２のＣＬ領域を含む。いくつかのそのような実施形態において、複数の結合アッセイにおける各結合アッセイは、溶液中に、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域からなる追加の分子実体を更に含む。いくつかのそのような実施形態において、複数のエッジにおける各エッジの線幅（Ｗ）は、対応する結合アッセイにおける単一重鎖ポリペプチド構築物が第１の軽鎖ポリペプチド構築物または第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対する選好を有する量によって、決定され、量は、下記式によって決定される：
Figure 2015533089
式中、ｆは、線形または非線形関数であり、Ｐ１は、（ｉ）第１の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した単一重鎖ポリペプチド構築物の量と、（ｉｉ）第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した単一重鎖ポリペプチド構築物の量との組み合わせによって正規化された、第１の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した単一重鎖ポリペプチド構築物の量であり、Ｐ２は、（ｉ）第１の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した単一重鎖ポリペプチド構築物の量と、（ｉｉ）第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した単一重鎖ポリペプチド構築物の量との合計量によって正規化された、第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した単一重鎖ポリペプチド構築物の量である。
いくつかのそのような実施形態において、ｆは対数または指数関数である。いくつかのそのような実施形態において、単一重鎖ポリペプチド構築物が第１の軽鎖ポリペプチド構築物に優先的に結合する場合、第１の図示様式は実線であり、単一の重鎖ポリペプチド構築物が第２の軽鎖ポリペプチド構築物に優先的に結合する場合、第１の図示様式は破線である。
いくつかの実施形態において、複数の結合アッセイのうちの１つの結合アッセイにおける曝露することは、１つ以上の対応する重鎖ポリペプチドおよび１つ以上の対応する軽鎖ポリペプチドの同時発現によって実行される。
ハイスループット
ハイスループットとは、本明細書で使用される場合、本明細書に記載される方法およびアッセイの、大規模および／または迅速な性能を指す。特定の実施形態において、本明細書に記載されるシステムは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの選択的対合のハイスループットスクリーニングにとって適切である。特定の実施形態において、本明細書に記載される方法およびアッセイにおいて有用な装置は、１週間当たり、少なくとも５０の異なる選択的重鎖−軽鎖対を処理することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法およびアッセイにおいて有用な装置は、１週間当たり、最大５００の異なる選択的重鎖−軽鎖対を処理することができる。１週間当たり、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、または１０００の異なる選択的重鎖−軽鎖対を処理することができる装置もまた提供される。
特定の実施形態において、ハイスループットを有する方法およびアッセイが提供される。いくつかの場合、本明細書に記載される方法またはアッセイは、１週間当たり、１装置当たり、少なくとも５０の異なる選択的対のスクリーニングに有用である。いくつかの場合、本明細書に記載される方法またはアッセイは、１週間当たり、１装置当たり、少なくとも１００の異なる選択的対のスクリーニングに有用である。いくつかの場合、方法またはアッセイは、１週間当たり、１装置当たり、少なくとも１５０の異なる選択的対のスクリーニングに有用である。いくつかの場合、方法またはアッセイは、１週間当たり、１装置当たり、少なくとも２００の異なる選択的対のスクリーニングに有用である。本明細書に記載されるいくつかの方法は、１週間当たり、１装置当たり、少なくとも３００の異なる選択的対のスクリーニングに有用である。
本明細書に記載されるハイスループット法、アッセイ、およびシステムは、堅固である。特定の実施形態において、本明細書に記載される方法、アッセイ、およびシステムは、可変流量を許容する。特定の実施形態において、本明細書に記載される方法およびアッセイは、流量における５％の変化を許容する。いくつかの実施形態において、方法およびアッセイは、流量における１０％の変化を許容する。流量における１５％の変化を許容する方法およびシステムが、いくつかの実施形態である。流量における２０％の変化を許容する方法およびアッセイもまた提供される。流量における２５％の変化を許容する方法およびアッセイもまた提供される。
タンパク質配列における小さい変化の効果を測定し得るアッセイが提供される。大きい表面積上の無差別なタンパク質間、ドメイン間、鎖間の相互作用は、通常、選択性を導入するために、複数の突然変異（スワップ）を必要とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、抗体構築物の単離または更なる精製を必要とせず、これにより、より効率的なスクリーニングを可能にする。本明細書に記載されるアッセイは敏感であり、すなわち、アッセイは、例えば、特定の例において、フェムトグラム／ウェル程度低くあり得る感度でＨＣ：ＬＣ対を検出し得る。
システムおよびキット：
本明細書に記載される方法を行うためのシステムおよびキットが提供される。重鎖および軽鎖ポリペプチドの選択的結合のハイスループットスクリーニングのための装置を含むキットが、いくつかの実施形態である。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載されるアッセイにとって有用な試薬を含む。いくつかの実施形態において、試薬は凍結乾燥される。本明細書に記載される重鎖および軽鎖ポリペプチドのための発現系を提供するキットおよびシステムが、いくつかの実施形態である。
免疫グロブリン重鎖領域、および相互作用表面層を含む装置によって捕捉されることができるタグを含む、重鎖ポリペプチドと、第１の免疫グロブリン軽鎖領域を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、第２の免疫グロブリン軽鎖領域を含む少なくとも１つの第２の軽鎖ポリペプチドと、を発現させるための、１つ以上の宿主細胞であって、該重鎖ポリペプチドおよび該軽鎖ポリペプチドが、重鎖ポリペプチドの量が限定的であるように、所定の比率で発現し、該第１および第２の軽鎖ポリペプチドが、検出可能な部分でタグ付けされる、宿主細胞と、該重鎖ポリペプチドを捕捉することができる相互作用表面層を含む検出装置であって、該検出装置が各該軽鎖ポリペプチド上の検出可能な部分を検出することが更に可能であり、重鎖ポリペプチドおよび該第１または第２の軽鎖ポリペプチドを含む構築物が、該１つ以上の宿主細胞によって発現し、かつ該検出装置と接触し、該検出装置が、重鎖ポリペプチドおよび第１の軽鎖ポリペプチドを含む第１の構築物の量と、重鎖ポリペプチドおよび第２の軽鎖ポリペプチドを含む第２の構築物の量とを、第２の構築物と比較してより多い第１の構築物の量が第２の軽鎖ポリペプチドと比較してより高い第１の軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を示すように検出するために有用である、検出装置と、を含む、重鎖ポリペプチドの、少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドとのハイスループットスクリーニングのためのシステムが提供される。
下記の実施例は、本発明の実施を例示するために提示される。これらは、本発明の全範囲を限定または定義することを意図しない。
実施例１： 軽鎖競合アッセイ（ＬＣＣＡ）
図１は、二重特異性Ｍａｂ（モノクローナル抗体）を形成するための操作必要条件、および重鎖軽鎖対を定量化するために必要なアッセイ必要条件の高レベル概略図を図示する。高純度（すなわち、誤対合Ｈ−Ｌ結合がほとんどまたは全くない）の二重特異性Ｍａｂを作製するという設計目標は、（特定のアミノ酸突然変異の導入を介して）２つの固有重鎖の、それらの固有同種軽鎖に対する優先的対合を合理的に操作することによって、達成され得る。この工程は、概略的に示され、ここで、Ｈ１はＬ２ではなくＬ１と優先的に対合するように操作されている。同様に、Ｈ２は、Ｌ１ではなくＬ２と優先的に対合するように操作されている。二重特異性Ｍａｂ設計の実験的スクリーニングは、Ｈ１−Ｌ１：Ｈ１−Ｌ２およびＨ２−Ｌ２：Ｈ２−Ｌ１を同時に定量化することができるアッセイを必要とする。これらのアッセイ必要条件は、各二重特異性Ｆａｂアームが独立的に作製され得ると仮定することによって、簡易化され得る。この場合、アッセイは、両方を同時にではなく、Ｈ１−Ｌ１：Ｈ１−Ｌ２またはＨ２−Ｌ２：Ｈ２−Ｌ１のみを定量化する必要がある。
以下のプロトコルは、軽鎖タグ付けされた群のＳＰＲ読み取りを使用する、アッセイの重要なステップの記載を提供する。図２は、例示的な全細胞発現：軽鎖競合アッセイを図示する。
軽鎖競合アッセイ：
Figure 2015533089
ＨＣ限定的：ＨＣ限定的。Ｈ：Ｌ１：Ｌ２＝１：１：１。軽鎖は重鎖について競合する。
初期変異体において、Ｈ−Ｌジスルフィド結合は観察されなかった。
軽鎖競合アッセイは、１つの重鎖の、少なくとも２つの固有軽鎖に対する相対的対合を定量化する。アッセイおよび前ステップは、以下のように要約され得る。１．重鎖が限定的である量（例えば、ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２＝１：１：１）での、重鎖および軽鎖の随伴性発現、２．ｈｉｓタグプルダウンを介して重鎖をＳＰＲチップに結合することによって達成される、ＨＣ−ＬＣ複合体の単離、ならびに３．相対的ＨＣ−ＬＣ群の定量化（すなわち、Ｈ１−Ｌ１：Ｈ１−Ｌ２）。ＳＰＲ形式において、固有軽鎖タグ付けされた群に特異的な抗体が、定量化に使用される。このアッセイは、Ｈ−Ｌジスルフィドの有無に関わらず行われ得ることに留意すること。
図３Ａおよび３Ｂは、アッセイがＳＰＲチップ上にいかに設定されるか、加えて、各軽鎖タグ付けされた群の百分率がいかに計算されるかの方法についての概略的記載の例を提供する。
ＳＰＲサンドイッチに基づくアッセイ（図３Ａ）が利用される：
１． Ｆａｂを捕捉する（Ｈｉｓタグ捕捉）−定量化する
２． 対照Ｆａｂを捕捉する（ＷＴ ＨＣ＋１００％ＷＴ ＦＬＡＧ−ＬＣまたは１００％ＷＴ ＨＡ−ＬＣ）−定量化する
３． 抗タグＡｂを捕捉する−定量化する
４． １００ＲＵ結合Ｆａｂ当たりの、抗タグＡｂ捕捉を正規化する
＊抗タグＦａｂ群を計算する（％）。
＊計算：
１． （標準抗Ｆｌａｇ Ａｂ ＲＵ／標準抗ＦＬＡＧ Ａｂ ＲＵ［対照］）×１００＝％抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ。
２． （標準抗ＨＡ Ａｂ ＲＵ／標準抗ＦＬＡＧ Ａｂ ＲＵ（対照））×１００＝％抗ＨＡ Ｆａｂ。
図３Ａにおいて、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６チップの概略を示す。各チップは、各細胞が結合反応を監視することができる、６×６格子の細胞で構成される。ＬＣＣＡにおいて、変異体および対照は、チップを横切る垂直方向に注入され、抗ｈｉｓタグＡｂを介してチップに結合する（更なる詳細については図３Ｂおよび実施例５を参照されたい）。洗浄ステップの後、（別個の細胞内で）チップを横切って水平に抗ＬＣタグＡｂを注入する。捕捉される各抗ＬＣタグＡｂの量は、（１００％ＬＣ１またはＬＣ２のみを有する）適切なＦａｂ対照に対して、ＨＣ−ＬＣ１およびＨＣ−ＬＣ２の相対的群が各変異体について計算されることを可能にする。上述の群を計算するために必要なステップは、計算に関して上述されている。
図４は、１００％ＨＣ：ＨＡ−ＬＣまたは１００％ＨＣ：ＦＬＡＧ−ＬＣの既知の比率が、所定の比率で混合される、ドーピング実験のプロットを図示する。精製されたＨＣ：ＨＡ−ＬＣおよびＨＣ：ＦＬＡＧ−ＬＣを既知の比率で混合する。Ｆａｂ混合物をＳＰＲチップ上にロードし、ＨＡおよびＦＬＡＧについてシグナルを読み取る。抗タグ抗体の読み取りは、ＬＣ−ＦＬＡＧまたはＬＣ−ＨＡの比率に対してプロットされる場合、およそ線形である。シグナル対ＬＣ群が線形の特性を有することは、ＨＣ−ＬＣ１群：ＨＣ−ＬＣ２群を定量化するための容易な手段を提供する。
