CN106770746A - 依匹哌唑中间体中1‑溴‑4‑氯丁烷的检测方法 - Google Patents

依匹哌唑中间体中1‑溴‑4‑氯丁烷的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种依匹哌唑中间体中1‑溴‑4‑氯丁烷的检测方法。该方法采用的是十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，能有效将依匹哌唑中间体中1‑溴‑4‑氯丁烷分离检测出来，检测结果准确、可靠，并且具有线性关系优异、精密度高、稳定性好、重复性好、回收率高、操作简便等诸多优点，适合于推广应用。

Description

依匹哌唑中间体中1-溴-4-氯丁烷的检测方法
技术领域
本发明涉及依匹哌唑中间体中1-溴-4-氯丁烷的检测方法，具体涉及1-溴-4-氯丁烷的检测方法。
背景技术
依匹哌唑是一款用于治疗精神分裂症的抗精神病药物。该药物化学名为Brexpiprazole，它还被批准作为一款辅助治疗药物用于重度抑制症(MDD)，MDD是一种严重的精神病症，可导致持续的悲伤、挫折感或愤怒。精神分裂症是一种慢性、严重并令人致残的脑部障碍，它可以导致妄想和幻觉。据美国国家心理卫生研究所提供的信息，这种疾病影响了大约1％的美国人。在其最糟糕时，MDD可导致自杀，据世界卫生组织称，每年大约有100万人因此而失去生命。该药由大冢制药公司于2015年8月投放于美国市场，目前未在中国境内上市。中间体作为本品合成过程中的中间产品，其质量情况直接影响成品的质量和安全性有效性，而有关物质作为保证药品安全可靠的一个相当重要的质量控制指标，几乎所有的化学药品都涉及到有关物质检查项，同类药品的有关物质检查方法也不尽相同。依匹哌唑和中间体有关物质检测方法，目前无法在公开的文献报道中查阅到。
依匹哌唑化学名称为：7-[4-(4-苯并[b]噻吩-4-基-哌嗪-1-基)丁氧基]-1H-喹啉-2-酮，分子式：C25H27N3O2S，分子量：433.57，结构式如下：
依匹哌唑中间体(Ⅰ)化学名称为：7-(4-氯丁氧基)-1H-喹啉-2-酮，分子式：C13H14ClNO2，分子量：251.71，结构式如下：
杂质1-溴-4-氯丁烷的分子式为：C4H8BrCl，分子量为：171.46，结构式如下：
在依匹哌唑中间体产品中，往往会存在有多种杂质，1-溴-4-氯丁烷作为依匹哌唑合成过程中的关键起始物料，容易在中间体中残留。为避免其影响成品的质量，进而影响药物的质量控制和用药安全，有必要对该杂质的含量进行检测和监控。
但是1-溴-4-氯丁烷紫外吸收小，HPLC检测信号响应低，准确检测存在一定的难度。目前尚未有依匹哌唑中间体中1-溴-4-氯丁烷的检测方法报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了式(Ⅰ)所示依匹哌唑中间体中1-溴-4-氯丁烷杂质的检测方法：
它包括以下步骤：
(1)1-溴-4-氯丁烷标准曲线的建立：
a、对照品溶液的制备：
取1-溴-4-氯丁烷对照品，加甲醇配制成对照品溶液；
b、对照品溶液的测定：
配制系列浓度的对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪检测，测定色谱峰面积，得到1-溴-4-氯丁烷的标准曲线；
色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
检测波长：215±5nm；
流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸氢二盐溶液或甲醇-0.02mol/L磷酸氢二盐溶液；所述磷酸氢二盐溶液选自磷酸氢二钠溶液或磷酸氢二钾溶液；所述甲醇或乙腈与磷酸氢二盐溶液的体积比为40％：60％～60％：40％；
(2)待测样品中1-溴-4-氯丁烷的含量测定：
c、供试品溶液的制备：
取待测依匹哌唑中间体样品，流动相溶解，得供试品溶液；
d、供试品溶液的测定：
取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，以步骤b相同的色谱条件检测，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中1-溴-4-氯丁烷的含量。
进一步地，所述检测波长为215±2nm。
进一步地，所述磷酸氢二盐溶液是通过磷酸调节pH至2.9～3.1的。
进一步地，所述磷酸氢二盐溶液是通过磷酸调节pH至3.0的。
进一步地，所述流动相为下述体积比的混合溶液：
乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝45：55、乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝55：45、乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝50：50、甲醇-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝45：55、甲醇-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝55：45、甲醇-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝50：50、乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠溶液＝45：55、乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠溶液＝55：45或乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠溶液＝50：50。
进一步地，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm。
进一步地，所述色谱柱的型号为Waters Symmetry C18。
