CN105062972B - 一种神经干细胞培养基及利用其进行的人神经干细胞体外长期培养扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种神经干细胞培养基及利用其进行的人神经干细胞体外长期培养扩增方法。该神经干细胞培养基包括以下重量配比的组分：肝素钠100‑1000μg，维生素E10‑100 μg，人重组胰岛素5‑50 mg，腐胺0.5‑5 mg，亚硒酸钠2‑10 μg，人转铁蛋白2‑10 mg，黄体酮2‑10 μg，L－谷氨酰胺300mg，4‑羟乙基哌嗪乙磺酸5.9 g，人重组表皮生长因子10‑100μg，人重组碱性成纤维生长因子10‑100μg，维生素C 葡萄糖苷20‑200 mg，庆大霉素40000‑400000 IU。该神经干细胞培养基解决了人神经干细胞体外培养易分化和难以长期培养扩增的技术难题。

Description

一种神经干细胞培养基及利用其进行的人神经干细胞体外长 期培养扩增方法

技术领域

本发明涉及一种神经干细胞的培养方法，特别涉及一种神经干细胞培养基及利用其进行的人神经干细胞体外长期培养扩增方法。

背景技术

1992年Reynolds and Weiss发现哺乳动物前脑有神经干细胞，并能在体外培养扩增。神经干细胞具有下列特性：1自我更新能力；2分化潜能：具有多向分化潜能，分化成神经元和星形胶质细胞及少突胶质细胞等三类细胞。神经干细胞对神经系统的损伤和神经退行性疾病都有直接或间接的治疗作用，因此大量培养扩增人神经干细胞具有巨大的应用价值。

用胰蛋白酶消化传代神经干细胞的常规方法培养神经干细胞的数量较少，难以获得供临床使用的大量神经干细胞。目前采取的办法是需要获得多个胚胎或胎儿进行多次培养扩增才能获得大量神经干细胞，这不但造成胚胎或胎儿源的贫乏，而且每一个胚胎或胎儿之间都存在差异，神经干细胞来源十分混杂，难以统一，更无法达到标准化。

发明内容

本发明提供一种神经干细胞培养基，其可用于人神经干细胞体外长期培养扩增。

本发明还提供一种所述利用神经干细胞培养基进行的人神经干细胞体外长期培养扩增方法，该方法解决了人神经干细胞体外培养易分化和难以长期培养扩增的技术难题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种神经干细胞培养基，该神经干细胞培养基包括以下重量配比的组分：

作为优选，该神经干细胞培养基包括以下重量配比的组分：

作为优选，该神经干细胞培养基的制备方法为：取12g DMEM/F12培养基与1000mL无菌去离子水混合，加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸搅拌均匀制成基础培养液，使溶液pH值控制在7.0～7.1；然后加入余下各组分混匀即可。

作为优选，该神经干细胞培养基的pH值为6.90～7.10。

一种神经干细胞培养基的制备方法，该方法是：取12g DMEM/F12培养基与1000mL无菌去离子水混合，加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸搅拌均匀制成基础培养液，使溶液pH值控制在7.0～7.1；然后加入余下各组分混匀即可。

一种利用所述的神经干细胞培养基进行人神经干细胞体外长期培养扩增方法，该方法是：采用所述神经干细胞培养基进行培养扩增，细胞瓶置于5％CO₂、37℃温度培养箱中进行培养，根据细胞增殖情况，每3-4天半量更换神经干细胞培养基一次；神经干细胞在神经干细胞培养基中连续培养20-30天，神经干细胞的干细胞球直径为500-1000微米时，把含有干细胞球的培养基用100-200ml注射器吸入，经干细胞球切割器切割，使每1个神经干细胞球切割成3-8小块，每块为30-200微米，切成小块的干细胞团放到新培养瓶中，并加入一半新配制的神经干细胞培养基和另一半使用后的神经干细胞培养基互相混合，按1:2或1:4比例分瓶传代继续培养。

