CN105754839A - 一种用于基因纯化的装置及纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于基因纯化的装置，所述装置包括吸头、套筒、筛板和推杆，吸头与套筒前端紧密贴合，筛板为与套筒内壁横截面大小配合的圆片状，筛板、推杆依次置于套筒内部，并分别与套筒内侧壁紧密贴合。在筛板与套筒前端之间，放置有吸附材料。本发明还提供应用该装置进行基因纯化的方法。本发明利用实验室常规耗材及药品实现了细菌基因组及质粒、PCR Clean以及胶回收的低成本、高效率纯化；且整个提取过程不添加任何有毒有机溶剂。本发明的装置制作方法和操作方法简单，可循环使用，降低了成本。清洗及洗脱过程无需使用离心机，且洗脱之前无需晾干挥发乙醇，节省了时间。装置规格种类多，可进行微量及大批量操作。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于基因纯化的装置及纯化方法。
背景技术
质粒被作为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要载体，它可以把目的DNA片段通过重组DNA技术，导入受体细胞中去进行复制和表达。因此质粒提取的质量对后续的分子生物学实验的成败起着关键的作用。目前许多国内外公司都研发和提供了质粒提取试剂盒，但这些试剂盒提取质粒时，需要经过繁琐的步骤，耗时长。且试剂盒中采用许多有毒化学物质，即污染环境又会威胁到操作者的健康。
目前提取细菌质粒DNA的方法主要有：1.酚-氯仿-异戊醇抽提；2.离心柱型质粒提取；3.磁珠法质粒提取；4.基于DEAE的重力柱法质粒提取。
以上四种方法各有缺陷。第一种方法含对人体有毒的有机溶剂，操作危险；第二种方法需要多次使用离心机，操作繁琐，提取过程中有晾干挥发乙醇步骤，增加了时间耗费；第三种方法磁珠易被氧化，且磁力、吸附量与磁珠大小、比表面积成比例，比表面积大，则吸附量高，体积小，磁力小，不易吸附到磁力架上，消耗时间长；第四种方法成本较高，依靠重力作用让液体流过柱子，流速慢，耗时长，洗脱体积大，盐离子浓度高，最后需对产物浓缩。
基因组DNA制备是分子生物学研究的关键技术，细菌样品中DNA的提取效率和质量对后续研究极其重要。所提取DNA的浓度、纯度及片段大小，对后续PCR、克隆的效果产生了一定影响。理想的基因组DNA提取方法不但要考虑DNA提取得率，还要尽可能地保证DNA的纯度。目前常用的微生物基因组纯化方法主要有碱裂解法、酚-氯仿法等。这些方法普遍存在产物不纯、操作繁琐等问题,且无法摆脱对高速离心机的依赖。
PCRClean作为对PCR产物纯化的一种方法，其纯化效率直接影响到下步酶切反应的进行，纯化效率低会导致整个转化效率过低。
胶回收是对基因片段选择性回收的主要方法，其本身回收体系较为有限且常规溶胶液对基因损伤较大，对回收率及纯度要求更高。
发明内容
为了解决在基因纯化过程中目前存在的使用有毒有机溶剂、多次使用离心机，操作繁琐、提取时间过长、成本高等问题，本发明提供了一种基因纯化方法。本发明的方法操作简便，无需多次离心，节约时间、可重复使用，节约成本、可实现大批量提取、不添加任何有毒有机溶剂。本发明利用实验室常规耗材及药品实现了细菌基因组及质粒、PCRClean以及胶回收的低成本、高效率纯化。
本发明的第一个目的是提供一种用于基因纯化的装置，所述装置包括吸头、套筒、筛板和推杆，吸头与套筒前端紧密贴合，筛板为与套筒内壁横截面大小配合的圆片状，筛板、推杆依次置于套筒内部，并分别与套筒内侧壁紧密贴合。在筛板与套筒前端之间，放置有吸附材料。
作为优选，所述吸附材料为SiO2粉末；
作为优选，所述SiO2粉末的粒径为20-80μm。
作为优选，所述装置的规格为2.5ml、5ml、10ml、20ml、50ml、100ml或300ml。
作为优选，所述装置的容积与SiO2的用量比为：2.5ml：0.1g或2.5ml：0.05g。
本发明的第二个目的是提供应用上述装置提取细菌质粒DNA的方法，当所述装置的规格为2.5ml时，提取细菌质粒DNA的步骤如下：
(1)将革兰氏阴性菌扩大培养后，取1-6ml菌液，离心弃上清；
(2)加200μl细胞悬浮液以悬浮步骤1中的细菌；
(3)向步骤(2)的细胞悬浮液中加入200μl细胞裂解液，温和颠倒混匀2-3次，此时溶液应变为澄清，步骤(3)操作时间不超过1分钟；
(4)向步骤(3)的溶液中加300μl质粒结合液，温和颠倒混匀3-5次，12000rpm离心5-8分钟；
(5)用权利要求1-4任一所述的装置吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；装置中，SiO2粉末的质量为0.1g；
(6)拉动推杆将步骤(4)中的离心上清吸入权利要求1或2所述的装置中，上下颠倒混匀3-5次，推动推杆挤出液体；
