CN105067719B

CN105067719B - 注射用三重霉素中三组分的hplc测定法

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Publication number: CN105067719B
Application number: CN201510424951.6A
Authority: CN
Inventors: 陈汝红
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-07-20
Filing date: 2015-07-20
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2035-07-20
Also published as: CN105067719A

Abstract

本发明涉及一种注射用三重霉素中三组分的HPLC测定法，其具体包括如下步骤：1)对照品溶液的配制。2)供试品溶液的配制。3)色谱条件：色谱柱：C₁₈反相色谱柱，流动相：体积比为81∶19的缓冲盐溶液‑乙腈，所述缓冲盐溶液内含0.21mol/L磷酸二氢钾和0.16％的三乙胺，pH值为5.6，流速：1.0ml/min，检测波长：215nm，进样量：10μl。4)含量计算方法按外标法以峰面积计算供试品中普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素的含量。本发明所提供的方法能同时完成三重霉素的三个组分的含量测定，具备重现性好、灵敏度高、准确性强、便于标准化操作的优点。

Description

注射用三重霉素中三组分的HPLC测定法

技术领域

本发明涉及一种分析方法，具体涉及一种注射用三重霉素中三组分的HPLC测定法。

背景技术

注射用三重霉素，又名强化苄星青霉素，为苄星青霉素、普鲁卡因青霉素、青霉素钠按国际单位比2∶1∶1混合的无菌粉末。苄星青霉素为青霉素的二苄基乙二胺盐，普鲁卡因青霉素为青霉素的普鲁卡因盐，二者均为青霉素长效品种，抗菌活性成分为青霉素，肌注后慢慢游离出青霉素，使血浓度维持时间延长，显示长效作用。三者混合使其具有长期，中期和即时起效的优势，可以维持1-4周血液中的有效浓度。该复方制剂国内未见分析报道。目前，对注射用三重霉素中苄星青霉素、普鲁卡因青霉素、青霉素钠的检测方法主要是通过HPLC法分别单独测定，存在测定步骤繁琐，测定时间长的缺陷。

有鉴于此，需要发明一种简单、快速的注射用三重霉素中三组分的HPLC测定法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种注射用三重霉素中三组分的HPLC测定法，利用相同的液相条件可以同时检测三组分的含量，具备方法简便、准确、稳定性好的特点。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种注射用三重霉素中三组分的HPLC测定法，其具体包括如下步骤：

1)对照品溶液的配制

配制含有普鲁卡因，二苄基乙二胺和青霉素工作对照品的对照品溶液；

2)供试品溶液的配制

配制供试品注射用三重霉素的供试品溶液；

3)色谱条件

色谱柱：C₁₈反相色谱柱，流动相：体积比为81∶19的缓冲盐溶液-乙腈，所述缓冲盐溶液内含0.21mol/L磷酸二氢钾和0.16％的三乙胺，pH值为5.6，流速：1.0ml/min，检测波长：215nm，进样量：10μl；

4)含量计算方法

按外标法以峰面积计算供试品中普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素的含量。

作为本发明进一步的改进，所述步骤1)中对照品溶液的配制方法如下：

称取普鲁卡因工作对照品12mg，二苄基乙二胺对照品20mg和青霉素工作品80mg，置100ml量瓶中，加乙腈10ml振摇使均匀分散后，加甲醇10ml充分振摇使溶解，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：取磷酸二氢钾6.8g和磷酸氢二钾1.14g于1000ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

作为本发明进一步的改进，所述步骤2)中供试品溶液的配制方法如下：

称取供试品50mg，置50ml量瓶中，加乙腈10ml振摇使均匀分散后，加甲醇10ml充分振摇使溶解，立即用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：取磷酸二氢钾6.8g和磷酸氢二钾1.14g于1000ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

作为本发明进一步的改进，所述步骤4)计算供试品中普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素的含量后，通过以下方法计算苄星青霉素、普鲁卡因青霉素和青霉素钠的效价：