进一步地，所述色谱条件的柱温为30℃～40℃，优选35℃。
进一步地，所述色谱条件的流速为0.8mL/min～1.2mL/min，优选1.0mL/min。
进一步地，所述色谱条件的进样量为20μL。
经试验证明，本发明依匹哌唑中间体中1-溴-4-氯丁烷的检测方法，通过多种工艺的筛选，有效将依匹哌唑中间体中的1-溴-4-氯丁烷分离检测出来，检测结果准确、可靠，并且具有线性关系优异、精密度高、稳定性好、重复性好、回收率高、操作简便等诸多优点，适合于推广应用。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1本发明方法对系统适用性试验的检测结果；
图2为实施例13的标准曲线图；
图3-5为实施例13专属性试验的检测结果：图3为供试品溶液；图4为对照品溶液；图5为溶剂空白溶液。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
高效液相色谱仪(型号：LC-20AT二元泵，生产厂家：日本岛津公司)。
电子天平(型号：AUW220D，生产厂家：日本岛津公司)。
依匹哌唑中间体(批号：20150731A，来源：成都百裕制药股份有限公司)。
1-溴-4-氯丁烷对照品(批号：15-09-01，来源：东台鑫源化工有限公司)。
实施例1
1、检测波长的确定
精密称取依匹哌唑中间体适量，用甲醇配制成浓度为20μg/mL的溶液，作为供试品溶液。
精密称取对照品(1-溴-4-氯丁烷)适量，用甲醇配制成浓度为20μg/mL的溶液，作为对照品溶液。
取上述的供试品溶液、对照品溶液，在200nm～400nm波长范围内进行扫描，试验结果见表1。
表1 供试品溶液和对照品溶液紫外扫描结果
项目 峰波长(nm) 峰值 谷波长(nm) 谷值
供试品溶液 215.7 0.617 278 0.226
对照品溶液 215.2 0.834 292 0.006
试验结果表明，检测波长在210nm～220nm范围内，均适合本发明的高效液相色谱检测方法；优选的，检测波长为215±2nm。
2、系统适用性试验
制备供试品溶液：称取依匹哌唑中间体20mg，置于10mL量瓶中，加甲醇适量，振摇溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
制备对照品溶液：称取1-溴-4氯丁烷对照品4mg，置于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置于50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；
色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾(用磷酸调pH至3.0)＝50：50；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
系统适用性试验：取依匹哌唑中间体2mg、1-溴-4氯丁烷对照品4.0μg，加入1mL甲醇溶解，作为系统适用性溶液；量取20μL系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，依匹哌唑中间体与1-溴-4氯丁烷之间的分离度应不低于2.0，理论塔板数按依匹哌唑中间体峰计算应不小于2000。
系统适用性试验的检测结果见图1，依匹哌唑中间体(保留时间为5.726min)与1-溴-4氯丁烷对照品(保留时间为14.710min)之间的分离度为21.885，理论塔板数(按1-溴-4氯丁烷色谱峰计算)为17104，该色谱条件及方法可以用于检测依匹哌唑中间体中1-溴-4氯丁烷的含量。
3、高效液相色谱检测方法
制备供试品溶液：称取依匹哌唑中间体20mg，置于10mL量瓶中，加甲醇适量，振摇溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
制备对照品溶液：称取1-溴-4氯丁烷对照品4mg，置于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置于50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；
色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾(用磷酸调pH至3.0)＝50：50；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
实施例2
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；
色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾(用磷酸调节pH至3.0)＝45：55；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：依匹哌唑中间体(保留时间为9.771min)与1-溴-4氯丁烷对照品(供其保留时间为24.582min)之间的分离度为19.715，理论塔板数(按1-溴-4氯丁烷色谱峰计算)为5913，1-溴-4氯丁烷色谱峰的拖尾因子为1.051。
可见，该色谱条件可以准确检测依匹哌唑中间体中1-溴-4氯丁烷的含量。
实施例3
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；
色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾(用磷酸调节pH至3.0)＝55：45；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：依匹哌唑中间体(保留时间为3.7707min)与1-溴-4氯丁烷对照品(供其保留时间为9.666min)之间的分离度为5.011，理论塔板数(按1-溴-4氯丁烷色谱峰计算)为19855，1-溴-4氯丁烷色谱峰的拖尾因子为1.003。
可见，该色谱条件可以准确检测依匹哌唑中间体中1-溴-4氯丁烷的含量。