実施例２：軽鎖競合アッセイの理論
反応定義および平衡挙動
１つの重鎖Ｈ、ならびに２つの軽鎖Ｌ１およびＬ２の同時発現では、以下の反応が可能である。
Figure 2015533089
これらの反応のそれぞれに対して、結合および解離速度定数が存在し、後者の反応は前者よりも遅いことが予想される。
アッセイのための所望の特性は、Ｌ２のＨとの対合に対するＬ１のＨとの対合についての相対傾向である。ＨＬ２種よりも高いＨＬ１種の相対量を生成する設計は、所望の特性を有する設計である。したがって、中央量は、以下の比率である。
Figure 2015533089
Ｒは、２つのＦａｂ種の量の比率である。ＳはＲの対数であり、Ｌ１のＨとの対合とＬ２のＨとの対合の間の自由エネルギー差に比例する。Ｐ１およびＰ２は、それぞれ、所望のおよび不所望の種の百分率である。この論述から、これは以下に従う。
Figure 2015533089
上記で定義した比率が所与の設計の関心対象の物理的特性を表すようにするために、発現におけるＬ１およびＬ２の量は、Ｈの量に対して過剰である必要がある。そのような条件下で、対合は競合となり、ＨＬ２の量に対するＨＬ１の量は、それぞれＨと対合したＬ１、およびＨと対合したＬ２の、相対的適合または適合性を反映することが予想される。
実験的出力をいかに解釈するかを理解するために、上記の比率は、結合および解離速度定数に異なる値を割り当てること、ならびに、そのように定義された化学反応速度の問題を解決することによって、理論的に演算される。この問題を解決するために、定常状態の反応速度が有効であると想定する。これは、結合および解離速度定数間の比率、言い換えると、平衡定数のみが、形成される種の量に影響を与えるということを意味する。
まず、Ｆａｂを形成する最初の２つを除き、全ての反応が、ゼロの確率を有すると想定する。同時発現における、Ｌ１およびＬ２の相対量の関数としての、ＨＬ１およびＨＬ２の相対量間の関係を演算し、図５に示す。関係は単純であり、縦軸との交点は、対合傾向の比率の対数に等しい。データを表示するための代替方法は、関係を、Ｌ１の百分率をｘ軸上に、およびＨＬ１の百分率をｙ軸上に変換することである。この関係を、図５と同じ対合傾向比率が使用される、図６に示す。見られるように、傾向は異なって見え、特に対合傾向における差が大きいほど、同一量のＬ１について得られるＨＬ１の量は多く、全ての曲線は下限および上限における同一点に接近する。
軽鎖二量体もまた非ゼロ確率で形成する条件下では、用量スケーリング曲線はわずかに変化する。例えば、軽鎖二量体を形成する対合傾向が、Ｌ１およびＬ２について等しい場合、傾きは低減するが、定量的傾向は保存されるということが示され得る。
実施例３：ＬＣＣＡの設定の分析
他の部分に記載されるように、ＬＣＣＡにおいて、異なってタグ付けされたＨＬ１およびＨＬ２は、まずチップ上で捕捉され、その後、捕捉される二次抗タグ抗体の量の、光学シグナルへの変換による、２つのＦａｂ種の定量化が後続する。典型的なＳＰＲチップを図７に図示し、以下の分析において細胞に対して使用される標識もまた同様に紹介する。
続いて、ＬＣＣＡを実行するために以下のステップを採る。（１）変異ＤＮＡで遺伝子移入された細胞から排出された物質を、図７の図において、チップの底部の入り口から上部まで流す。これが行われる際、水平チャネルは閉鎖される。（２）垂直チャネルを閉鎖する。（３）それぞれの細胞上にロードされた物質の質量を、単位ＲＵにおいて評価する。（４）水平チャネルを開放する。（５）＿抗ＨＡ、抗ＦＬＡＧ、およびＦａｂの溶解性抗原などの様々な二次抗体を、図７の図において左の入り口から右に流す。質量の追加を、単位ＲＵにおいて評価する。
Figure 2015533089
は、変異体ｖ１の細胞から排出された物質におけるＦａｂの総量を示す。
Figure 2015533089
は、Ｆａｂの数とＦａｂの質量との間の変換係数を示す。実験の正確性において、全てのＦａｂは、同一の変換係数を有する。ｄ＾ｉ＿ｖｅｒｔｉｃａｌは、図７における縦の流れに沿って、第ｉ列と供給源溶液中の濃度との間で、分子濃度がどれだけ異なるかを定量化する、係数を示す。ＳＰＲチップ上の流れが完全に平衡化されている場合、この係数は全ての細胞について値が１である。したがって、以下の関係が成り立つ。
Figure 2015533089
Figure 2015533089
は、種ＨＬ１のものである変異体ｖ１のＦａｂの画分を示す。
Figure 2015533089
は、ＨＬ２の対応する量を示す。
水平の流れについては、垂直の流れと同様の量が導入され、以下の関係が定式化される：
Figure 2015533089
式中、以下の量が導入される。
Figure 2015533089
は細胞ｊと、挿入される溶液との間で、二次抗体の濃度がどれだけ異なるかを定量化する係数を示し、ns1は二次抗体の数であり、ρs1は二次抗体の密度である。捕捉Ｆａｂの量への依存性は、二次がＦａｂにのみ結合することに由来する。二次抗体ｓ１がＨＬ１のタグに結合するという任意の割り当ても同様に行われた。
ＳＰＲで、
Figure 2015533089
の量に直接比例するシグナルが、ＳＰＲ機械の不正確さに由来する特定の誤差を伴って測定される。機械誤差であるｅ（σ）は、正規分布し、ゼロを中心とし、何らかの標準偏差σであると想定される。
２つの質量の比率は、
Figure 2015533089
であり、式中、誤差は、分母内で無視できるほど小さいと想定され、Ｃは定数である。
対照試料は、ＨＬ１の量が１００％である、言い換えると
Figure 2015533089
であることが既知の場合に、流される。対応する質量比をＲＳ１，１００％と表す。したがって、質量比の比率は、以下の通りである。
Figure 2015533089
二次抗体の分布が、水平寸法に沿ってほぼ均一である限り、二次抗体の濃度は、変異体を含有するチャネルおよび対照を含有するチャネルについてほぼ同一であり、この比率は、所与の試料のＨＬ１の画分である関心対象の量を返す。本想定が妥当でなく対照変異体は常に同一チャネル内を流れるとしても、以下の関係が得られる。
Figure 2015533089
本実験の誤差内で、右側の量は濃度の分数
Figure 2015533089
に等しく、したがって、これは、反応定義について前の節に記載した、量の演算を可能にする。
実施例で用いられる試薬は、商業的に入手可能であるか、または商業的に入手可能な、当該技術分野において既知である、器具、方法、または試薬を使用して調製され得る。前述の実施例は、本発明の様々な態様および本発明の方法の実施を図示する。実施例は、本発明の多くの実施形態の網羅的な記載を提供することを意図しない。したがって、前述の発明は、理解を明確にする目的で例示および例により幾らか詳細に記載されてきたが、当業者は、多くの変更および修正を、添付の特許請求の範囲の精神および範囲を逸脱することなく実施できることを容易に理解する。
実施例４： Ｄ３Ｈ４４ＩＧＧ重鎖およびＤ３Ｈ４４ＩｇＧ軽鎖をコードする構築物の調製
本明細書に記載される方法における使用のための、抗組織因子抗体Ｄ３Ｈ４４の重鎖および軽鎖を、以下の通りに調製した。Ｄ３Ｈ４４Ｆａｂ軽鎖（ＡＪ３０８０８７．１）および重鎖（ＡＪ３０８０８６．１）配列を、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）から取得した。１つの重鎖および２つの異なる軽鎖を含む同時発現セットを、該重鎖の、該軽鎖のうちの１つとの選択的対合を駆動するために、重鎖および軽鎖配列のＦａｂ領域において少なくとも１つの突然変異を起こすことにより設計した。
同時発現セットを、哺乳類発現のために、遺伝子合成し、コドン最適化した。５'−ＥｃｏＲＩ切断部位−ＨＬＡ−Ａシグナルペプチド−ＨＡまたはＦＬＡＧタグ−軽鎖クローン−ＴＧＡ終止−ＢａｍＨ１切断部位−３'からなる、軽鎖ベクター挿入物を、ｐＴＴ５ベクターにライゲーションした（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２；３０，Ｎｏ．２ｅ９）。得られたベクター＋挿入物を、続いて、コードＤＮＡの正確な読み枠および配列を確認するために配列決定に供した。同様に、５'−ＥｃｏＲ１切断部位−ＨＬＡ−Ａシグナルペプチド−重鎖クローン−ＡＢＤ２−Ｈｉｓ６タグ−ＴＧＡ終止−ＢａｍＨ１切断部位−３'からなる重鎖ベクター挿入物を、ｐＴＴ５ベクター（ＡＢＤ；アルブミン結合ドメイン）にライゲーションした。得られたベクター＋挿入物もまた、続いて、コードＤＮＡの正確な読み枠および配列を確認するために配列決定に供した。
実施例５：Ｄ３Ｈ４４ＩｇＧ軽鎖および／または重鎖における変更を含む同時発現セットにおける、ヘテロ二量体の優先的対合の評価
実施例４に従って調製された、変更されたＦａｂドメインを有するＤ３Ｈ４４重鎖および軽鎖を含む同時発現セットにおいて、ヘテロ二量体が優先的に対合する能力を決定し、結果を図５に示す。２つの固有Ｄ３Ｈ４４軽鎖構築物と共に相対軽鎖対合特異性（例えば、Ｈ１＿Ｌ１：Ｈ１＿Ｌ２）を有して同時発現する１つのＤ３Ｈ４４重鎖構築物をそれぞれ含む、１５種の同時発現セットを試験した。いくつかの例において、ヒットが取得されることを確認するため、および設計の堅固性の評価を提供するために、任意で検証ステップが方法に含まれ得る。重鎖（ＨＣ）は、競合アッセイスクリーニングおよび検証の両方について、限定的な量（すなわち、ＨＣ＜Ｌ１＋Ｌ２）に保持された。方法は、以下のように行われた。
遺伝子移入方法
実施例４に記載するように調製された、１つの重鎖および２つの軽鎖構築物を含む同時発現セットを、以下のように、ＣＨＯ−３Ｅ７細胞内に遺伝子移入した。ＣＨＯ−３Ｅ７細胞を、４ｍＭのグルタミンおよび０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号２４０４０−０３２）を補ったＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＴＭ Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ−１３８３５０１）内で、３７℃で培養した。２ｍｌの増殖培地内の２００万個の細胞（ＣＨＯ−３Ｅ７）を、１：２．５のＤＮＡ：ＰＥＩ比率でＰＥＩ−ｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓカタログ番号１１５−０１０）を使用して、合計２μｇのＤＮＡで遺伝子移入した。ＤＮＡ−ＰＥＩ混合物の添加の２４時間後、細胞を、３２℃に移した。７日目に、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって上清を発現について試験し、続いて、バンドを視覚化するためにクマシーブリリアントブルー染色を行った。ＨＣ：ＬＣ比率は、表２に示す通りである。ＬＣＣＡスクリーニングおよび検証のため、ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２比率の例を使用した。それぞれの２ｍｌのＣＨＯ／ＨＥＫ細胞培養を遺伝子移入するために使用されるＤＮＡの相対量もまた提供される。注：「遺伝子移入に使用されるＤＮＡ量」は、ベクターならびに挿入物（例えばＨＣ）を含む。
（表２）
Figure 2015533089
＃ＨＣ：重鎖、Ｌ１：軽鎖１、Ｌ２：軽鎖２
＾スタッファーＤＮＡ：ＤＮＡ挿入を有さないＰＴＴ５ベクター。
競合アッセイＳＰＲ法
同時発現セットにおける、Ｄ３Ｈ４４重鎖に対する優先的Ｄ３Ｈ４４軽鎖対合の程度を、各軽鎖のＮ末端に位置する固有エピトープタグのＳＰＲに基づく読み取りを使用して、評価した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）供給。ＧＬＭセンサーチップ、Ｂｉｏｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎアミン結合キット（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓＮＨＳ）およびエタノールアミン）、並びに、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝剤を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）から購入した。組み換えＨｅｒ−２タンパク質を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、およびＮａＣｌを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）から購入した。１０％のＴｗｅｅｎ２０溶液を、Ｔｅｋｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入した。