作为优选，所述的干细胞球切割器为不锈钢筛网，不锈钢筛网的孔径为100μm-320μm。孔径的大小根据培养情况和需要分割的小块个数进行选择。

用发明人经过多年研究发现合理配制神经干细胞培养液结合干细胞球切割器的分离传代培养法，对细胞本身没有任何损害，这对长期培养神经干细胞极其有利。本发明解决了体外培养神经干细胞易分化和易死亡的技术难题，达到长期规模化培养人神经干细胞的目的，而且经这种方法培养的人神经干细胞的基因稳定，质量可控，为广泛应用于临床提供重要的、用之不竭的神经干细胞。

本发明的神经干细胞培养基中添加了其它特殊成分：肝素钠、维生素E、维生素C葡萄糖苷、庆大霉素等。

特殊成分的作用机理说明：

①肝素

肝素是一类由糖醛酸和氨基己糖组成的聚阴离子糖胺聚糖类大分子，其分子量约5000Da(3000-8000Da)。它具有抗凝血、抗血栓、抗炎、免疫调节、抗肿瘤转移等作用；能降低血黏稠度，增加脂蛋白酶的活性，增加极低密度脂蛋白和甘油三脂的分解，从而降低血中极低密度脂蛋白、甘油三脂、低密度脂蛋白、总胆固醇。此外，肝素有下列特殊作用：1)可以与许多种蛋白质结合，增强蛋白质作用；2)促进干细胞增殖作用；3)能够间接抑制神经元，间接地达到抑制神经干细胞分化作用，有利于长期神经干细胞培养。

②维生素E(VE)

维生素E对神经元损伤有保护作用。维生素E除了通过抗氧化机制发挥作用外,还可以通过调节相关酶活性机制及调控相关基因表达机制发挥作用。此外，低剂量维生素E长期使用对细胞增殖无不良影响，而大剂量长期使用维生素E有抑制细胞增殖作用，所以，本发明选用小剂量长期使用维生素E，结果非常好，即对长期培养扩增神经干细胞有辅助作用。此外，维生素E具有对抗庆大霉素的毒性作用。

③维生素C葡萄糖苷

维生素C具有抗氧化作用，但是普通维生素C自身很容易被氧化，容易失效，所以为了保护维生素C的活性，做成维生素C葡萄糖苷(VC糖苷)衍生物，以保护维生素C的活性。在长期培养中细胞代谢中不断产生自由基和脂质过氧化反应，VC糖苷通过抑制氧化反应减少自由基的合成，延长细胞的寿命。VC糖苷与天然维生素C相比溶解性更好，在很多pH值环境中都比较稳定。

④庆大霉素(Gentenmycin)

本发明的神经干细胞培养基中不加入青霉素或链霉素，因为青霉素和链霉素的过敏性、肾毒性、耳毒性等副作用，限制了细胞的正常使用。庆大霉素能与细菌核糖体30s亚基结合，阻止细菌生长。同时，它对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气杆菌、克雷白杆菌等十多种细菌有光谱抗菌作用，并且具有热稳定性的优势。庆大霉素对肾毒性和/或耳毒性的副作用与联合使用其他氨基糖苷类、多粘菌素类、头孢噻吩、神经肌肉阻滞药有关，但是即使单独长期使用庆大霉素也可能产生毒性作用，但添加维生素E后，可以消除庆大霉素的副作用。在体外长期培养中，庆大霉素对长期培养扩增人神经干细胞起到防止细菌污染作用，同时添加维生素E和bFGF对干细胞的生长有利，而且可以减轻或对抗庆大霉素的毒副作用。

本发明培养液组分中胰岛素作用是通过促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，从而促进细胞分裂、生长。腐胺能够刺激和诱导神经干细胞生长和增殖。亚硒酸钠促进和参与神经干细胞代谢。人转铁蛋白可结合铁离子，使神经干细胞细胞合理利用铁离子，并减少其对细胞的毒性，从而维持细胞正常状态。黄体酮具有促进神经干细胞生长和调节作用。HEPES是维持细胞液中酸碱平衡作用。

本发明的神经干细胞培养基能够使人神经干细胞在体外长期(>30个月)培养扩增，大量扩增后神经干细胞遗传稳定。本发明很好地解决了人神经干细胞体外培养易分化和难以长期培养扩增的技术难题，从而为临床应用提供来源和标准统一的、用之不竭的大量神经干细胞，用于防治神经系统损伤和退行性疾病、药物筛选、干细胞定向分化和毒理学、药理学以及其它应用学等科学研究中。