(7)拉动推杆吸入500μl去蛋白液，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(8)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(9)重复步骤(7)一次；
(10)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(11)拉动推杆吸入50-300μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将液体挤到新的容器中，获得质粒；
其中，步骤(2)中所述细胞悬浮液的配方为：50mmol/LTris，10mmol/LEDTA，1-10μg/mLRNaseA；以超纯水为溶剂，pH6.0-9.0；
步骤(3)中所述细胞裂解液的配方为：0.05-1.5mol/LNaOH，质量体积百分比为1％-3％的SDS；以超纯水为溶剂；
步骤(4)中所述质粒结合液的配方为：2-6mol/LGuHCl，0.01-1mol/LCH3COOK；以超纯水为溶剂，pH3-5；
步骤(7)中所述去蛋白液的配方为：2-6mol/LGuHCl，100mmol/LTris，20mmol/LEDTA，体积百分比10％-30％的异丙醇；以超纯水为溶剂，pH6-8；
步骤(8)中所述洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；
步骤(10)中所述洗涤液2的配方为：ddH2O；
步骤(11)中所述洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，pH7-12。
本发明的第三个目的是提供应用上述装置提取细菌基因组DNA的方法，所述装置的规格为2.5ml时，提取细菌基因组DNA的步骤如下：
(1)将细菌扩大培养后，取0.5-1ml菌液，离心弃上清；
(2)加200μl细胞悬浮液以悬浮步骤(1)中的细菌；
(3)若为革兰氏阴性菌：向步骤(2)的细胞悬浮液中加入200μl细胞裂解液，10μl浓度为20mg/ml蛋白酶K，温和颠倒混匀2-3次，37℃水浴10min；
若为革兰氏阳性菌：向步骤(2)的细胞悬浮液中加入10μl浓度为100mg/ml的溶菌酶，37℃水浴30min；
(4)向步骤(3)的溶液中加200μl中和液，上下颠倒2-3次；
(5)用权利要求1-4任一所述的装置吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；装置中，SiO2粉末的质量为0.1g；
(6)拉动推杆将步骤(4)中的液体全部吸入套筒中，静置1min，期间每10s颠倒混匀一次，推动推杆挤出液体；
(7)拉动推杆吸入500μl去蛋白液，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(8)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(9)重复步骤(7)一次；
(10)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(11)拉动推杆吸入50-300μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将液体挤到新的容器中，获得基因组DNA；
作为优选，在步骤(11)后还包括以下步骤：拉动推杆吸入500μl0.02mol/LNaOH颠倒混匀5-10次，挤干，吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干，吸入1000μl20％乙醇，常温保存；该步骤是为了清洗装置中的残留物，方便下次使用；
其中，步骤(2)中所述的细胞悬浮液的配方为：50mmol/LTris，10mmol/LEDTA，1μg/mLRNaseA；以超纯水为溶剂；pH6.0-9.0；
步骤(3)中所述细胞裂解液的配方为：体积百分比为2％-6％的TritonX-100，以超纯水为溶剂；
步骤(4)中所述中和液的配方为：2-6mol/LGuHCl，0.5-2mol/LLiCl，体积百分比为30％-60％乙醇；以超纯水为溶剂，pH5-7；
步骤(7)中所述去蛋白液的配方为：2-6mol/LGuHCl，100mmol/LTris，20mmol/LEDTA，体积百分比10％-30％的异丙醇；以超纯水为溶剂，pH6-8；
步骤(8)中所述洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；
步骤(10)中所述洗涤液2的配方为：ddH2O；
步骤(11)中所述洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，pH7-12。
本发明的第四个目的是提供应用上述装置进行PCRClean的方法，所述装置的规格为2.5ml时，进行PCRClean的步骤如下：