按每1mg的青霉素相当于1780青霉素单位计算供试品中普鲁卡因青霉素、苄星青霉素、青霉素钠的效价，每1mg含青霉素总效价＝青霉素含量×1780，苄星青霉素效价＝二苄基乙二胺含量×4953，普鲁卡因青霉素效价＝普鲁卡因含量×2519，青霉素钠效价＝青霉素总效价-苄星青霉素效价-普鲁卡因青霉素效价。

作为本发明进一步的改进，所述色谱柱为封尾完全完全的C₁₈色谱柱。

作为本发明进一步的改进，所述步骤3)中缓冲盐溶液通过氢氧化钾调pH至5.6。

在本发明中三重霉素的三组分中，由于组分酸碱性差异较大，为了寻找合适的流动相pH值，发明人进行了大量的工作。普鲁卡因和二苄基乙二胺为有机碱，流动相pH增大，保留时间延长；青霉素为有机酸，pH增大，保留时间缩短。pH大于6时，二苄基乙二胺出峰晚，峰拖尾严重；pH小于5，普鲁卡因出峰太快，不易与溶剂峰或杂质峰分离。pH在5～6时，三者有较合适的保留时间。为减小二苄基乙二胺的拖尾，加入适量的三乙胺。三乙胺浓度增大，普鲁卡因和二苄基乙二胺保留时间缩短，青霉素保留时间延长。三重霉素的降解物主要为青霉素的降解物，加入0.3％以上三乙胺，普鲁卡因不易与青霉素降解物峰分离。乙腈比例在17％～19％调节，筛选pH值及三乙胺浓度，使普鲁卡因和青霉素有合适的保留时间，并与相邻峰有效分离。二苄基乙二胺对pH值，三乙胺浓度，盐浓度均较敏感，盐浓度增大，二苄基乙二胺保留时间缩短，而盐浓度对另两者影响较小。通过调节盐的浓度，使二苄基乙二胺处于合适的峰位，恰与青霉素降解物峰分离完全。

与现有技术相比，本发明所取得的有益效果如下：

本发明一次检测能同时完成三重霉素的三个组分的含量测定，可以快速的提供检测报告，为企业生产和销售产品提供有效技术保障，方法操作简单，降低了检测技术人员的劳动强度，提高了工作效率，本发明方法具备重现性好、灵敏度高、准确性强、便于标准化操作的优点。

附图说明

附图1为本发明方法测定三重霉素中三组分含量的典型液相图谱；

附图2为热破坏后的图谱；

附图3为酸破坏后的图谱；

附图4为碱破坏后的图谱；

附图5为光破坏后的图谱；

附图6为氧化破坏后的图谱；

在附图中：1普鲁卡因、2二苄基乙二胺、3.青霉素。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步详细的叙述。

以下实施例中所用仪器与试药如下：

Waters 2695型高效液相色谱仪；Waters 2487型紫外检测器。

供试品注射用三重霉素(石药集团中诺药业有限公司，规格：苄星青霉素600000单位，普鲁卡因青霉素300000单位，青霉素300000单位，批号：SP090810，H091005)；青霉素钠工作对照品(石药集团中诺药业有限公司，批号：101118-1，含量：93.5％)，二苄基乙二胺二乙酸盐工作对照品(重庆市春瑞医药化工有限公司，批号：20110110，含量：66.3％)，盐酸普鲁卡因工作对照品(重庆市春瑞医药化工有限公司，批号：20110416，含量：86.3％)；乙腈为色谱纯，三乙胺，磷酸二氢钾为分析纯。

实施例1

1)对照品溶液的制备精密称取普鲁卡因工作对照品约12mg，二苄基乙二胺对照品约20mg和青霉素工作品约80mg，置100ml量瓶中，加乙腈10ml振摇使均匀分散后，加甲醇10ml充分振摇使溶解，立即用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2)供试品溶液的制备精密称取供试品约50mg，置50ml量瓶中，加乙腈10ml振摇使均匀分散后，加甲醇10ml充分振摇使溶解，立即用磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8g和磷酸氢二钾1.14g于1000ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；