ＳＰＲバイオセンサーアッセイ。全ての表面プラズモン共鳴アッセイは、ＢｉｏＲａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ））をＰＢＳＴランニング緩衝剤（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ Ｔｅｋｎｏｖａ Ｉｎｃ）と共に２５℃で使用して、行った。抗ペンタＨｉｓ捕捉表面はＧＬＭセンサーチップを使用して生成し、分析物（水平）方向に１００μＬ／分で１４０秒間注入された標準ＢｉｏＲａｄ ｓＮＨＳ／ＥＤＣ溶液の１：５希釈によって活性化させた。活性化の直後、１０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５内の抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）の２５μｇ／ｍＬ溶液を、約３０００の共鳴ユニット（ＲＵ）が固定化されるまで、分析物（垂直）方向に、２５μＬ／分の流量で注入した。残存する活性基を、１Ｍのエタノールアミンの分析物方向での１００μＬ／分での１４０秒間の注入によって急冷し、これもまた、疑似活性化したインタースポットがブランク参照のために作成されるということを確実にする。
抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．）および抗ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．）モノクローナル抗体に対する結合についての、ヘテロ二量体のスクリーニングは、リガンド方向でのヘテロ二量体の抗ペンタＨｉｓ表面上への間接捕捉に続く、分析物方向での抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＡの注入という、２つのステップで行った。まず、リガンド方向での、１００μＬ／分での３０秒間の１回の緩衝剤注入が、ベースラインを安定化させるために使用された。各ヘテロ二量体捕捉について、細胞培養培地内の未精製ヘテロ二量体を、ＰＢＳＴ内で４％まで希釈した。１〜５種のヘテロ二量体または対照（すなわち、１００％ＨＡ軽鎖または１００％ＦＬＡＧ軽鎖のいずれかを含有する対照）を、２４０秒間、２５μＬ／分の流れで、個別のリガンドチャネルに同時に注入した。これは、抗ペンタＨｉｓ表面上への、約３００〜４００ＲＵの飽和ヘテロ二量体捕捉をもたらした。第１のリガンドチャネルは、必要であればブランク対照として使用するために、ブランクのままにした。このヘテロ二量体捕捉ステップの直後に、ベースラインを安定化させるための、分析物方向での２回の緩衝剤注入が続き、その後、１８０秒間の解離期を伴って、５ｎＭの抗ＦＬＡＧおよび５ｎＭの抗ＨＡを５０μＬ／分で１２０秒間、二つ組でそれぞれ注入し、捕捉されたヘテロ二量体のそれぞれに対する緩衝剤基準を有する、一連の結合センサーグラムをもたらした。可能な場合、ヘテロ二量体が結合する抗原は、活性対照として最後に残存する分析物チャネルを介してもまた注入され得る。ヘテロ二量体を、次の注入周期のための抗ペンタＨｉｓ表面を調製するために、１８秒間、１００μＬ／分での０．８５％のリン酸の１８秒間のパルスによって再生した。センサーグラムを緩衝剤ブランク注入およびインタースポットを使用して整列および二重基準化し、得られたセンサーグラムを、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖ３．０を使用して分析した。
ＳＰＲから取得されたデータを、実施例２および３に記載されるように分析した。
処理されたデータは、表３に示すように、ＳＰＲに基づくアッセイから取得され得る。Ｈ１またはＨ２＋ＬａおよびＬ２両方を有する、軽鎖競合アッセイの結果の選択が提供される。優先的Ｈ１−Ｌ１およびＨ２−Ｌ２結合が達成された。
（表３）静電気／立体に基づく設計
Figure 2015533089
理論的には、Ｌ１およびＬ２の合計の百分率は、合計１００％になるべきである。実際には、いくつかの変異体について、Ｌ１およびＬ２の総量が１００％を大きく下回ることが観察された。合計軽鎖百分率におけるこの相違は、一部には、ＳＰＲチップ上での初期ヘテロ二量体捕捉の際の、可変非特異性結合の生成によるものであると考えられる。
１台のＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機械上でのＬＣＣＡ処理量は、典型的には、１日当たり６０の変異体、または１週間当たり３００の変異体である。ＳＰＲ機械は、１週間当たり４または５日間動作し得るということが理解されるべきである。更に、より高い処理量のスクリーニング速度は、資材の増加（例えば、２台のＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機械の使用）によって、または、より高い処理量のＳＰＲ機械への交換によって、達成され得る。
実施例６：スクリーニングアッセイの結果は「野生型形式」における選択的対合を予測する
「Ｆａｂ対設計」（実用的なＨ１−Ｌ１＋Ｈ２−Ｌ２設計の組み合わせ）のＬＣＣＡ結果は、対応する２つの完全長の重鎖が２つの固有軽鎖構築物（野生型形式）と同時発現される際に取得される結果と、正の相関を示す。重鎖ポリペプチドが互いと優先的にヘテロ二量体化するように、ＣＨ３領域内に突然変異を有する２つの該重鎖を使用して、「野生型形式」における対合を試験するためのアッセイを以下の通り行った。
２つの固有完全長の重鎖構築物が、２つの固有軽鎖構築物と同時発現し、１０の可能性のある抗体種：Ｈ１＿Ｌ１：Ｈ１＿Ｌ１、Ｈ１＿Ｌ２：Ｈ１＿Ｌ２、Ｈ１＿Ｌ１：Ｈ１＿Ｌ２、Ｈ２＿Ｌ１：Ｈ２＿Ｌ１、Ｈ２＿Ｌ２：Ｈ２＿Ｌ２、Ｈ２＿Ｌ１：Ｈ２＿Ｌ２、Ｈ１＿Ｌ１：Ｈ２＿Ｌ１、Ｈ１＿Ｌ２：Ｈ２＿Ｌ２、Ｈ１＿Ｌ２：Ｈ２＿Ｌ１、およびＨ１＿Ｌ１：Ｈ２＿Ｌ２をもたらした。Ｈ１＿Ｌ１：Ｈ２＿Ｌ２種は、正確に対合したヘテロ二量体である。好適な種Ｈ１＿Ｌ１：Ｈ２＿Ｌ２の量対他の量に関する相対的対合特異性を、プロテインＡ（ｐＡ）精製の後に、ＬＣ−ＭＳを使用して決定された。不均質性および質量分析からの結果を混同する危険性を低減するために、Ｃ末端ＬＹＳを、重鎖から除去した。可能である限りタグを除外し；混合物内の可能性のある種のうちのいずれかの間の質量の差が５０Ｄａ未満であった場合、１つまたは両方の軽鎖を、Ｎ末端ＨＡタグ融合および／またはＦＬＡＧタグ融合を伴って設計した。重鎖（ＨＣ）を、限定的な量に保持した（すなわち、ＨＣ＜Ｌ１＋Ｌ２）。
図１４は、１７種の「Ｆａｂ対設計」についての、ＬＣＣＡ Ｆａｂ１（すなわち、ＨＣ１：ＬＣ１：ＬＣ２；ｘ軸）およびＦａｂ２（すなわち、ＨＣ１：ＬＣ１：ＬＣ２；ｙ軸）の結果を示す。両方のＦａｂアーム上で良好に稼働する（すなわち正確に対合したＦａｂの高い百分率を示す）設計が、プロットの第１象限において見られる。あまる効果的に機能しない（例えば、１つのＦａｂアームが良好に稼動していない）設計が、プロットの第３象限に示される。野生型形式におけるＦａｂ対設計の性能を、データ点の着色によって示す（凡例を参照されたい）。正の相関が明白に見られ、良好に機能するＬＣＣＡ Ｆａｂ対設計は、野生型形式に良好につながる（すなわち、正確に対合したＦａｂの百分率が高い）。同様に、不良に稼働するＬＣＣＡ Ｆａｂ対設計は、野生型形式において比較的不良に機能する。注：混合ＬＣＣＡの結果は、Ｄ３Ｈ４４およびＰｅｒｔｕｚｕｍａｂの混合物から取得した。例えば、Ｆａｂ１ ＬＣＣＡは、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ＨＣ、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ＬＣ１、およびＤ３Ｈ４４ＬＣ２であり得る。
本明細書に記述された全ての公報、特許、および特許出願は、まるでそれぞれ個別の公報、特許、および特許出願が特定的および個別に参照として組み込まれるように示されているかのように、同一程度で、参照として本明細書に組み込まれる。

Claims (134)

  1. 軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法であって、
    （ａ）ＶＨおよびＣＨ１領域を含む第１の重鎖ポリペプチドと、
    第１のＶＬおよび第１のＣＬ領域を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
    第２のＶＬおよび第２のＣＬ領域を含む第２の軽鎖ポリペプチドと
    を含む、一連の構築物を同時発現させるステップであって、前記重鎖ポリペプチドおよび前記軽鎖ポリペプチドが、前記重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、前記一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、
    （ｂ）前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドと対合した前記重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を、前記一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、
    （ｃ）前記重鎖対合ポリペプチド生成物において、前記第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および前記第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量のステップと
    を含み、
    前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した前記重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての前記重鎖ポリペプチドの選択性を示す、方法。
  2. 前記重鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドが、約０．２５：１：１の所定の比率で発現する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記重鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドが、約１：２：２の所定の比率で発現する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記重鎖ポリペプチド、ならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドが、約１：３：３の所定の比率で発現する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記同時発現が、宿主細胞内においてである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記同時発現が、インビトロ無細胞発現系においてである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  7. 発現後に、発現したポリペプチドを発現培地から分離するステップを更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ポリペプチドが、遠心分離によって分離される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ポリペプチドが、精製カラムの使用によって分離される、請求項７に記載の方法。
  10. ＶＨおよびＣＨ１領域を含む前記第１の重鎖ポリペプチドが、ＣＨ３領域を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 第２の重鎖ポリペプチドの同時発現を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 少なくとも１つの重鎖ポリペプチドが、ＣＨ２領域またはその断片を含む、請求項１０〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記重鎖ポリペプチド、ならびに前記第１および第２の軽鎖ポリペプチドのうちの１つを、少なくとも１つの宿主細胞内で、他の軽鎖ポリペプチドの不在下で発現させるステップと、