(1)以体积比1：1向PCR反应产物中加入结合液，混匀；
(2)用权利要求1-4任一所述的装置吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；装置中，SiO2粉末的质量为0.05g；
(3)拉动推杆将步骤(1)中的液体全部吸入套筒中，上下颠倒混匀3-5次，推动推杆挤出液体；
(4)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(5)重复步骤(3)一次；
(6)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(7)拉动推杆吸入50-100μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将液体挤到新的容器中，获得PCRClean产物；
其中，步骤(1)中所述结合液的配方为：2-6mol/LGuHCl，0.01-1mol/LCH3COOK；以超纯水为溶剂，pH3-5；
步骤(4)中所述洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；
步骤(6)中所述洗涤液2的配方为：ddH2O；
步骤(7)中所述洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，pH7-12。
作为优选，在步骤(7)后还包括以下步骤：拉动推杆吸入500μl0.02mol/LNaOH颠倒混匀5-10次，挤干，吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干，吸入1000μl20％乙醇，常温保存。该步骤是为了清洗装置中的残留物，方便下次使用。
本发明的第五个目的是提供应用权利要求上述装置进行胶回收的方法，所述装置的规格为2.5ml时，进行胶回收的步骤如下：
(1)在胶上切下目的基因条带，以质量体积比1：3加入溶胶液，50℃溶胶5-10min直至胶完全融化；
(2)用权利要求1-4任一所述的装置吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；装置中，SiO2粉末的质量为0.05g；
(3)拉动推杆将步骤(1)中的液体全部吸入套筒中，上下颠倒混匀3-5次，推动推杆挤出液体；
(4)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(5)重复步骤(3)一次；
(6)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(7)拉动推杆吸入50-100μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将液体挤到容器中，获得目的片段基因；
其中，步骤(1)中所述溶胶液的配方为：2-6mol/L硫氰酸胍，0.01-1mol/LCH3COOK，pH3-6，以超纯水为溶剂；
步骤(4)中所述洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；
步骤(6)中所述洗涤液2的配方为：ddH2O；
步骤(7)中所述洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，pH7-12。
作为优选，在步骤(7)后还包括以下步骤：拉动推杆吸入500μl0.02mol/LNaOH颠倒混匀5-10次，挤干，吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干，吸入1000μl20％乙醇，常温保存。该步骤是为了清洗装置中的残留物，方便下次使用。
本发明利用实验室常规耗材及药品实现了细菌基因组及质粒、PCRClean以及胶回收的低成本、高效率纯化；且整个提取过程不添加任何有毒有机溶剂。本发明将SiO2粉末装入带筛板的套筒中，利用推杆的作用吸取和挤出液体，达到纯化细菌基因的目的。本发明的装置制作简单，可循环使用，降低了成本。清洗及洗脱过程无需使用离心机，且洗脱之前无需晾干挥发乙醇，节省了时间。只需推拉推杆就能完成清洗及洗脱过程，操作较为简便。装置规格种类多，可进行微量及大批量操作。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为基因纯化的装置结构图；
图2为应用本发明的方法与其他方法的对比实验。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
试剂：SiO2粉末，购自(国药集团化学试剂有限公司)，粒径在20-80μm。该粒径在不会穿过筛板的情况下保证了最大的比表面积，达到最大吸附量和较快的流速。
实施例1
本发明的一种用于基因纯化的装置结构如下：
