CN107462648B - 一种Cangrelor中间体腺苷-2-硫酮的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

一种Cangrelor中间体腺苷-2-硫酮的高效液相色谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Cangrelor中间体腺苷‑2‑硫酮的高效液相色谱检测方法，它包括以下步骤：a、配制标准溶液；b、采用反向高效液相色谱对标准溶液进行检测；c、按外标法以峰面积计算样品中腺苷‑2‑硫酮的含量。本发明检测方法，可以使腺苷‑2‑硫酮和原料及其他杂质在高效液相色谱仪上得到良好的分离；在0.5～6.0mg/ml内，线性关系良好，R2＝0.9999，平均回收率为102.11％，RSD为2.70％。

Description

一种Cangrelor中间体腺苷-2-硫酮的高效液相色谱检测方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种Cangrelor中间体腺苷-2-硫酮的高效液相色谱检测方法。
背景技术
Cangrelor，分子式：C17H25Cl2F3N5O12P3S2，CAS登记号：163706-06-7，其化学结构如式A所示；Cangrelor是一种短效血小板P2Y12的可逆抑制剂，此药物主要为了预防成人患者在经皮冠状动脉介入治疗(PCI)过程中因凝血而造成的冠状动脉柱塞。早在2015年3，欧洲药品管理局EMA就已经批准上市，商品名Kengrexal，2016年6月22日，美国FDA批准了Medicine公司的抗血小板药物注射剂Cangrelor上市。
腺苷-2-硫酮是合成Cangrelor的重要中间体，又可称作2-硫代腺苷，CAS登记号为43157-50-2，分子式为C10H13N5O4S，分子量为299.31，淡黄色粉末。英文简称：2-thioadenosine，其化学结构如式B所示；它的同分异构体为腺苷-2-硫醇，其化学结构如式C所示。
一般情况下，腺苷-2-硫酮中不可避免地会存在杂质化合物，检测其中的杂质化合物对于腺苷-2-硫酮产品以及Cangrelor的质量控制具有重要的意义。
高效液相色谱是一种常用的检测方法，它又分为反相高效液相色谱、正相高效液相色谱，由于两者的固定相、流动相等都完全不同，因此它们是两种差异非常大的检测方法，具体而言：
反相高效液相色谱：采用非极性或相对极性较弱的固定相，以极性较强的溶剂作为流动相，常用于分离、检测非极性和极性较弱的化合物；反相高效液相色谱在现代液相色谱中的应用最为广泛，据统计，它占整个高效液相色谱应用的80％左右。
正相高效液相色谱：采用极性固定相，以相对极性较弱的溶剂作为流动相，常用于分离、检测中等极性和极性较强的化合物。
目前，未见有式B所示化合物检测方法的相关报道。
因此，亟需研发一种操作简便、分离度高的式B所示化合物的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供Cangrelor中间体腺苷-2-硫酮的高效液相色谱检测方法。
本发明提供的Cangrelor中间体腺苷-2-硫酮的高效液相色谱检测方法，它包括以下步骤：
a、配制标准溶液：精密称取0.100g的产品腺苷-2-硫酮，用0.1mol/LNaOH溶液溶解，制成浓度为0.5mg/ml～6mg/ml的溶液，用微孔滤膜过滤，得到标准溶液；
b、采用反相高效液相色谱对标准溶液进行检测，检测条件为：
色谱柱的固定相：表面键合非极性的十八烷基官能团(ODS)的硅胶为填料；
流动相：乙腈和0.3％乙酸水溶液(三乙胺调pH至5.8)(5.2:94.8～5.8:94.2(V:V))；
检测波长：230nm～270nm；
c、按外标法以峰面积计算样品中腺苷-2-硫酮的含量。
进一步的，步骤a中，标准溶液的浓度为1mg/ml～2mg/ml。
进一步的，步骤b中，色谱柱的规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填料粒径为5μm。
进一步的，步骤b中，色谱柱为赛默飞C-18。
进一步的，步骤b中，所述的流动相中，乙腈：0.3％乙酸水的体积比为5.:2：94.8～5.8：94.2。
进一步的，步骤b中，柱温为25℃；流速为0.5ml/min～1ml/min。
进一步的，步骤b中，检测波长为230nm～270nm。
进一步的，步骤b中，进样量为5μl～10μl。
进一步的，步骤b中，分析时间为10min～15min。
本发明检测方法，无需进行梯度洗脱，就能实现腺苷-2-硫酮与杂质化合物的完全分离，分离度在2.5以上，理论塔板数高，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法具有检测结果准确可靠、操作简便、分析时间短等优点。
分离度，等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比，用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标，本领域技术人员可以根据《中国药典2010年版》附录ⅤD给出分离度通常具有的定义、解释等。在高效液相色谱领域中，无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。
附图说明
图1是实施例1待测溶液的检测结果；
图2是实施例1检测波长的试验结果；
图3是试验例1的线性关系图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
本发明中，供试品和对照品可以通过购买市售产品获得，也可以通过以下合成路
线制备得到。
腺苷-2-硫酮可以通过合成制备，并经过检测确证其结构，合成路线如下：
高效液相色谱仪：Ultimate 3000分离单元、DAD-3000(RS)检测器、Chromeleon7色谱工作站，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；
Syncronis-C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
实施例1
本实施例提供Cangrelor中间体腺苷-2-硫酮的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：