实施例4
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；
色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.02mol/L磷酸氢二钾(用磷酸调节pH至3.0)＝45：55；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：依匹哌唑中间体(保留时间为11.073min)与1-溴-4氯丁烷对照品(供其保留时间为29.362min)之间的分离度为21.027，理论塔板数(按1-溴-4氯丁烷色谱峰计算)为4787，1-溴-4氯丁烷色谱峰的拖尾因子为1.178。
可见，该色谱条件可以准确检测依匹哌唑中间体中1-溴-4氯丁烷的含量。
实施例5
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；
色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.02mol/L磷酸氢二钾(用磷酸调节pH至3.0)＝55：45；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：依匹哌唑中间体(保留时间为5.011min)与1-溴-4氯丁烷对照品(其保留时间为12.776min)之间的分离度为7.913，理论塔板数(按1-溴-4氯丁烷色谱峰计算)为11107，1-溴-4氯丁烷色谱峰的拖尾因子为1.015。
可见，该色谱条件可以准确检测依匹哌唑中间体中1-溴-4氯丁烷的含量。
实施例6
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；
色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：甲醇-0.02mol/L磷酸氢二钾(用磷酸调节pH至3.0)＝50：50；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：依匹哌唑中间体(保留时间为7.019min)与1-溴-4氯丁烷对照品(其保留时间为17.555min)之间的分离度为11.116，理论塔板数(按1-溴-4氯丁烷色谱峰计算)为8913，1-溴-4氯丁烷色谱峰的拖尾因子为1.056。
可见，该色谱条件可以准确检测依匹哌唑中间体中1-溴-4氯丁烷的含量。
实施例7
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；
色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠(用磷酸调节pH至3.0)＝45：55；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：依匹哌唑中间体(保留时间为10.017min)与1-溴-4氯丁烷对照品(保留时间为25.118min)之间的分离度为21.008，理论塔板数(按1-溴-4氯丁烷色谱峰计算)为5557，1-溴-4氯丁烷色谱峰的拖尾因子为1.081。
可见，该色谱条件可以准确检测依匹哌唑中间体中1-溴-4氯丁烷的含量。
实施例8
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；
色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠(用磷酸调节pH至3.0)＝55：45；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：依匹哌唑中间体(保留时间为3.801min)与1-溴-4氯丁烷对照品(供其保留时间为9.882min)之间的分离度为6.232，理论塔板数(按1-溴-4氯丁烷色谱峰计算)为18187，1-溴-4氯丁烷色谱峰的拖尾因子为1.005。
可见，该色谱条件可以准确检测依匹哌唑中间体中1-溴-4氯丁烷的含量。
实施例9
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；
色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠(用磷酸调节pH至3.0)＝50：50；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：依匹哌唑中间体(保留时间为5.805min)与1-溴-4氯丁烷对照品(保留时间为14.991min)之间的分离度为11.011，理论塔板数(按1-溴-4氯丁烷色谱峰计算)为9988，1-溴-4氯丁烷色谱峰的拖尾因子为1.025。
可见，该色谱条件可以准确检测依匹哌唑中间体中1-溴-4氯丁烷的含量。
实施例10
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；
色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾(用磷酸调节pH至2.9)＝50：50；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：依匹哌唑中间体(保留时间为5.833min)与1-溴-4氯丁烷对照品(保留时间为14.887min)之间的分离度为10.655，理论塔板数(按1-溴-4氯丁烷色谱峰计算)为9973，1-溴-4氯丁烷色谱峰的拖尾因子为1.019。
可见，该色谱条件可以准确检测依匹哌唑中间体中1-溴-4氯丁烷的含量。
实施例11
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；
色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾(用磷酸调节pH至3.1)＝50：50；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，结果表明：依匹哌唑中间体(保留时间为5.790min)与1-溴-4氯丁烷对照品(供其保留时间为14.905min)之间的分离度为10.446，理论塔板数(按1-溴-4氯丁烷色谱峰计算)为10103，1-溴-4氯丁烷色谱峰的拖尾因子为1.022。