如图1所示，本发明的用于细菌基因纯化的装置是在普通注射器的基础上，加入了筛板和吸附材料。具体结构如下：本发明的装置包括吸头4、套筒1、筛板3和推杆2，吸头4与套筒1前端紧密贴合，筛板3为与套筒内壁横截面大小配合的圆片状，筛板3、推杆2依次置于套筒1内部，并分别与套筒1内侧壁紧密贴合。在筛板3与套筒1前端之间，放置有吸附材料，比如粒径在20-80μm之间的SiO2粉末。
装置的容积与SiO2的用量比为：2.5ml：0.1g或2.5ml：0.05g。(当用本发明的装置提取细菌质粒DNA或提取细菌基因组DNA时，装置的容积与SiO2的用量比为：2.5ml：0.1g；当用本发明的装置进行PCRClean或胶回收时，装置的容积与SiO2的用量比为2.5ml：0.05g。
筛板为超高分子聚乙烯材料，疏松多孔，孔径均一，为20μm，购自深圳逗点生物技术有限公司，型号LF093-16-20。
筛板可以将SiO2或其它吸附材料固定在套筒内，通过更换套筒内填料，可以经济快速简便的完成多种目的产物的纯化。本发明的装置可以有多种不同规格，比如2.5ml、5ml、10ml、20ml、50ml、100ml、300ml等，当规格为300ml时，此时，不重复上样可以纯化720ml菌液。
实施例2
一种提取细菌质粒DNA的试剂，由以下成分组成：
细胞悬浮液、细胞裂解液、质粒结合液、去蛋白液、洗涤液、洗脱液。
其中，细胞悬浮液的配方为：50mmol/LTris，10mmol/LEDTA，1-10μg/mLRNaseA；以超纯水为溶剂；pH6.0-9.0，4℃贮存。
细胞裂解液的配方为：0.05-1.5mol/LNaOH，质量体积百分比为1％-3％的SDS；以超纯水为溶剂，室温密闭贮存。在上述组分及组分浓度时，裂解温和快速，对基因组和质粒损伤小，有助于减少基因组污染和保护质粒的超螺旋结构。
质粒结合液的配方为：2-6mol/LGuHCl，0.01-1mol/LCH3COOK；以超纯水为溶剂，pH3-5，室温密闭贮存。2-6mol/L的GuHCl能够有效的变性蛋白质，促进蛋白沉淀。
去蛋白液的配方为：2-6mol/LGuHCl，100mmol/LTris，20mmol/LEDTA，体积百分比10％-30％的异丙醇；以超纯水为溶剂，pH6-8，室温密闭贮存。2-6mol/L的GuHCl能够进一步去除蛋白质，提高质粒浓度；体积比为10％-30％的异丙醇能够增强DNA与SiO2的结合能力。
洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；该洗涤液能够有效去除杂质且不引入新的杂质；
洗涤液2的配方为：ddH2O。该洗涤液能够有效去除残留乙醇，节省时间。
洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，pH7-12，室温密闭贮存。
应用上述提取细菌质粒DNA的试剂提取细菌质粒DNA的方法如下(以2.5ml规格套筒为例)：
(1)取1-6ml在培养基(培养基可以为LB或其它常用细菌培养基)中培养8-16小时的菌液(适用于所有革兰氏阴性菌)，12000rpm离心1分钟，弃上清；
(2)加200μl细胞悬浮液以悬浮步骤1中的细菌；
(3)向步骤(2)的细胞悬浮液中加入200μl细胞裂解液，温和颠倒混匀2-3次，此时溶液应变为澄清，步骤(3)操作时间不超过1分钟；
(4)向步骤(3)的溶液中加300μl质粒结合液，温和颠倒混匀3-5次，12000rpm离心5-8分钟；
(5)称取0.1gSiO2粉末装入带筛板的套筒中，放入推杆，吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；SiO2粉末的作用为吸附质粒DNA；
(6)拉动推杆将步骤(4)中的离心上清吸入套筒中，上下颠倒混匀3-5次，推动推杆挤出液体；
(7)拉动推杆吸入500μl去蛋白液，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(8)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(9)重复步骤(7)一次；
(10)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(11)拉动推杆吸入50-300μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将液体挤到新的EP管中，获得质粒。
实施例3
一种提取细菌基因组DNA的试剂，由以下成分组成：
细胞悬浮液、细胞裂解液、中和液、去蛋白液、洗涤液、洗脱液。
其中，细胞悬浮液的配方为：50mmol/LTris，10mmol/LEDTA，1μg/mLRNaseA；以超纯水为溶剂；pH6.0-9.0，4℃贮存。
细胞裂解液的配方为：体积百分比为2％-6％的TritonX-100，以超纯水为溶剂，室温密闭贮存。体积百分比为2％-6％的TritonX-100裂解温和，对基因组无损伤。