附图说明

图1是本发明的人神经干细胞球显微照片(40倍放大)；

图2是本发明的人神经干细胞球显微照片(100倍放大)；

图3是人神经干细胞球的分化显微照片(200倍放大)；

图4是人神经干细胞球单个细胞分化显微照片(100倍放大)；

图5是人神经干细胞球用不锈钢筛网切割后的细胞团块显微照片(100倍放大)；

图6是人神经干细胞球用切割后20天新神经球显微照片(100倍放大)；

图7是人神经干细胞分化1天用巢蛋白抗体荧光标记显微照片(40倍放大)；

图8是人神经干细胞分化后用巢蛋白抗体荧光标记显微照片(200倍放大)；

图9是为人神经干细胞分化后用β-Tublin III抗体荧光标记显示神经元显微照片(400倍放大)；

图10是为人神经干细胞分化后用β-Tublin III抗体荧光标记显示神经元显微照片(1000倍放大)；

图11是人神经干细胞分化(GFAP)荧光抗体标记星形胶质细胞显微照片(400倍放大)；

图12是人神经干细胞分化用Gal-C抗体荧光标记少突胶质细胞显微照片；

图13是人神经干细胞培养不同时间的FAM标记波形图(样本1-3号)；

图14是人神经干细胞培养不同时间的FAM标记波形图(样本4-6号)；

图15是人神经干细胞培养不同时间的FAM标记波形图(样本7-9号)；

图16是人神经干细胞培养不同时间的JOE标记波形图(样本1-3号)；

图17是人神经干细胞培养不同时间的JOE标记波形图(样本4-6号)；

图18是人神经干细胞培养不同时间的JOE标记波形图(样本7-9)；

图19是人神经干细胞培养不同时间的TAM标记波形图(样本1-3)。

图20是人神经干细胞培养不同时间的TAM标记波形图(样本4-6)；

图21是人神经干细胞培养不同时间的TAM标记波形图(样本7-9)。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

DMEM/F12培养基(质量比1∶1)，市售。

实施例1神经干细胞的培养扩增

(1)神经干细胞培养：取制备的胎儿脑源海马神经干细胞，按1-2x 10⁶/ml细胞量种植于细胞培养瓶中。采用神经干细胞培养基进行培养扩增，细胞瓶置于5％CO₂、37℃温度培养箱中进行培养。根据细胞增殖情况，一般培养每3-4天半量换细胞培养基一次。该神经干细胞培养基的组分为：

该神经干细胞培养基的制备方法为：取12g DMEM/F12培养基与1000mL无菌去离子水混合，加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸搅拌均匀制成基础培养液，使溶液pH值控制在7.0～7.1；然后加入余下各组分混匀即可。

(2)传代扩增方式是：神经干细胞以悬浮神经球方式在神经干细胞培养液中培养，每3-4天换半量新鲜培养液，连续培养20-30天。神经干细胞球直径约500-1000微米时，把含有干细胞球的培养基用200ml注射器吸入，经干细胞球切割器(不锈钢筛网)切割，使每1个大的神经干细胞球切割成3-8小块(约30-200微米)，切成小块的干细胞团放到新培养瓶中，并加入一半新配制的培养液，按1:2或1:4比例分瓶传代继续培养。按这种传代扩增方式可以使人神经干细胞连续培养扩增2年以上。培养的人神经干细胞结果见图1，本发明的人神经干细胞球(放大40倍)；图2、人神经干细胞球(放大100倍)；图3、人神经干细胞球的分化；图4、人神经干细胞单细胞分化；图5人神经干细胞球用不锈钢筛网切割后的细胞团块；图6人神经干细胞球切割后20天的新神经球。

实施例2神经干细胞的巢蛋白鉴定

神经干细胞的特异性抗原巢蛋白(nestin)是目前常用于处分神经干细胞与其它干细胞的一种特异抗原，用巢蛋白(nestin)抗体进行免疫荧光染色以初步确定为神经干细胞。

取连续培养10个月的神经干细胞球直接种于多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，细胞密度为5×10⁴/片，5～6天后用巢蛋白(nestin)抗体进行免疫荧光染色。