可见，该色谱条件可以准确检测依匹哌唑中间体中1-溴-4氯丁烷的含量。
实施例12本发明的色谱条件筛选
1、流动相筛选试验
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；如：色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：表2；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，检测结果见表2。
表2 流动相筛选试验结果
表2中，流动相“例如：乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾(用磷酸调pH至3.0)＝50：50”具有中国药典2015年版通常具有的含义，其中50：50表示乙腈与0.02mol/L磷酸二氢钾(用磷酸调pH至3.0)(50：50)的体积比；保留时间是指1-溴-4-氯丁烷的保留时间；分离度是指依匹哌唑中间体与1-溴-4-氯丁烷之间的分离度；拖尾因子是指1-溴-4-氯丁烷色谱峰的拖尾因子；理论塔板数是指理论塔板数(按1-溴-4-氯丁烷计算)。
试验结果表明，乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝45：55、乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝55：45、乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝50：50、甲醇-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝45：55、甲醇-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝55：45、甲醇-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝50：50、乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠溶液＝45：55、乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠溶液＝55：45或乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠溶液＝50：50，均适合用于检测依匹哌唑中间体中1-溴-4-氯丁烷的含量。
2、柱温和流速筛选试验
选择不同的柱温和流速进行筛选试验，其他色谱条件如下：
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；如：色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾(用磷酸调节pH至3.0)；
柱温：表3；
流速：表3；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
按照实施例1的方法进行系统适用性试验，检测结果见表3：
表3 柱温和流速筛选试验结果
表3中，保留时间是指1-溴-4-氯丁烷的保留时间；分离度是指依匹哌唑中间体与1-溴-4-氯丁烷之间的分离度；拖尾因子是指1-溴-4-氯丁烷的拖尾因子；理论塔板数是指理论塔板数(按1-溴-4-氯丁烷峰计算)。
试验结果表明，不同的柱温和流速下，本发明方法均能有效准确检测依匹哌唑中间体中的1-溴-4-氯丁烷的含量，优选的柱温为30℃～40℃，进一步优选为35℃；优选的流速为0.8mL/min～1.2mL/min，进一步优选为1.0mL/min。
实施例13本发明方法的方法学验证
方法学验证中，色谱条件均如下：
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合的硅胶为填充剂；
色谱柱的型号为Waters Symmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾(用磷酸调节pH至3.0)＝50：50；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：215nm；
进样量：20μL。
1、线性关系
取杂质1-溴-4-氯丁烷对照品适量，用溶剂溶解并稀释制成一系列浓度的杂质对照品溶液。照上述色谱条件，分别取不同浓度对照品溶液各20μL注入液相色谱仪，分别测定峰面积。结果见表4和图2。
表4 线性关系试验结果表
以杂质1-溴-4-氯丁烷浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y＝1319.2502X-374.9654，R2＝0.9997。
试验结果表明，杂质1-溴-4-氯丁烷在浓度1.7248μg/mL～43.1211μg/mL范围内，其峰面积与测定浓度呈良好的线性关系。
2、专属性
按照本发明方法制备供试品溶液、对照品溶液，并准备空白溶剂甲醇。
精密量取上述各溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图3-5。图3为供试品溶液；图4为对照品溶液；图5为溶剂空白溶液。
试验结果表明，空白溶液不会对本发明检测依匹哌唑中间体中1-溴-4-氯丁烷含量的方法造成干扰。
3、精密度
取1-溴-4-氯丁烷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1mL中含4μg的溶液，作为对照品溶液；
精密量取20μL对照品溶液，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。检测结果见表5。
表5 精密度试验的检测结果
试验结果表明，本发明方法精密度良好。