配制标准溶液：精密称取0.100g的产品腺苷-2-硫酮，用0.1mol/LNaOH溶液溶解，并定容于100mL。用0.45μm微孔滤膜过滤，得到标准溶液，取5μl进样；
采用反相高效液相色谱对标准溶液进行检测，检测条件为：
色谱柱的固定相：表面键合非极性的十八烷基官能团(ODS)的硅胶为填料；
流动相：乙腈和0.3％乙酸水溶液(三乙胺调pH至5.8)(5.5:94.5(V:V))；
流速：0.5ml/min；
柱温：25℃；
检测波长：254nm；
按照上述检测条件，取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。
按外标法以峰面积计算待测样品中腺苷-2-硫酮的含量。
结果表明，本发明的检测方法，腺苷-2-硫酮和原料及其他杂质在高效液相色谱上分离良好；RSD为2.70％。
确定检测波长
利用紫外分光光度计对样品进行200～800nm全波长的光谱扫描，可以检测腺苷-2-硫酮的紫外吸收波长，试验结果见图2。
试验结果表明，在203nm和289nm波长下目标物吸收值较大，但其他杂质的吸收较弱，不能全部被检测出来。通过一系列的试验发现使用254nm波长进行检测，可以扫描出全部杂质；检测波长在230nm～270nm范围内，均适合本发明的高效液相色谱检测方法。
实施例2
本实施例提供现有的Cangrelor中间体腺苷-2-硫酮的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：
配制标准溶液：精密称取0.010g的产品腺苷-2-硫酮，用纯水溶解，并定容于100mL。用0.45μm微孔滤膜过滤，得到标准溶液，取5μl进样；
采用反相高效液相色谱对标准溶液进行检测，检测条件为：
色谱柱的固定相：表面键合非极性的十八烷基官能团(ODS)的硅胶为填料；
流动相：乙腈和磷酸水溶液(pH＝3)(5:95-30:70(V:V)梯度洗脱)；
流速：1ml/min；
柱温：25℃；
检测波长：260nm；
按照上述检测条件，取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
按外标法以峰面积计算待测样品中腺苷-2-硫酮的含量。
结果表明，已有的检测方法，产品溶液度不高，检测效果不佳。
为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：
试验例1
1、线性关系
分别配制0.5、1、2、3、4、5、6mg/ml浓度的标准溶液。在上述色谱条件分别进样5μl，测定峰面积(mAU*min)积分值，用所配制腺苷-2-硫酮样品的浓度(mg/ml)作为横坐标，谱图中样品的峰面积(mAU*min)为纵坐标，绘制出标准曲线图，详细结果如图3所示。
试验结果表明，在本发明检测条件下，腺苷-2-硫酮的浓度与峰面积线性关系良好，R2＝0.9999。
2、稳定性试验
取腺苷-2-硫酮样品制备供试品溶液适量，分别于室温下0、2、4、8、16、24h进样5μl，进行检测，并且记录下产品的峰面积，计算平均峰面积及RSD，结果见表1。
表1、稳定性试验结果
试验结果表明，24小时内供试品溶液的稳定性良好，满足测定的要求。
3、精密度试验
精密吸取标准溶液(1mg/ml)5μl，连续进样10次，进行HPLC测定，记录样品含量数据，并且计算平均含量、相对标准偏差(RSD)，结果见表2。
相对标准偏差RSD的计算公式为：
式中：S为标准偏差；
n为试样总数或测量次数，一般n值不应少于5个；
i为某成分的各次测量值，1～n。
表2、精密度试验结果
试验结果表明，本发明检测方法的结果精密度良好。
4、重复性试验
精密称取10份腺苷-2-硫酮，每份0.1g，按上述标准溶液的配制方法配制，并用同样的色谱方法进行分析测定。
试验结果表明，本发明检测方法的重复性好。
5、回收率试验
精密称取5份已知含量的腺苷-2-硫酮，并用同样的色谱方法进行分析测定，并计算回收率、RSD,结果见表3。
表3、回收率试验结果
试验结果表明，本发明检测方法的回收率好，检测结果准确可靠。
本发明检测方法的线性关系好、稳定性好、精密度好、重复性好、回收率好，检测结果准确可靠；同时，具有易操作、省时节能等优点。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种Cangrelor中间体腺苷-2-硫酮的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：
a、配制标准溶液：精密称取0.100g的产品腺苷-2-硫酮，用0.1mol/LNaOH溶液溶解，制成浓度为0.5mg/ml～6mg/ml的溶液，用微孔滤膜过滤，得到标准溶液；
b、采用反相高效液相色谱对标准溶液进行检测，检测条件为：色谱柱的固定相：表面键合非极性的十八烷基官能团(ODS)的硅胶为填料；流动相：乙腈和0.3％乙酸水溶液，0.3％乙酸水溶液用三乙胺调pH至5.8；检测波长：230～270nm；所述的流动相中，乙腈：0.3％乙酸水的体积比为5.2：94.8～5.8:94.2；
c、按外标法以峰面积计算样品中腺苷-2-硫酮的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a中，标准溶液的浓度为1mg/ml～2mg/ml。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤b中，色谱柱的规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填料粒径为5μm。
4.根据权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于：步骤b中，色谱柱为赛默飞C-18。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤b中，柱温为25℃；流速为0.5ml/min～1ml/min。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤b中，进样量为5μl～10μl。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤b中，分析时间为10～15min。
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