3)色谱条件及测定法

色谱柱：依利特SinoChrom C₁₈(250mm×4.60mm，5μm)，流动相：缓冲盐溶液(内含0.21mol/L磷酸二氢钾和0.16％的三乙胺)(用氢氧化钾调节pH值为5.6)-乙腈(81∶19)，流速1.0ml/min，检测波长215nm，进样量10μl。普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素峰的理论板数分别为12020，10802，12034；相邻两个主峰之间的分离度分别为21.6和14.2；连续进样5次，普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素峰面积的RSD分别为0.10％、0.22％和0.09％。

4)含量计算方法

分别取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，典型图谱见附图1，按外标法以峰面积计算供试品中普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素的含量。测出普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素的含量后经过以下方法计算苄星青霉素、普鲁卡因青霉素和青霉素钠的效价：

按每1mg的青霉素相当于1780青霉素单位，根据各主成分的分子式及分子量，计算供试品中普鲁卡因青霉素、苄星青霉素、青霉素钠的效价，推导公式如下：每1mg含青霉素总效价＝青霉素含量×1780，苄星青霉素效价＝二苄基乙二胺含量×4953，普鲁卡因青霉素效价＝普鲁卡因含量×2519，青霉素钠效价＝青霉素总效价-苄星青霉素效价-普鲁卡因青霉素效价。

本实施例1提供的HPLC测定法的专属性考察如下：

对供试品溶液进行高温、强酸、强碱、氧化、光照的破坏性试验，以研究其降解产物与主峰的分离情况。破坏条件如下：

热破坏试验：取样品50mg，置50ml量瓶中，加乙腈10ml和甲醇10ml使溶解，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，置水浴中加热60min，放冷，进样。

酸破坏试验：取样品50mg，置50ml量瓶中，加乙腈10ml和甲醇10ml使溶解，加0.1mol/L盐酸溶液2.0ml，放置10min，加0.1mol/L氢氧化钠溶液2.0ml中和，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，进样。

碱破坏试验：取样品50mg，置50ml量瓶中，加乙腈10ml和甲醇10ml使溶解，加0.1mol/L氢氧化钠溶液2.0ml，放置10min，加0.1mol/L盐酸溶液2.0ml中和，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，进样。

光破坏试验：取样品50mg，置50ml量瓶中，加乙腈10ml和甲醇10ml使溶解，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，置4000lx条件下放置48h，进样。

氧化破坏试验：取样品50mg，置50ml量瓶中，加乙腈10ml和甲醇10ml使溶解，加10％过氧化氢溶液2.0ml，放置15min，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，立即进样。

在本实施例1的色谱条件下，进行测定，结果见图2-6，可见在选定的色谱条件下，各主峰与相邻杂质峰均能获得有效分离。

本实施例1提供的HPLC测定法的精密度试验如下：

同一批样品，分别取样6次，依法测定含量，结果普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素含量的RSD分别为0.66％、0.58％和0.43％，表明方法精密度良好。

本实施例1提供的HPLC测定法的回收率试验如下：

精密称取注射用三重霉素约80、100、120mg各3份，置200ml量瓶中，分别加入普鲁卡因工作对照品约10、12、14mg各3份，二苄基乙二胺工作对照品约16、20、24mg各3份和青霉素工作对照品约64、80、96mg各3份，加乙腈40ml和甲醇40ml使溶解，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，制成含量测定浓度的80％、100％、120％的溶液，滤过，进样。按外标法分别计算各组分的回收率，结果见表1，普鲁卡因平均回收率为99.6％，RSD 0.90％(n＝9)；二苄基乙二胺平均回收率为99.5％，RSD 0.90％(n＝9)；青霉素平均回收率为99.9％，RSD 0.66％(n＝9)。