4、稳定性
取于日光下放置的20150731A批中间体样品，依法配制供试品溶液，分别于配制后0h、2h、4h、6h、8h进样测定，记录峰面积，考察其供试品溶液各个杂质的稳定性情况，并统计杂质个数，结果见表6。
表6 有关物质检查供试品溶液稳定性试验结果表
时间 0h 2h 4h 6h 8h
1-溴-4-氯丁烷(％) 0.047％ 0.048％ 0.047％ 0.047％ 0.047％
试验结果表明，在8小时内供试品溶液检出的杂质1-溴-4-氯丁烷的含量，其结果差异不大，可知供试品溶液在配制后8小时内稳定性良好。
5、重复性
取20150731A批样品，按拟定的方法分别平行制备6份供试品溶液，同时制备相对应的杂质对照溶液。照上述确定的有关物质检测色谱条件，精密量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，其有关物质检查重复性试验结果见表7。
表7 有关物质检查重复性试验结果表
样品 样1 样2 样3 样4 样5 样6
1-溴-4-氯丁烷(％) 0.047％ 0.048％ 0.047％ 0.043％ 0.051％ 0.042％
试验结果表明，6份样品杂质1-溴-4-氯丁烷的测定结果差异不大，本法测定本品中的杂质1-溴-4-氯丁烷，重复性良好。
6、系统适用性试验
取依匹哌唑中间体0.5mg及1-溴-4-氯丁烷对照品4μg，加甲醇1mL使溶解，作为系统适用性溶液；量取20μL系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，依匹哌唑中间体与1-溴-4-氯丁烷之间的分离度应不低于2.0，理论塔板数按1-溴-4-氯丁烷峰计算应不小于2000。
制备供试品溶液：称取依匹哌唑中间体20mg，置于10mL量瓶中，加甲醇适量，振摇使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
制备对照品溶液：称取对照品(1-溴-4-氯丁烷)4mg，置于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置于50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使1-溴-4-氯丁烷色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20％，再精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如果显示1-溴-4-氯丁烷的色谱峰，按外标法以峰面积计算1-溴-4-氯丁烷的含量不得过0.2％。按照上述的方法，对依匹哌唑中间体进行检测3次。
试验结果表明，供试品中检出1-溴-4-氯丁烷的量为0.047％，依匹哌唑中间体与1-溴-4-氯丁烷达到良好的基线分离。
7、定量限和检测限
取浓度为0.53887mg/mL杂质1-溴-4-氯丁烷对照品贮备液，逐级稀释至一定浓度，摇匀，精密量取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，当杂质1-溴-4-氯丁烷浓度为每1mL中含1.29μg时，峰高约为基线噪音的10倍，按信噪比等于10：1计，测得杂质1-溴-4-氯丁烷的定量限为25.8ng。
量取“1-溴-4-氯丁烷定量限试验项下”对照品溶液3mL，置于10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。精密量取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，杂质1-溴-4-氯丁烷浓度为每1mL中含0.387μg，峰高约为基线噪音的3倍，按信噪比等于3：1计，测得杂质1-溴-4-氯丁烷的检测限为7.74ng。
8、回收率
浓度1：称取中间体样品20mg，置于10mL量瓶中，加入杂质1-溴-4-氯丁烷对照品贮备液(43.11μg/mL)0.8mL，加溶剂稀释至刻度，摇匀，同法配制三份，备用；浓度2：称取中间体样品20mg，置于10mL量瓶中，加入杂质1-溴-4-氯丁烷对照品贮备液(43.11μg/mL)1mL，加溶剂稀释至刻度，摇匀，同法配制三份，备用；浓度3：称取中间体样品20mg，置于10mL量瓶中，加入杂质1-溴-4-氯丁烷对照品贮备液(43.11μg/mL)1.2mL，加溶剂稀释至刻度，摇匀，同法配制三份，备用；另外，按照上述拟定的方法制备杂质1-溴-4-氯丁烷对照品溶液，精密吸取供试品及杂质1-溴-4-氯丁烷对照品溶液20μL进样测定，记录色谱图，并计算上述成分的测得量及回收率，其结果见表8。
表8 杂质1-溴-4-氯丁烷回收率试验结果表
以上试验结果表明，该方法测定杂质1-溴-4-氯丁烷的含量，回收率较好，测定的回收率相对标准偏差较小，准确度较高。
9、破坏性试验
为了进一步考察上述初步确定的色谱系统的专属性，拟以酸、碱、氧化、高温、强光破坏后的样品进样分析，考察样品的降解情况，以及主峰与杂质峰的分离情况。
酸破坏称取20150731A批中间体20.15mg，置10mL量瓶中，加入0.1mol/L盐酸2mL，摇匀，加入0.1mol/L氢氧化钠2mL中和，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
碱破坏称取20150731A批中间体20.48mg，置10mL量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠2mL，摇匀，加入0.1mol/L盐酸2mL中和，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
氧化破坏称取20150731A批中间体20.04mg，置10mL量瓶中，加30％过氧化氢溶液2mL，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
高温破坏取经130℃烘箱中加热3小时的20150731A批中间体，精密称取20.39mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