    前記重鎖ポリペプチドおよび前記軽鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を単離するステップと、
    前記生成物の量を定量化するステップであって、前記量が、前記重鎖ポリペプチドの前記軽鎖ポリペプチドとの最大の検出可能な結合のための対照標準としての役割を果たす、ステップと
    を更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記重鎖ポリペプチドおよび所望の軽鎖ポリペプチドを含む生成物が、陽性対照標準を提供する、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記重鎖ポリペプチドおよびあまり所望でない軽鎖ポリペプチドを含む生成物が、陰性対照標準を提供する、請求項１３に記載の方法。
  16. 全ての未結合のポリペプチドを、単離された構築物から除去するステップを更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドが、検出可能な部分を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 検出可能な部分が、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または、更なる検出可能な部分を含むタグである、請求項１６に記載の方法。
  19. 各軽鎖ポリペプチドが、異なる検出可能な部分を含む異なるタグで標識されている、請求項１８に記載の方法。
  20. 少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドが、相互作用表面層を含む表面上に捕捉されかつ更に装置によって検出および定量化されることができる、タグを含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記重鎖ポリペプチドが、タグで標識されている、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記重鎖ポリペプチドを標識している前記タグが、相互作用表面層を含む表面上に捕捉されかつ更に装置によって検出および定量化されることができる、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記装置が、前記第１および第２の軽鎖ポリペプチドのうちの少なくとも１つにおける前記検出可能な部分を検出および定量化することができる、請求項２０および２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記装置が、ハイスループットが可能である、請求項２０、２２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 検出可能な部分の前記検出が、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲチップ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせによる測定を含む、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記検出可能な部分の前記検出が、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含む、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  27. 競合する重鎖もしくは軽鎖ポリペプチド、またはそれらの組み合わせの存在下でのＦａｂ含有構築物の選択的形成を決定する方法であって、
    ＶＨおよびＣＨ１領域を含む第１の重鎖ポリペプチド、ならびに
    第１のＶＬおよび第１のＣＬ領域を含む第１の軽鎖ポリペプチド、
    １つ以上の他の重鎖ポリペプチド、軽鎖ポリペプチド、またはこれらの組み合わせ
    を同時発現させるステップであって、前記第１の軽鎖ポリペプチドが、選択的に前記重鎖ポリペプチドと結合して、所望のＦａｂ構築物を形成する、ステップと、
    前記第１の重鎖ポリペプチドまたは前記第１の軽鎖ポリペプチドを含む各Ｆａｂ構築物を単離するステップと、
    所望のＦａｂ構築物の量を、他のＦａｂ構築物と比較して検出するステップであって、前記所望のＦａｂ構築物のより多い量が、前記Ｆａｂ構築物の形成のより高い選択性を示す、ステップと
    を含む、方法。
  28. 前記第１の重鎖ポリペプチド、および前記軽鎖ポリペプチドが、異なる検出可能な部分を含むタグで標識されている、請求項２７に記載の方法。
  29. 合理的に設計されたＦａｂ構築物の、他の重鎖または軽鎖ポリペプチドの存在下で自己結合する能力を決定する方法であって、請求項２７〜２８のいずれか一項に記載の方法を含み、前記第１の重鎖ポリペプチドおよび前記第１の軽鎖ポリペプチドが結合して、前記設計されたＦａｂ構築物を形成する、方法。
  30. 前記同時発現が、細菌細胞である宿主細胞内においてである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記同時発現が、酵母細胞である宿主細胞内においてである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記同時発現が、哺乳類細胞である宿主細胞内においてである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記哺乳類細胞が、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ−２９３、ＮＳＯ、３Ｔ３細胞、およびこれらの派生物のうちの少なくとも１つである、請求項３２に記載の方法。
  34. ６×Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｃ−ｍｙｃ、ｓ−ＦＬＡＧ、ＳＢＰ、Ｖ５、およびＡＢＤから選択される、前記重鎖および軽鎖ポリペプチドのうちの少なくとも１つのための少なくとも１つのタグを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 二パラトープ抗体構築物を形成するためのＦａｂ構築物の選択における、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法の使用。
  36. 前記二パラトープ抗体構築物が、二重特異性抗体構築物である、請求項３０に記載の使用。
  37. 前記二パラトープ抗体構築物が、同一の抗原上の２つの異なる部位を結合する、請求項３０に記載の使用。
  38. （ａ）第１の免疫グロブリン重鎖領域を含む第１の重鎖ポリペプチドと、
    前記第１の重鎖ポリペプチドと結合して第１のＦａｂ構築物を形成することができる、第１の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
    第２の免疫グロブリン重鎖可変領域を含む第２の重鎖ポリペプチドと結合して第２のＦａｂ構築物を形成することができる、第２の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む第２の軽鎖ポリペプチドと
    を同時発現させるステップであって、前記第１および第２の重鎖ポリペプチドが、前記重鎖ポリペプチドが互いと優先的にヘテロ二量体化するように、変異ＣＨ３領域を含む、ステップと、
    （ｂ）前記第１の重鎖ポリペプチドおよびいずれか１つの前記軽鎖ポリペプチドを含んで形成されたＦａｂ構築物の量を検出するステップと、
    （ｃ）前記第２の重鎖ポリペプチド、第１の軽鎖ポリペプチド、および第２の軽鎖ポリペプチドを宿主細胞において発現させるステップと、
    （ｄ）前記第２の重鎖ポリペプチドおよびいずれか１つの前記軽鎖ポリペプチドを含んで形成されたＦａｂ構築物の量を検出するステップと
    を含み、
    他のＦａｂ構築物と比較した、ステップ（ｂ）における前記第１のＦａｂ構築物のより多い量、およびステップ（ｄ）における前記第２のＦａｂ構築物のより多い量が、前記ポリペプチドが自己集合してヘテロ多量体抗体構築物を形成し得ることを示す、前記ヘテロ多量体抗体構築物を設計するための、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  39. ヘテロ多量体抗体を設計するための、ポリペプチドのハイスループットスクリーニング方法であって、
    （ａ）第１の免疫グロブリン重鎖可変領域を含む第１の重鎖ポリペプチドと、
    前記第１の重鎖ポリペプチドと結合して第１のＦａｂ構築物を形成することができる、第１の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
    第２の免疫グロブリン重鎖可変領域を含む第２の重鎖ポリペプチドであって、前記第１および第２の重鎖ポリペプチドは変異ＣＨ３可変領域を含むヘテロ多量体を形成することができる、第２の重鎖ポリペプチドと、
    前記第２の重鎖ポリペプチドと結合して第２のＦａｂ構築物を形成することができる、第２の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む第２の軽鎖ポリペプチドと
    を取得するステップと、
    （ｂ）溶液中で、前記第１の重鎖ポリペプチドを、前記第１および第２の軽鎖ポリペプチドと接触させるステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）の前記溶液中で、前記第１の重鎖ポリペプチドおよびいずれか１つの前記軽鎖ポリペプチドを含んで形成されたＦａｂ構築物の量を検出するステップと、
    （ｄ）別の溶液中で、前記第２の重鎖ポリペプチドを、前記第１および第２の軽鎖ポリペプチドと接触させるステップと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）の前記溶液中で、前記第２の重鎖ポリペプチドおよびいずれか１つの前記軽鎖ポリペプチドを含んで形成されたＦａｂ構築物の量を検出するステップと
    を含み、
    他のＦａｂ構築物と比較した、ステップ（ｃ）における前記第１のＦａｂ構築物のより多い量、およびステップ（ｅ）における前記第２のＦａｂ構築物のより多い量が、前記ポリペプチドが自己集合してヘテロ多量体抗体構築物を形成し得ることを示す、方法。
  40. 各軽鎖ポリペプチドおよび各重鎖ポリペプチドが、異なる検出可能な部分を含む異なるタグで標識されている、請求項３８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 各重鎖タグが、相互作用表面層を含む装置によって捕捉されることができる、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記装置が、各軽鎖ポリペプチド上の前記タグを定量的に認識することができる、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記装置が、ハイスループットが可能である、請求項４１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記検出可能な部分が、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲチップ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせによる測定によって、定量化可能に検出される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記検出可能な部分が、蛍光、消光、放射活性、または化学発光による測定によって、定量化可能に検出される、請求項４０に記載の方法。
  46. 軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を決定するハイスループット法であって、
    免疫グロブリン重鎖可変領域を含む重鎖ポリペプチドと、
    第１の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
    第２の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む少なくとも１つの第２の軽鎖ポリペプチドと