①用吸管分别取培养10个月3-5个神经干细胞球悬液滴于经多聚赖氨酸包被的载玻片上，置37℃培养箱24h，使细胞黏附于载玻片上。

②用4％多聚甲醛+0.3％戊二醛固定15min。

③用DPBS缓冲液漂洗3次后，用含5％正常山羊血清的DPBS(含0.1％Triton X-100)在37℃温育30min进行封闭。

④吸去封闭液，加抗人nestin单克隆抗体，37℃温育3h后，用含0.1％Triton X-100的DPBS漂洗3次，各10min。

⑤加偶联Rodamine的第二抗体，37℃温育45min。

⑥吸去第二抗体反应液，用DPBS漂洗3次，用封片液封片，荧光显微镜下观察结果。人神经干细胞分化1天用巢蛋白抗体荧光标记(40倍放大)结果见图7，人神经干细胞分化后用巢蛋白抗体荧光标记(200倍放大)结果见图8，图7和图8表明该细胞为神经干细胞。

实施例3神经干细胞的分化鉴定

神经干细胞可以分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经元内含有β-Tublin III抗原，用β-Tublin III抗体荧光标记细胞，检测是否是神经元。星形胶质细胞内含有GFAP抗原蛋白，用GFAP抗体荧光标记细胞，检测是否是星形胶质细胞。少突胶质细胞内含(Gal-C)抗原蛋白，用Gal-C抗体荧光标记细胞，检测是否是少突胶质细胞。

实验方法

(1)取培养10个月的神经干细胞球直接吹打或用0.125％胰蛋白酶和0.5mMEDTA·4Na溶液消化神经干细胞球和吹打后制成单细胞悬液。

(2)细胞以5×10⁴/片密度种于经多聚赖氨酸(100mg/ml)包被的玻璃盖玻片上，在DMEM/F12培养基中添加2％胎牛血清(FBS)，B27添加剂(1：50稀释)，撤除生长因子(EGF,bFGF)进行分化培养。

(3)培养8天后用免疫细胞化学染色

①取培养8天神经干细胞的单细胞的盖玻片，用4％多聚甲醛+0.3％戊二醛固定15min；

②用DPBS漂洗3次后，用含5％正常山羊血清的DPBS(含0.1％Triton X-100)在37℃温育30min进行封闭；

③在生长有细胞的盖玻片上，分别加抗βⅢ微管蛋白(β-TubulinⅢ)单抗、抗胶质源酸性蛋白(GFAP)单抗、抗半乳糖脑苷脂(Gal-C)抗体，4℃反应过夜；

④用含0.1％Triton X-100的DPBS漂洗3次，各10min；

⑤加偶联荧光标记(如FITC，Rhodamine等)的适当稀释的第二抗体，37℃温育45min；

⑥吸去第二抗体反应液，用DPBS漂洗3次，用封片液封片；

⑦在荧光显微镜下观察结果。

结果图9为人神经干细胞分化后用β-Tublin III抗体荧光标记显示神经元(400倍)。图10为人神经干细胞分化后用β-Tublin III抗体荧光标记显示神经元(1000倍)。图11人神经干细胞分化(GFAP)荧光抗体标记星形胶细胞(400倍)，图12人神经干细胞分化(Gal-C)荧光抗体标记少突胶质细胞。结果表明，用β-Tublin III抗体荧光标记细胞显示神经元。用GFAP抗体荧光标记显示星形胶质细胞。用Gal-C抗体荧光标记细胞显示少突胶质细胞。进一步证明我们长期培养的细胞是神经干细胞。

实施例4神经干细胞基因鉴定(STR分析法)

神经干细胞(Neural stem cell，NSC)不仅具有自我更新能力，还能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。长期培养神经干细胞时，由于微环境等多种影响因素可能使神经干细胞突变或遗传不稳定，所以需要用更先进的分析方法确定神经干细胞在长期培养过程中遗传是否稳定。

短串联重复序列(Short tandem repeats，STR)分析法又称为微卫星DNA，重复单位为2-6bp，重复次数10～60多次，基因片段，400bp以下。STR分布于染色体中，多位于非编码区附近，也可位于内含子、启动子、Ali序列中，由于其核心序列单位数目的变化，因此其在人群中变异较大，构成了STR的遗传多态性，现今STR分析法已经广泛应用于基因定位、法医学鉴定、人类学以及遗传病的诊断等许多研究领域中。我们用STR分析法了解我们长期培养的神经干细胞是否神经干细胞和遗传稳定性。