强光破坏称取20150731A批中间体20.47mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解后并稀释至刻度，摇匀，于紫外光灯下放置24h，即得。
未破坏样品称取20150731A批中间体19.77mg，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
酸碱空白溶液的制备：取0.1mol/L盐酸2mL，置10mL量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液2mL中和，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
氧化空白溶液的制备：取30％过氧化氢溶液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
照上述拟定的色谱条件，取上述溶液各20μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表9。
表9 破坏试验结果表
试验结果表明，在本色谱条件下，本品在酸、碱、氧化、高温条件下均较为稳定，供试品溶液在光照射下，中间体中的杂质1-溴-4-氯丁烷明显增加，因此，本法完全能满足本品中杂质1-溴-4-氯丁烷检测的需要，因此，本品的检测和贮存等各项操作条件均应在避光条件下进行。
综上所述，本发明依匹哌唑中间体中1-溴-4-氯丁烷的检测方法，通过多种工艺的筛选，有效将依匹哌唑中间体中1-溴-4-氯丁烷分离检测出来，检测结果准确、可靠，并且具有线性关系优异、精密度高、稳定性好、重复性好、回收率好、操作简便等诸多优点，适合于推广应用。

Claims (10)

1.式(Ⅰ)所示依匹哌唑中间体中1-溴-4-氯丁烷杂质的检测方法，其特征在于：
它包括以下步骤：
(1)1-溴-4-氯丁烷标准曲线的建立：
a、对照品溶液的制备：
取1-溴-4-氯丁烷对照品，加甲醇配制成对照品溶液；
b、对照品溶液的测定：
配制系列浓度的对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪检测，测定色谱峰面积，得到1-溴-4-氯丁烷的标准曲线；
色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
检测波长：215±5nm；
流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸氢二盐溶液或甲醇-0.02mol/L磷酸氢二盐溶液；所述磷酸氢二盐溶液选自磷酸氢二钠溶液或磷酸氢二钾溶液；所述甲醇或乙腈与磷酸氢二盐溶液的体积比为40％：60％～60％：40％；
(2)待测样品中1-溴-4-氯丁烷的含量测定：
c、供试品溶液的制备：
取待测依匹哌唑中间体样品，流动相溶解，得供试品溶液；
d、供试品溶液的测定：
取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，以步骤b相同的色谱条件检测，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中1-溴-4-氯丁烷的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测波长为215±2nm。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述磷酸氢二盐溶液是通过磷酸调节pH至2.9～3.1的。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述磷酸氢二盐溶液是通过磷酸调节pH至3.0的。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于：所述流动相为下述体积比的混合溶液：
乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝45：55、乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝55：45、乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝50：50、甲醇-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝45：55、甲醇-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝55：45、甲醇-0.02mol/L磷酸氢二钾溶液＝50：50、乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠溶液＝45：55、乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠溶液＝55：45或乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠溶液＝50：50。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱的型号为WatersSymmetry C18。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件的柱温为30℃～40℃，优选35℃。
9.根据权利要求1-8所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件的流速为0.8mL/min～1.2mL/min，优选1.0mL/min。
10.根据权利要求1-9任一项所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件的进样量为20μL。
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