    を取得するステップと、
    溶液中で、前記重鎖ポリペプチドおよび前記軽鎖ポリペプチドを、前記重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように、所定の比率で接触させるステップと、
    前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドと対合した前記重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を単離するステップと、
    前記第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および前記第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を定量化するステップと
    を含み、
    前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した前記重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての前記重鎖ポリペプチドの選択性を示す、方法。
  47. 重鎖ポリペプチドの軽鎖ポリペプチドとの選択的対合についてのハイスループットスクリーニングのシステムであって、
    免疫グロブリン重鎖可変領域、および相互作用表面層を含む装置によって捕捉されることができるタグを含む、重鎖ポリペプチドと、
    第１の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
    第２の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む少なくとも１つの第２の軽鎖ポリペプチドと
    を発現させるための、１つ以上の宿主細胞、またはインビトロ機構であって、
    前記重鎖ポリペプチドおよび前記軽鎖ポリペプチドが、重鎖の量が前記第１および第２の軽鎖ポリペプチドの合計より多くなるように、所定の比率で発現し、前記第１および第２の軽鎖ポリペプチドが、検出可能な部分でタグ付けされる、宿主細胞、またはインビトロ機構と、
    前記重鎖ポリペプチドを捕捉することができる相互作用表面層を含む検出装置であって、前記検出装置が各前記軽鎖ポリペプチド上の前記検出可能な部分を検出することが更に可能であり、
    前記重鎖ポリペプチドおよび第１または第２の軽鎖ポリペプチドを含む構築物が、前記１つ以上の宿主細胞によって発現し、かつ前記検出装置と接触し、
    前記検出装置が、前記重鎖ポリペプチドおよび第１の軽鎖ポリペプチドを含む第１の構築物の量と、前記重鎖ポリペプチドおよび第２の軽鎖ポリペプチドを含む第２の構築物の量とを、前記第２の構築物と比較してより多い前記第１の構築物の量が前記第２の軽鎖ポリペプチドと比較してより高い前記第１の軽鎖ポリペプチドとの対合についての前記重鎖ポリペプチドの選択性を示すように検出するために有用である、検出装置と
    を含む、システム。
  48. 前記検出装置と接触させる前に、前記構築物を前記１つ以上の宿主細胞から単離するための機構を更に含む、請求項４７に記載のシステム。
  49. 前記重鎖ポリペプチドならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドの前記所定の比率が、約０．２５：１：１である、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載のシステム。
  50. 前記重鎖ポリペプチドならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドの前記所定の比率が、約１：２：２である、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載のシステム。
  51. 前記重鎖ポリペプチドならびに第１および第２の軽鎖ポリペプチドの前記所定の比率が、約１：３：３である、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載のシステム。
  52. 請求項４７〜５２のいずれか一項に記載のシステム、および使用説明書を含む、重鎖ポリペプチドの軽鎖ポリペプチドとの選択的対合のハイスループットスクリーニングのためのキット。
  53. 試薬および緩衝剤を更に含む、請求項５２に記載のキット。
  54. 前記重鎖および軽鎖ポリペプチドを精製するための機構を更に含む、請求項５２に記載のキット。
  55. （ｃ）が、ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２を捕捉する表面上で検出されるＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２間の対合を定量化することを含み、前記方法が、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲチップ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせ、ならびに前記ユニットのうちの１つ以上と前記環境との間の相互作用について前記表面をスクリーニングすることを含む、請求項１に記載の方法。
  56. 前記対合が、検出可能な部分を定量化することによって検出される、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記検出可能な部分が、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または更なる検出可能な部分を含むタグである、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記検出可能な部分の検出が、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含む、請求項５６または５７に記載の方法。
  59. 前記ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２を含む環境が、複合分子混合物、細胞上清、宿主細胞の細胞質、またはこれらの組み合わせである、請求項５５に記載の方法。
  60. 特定の軽鎖タグを有する抗体の質量が、単離された重鎖画分の量によって正規化される、請求項１に記載の方法。
  61. 等価質量比が対照抗体に対して評価される、請求項６０に記載の方法。
  62. ２つの質量比の比率が、特定のタグを有する単離された抗体の百分率に等しい、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記方法によって取得されたデータが汎用コンピュータに送信され、前記データを出力することが、前記結果をデータ記憶媒体上に記憶することを含む、請求項５５〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. ＨＣ−ＬＣ結果を分析するステップを任意に含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 対合された重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドのＬＣＣＡライブラリを構築するステップを更に含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法であって、
    （ａ）ＶＬおよびＣＬ領域を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
    第１のＶＨおよび第１のＣＨ１領域を含む第１の重鎖ポリペプチドと、
    第２のＶＨおよび第２のＣＨ１領域を含む第２の重鎖ポリペプチドと
    を含む、一連の構築物を同時発現させるステップであって、前記軽鎖ポリペプチドおよび前記重鎖ポリペプチドが、前記軽鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、前記一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、
    （ｂ）前記第１または第２の重鎖ポリペプチドと対合した前記軽鎖ポリペプチドを含む軽鎖対合ポリペプチド生成物を、前記一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、
    （ｃ）前記軽鎖対合ポリペプチド生成物において、前記第１の重鎖ポリペプチドと対合した軽鎖ポリペプチドの量、および前記第２の重鎖ポリペプチドと対合した軽鎖ポリペプチドの量のステップと
    を含み、
    前記第１または第２の重鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した前記軽鎖ポリペプチドの、他方の重鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、前記第１または第２の重鎖ポリペプチドとの対合についての前記軽鎖ポリペプチドの選択性を示す、方法。
  67. 前記第１または前記第２の重鎖ポリペプチドが、Ｆｃ領域を更に含む、請求項１に記載の方法。
  68. 前記第１および前記第２の重鎖ポリペプチドが、Ｆｃ領域を更に含む、請求項１に記載の方法。
  69. 前記第１または前記第２の重鎖ポリペプチドが、Ｆｃおよび領域およびＦｖ領域を含む、請求項１に記載の方法。
  70. 前記第１および前記第２の重鎖ポリペプチドが、Ｆｃ領域およびＦｖ領域を含む、請求項１に記載の方法。
  71. 前記第１または前記第２の重鎖ポリペプチドが、Ｆｃ領域を更に含む、請求項６６に記載の方法。
  72. 前記第１および前記第２の重鎖ポリペプチドが、Ｆｃ領域を更に含む、請求項６６に記載の方法。
  73. 前記第１または前記第２の重鎖ポリペプチドが、Ｆｃ領域およびＦｖ領域を含む、請求項６６に記載の方法。
  74. 前記第１および前記第２の重鎖ポリペプチドが、Ｆｃ領域およびＦｖ領域を含む、請求項６６に記載の方法。
  75. 軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法であって、
    （ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む第１の重鎖ポリペプチドと、
    第１のＶＬおよび第１のＣＬ領域を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
    第２のＶＬおよび第２のＣＬ領域を含む第２の軽鎖ポリペプチドと
    を含む、一連の構築物を同時発現させるステップであって、前記重鎖ポリペプチドおよび前記軽鎖ポリペプチドが、前記重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、前記一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、
    （ｂ）前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドと対合した前記重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を、前記一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、
    （ｃ）前記重鎖対合ポリペプチド生成物において、前記第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および前記第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量のステップと
    を含み、
    前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した前記重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての前記重鎖ポリペプチドの選択性を示す、方法。
  76. 軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法であって、
    （ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む完全長の重鎖ポリペプチドと、
    ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む重鎖ポリペプチドと、