中和液的配方为：2-6mol/LGuHCl，0.5-2mol/LLiCl，体积百分比为30％-60％乙醇；以超纯水为溶剂，pH5-7，室温密闭贮存。加入该中和液后，溶液无絮状沉淀，无需震荡，能更好的保持基因组完整性。
去蛋白液的配方为：2-6mol/LGuHCl，100mmol/LTris，20mmol/LEDTA，体积百分比10％-30％的异丙醇；以超纯水为溶剂，pH6-8，室温密闭贮存。2-6mol/L的GuHCl能够进一步去除蛋白质，提高质粒浓度；体积比为10％-30％的异丙醇能够增强DNA与SiO2的结合能力。
洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；该洗涤液能够有效去除杂质且不引入新的杂质；
洗涤液2的配方为：ddH2O。该洗涤液能够有效去除残留乙醇，节省时间。
洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，pH7-12，室温密闭贮存。
应用上述提取细菌基因组DNA的试剂及装置提取细菌基因组DNA的方法如下(以2.5ml规格套筒为例)：
(1)取0.5-1ml在培养基中培养8-16小时的菌液(适用于所有细菌)，12000rpm离心1分钟，弃上清；
(2)加200μl细胞悬浮液以悬浮步骤(1)中的细菌；
(3)若为革兰氏阴性菌：向步骤(2)的细胞悬浮液中加入200μl细胞裂解液，10μl浓度为20mg/ml蛋白酶K，温和颠倒混匀2-3次，37℃水浴10min；
若为革兰氏阳性菌：向步骤(2)的细胞悬浮液中加入10μl浓度为100mg/ml的溶菌酶，37℃水浴30min；
(4)向步骤(3)的溶液中加200μl中和液，上下颠倒2-3次；
(5)称取0.1gSiO2粉末装入带筛板的套筒中，放入推杆，吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；SiO2粉末的作用为吸附基因组DNA；
(6)拉动推杆将步骤(4)中的液体全部吸入套筒中，静置1min，期间每10s颠倒混匀一次，推动推杆挤出液体；
(7)拉动推杆吸入500μl去蛋白液，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(8)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(9)重复步骤(7)一次；
(10)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(11)拉动推杆吸入50-300μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将液体挤到新的EP管中，获得基因组DNA；
(12)拉动推杆吸入500μl0.02mol/LNaOH颠倒混匀5-10次，挤干，吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干，吸入1000μl20％乙醇，常温保存，以备下次使用。
实施例4
一种PCRClean试剂，由以下成分组成：结合液、洗涤液、洗脱液。
其中，结合液的配方为：2-6mol/LGuHCl，0.01-1mol/LCH3COOK；以超纯水为溶剂，pH3-5，室温密闭贮存。2-6mol/L的GuHCl提供高盐环境使目的基因表现出疏水性而结合到SiO2上；
洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；该洗涤液能够有效去除杂质且不引入新的杂质；
洗涤液2的配方为：ddH2O。该洗涤液能够有效去除残留乙醇，节省时间。
洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，pH7-12，室温密闭贮存。
应用上述PCRClean试剂进行PCRClean的方法(以2.5ml规格套筒为例)如下：
(1)以体积比1：1向PCR反应产物中加入结合液，混匀；
(2)称取0.05gSiO2粉末装入带筛板的套筒中，放入推杆，吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；SiO2粉末的作用为吸附PCR产物；
(3)拉动推杆将步骤(1)中的液体全部吸入套筒中，上下颠倒混匀3-5次，推动推杆挤出液体；
(4)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(5)重复步骤(3)一次；
(6)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(7)拉动推杆吸入50-100μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将液体挤到新的EP管中，获得PCRClean产物；