表1 回收率实验结果

本实施例1提供的HPLC测定法的线性范围考察如下：

精密称取普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素工作对照品各适量，加上述溶剂分别制成含普鲁卡因0.011，0.021，0.053，0.11，0.21，0.43，0.64mg/ml、二苄基乙二胺0.013，0.027，0.066，0.13，0.27，0.53，0.80mg/ml、青霉素0.075，0.15，0.38，0.75，1.5，3.0，4.5mg/ml的系列溶液，分别进样10μl测定，结果以峰面积A对其浓度C(mg/ml)进行线性回归，得回归方程分别如下：

普鲁卡因 A＝16005319C-15327 r＝1.0000

二苄基乙二胺 A＝21113654C-31843 r＝0.9999

青霉素 A＝17763521C+154454 r＝0.9999

结果表明，普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素分别在0.011～0.64mg·ml^-1、0.013～0.80mg·ml^-1和0.075～4.5mg·ml^-1浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

本实施例1提供的HPLC测定法的稳定性试验如下：

取供试品溶液，室温放置0、2、4、6、8、10、12h后进样，结果普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素峰面积的RSD分别为0.30％、0.25％和0.21％，表明溶液12h内稳定。

本实施例1提供的HPLC测定法的耐用性试验如下：

取另外两根不同厂牌的色谱柱同法测试，亦有较好的峰形和分离度。

本实施例1提供的HPLC测定法对样品的测定具体如下：

取供试品溶液和对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液的典型色谱图见图1。按外标法以峰面积计算含量，结果见表2。

表2 样品测定结果

本发明提供的方法分析一个样品仅需要25分钟的时间，大大简化了分析技术人员的测定内容，减少了测定步骤，提高了工作效率。本发明提供的方法具备重现性好、灵敏度高、准确性强、便于标准化操作的优点。

以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims

1.一种注射用三重霉素中三组分的HPLC测定法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)对照品溶液的配制

配制含有普鲁卡因，二苄基乙二胺和青霉素对照品的对照品溶液；

2)供试品溶液的配制

配制供试品注射用三重霉素的供试品溶液；

3)色谱条件

色谱柱：封尾完全的C₁₈反相色谱柱，流动相：体积比为81∶19的缓冲盐溶液一乙腈，所述缓冲盐溶液内含0.21mol/L磷酸二氢钾和0.16％的三乙胺，用氢氧化钾试液调节pH值至5.6，流速：1.0ml/min，检测波长：215nm，进样量：10μl；

4)含量计算方法

按外标法以峰面积计算供试品中普鲁卡因、二苄基乙二胺和青霉素的含量，并按每1mg的青霉素相当于1780青霉素单位计算供试品中普鲁卡因青霉素、苄星青霉素、青霉素钠的效价，每1mg含青霉素总效价＝青霉素含量×1780，苄星青霉素效价＝二苄基乙二胺含量×4953，普鲁卡因青霉素效价＝普鲁卡因含量×2519，青霉素钠效价＝青霉素总效价-苄星青霉素效价-普鲁卡因青霉素效价。

2.根据权利要求1所述的一种注射用三重霉素中三组分的HPLC测定法，其特征在于，所述步骤1)中对照品溶液的配制方法如下：

称取普鲁卡因对照品12mg，二苄基乙二胺对照品20mg和青霉素对照品80mg，置100ml量瓶中，加乙腈10ml振摇使均匀分散后，加甲醇10ml充分振摇使溶解，立即用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：取磷酸二氢钾6.8g和磷酸氢二钾1.14g置1000ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。

3.根据权利要求1所述的一种注射用三重霉素中三组分的HPLC测定法，其特征在于，所述步骤2)中供试品溶液的配制方法如下：

称取供试品50mg，置50ml量瓶中，加乙腈10ml振摇使均匀分散后，加甲醇10ml充分振摇使溶解，立即用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：取磷酸二氢钾6.8g和磷酸氢二钾1.14g置1000ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。