    第１のＶＬおよび第１のＣＬ領域を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
    第２のＶＬおよび第２のＣＬ領域を含む第２の軽鎖ポリペプチドと
    を含む一連の構築物を同時発現させるステップであって、前記重鎖ポリペプチドおよび前記軽鎖ポリペプチドが、前記完全長の重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、前記一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、
    （ｂ）前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドを有する、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む前記重鎖ポリペプチドと対合した前記完全長の重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を、前記一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、
    （ｃ）前記重鎖対合ポリペプチド生成物において、前記第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および前記第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を決定するステップと
    を含み、
    前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した前記重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての前記重鎖ポリペプチドの選択性を示す、方法。
  77. Ｈと対合するＬ１の相対対合傾向を、Ｈと対合するＬ２の相対対合傾向と比較して決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  78. ＨＬ２種よりも高いＨＬ１種の相対量を生成する対合したポリペプチドを選択するステップを更に含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 以下の計算式に従って比率を比較するステップを含み、
    Figure 2015533089
    式中、Ｒは、前記２つのＦａｂ種の量の比率であり、ＳはＲの対数であって、Ｌ１のＨとの対合とＬ２のＨとの対合の間の自由エネルギー差に比例し、Ｐ１およびＰ２は、
    Figure 2015533089
    であるような、それぞれ所望のおよび不所望の種の百分率である、請求項７８に記載の方法。
  80. 軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法であって、
    （ａ）ＶＨ領域、ＣＨ１領域、および第１の検出可能な標識（タグ）を含む重鎖ポリペプチドと、
    第１のＶＬ、第１のＣＬ領域、および第２の検出可能な標識を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
    第２のＶＬ、第２のＣＬ領域、および第３の検出可能な標識を含む第２の軽鎖ポリペプチドと
    を含む、一連の構築物を同時発現させるステップであって、前記重鎖ポリペプチドおよび前記軽鎖ポリペプチドが、前記完全長の重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、前記一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、
    （ｂ）前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドと共に前記重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を、前記一連のポリペプチド生成物から、前記重鎖ポリペプチド上の前記第１の検出可能な標識を使用して単離するステップと、
    （ｃ）前記重鎖対合ポリペプチド生成物において、前記第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および前記第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を決定するステップと
    を含み、
    前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した前記重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての前記重鎖ポリペプチドの選択性を示す、方法。
  81. 前記第１の検出可能な標識が、６×Ｈｉｓタグである、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記第２の検出可能な標識が、前記第３の検出可能な標識とは異なる、請求項８０に記載の方法。
  83. （ｃ）の決定するステップが、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせを含む、請求項８０に記載の方法。
  84. 前記検出可能な標識が、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または更なる検出可能な部分を含むタグである、請求項８０に記載の方法。
  85. 前記検出可能な標識の検出が、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含む、請求項８４に記載の方法。
  86. 重鎖ポリペプチドとの対合についての軽鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法であって、
    （ａ）ＶＬ領域およびＣＬ領域を含む軽鎖ポリペプチドと、
    第１のＶＨ、第１のＣＨ１領域、および少なくとも１つの検出可能な標識を含む第１の重鎖ポリペプチドと、
    第２のＶＨ、第２のＣＨ１領域、および少なくとも１つの検出可能な標識を含む第２の重鎖ポリペプチドと
    を含む、一連の構築物を同時発現させるステップであって、前記軽鎖ポリペプチドおよび前記重鎖ポリペプチドが、前記軽鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、前記一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、
    （ｂ）前記第１または第２の重鎖ポリペプチドと共に前記軽鎖ポリペプチドを含む軽鎖対合ポリペプチド生成物を、前記一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、
    （ｃ）前記軽鎖対合ポリペプチド生成物において、前記第１の重鎖ポリペプチドと対合した軽鎖ポリペプチドの量、および前記第２の重鎖ポリペプチドと対合した軽鎖ポリペプチドの量を決定するステップと
    を含み、
    前記第１または第２の重鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した前記軽鎖ポリペプチドの、他方の重鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、前記第１または第２の重鎖ポリペプチドとの対合についての前記軽鎖ポリペプチドの選択性を示す、方法。
  87. （ｃ）の決定するステップが、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせを含む、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記第１の重鎖ポリペプチドが、２つの標識で標識されている、請求項８６に記載の方法。
  89. 前記第１の重鎖ポリペプチドが、６×Ｈｉｓタグおよび第２の標識で標識されている、請求項８６に記載の方法。
  90. 前記第２の重鎖ポリペプチドが、２つの標識で標識されている、請求項８６に記載の方法。
  91. 前記第２の重鎖ポリペプチドが、６×Ｈｉｓタグおよび第２の標識で標識されている、請求項８６に記載の方法。
  92. 前記検出可能な標識が、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または更なる検出可能な部分を含むタグである、請求項８６に記載の方法。
  93. 前記検出可能な標識の検出が、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含む、請求項９２に記載の方法。
  94. 軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法であって、
    （ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む完全長の重鎖ポリペプチドと、
    ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む重鎖ポリペプチドと、
    第１のＶＬ、第１のＣＬ領域、および第１の検出可能な標識を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
    第２のＶＬ、第２のＣＬ領域、および第２の検出可能な標識を含む第２の軽鎖ポリペプチドと
    を含む、一連の構築物を同時発現させるステップであって、前記重鎖ポリペプチドおよび前記軽鎖ポリペプチドが、前記完全長の重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、前記一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、
    （ｂ）重鎖対合ポリペプチド生成物を抗Ｆｃ抗体で単離するステップと、
    （ｃ）前記重鎖対合ポリペプチド生成物において、前記第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および前記第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を決定するステップと
    を含み、
    前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した前記重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての前記重鎖ポリペプチドの選択性を示す、方法。
  95. （ｃ）の決定するステップが、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせを含む、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記第１の検出可能な標識が、前記第２の検出可能な標識とは異なる、請求項９４に記載の方法。
  97. 前記検出可能な標識が、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または更なる検出可能な部分を含むタグである、請求項９４に記載の方法。
  98. 前記検出可能な標識の検出が、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法であって、
    （ａ）ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む完全長の重鎖ポリペプチドと、
    第１のＶＬ、第１のＣＬ領域、および第１の検出可能な標識を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
    第２のＶＬ、第２のＣＬ領域、および第２の検出可能な標識を含む第２の軽鎖ポリペプチドと
    を含む、一連の構築物を同時発現させるステップであって、前記重鎖ポリペプチドおよび前記軽鎖ポリペプチドが、前記完全長の重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、前記一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、
    （ｂ）重鎖対合ポリペプチド生成物を抗Ｆｃ抗体で単離するステップと、