(8)拉动推杆吸入500μl0.02mol/LNaOH颠倒混匀5-10次，挤干，吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干，吸入1000μl20％乙醇，常温保存，以备下次使用。目的DNA片段在100bp-10Kb之间回收率可达85％-90％之间。
实施例5
一种胶回收的试剂，由以下成分组成：溶胶液、洗涤液、洗脱液。
其中，溶胶液的配方为：2-6mol/L硫氰酸胍，0.01-1mol/LCH3COOK，pH3-6，以超纯水为溶剂，室温密闭贮存。2-6mol/L硫氰酸胍能够快速溶解琼脂糖凝胶；
洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；该洗涤液能够有效去除杂质且不引入新的杂质；
洗涤液2的配方为：ddH2O。该洗涤液能够有效去除残留乙醇，节省时间。
洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，pH7-12，室温密闭贮存。
应用上述胶回收试剂进行胶回收的方法如下(以2.5ml规格套筒为例)：
(1)在胶上切下目的基因条带，放入已称重的离心管中，称重，以质量体积比1：3加入溶胶液，50℃溶胶5-10min直至胶完全融化；
(2)称取0.05gSiO2粉末装入带筛板的套筒中，放入推杆，吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；SiO2粉末的作用为吸附目的条带DNA；
(3)拉动推杆将步骤(1)中的液体全部吸入套筒中，上下颠倒混匀3-5次，推动推杆挤出液体；
(4)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(5)重复步骤(3)一次；
(6)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(7)拉动推杆吸入50-100μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将液体挤到新的EP管中，获得目的片段基因；
(8)拉动推杆吸入500μl0.02mol/LNaOH颠倒混匀5-10次，挤干，吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干，吸入1000μl20％乙醇，常温保存，以备下次使用。目的DNA片段在100bp-10Kb之间回收率可达70％-80％之间。
实施例6对比试验
利用某公司细菌质粒抽提试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒与本发明的各种试剂进行比较(图2)。
图2中，1为DNAmark；2为本发明方法提取基因组DNA；3为本发明方法提取基因组DNA的16SrDNAPCR；4为本发明方法PCRClean；5为本发明方法胶回收；6为本发明方法提取质粒；7为质粒单酶切；8为质粒PCR；9为某公司试剂盒提取基因组DNA；10为某公司试剂盒提取基因组DNA的16SrDNAPCR；11为某公司PCRClean；12为某公司胶回收；13为某公司试剂盒提取质粒。
从图2可以看出，本发明方法所提取的基因组及质粒浓度较高，质粒形态较好，对下游PCR及酶切无影响，符合提取要求。与试剂盒相比，本发明所提基因组浓度较高，且无RNA污染，所提质粒条带单一，多为超螺旋结构，试剂盒所提质粒超螺旋结构较少，说明质粒受损较为严重。在产物纯化及胶回收上本发明与试剂盒效果相当。
主要技术指标：
OD260/OD280＝1.8-2.0，OD260/OD230>2.0(表1为应用本发明的方法提取的结果)，不影响下游酶切及PCR过程(图2)。
表1应用本发明的方法进行提取的结果
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于基因纯化的装置，其特征在于：所述装置包括吸头(4)、套筒(1)、筛板(3)和推杆(2)，吸头(4)与套筒(1)前端紧密贴合，筛板(3)为与套筒内壁横截面大小配合的圆片状，筛板(3)、推杆(2)依次置于套筒(1)内部，并分别与套筒(1)内侧壁紧密贴合。在筛板(3)与套筒(1)前端之间，放置有吸附材料。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述吸附材料为SiO2粉末；作为优选，所述SiO2粉末的粒径为20-80μm。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述装置的规格为2.5ml、5ml、10ml、20ml、50ml、100ml或300ml。
4.根据权利要求1-3任一所述的装置，其特征在于：所述装置的容积与SiO2的用量比为：
2.5ml：0.1g或2.5ml：0.05g。
5.应用权利要求1-4任一所述的装置提取细菌质粒DNA的方法，其特征在于：所述装置的规格为2.5ml时，提取细菌质粒DNA的步骤如下：
