CN105063017A - 一种质粒dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种质粒DNA提取方法，其包括以下步骤：挑选单一的菌落在含有抗生素的液体培养基中进行扩大培养；向离心管中加入溶液I，充分悬浮细菌沉淀，加入溶液II，缓慢翻转数次，充分裂解2-6min，之后加入溶液III，翻转数次至形成白色聚合物，室温放置2-4min，将得到的溶液离心后，取上清放置在收集管的离心柱上；离心后，弃掉收集管内的废液，继续装载离心柱，向离心柱内加入清洗液A，离心后弃滤液，之后向离心柱内加入清洗液B，离心后弃滤液并重复该步骤2-3次，将离心柱放入无菌工作台的无菌管内，加入预热后的TE缓冲液，静置1min，离心后去掉离心柱，无菌管内得到目的DNA。本发明价格低廉，可大规模的制备，用于科研和药物生产等领域都具有良好效果。
Description
技术领域
本发明涉及分子研究领域，具体的涉及一种质粒DNA提取方法。
背景技术
现有技术提取DNA采用碱裂解法，碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
碱裂解法的具体操作步骤为：取1.5ml培养物加入微量离心管中，室温离心12000g×1min，放弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽，残余液体可用移液枪吸净。
将细菌沉淀重悬于100μL预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-el，10mMEDTAPH：8.0)中，用振荡器剧烈振荡，使菌体分散混匀。
加200μL新鲜配制的溶液II(0.2MNaOH，1％SDS)，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管在室温下放置2min，使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。
加入150μL预冷的溶液III(乙酸钾，PH为4.8)，将离心管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置5min。溶液III为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
取上清至一新离心管中，加入400μL的溶液IV(苯酚/氯仿/异戊醇)，振荡混匀，离心12000g×5min。
小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置5min，离心12000g×15min。
在1ml预冷的70％乙醇中洗涤沉淀1-2次，离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。
沉淀溶于20μLTE(10mMTris-cl，1mMEDTA，含RNaseA20μg/ml)，37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
该方法提取质粒DNA的过程中具有以下几个缺点：
1.提取出来的质粒DNA纯度不高。可能是实验过程中杂蛋白和RNA去除的不干净，影响产物纯度。
2.提取的量太少，可能是实验中反应不完全，损失较多导致的。
3.实验过程中用到苯酚/氯仿/异戊醇等有毒试剂，不利于人员健康。
发明内容
本发明为了解决上述提到的现有的质粒DNA提取过程存在的缺点，提供一种DNA纯度高的质粒DNA提取方法。
具体地，本发明提供一种质粒DNA提取方法，其包括以下步骤：
S1、细菌的培养：挑选单一的菌落在含有抗生素的液体培养基中进行扩大培养，在35℃-40℃下培养12-16小时，将培养后的菌液无菌封装在至少两个离心管中，离心后，放弃上清；
S2、细菌的裂解：向离心管中加入溶液I，充分悬浮细菌沉淀，加入溶液II，缓慢翻转数次，充分裂解2-6min，之后加入溶液III，翻转数次至形成白色聚合物，室温放置2-4min，溶液I、溶液II和溶液III的摩尔比为1∶1∶1.4；
S3、质粒DNA的分离：将S2得到的溶液离心后，取上清放置在收集管的离心柱上；
S4、质粒DNA的收集：离心后，弃掉收集管内的废液，继续装载离心柱，向离心柱内加入清洗液A，离心后后弃滤液，之后向离心柱内加入清洗液B，离心后弃滤液并重复该步骤2-3次，将离心柱放入无菌工作台的无菌管内，加入预热后的TE缓冲液，静置1min，离心后去掉离心柱，无菌管内得到目的DNA，放入-20℃保存或者常温干燥保存，其中清洗液A和清洗液B的摩尔比为5∶7。
优选地，溶液I为25mMTris-cl与10mMEDTA高压灭菌后加入RNaseA0.1067mg/ml得到，其PH为8.0。
优选地，溶液II为0.2MNaOH与1％SDS。
优选地，溶液III为4M盐酸胍与0.5M醋酸钾，其PH为4.2。
优选地，清洗液A为5M盐酸胍、20mMTris-cl与浓度为37.5％乙醇的混合液，其PH为6.0。
优选地，清洗液B为浓度为80％的乙醇。
优选地，TE缓冲液为10mMTris-cl与1mMEDTA，其PH为8.0。
优选地，收集管的离心柱装载有硅胶膜。
本发明的优点如下所述：
本发明针对质粒DNA纯度不高，在相应的试剂中添加盐酸胍来溶解去除多余的杂蛋白。
本发明在收集DNA的过程中采用装有特定的硅胶膜装载在具有过滤垫片的空柱上，用来吸附裂解后的DNA，方便后期的杂蛋白和RNA去除，以及保证没有多余的DNA损失。