    （ｃ）前記重鎖対合ポリペプチド生成物において、前記第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および前記第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を決定するステップと
    を含み、
    前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した前記重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての前記重鎖ポリペプチドの選択性を示す、方法。
  100. （ｃ）の決定するステップが、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせを含む、請求項９９に記載の方法。
  101. 前記第１の検出可能な標識が、前記第２の検出可能な標識とは異なる、請求項９９に記載の方法。
  102. 前記検出可能な標識が、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または更なる検出可能な部分を含むタグである、請求項９９に記載の方法。
  103. 前記検出可能な標識の検出が、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含む、請求項１０２に記載の方法。
  104. 軽鎖ポリペプチドとの対合についての重鎖ポリペプチドの選択性を定量化するハイスループット法であって、
    （ａ）ＶＨ領域、ＣＨ１領域、および検出可能な標識を含む第１の重鎖ポリペプチドと、
    ＶＨ領域、ＣＨ１領域、および検出可能な標識を含む第２の重鎖ポリペプチドと、
    第１のＶＬ、第１のＣＬ領域、および検出可能な標識を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
    第２のＶＬ、第２のＣＬ領域、および検出可能な標識を含む第２の軽鎖ポリペプチドと
    を含む、一連の構築物を同時発現させるステップであって、前記重鎖ポリペプチドおよび前記軽鎖ポリペプチドが、前記重鎖ポリペプチドの総量が限定的であるように発現し、かつ、前記一連の構築物を同時発現させるステップが一連のポリペプチド生成物をもたらす、ステップと、
    （ｂ）前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドと対合した前記重鎖ポリペプチドを含む重鎖対合ポリペプチド生成物を、前記一連のポリペプチド生成物から単離するステップと、
    （ｃ）前記重鎖対合ポリペプチド生成物において、前記第１の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量、および前記第２の軽鎖ポリペプチドと対合した重鎖ポリペプチドの量を決定するステップと
    を含み、
    前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドのうちの一方と対合した前記重鎖ポリペプチドの、他方の軽鎖ポリペプチドと比較してより多い量が、前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての前記重鎖ポリペプチドの選択性を示す、方法。
  105. 前記検出可能な標識のうちのそれぞれが固有である、請求項１０４に記載の方法。
  106. （ｃ）の決定するステップが、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、二分子蛍光補完読み取り、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、蛍光偏光／異方性（ＦＰ）、蛍光／フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１０４に記載の方法。
  107. 前記検出可能な標識が、タンパク質結合部位、リガンド結合部位、または更なる検出可能な部分を含むタグである、請求項１０４に記載の方法。
  108. 前記検出可能な標識の検出が、蛍光、消光、放射活性、または化学発光の測定を含む、請求項１０７に記載の方法。
  109. 重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの選択的対合を可視化する方法であって、
    １つ以上の処理装置と、前記方法を実行するために前記１つ以上の処理装置によって実行される１つ以上のプログラムを記憶する記憶装置とを含む、コンピュータシステム上での、
    （ａ）複数の結合アッセイを含む競合アッセイデータを取得するステップであって、前記複数の結合アッセイのうちの各それぞれの結合アッセイが、溶液中で、複数の重鎖ポリペプチド構築物から選択される１つ以上の対応する重鎖ポリペプチドの第１の量を、複数の軽鎖ポリペプチド構築物から選択される１つ以上の対応する軽鎖ポリペプチドの第２の量に、溶液中の前記対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドまたは前記対応する１つ以上の軽鎖ポリペプチドのいずれかを限定する条件下で、曝露することを含み、
    前記対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドが限定的である場合、前記１つ以上の重鎖ポリペプチドが単一重鎖ポリペプチド構築物からなり、かつ前記１つ以上の軽鎖ポリペプチドが複数の軽鎖ポリペプチド構築物からなり、
    前記対応する１つ以上の軽鎖ポリペプチドが限定的である場合、前記１つ以上の軽鎖ポリペプチドが単一軽鎖ポリペプチド構築物からなり、かつ前記１つ以上の重鎖ポリペプチドが複数の重鎖ポリペプチド構築物からなる、ステップと、
    （ｂ）複数の節点を含むグラフを構築するステップであって、
    前記複数の節点が、節点の第１のサブセット、および節点の第２のサブセットを含み、
    節点の前記第１のサブセットにおける各それぞれの節点が、第１の図示形式で表示され、前記複数の結合アッセイのうちの１つ以上の結合アッセイにおける１つ以上の対応する重鎖ポリペプチドを一意的に表し、
    節点の前記第２のサブセットにおける各それぞれの節点が、第２の図示形式で表示され、前記複数の結合アッセイのうちの１つ以上の結合アッセイにおける１つ以上の対応する軽鎖ポリペプチドを一意的に表し、
    節点の前記第１のサブセットが、前記複数の結合アッセイにおいて使用された前記重鎖ポリペプチドの全てを集合的に表し、
    節点の前記第２のサブセットが、前記複数の結合アッセイにおいて使用された前記軽鎖ポリペプチドの全てを集合的に表す、ステップと、
    （ｃ）前記グラフに、複数のエッジを設定するステップであって、
    前記複数のエッジにおける各それぞれのエッジが、前記複数の結合アッセイにおける対応する結合アッセイを表し、かつ前記対応する結合アッセイにおける前記１つ以上の重鎖ポリペプチドを表す節点の前記第１のサブセット中の第１の節点を、前記対応する結合アッセイにおける前記１つ以上の軽鎖ポリペプチドを表す節点の前記第２のサブセット中の第２の節点と接続し、
    前記複数のエッジにおける各エッジの第１の図示様式は、前記対応する結合アッセイにおける前記限定的ポリペプチドが、前記対応する結合アッセイにおける前記非限定的ポリペプチドのうちの１つに対して選好を有するかどうかを示す、ステップと
    を含む、方法。
  110. 前記複数のエッジにおける各エッジの第２の図示様式が、前記対応する結合アッセイにおける前記限定的ポリペプチドが前記対応する結合アッセイにおける前記非限定的ポリペプチドのうちの１つに対して選好を有する量によって、決定される、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記第１の図示様式が点線であり、前記第２の図示様式が線幅である、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記複数のエッジにおける１つのエッジの前記線幅が、前記対応する結合アッセイにおける前記限定的ポリペプチドが前記対応する結合アッセイにおける前記非限定的ポリペプチドのうちの１つに対する選好を有する量によって、決定され、前記対応する結合アッセイにおける前記限定的ポリペプチドが前記対応する結合アッセイにおける前記非限定的ポリペプチドのうちの１つに対する選好を有する量が多ければ多いほど、前記エッジの前記線幅が大きくなる、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記第１の図示形式が、第１の二次元閉形式の形状であり、前記第２の図示形式が、前記第１の二次元閉形式の形状以外の第２の二次元閉形式の形状である、請求項１０９に記載の方法。
  114. 前記第１の図示形式が、第１の二次元地理的形状であり、前記第２の図示形式が、前記第１の二次元地理的形状以外の第２の二次元地理的形状である、請求項１０９に記載の方法。
  115. 前記第１の二次元地理的形状または前記第２の二次元地理的形状が、ｎが３以上の整数であるｎ角形、円、または楕円からなる群から選択される、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記複数の結合アッセイのうちの各結合アッセイにおける前記対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドが、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含む単一重鎖ポリペプチド構築物からなり、
    前記複数の結合アッセイのうちの各結合アッセイにおける前記１つ以上の軽鎖ポリペプチドが、第１の軽鎖ポリペプチド構築物および第２の軽鎖ポリペプチド構築物からなり、前記第１の軽鎖ポリペプチド構築物が、第１のＶＬ領域および第１のＣＬ領域からなり、前記第２の軽鎖ポリペプチド構築物が、第２のＶＬ領域および第２のＣＬ領域を含む、請求項１０９に記載の方法。
  117. 前記複数のエッジにおける各エッジの線幅（Ｗ）が、前記対応する結合アッセイにおける前記単一重鎖ポリペプチド構築物が前記第１の軽鎖ポリペプチド構築物または前記第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対する選好を有する量によって、決定され、前記量が、下記式によって決定され、
    Figure 2015533089
    式中、
    ｆは、線形または非線形関数であり、
    Ｐ１は、（ｉ）前記第１の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一重鎖ポリペプチド構築物の量と、（ｉｉ）前記第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一重鎖ポリペプチド構築物の量との組み合わせによって正規化された、前記第１の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一重鎖ポリペプチド構築物の量であり、
    Ｐ２は、（ｉ）前記第１の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一重鎖ポリペプチド構築物の量と、（ｉｉ）前記第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一重鎖ポリペプチド構築物の量との組み合わせによって正規化された、前記第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一重鎖ポリペプチド構築物の量である、請求項１１６に記載の方法。
  118. ｆが対数関数である、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記単一重鎖ポリペプチド構築物が前記第１の軽鎖ポリペプチド構築物に優先的に結合する場合、前記第１の図示様式が実線であり、
    前記単一重鎖ポリペプチド構築物が前記第２の軽鎖ポリペプチド構築物に優先的に結合する場合、前記第１の図示様式が破線である、請求項１１７に記載の方法。
  120. 前記複数の結合アッセイのうちの各結合アッセイにおける前記対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドが、第１のＶＨおよび第１のＣＨ１領域を含む第１の重鎖ポリペプチド構築物、ならびに第２のＶＨおよび第２のＣＨ１領域を含む第２の重鎖ポリペプチド構築物からなり、
    前記複数の結合アッセイのうちの各結合アッセイにおける前記１つ以上の軽鎖ポリペプチドが、ＶＬおよびＣＬ領域を含む軽鎖ポリペプチド構築物からなる、請求項１０９に記載の方法。