(1)将革兰氏阴性菌扩大培养后，取1-6ml菌液，离心弃上清；
(2)加200μl细胞悬浮液以悬浮步骤1中的细菌；
(3)向步骤(2)的细胞悬浮液中加入200μl细胞裂解液，温和颠倒混匀2-3次，此时溶液应变为澄清，步骤(3)操作时间不超过1分钟；
(4)向步骤(3)的溶液中加300μl质粒结合液，温和颠倒混匀3-5次，12000rpm离心5-8分钟；
(5)用权利要求1-4任一所述的装置吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；装置中，SiO2粉末的质量为0.1g；
(6)拉动推杆将步骤(4)中的离心上清吸入权利要求1或2所述的装置中，上下颠倒混匀3-5次，推动推杆挤出液体；
(7)拉动推杆吸入500μl去蛋白液，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(8)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(9)重复步骤(7)一次；
(10)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(11)拉动推杆吸入50-300μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将液体挤到新的容器中，获得质粒；
其中，步骤(2)中所述细胞悬浮液的配方为：50mmol/LTris，10mmol/LEDTA，1-10μg/mLRNaseA；以超纯水为溶剂，pH6.0-9.0；
步骤(3)中所述细胞裂解液的配方为：0.05-1.5mol/LNaOH，质量体积百分比为1％-3％的SDS；以超纯水为溶剂；
步骤(4)中所述质粒结合液的配方为：2-6mol/LGuHCl，0.01-1mol/LCH3COOK；以超纯水为溶剂，pH3-5；
步骤(7)中所述去蛋白液的配方为：2-6mol/LGuHCl，100mmol/LTris，20mmol/LEDTA，体积百分比10％-30％的异丙醇；以超纯水为溶剂，pH6-8；
步骤(8)中所述洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；
步骤(10)中所述洗涤液2的配方为：ddH2O；
步骤(11)中所述洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，pH7-12。
6.应用权利要求1-4任一所述的装置提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于：所述装置的规格为2.5ml时，提取细菌基因组DNA的步骤如下：
(1)将细菌扩大培养后，取0.5-1ml菌液，离心弃上清；
(2)加200μl细胞悬浮液以悬浮步骤(1)中的细菌；
(3)若为革兰氏阴性菌：向步骤(2)的细胞悬浮液中加入200μl细胞裂解液，10μl浓度为20mg/ml蛋白酶K，温和颠倒混匀2-3次，37℃水浴10min；
若为革兰氏阳性菌：向步骤(2)的细胞悬浮液中加入10μl浓度为100mg/ml的溶菌酶，37℃水浴30min；
(4)向步骤(3)的溶液中加200μl中和液，上下颠倒2-3次；
(5)用权利要求1-4任一所述的装置吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；装置中，SiO2粉末的质量为0.1g；
(6)拉动推杆将步骤(4)中的液体全部吸入套筒中，静置1min，期间每10s颠倒混匀一次，推动推杆挤出液体；
(7)拉动推杆吸入500μl去蛋白液，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(8)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(9)重复步骤(7)一次；
(10)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(11)拉动推杆吸入50-300μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将液体挤到新的容器中，获得基因组DNA；
作为优选，在步骤(11)后还包括以下步骤：拉动推杆吸入500μl0.02mol/LNaOH颠倒混匀5-10次，挤干，吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干，吸入1000μl20％乙醇，常温保存；
其中，步骤(2)中所述的细胞悬浮液的配方为：50mmol/LTris，10mmol/LEDTA，1μg/mLRNaseA；以超纯水为溶剂；pH6.0-9.0；
步骤(3)中所述细胞裂解液的配方为：体积百分比为2％-6％的TritonX-100，以超纯水为溶剂；