采用本发明提取的质粒DNA，在解决了传统方法所得产物纯度不高，有毒，量少等缺点的同时，与应用国外Qiagen柱式纯化试剂盒提取相同的质粒DNA比较，所得的DNA电泳条带同样清晰，无RNA混杂。本发明价格低廉，可扩大到较大规模的制备，用于科研和药物生产等领域都具有不错的效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的结构及工作原理做进一步解释：
1.大肠杆菌的培养。挑选单一的菌落到3-4毫升的含有抗生素的液体培养基中进行扩大培养。培养温度一般为37°，180rpm(180转每分钟)，时长为12-16小时。
2.将菌液无菌封装在2个2ml的离心管中，于12000rpm下离心2min，弃上清。
3.向离心管中加入250微升的溶液I充分悬浮细菌沉淀(移液器吹打)。
4.加入250微升溶液II，缓慢翻转数次，裂解充分4min左右。
5.加入350微升溶液III，翻转数次至形成白色聚合物，室温放置2min。
6.在12000rpm下离心10min，将上清加入安放在一个无盖的收集管上的装有硅胶膜的离心柱上，不能吸到沉淀，以免污染。
7.加热一定量的TE缓冲液，根据质粒种类决定数量，一般每管60-100微升。
8.在12000rpm下离心1min，弃掉收集管内的废液，继续装载离心柱。
9.向离心柱内加入500微升RinseA洗液，12000rpm，30s，然后弃滤液。
10.向离心柱内加入700微升RinseB洗液，12000rpm，30s，然后弃滤液。
11.重复10步骤。
12.12000rpm空离心，弃掉收集管。
13.将离心柱放入无菌工作台的无菌1.5mlEP管内，加入预热后的TE缓冲液60微升，静置1min。
14.12000rpm离心1min，去掉离心柱，EP管内就是目的DNA。放入-20保存或者常温干燥保存。
其中溶液I：25mMTris-cl，10mMEDTA，高压灭菌后加入RNaseA0.1067mg/ml，其PH为8.0；
溶液II：0.2MNaOH，1％SDS；
溶液III：4M盐酸胍，0.5M醋酸钾，其PH为4.2
RinseA：5M盐酸胍、20mMTris-cl以及浓度为37.5％乙醇，其PH为6.0。
RinseB：浓度为80％乙醇。
TE缓冲液：10mMTris-cl以及1mMEDTAPH8.0，并高压灭菌。
最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种质粒DNA提取方法，其特征在于：其包括以下步骤：
S1、细菌的培养：挑选单一的菌落在含有抗生素的液体培养基中进行扩大培养，在35℃-40℃下培养12-16小时，将培养后的菌液无菌封装在至少两个离心管中，离心后，放弃上清；
S2、细菌的裂解：向离心管中加入溶液I，充分悬浮细菌沉淀，加入溶液II，缓慢翻转数次，充分裂解2-6min，之后加入溶液III，翻转数次至形成白色聚合物，室温放置2-4min，溶液I、溶液II和溶液III的摩尔比为1∶1∶1.4；
S3、质粒DNA的分离：将S2得到的溶液离心后，取上清放置在收集管的离心柱上；
S4、质粒DNA的收集：离心后，弃掉收集管内的废液，继续装载离心柱，向离心柱内加入清洗液A，离心后后弃滤液，之后向离心柱内加入清洗液B，离心后弃滤液并重复该步骤2-3次，将离心柱放入无菌工作台的无菌管内，加入预热后的TE缓冲液，静置1min，离心后去掉离心柱，无菌管内得到目的DNA，放入-20℃保存或者常温干燥保存，其中清洗液A和清洗液B的摩尔比为5∶7。
2.根据权利要求1所述的质粒DNA提取方法，其特征在于：溶液I为25mMTris-cl与10mMEDTA高压灭菌后加入RNaseA0.1067mg/ml得到，其PH为8.0。
3.根据权利要求1所述的质粒DNA提取方法，其特征在于：溶液II为0.2MNaOH与1％SDS。
4.根据权利要求1所述的质粒DNA提取方法，其特征在于：溶液III为4M盐酸胍与0.5M醋酸钾，其PH为4.2。
5.根据权利要求1所述的质粒DNA提取方法，其特征在于：清洗液A为5M盐酸胍、20mMTris-cl与浓度为37.5％乙醇的混合液，其PH为6.0。
6.根据权利要求1所述的质粒DNA提取方法，其特征在于：清洗液B为浓度为80％的乙醇。
7.根据权利要求1所述的质粒DNA提取方法，其特征在于：TE缓冲液为10mMTris-cl与1mMEDTA，其PH为8.0。
8.根据权利要求1所述的质粒DNA提取方法，其特征在于：收集管的离心柱装载有硅胶膜。
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| CN106434638A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-02-22 | 河南省农业科学院小麦研究所 | 一种大量提取细菌质粒的方法 |
| CN113755488A (zh) * | 2021-09-30 | 2021-12-07 | 天津津科生物科技有限责任公司 | 一种快速提取高纯度质粒dna的方法 |
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2015
- 2015-08-27 CN CN201510529938.7A patent/CN105063017A/zh active Pending
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