  121. 前記複数のエッジにおける各エッジの線幅（Ｗ）が、前記対応する結合アッセイにおける前記単一軽鎖ポリペプチド構築物が前記第１の重鎖ポリペプチド構築物または前記第２の重鎖ポリペプチド構築物に対する選好を有する量によって、決定され、前記量が、下記式によって決定され、
    Figure 2015533089
    式中、
    ｆは、線形または非線形関数であり、
    Ｐ１は、（ｉ）前記第１の重鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一軽鎖ポリペプチド構築物の量と、（ｉｉ）前記第２の重鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一軽鎖ポリペプチド構築物の量との組み合わせによって正規化された、前記第１の重鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一軽鎖ポリペプチド構築物の量であり、
    Ｐ２は、（ｉ）前記第１の重鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一軽鎖ポリペプチド構築物の量と、（ｉｉ）前記第２の重鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一軽鎖ポリペプチド構築物の量との組み合わせによって正規化された、前記第２の重鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一軽鎖ポリペプチド構築物の量である、請求項１２０に記載の方法。
  122. ｆが対数関数である、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記単一軽鎖ポリペプチド構築物が前記第１の重鎖ポリペプチド構築物に優先的に結合する場合、前記第１の図示様式が実線であり、
    前記単一軽鎖ポリペプチド構築物が前記第２の重鎖ポリペプチド構築物に優先的に結合する場合、前記第１の図示様式が破線である、請求項１２１に記載の方法。
  124. 前記複数の結合アッセイのうちの各結合アッセイにおける前記対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドが、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む単一重鎖ポリペプチド構築物からなり、
    前記複数の結合アッセイのうちの各結合アッセイにおける前記１つ以上の軽鎖ポリペプチドが、第１の軽鎖ポリペプチド構築物および第２の軽鎖ポリペプチド構築物からなり、前記第１の軽鎖ポリペプチド構築物が、第１のＶＬおよび第１のＣＬ領域を含み、前記第２の軽鎖ポリペプチド構築物が、第２のＶＬおよび第２のＣＬ領域を含む、請求項１０９に記載の方法。
  125. 前記複数の結合アッセイにおける各結合アッセイが、溶液中に、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域からなる追加の分子実体を更に含む、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記複数のエッジにおける各エッジの線幅（Ｗ）が、前記対応する結合アッセイにおける前記単一重鎖ポリペプチド構築物が前記第１の軽鎖ポリペプチド構築物または前記第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対する選好を有する量によって、決定され、前記量が、下記式によって決定され、
    Figure 2015533089
    式中、
    ｆは、線形または非線形関数であり、
    Ｐ１は、（ｉ）前記第１の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一重鎖ポリペプチド構築物の量と、（ｉｉ）前記第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一重鎖ポリペプチド構築物の量との組み合わせによって正規化された、前記第１の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一重鎖ポリペプチド構築物の量であり、
    Ｐ２は、（ｉ）前記第１の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一重鎖ポリペプチド構築物の量と、（ｉｉ）前記第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一重鎖ポリペプチド構築物の量との合計量によって正規化された、前記第２の軽鎖ポリペプチド構築物に対合した前記単一重鎖ポリペプチド構築物の量である、請求項１２４に記載の方法。
  127. ｆが対数関数である、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記単一重鎖ポリペプチド構築物が前記第１の軽鎖ポリペプチド構築物に優先的に結合する場合、前記第１の図示様式が実線であり、
    前記単一重鎖ポリペプチド構築物が前記第２の軽鎖ポリペプチド構築物に優先的に結合する場合、前記第１の図示様式が破線である、請求項１２４に記載の方法。
  129. 前記複数の結合アッセイのうちの１つの結合アッセイにおける前記曝露することが、前記１つ以上の対応する重鎖ポリペプチドおよび前記１つ以上の対応する軽鎖ポリペプチドの同時発現によって実行される、請求項１０９に記載の方法。
  130. 前記第１の図示様式が線色であり、前記第２の図示様式が線幅である、請求項１１０または１１１に記載の方法。
  131. 前記第１の図示様式が線色および点線の組み合わせであり、前記第２の図示様式が線幅である、請求項１１０または１１１に記載の方法。
  132. 重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの選択的対合を可視化するためのシステムであって、
    １つ以上の処理装置と、
    前記１つ以上の処理装置によって実行される１つ以上のプログラムを記憶する記憶装置と
    を含み、前記１つ以上のプログラムが、
    （ａ）複数の結合アッセイを含む競合アッセイデータを取得する命令であって、前記複数の結合アッセイのうちの各それぞれの結合アッセイが、溶液中で、複数の重鎖ポリペプチド構築物から選択される１つ以上の対応する重鎖ポリペプチドの第１の量を、複数の軽鎖ポリペプチド構築物から選択される１つ以上の対応する軽鎖ポリペプチドの第２の量に、溶液中の前記対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドまたは前記対応する１つ以上の軽鎖ポリペプチドのいずれかを限定する条件下で、曝露することを含み、
    前記対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドが限定的である場合、前記１つ以上の重鎖ポリペプチドが単一重鎖ポリペプチド構築物からなり、かつ前記１つ以上の軽鎖ポリペプチドが複数の軽鎖ポリペプチド構築物からなり、
    前記対応する１つ以上の軽鎖ポリペプチドが限定的である場合、前記１つ以上の軽鎖ポリペプチドが単一軽鎖ポリペプチド構築物からなり、かつ前記１つ以上の重鎖ポリペプチドが複数の重鎖ポリペプチド構築物からなる、命令と、
    （ｂ）複数の節点を含むグラフを構築する命令であって、
    前記複数の節点が、節点の第１のサブセット、および節点の第２のサブセットを含み、
    節点の前記第１のサブセットにおける各それぞれの節点が、第１の図示形式で表示され、前記複数の結合アッセイのうちの１つ以上の結合アッセイにおける１つ以上の対応する重鎖ポリペプチドを一意的に表し、
    節点の前記第２のサブセットにおける各それぞれの節点が、第２の図示形式で表示され、前記複数の結合アッセイのうちの１つ以上の結合アッセイにおける１つ以上の対応する軽鎖ポリペプチドを一意的に表し、
    節点の前記第１のサブセットが、前記複数の結合アッセイにおいて使用された前記重鎖ポリペプチドの全てを集合的に表し、
    節点の前記第２のサブセットが、前記複数の結合アッセイにおいて使用された前記軽鎖ポリペプチドの全てを集合的に表す、命令と、
    （ｃ）前記グラフに、複数のエッジを設定する命令であって、
    前記複数のエッジにおける各それぞれのエッジが、前記複数の結合アッセイにおける対応する結合アッセイを表し、かつ前記対応する結合アッセイにおける前記１つ以上の重鎖ポリペプチドを表す節点の前記第１のサブセット中の第１の節点を、前記対応する結合アッセイにおける前記１つ以上の軽鎖ポリペプチドを表す節点の前記第２のサブセット中の第２の節点と接続し、
    前記複数のエッジにおける各エッジの第１の図示様式は、前記対応する結合アッセイにおける前記限定的ポリペプチドが、前記対応する結合アッセイにおける前記非限定的ポリペプチドのうちの１つに対して選好を有するかどうかを示す、命令と
    を含む、システム。
  133. 重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの選択的対合を可視化するためのコンピュータシステムによる実行のための１つ以上のコンピュータプログラムを記憶する、非一時的コンピュータ可読記憶媒体であって、前記１つ以上のコンピュータプログラムが、
    （ａ）複数の結合アッセイを含む競合アッセイデータを取得する命令であって、前記複数の結合アッセイのうちの各それぞれの結合アッセイが、溶液中で、複数の重鎖ポリペプチド構築物から選択される１つ以上の対応する重鎖ポリペプチドの第１の量を、複数の軽鎖ポリペプチド構築物から選択される１つ以上の対応する軽鎖ポリペプチドの第２の量に、溶液中の前記対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドまたは前記対応する１つ以上の軽鎖ポリペプチドのいずれかを限定する条件下で、曝露することを含み、
    前記対応する１つ以上の重鎖ポリペプチドが限定的である場合、前記１つ以上の重鎖ポリペプチドが単一重鎖ポリペプチド構築物からなり、かつ前記１つ以上の軽鎖ポリペプチドが複数の軽鎖ポリペプチド構築物からなり、
    前記対応する１つ以上の軽鎖ポリペプチドが限定的である場合、前記１つ以上の軽鎖ポリペプチドが単一軽鎖ポリペプチド構築物からなり、かつ前記１つ以上の重鎖ポリペプチドが複数の重鎖ポリペプチド構築物からなる、命令と、
    （ｂ）複数の節点を含むグラフを構築する命令であって、
    前記複数の節点が、節点の第１のサブセット、および節点の第２のサブセットを含み、
    節点の前記第１のサブセットにおける各それぞれの節点が、第１の図示形式で表示され、前記複数の結合アッセイのうちの１つ以上の結合アッセイにおける１つ以上の対応する重鎖ポリペプチドを一意的に表し、
    節点の前記第２のサブセットにおける各それぞれの節点が、第２の図示形式で表示され、前記複数の結合アッセイのうちの１つ以上の結合アッセイにおける１つ以上の対応する軽鎖ポリペプチドを一意的に表し、
    節点の前記第１のサブセットが、前記複数の結合アッセイにおいて使用された前記重鎖ポリペプチドの全てを集合的に表し、
    節点の前記第２のサブセットが、前記複数の結合アッセイにおいて使用された前記軽鎖ポリペプチドの全てを集合的に表す、命令と、
    （ｃ）前記グラフに、複数のエッジを設定する命令であって、
    前記複数のエッジにおける各それぞれのエッジが、前記複数の結合アッセイにおける対応する結合アッセイを表し、かつ前記対応する結合アッセイにおける前記１つ以上の重鎖ポリペプチドを表す節点の前記第１のサブセット中の第１の節点を、前記対応する結合アッセイにおける前記１つ以上の軽鎖ポリペプチドを表す節点の前記第２のサブセット中の第２の節点と接続し、
    前記複数のエッジにおける各エッジの第１の図示様式は、前記対応する結合アッセイにおける前記限定的ポリペプチドが、前記対応する結合アッセイにおける前記非限定的ポリペプチドのうちの１つに対して選好を有するかどうかを示す、命令と
    を含む、コンピュータプログラム。
  134. 前記第１または第２の軽鎖ポリペプチドとの対合についての前記重鎖ポリペプチドの選択性が、請求項１０９〜１３３のいずれか一項に記載の方法によって可視化される、請求項１に記載の方法。
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