步骤(4)中所述中和液的配方为：2-6mol/LGuHCl，0.5-2mol/LLiCl，体积百分比为30％-60％乙醇；以超纯水为溶剂，pH5-7；
步骤(7)中所述去蛋白液的配方为：2-6mol/LGuHCl，100mmol/LTris，20mmol/LEDTA，体积百分比10％-30％的异丙醇；以超纯水为溶剂，pH6-8；
步骤(8)中所述洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；
步骤(10)中所述洗涤液2的配方为：ddH2O；
步骤(11)中所述洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，pH7-12。
7.应用权利要求1-4任一所述的装置进行PCRClean的方法，其特征在于：所述装置的规格为2.5ml时，进行PCRClean的步骤如下：
(1)以体积比1：1向PCR反应产物中加入结合液，混匀；
(2)用权利要求1-4任一所述的装置吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；装置中，SiO2粉末的质量为0.05g；
(3)拉动推杆将步骤(1)中的液体全部吸入套筒中，上下颠倒混匀3-5次，推动推杆挤出液体；
(4)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(5)重复步骤(3)一次；
(6)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(7)拉动推杆吸入50-100μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将液体挤到新的容器中，获得PCRClean产物；
其中，步骤(1)中所述结合液的配方为：2-6mol/LGuHCl，0.01-1mol/LCH3COOK；以超纯水为溶剂，pH3-5；
步骤(4)中所述洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；
步骤(6)中所述洗涤液2的配方为：ddH2O；
步骤(7)中所述洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，pH7-12。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在步骤(7)后还包括以下步骤：拉动推杆吸入500μl0.02mol/LNaOH颠倒混匀5-10次，挤干，吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干，吸入1000μl20％乙醇，常温保存。
9.应用权利要求1-4任一所述的装置进行胶回收的方法，其特征在于：所述装置的规格为2.5ml时，进行胶回收的步骤如下：
(1)在胶上切下目的基因条带，以质量体积比1：3加入溶胶液，50℃溶胶5-10min直至胶完全融化；
(2)用权利要求1-4任一所述的装置吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；装置中，SiO2粉末的质量为0.05g；
(3)拉动推杆将步骤(1)中的液体全部吸入套筒中，上下颠倒混匀3-5次，推动推杆挤出液体；
(4)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(5)重复步骤(3)一次；
(6)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(7)拉动推杆吸入50-100μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将液体挤到新的容器中，获得目的片段基因；
其中，步骤(1)中所述溶胶液的配方为：2-6mol/L硫氰酸胍，0.01-1mol/LCH3COOK，pH3-6，以超纯水为溶剂；
步骤(4)中所述洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；
步骤(6)中所述洗涤液2的配方为：ddH2O；
步骤(7)中所述洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，pH7-12。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：在步骤(7)后还包括以下步骤：拉动推杆吸入500μl0.02mol/LNaOH颠倒混匀5-10次，挤干，吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干，吸入1000μl20％乙醇，常温保存。
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