实验方法

1)、分组编号(1-8号)

1号、人神经干细胞(NSC)培养2个月；

2号、NSC培养6个月；

3号、NSC培养12个月；

4号、NSC培养30个月；

5号、NSC混合组(培养2个月，6个月，12个月和30个月)。

6号、阳性对照：2800M DNA。

7号、阴性对照：DEPC水代替DNA。

8号、等位基因Ladder。

2)、STR试剂盒

STR试剂盒由Promega公司生产，试剂盒名称：16HS System。编号：DC2101。

3).人神经干细胞总DNA提取

(1)人神经干细胞培养时间3、6、12、30个月和混合型细胞，编号为样品1-5号细胞。阳性对照编号为6号。

(2)每样品取1.5-1.6X 10⁶神经干细胞，胰蛋白酶37℃消化5min，1000rpm离心5min，弃上清液，加D-Hank’s液悬浮沉淀细胞，重复1次；5000g离心5min，弃上清液；加入500μl细胞裂解液(内含protenase K 5μl)，颠倒20次，50℃水浴3h，半小时摇动一次；冷却至室温，加入500μl平衡酚，快速颠倒1min混匀；5000g离心15min，吸取上层水相加入EP管中；水相中加入氯仿/异戊醇(24∶1)450μl，混匀，5000g离心15min；吸取上层水相与新EP管中，加入10μl RNAase A稀释液(1μl RNAase A+9μl Buffer)，37℃水浴30min；加入50μl 3mol/LNaAC(1/10体积)，无水乙醇加满(2.5倍体积)EP管，混匀，-20℃静置30min；10000g离心15min，弃上清；70％冷乙醇洗涤1～2次，再用无水乙醇清洗，12000g离心10min，弃上清，风干；加入10μl TE缓冲液(1μl+9μl无菌水)，-20℃保存。

4)、琼脂糖凝胶电泳

(1)DNA Marker：5μl DL 15,000；(2)电解液：TAE稀释液；

(3)电泳电压：170V；(4)电泳时间：30min

5)、STR反应体系

DNA：最大上样量17.5μl；

5×Master Mix：5μl；

10×Primer Pair Mix：2.5μl；

去离子水：补足25μl。

6)、PCR反应

(1)反应条件96℃,2分钟；94℃，30秒循环10次；60℃30秒，循环10次；

70℃45秒循环10次；90℃30秒，循环22次；60℃30秒，循环22次；70℃45秒，循环22次；60℃分钟，4℃保存。

7)、STR测序，得到测序结果及波形图。

结果

1).神经干细胞STR测序STR测序结果见表1。

表1培养不同时间神经干细胞短串重复序列重复数次测序结果

基因位点	1号	2号	3号	4号	5号	6号
							D5S818	11,13	11,13	11,13	11,13	11,13	11,13
D13S317	8,12	8,12	8,12	8,12	8,12	8,12
							D7S820	9,11	9,11	9,11	9,11	9,11	9,11
D16S539	9,10	9,10	9,10	9,10	9,10	9,10
							CSF1PO	12	12	12	12	12	12
Penta D	11	11	11	11	11	11
							D3S1358	17	17	17	17	17	17
TH01	6	6	6	6	6	6
							D21S11	29.2,30.2	29.2,30.2	29.2,30.2	29.2,30.2	29.2,30.2	29.2,30.2
D18S51	13,18,25	13,18,25	13,18,25	13,18,25	13,18,25	13,18,25
							Penta E	15	15	15	15	15	15
vWA	16,17	16,17	16,17	16,17	16,17	16,17
							D8S1179	13,14	13,14	13,14	13,14	13,14	13,14
TPOX	8,9	8,9	8,9	8,9	8,9	8,9
							FGA	23,26	23,26	23,26	23,26	23,26	23,26
Amelogenin	X	X	X	X	X	X

注：1号、培养2个月人神经干细胞DNA；2号、培养6个月人神经干细胞DNA；3号、培养12个月人神经干细胞DNA；4号、培养30个月人神经干细胞DNA；5号、混合组DNA(培养2个月，6个月，12个月和30个月人神经干细胞)；6号、阳性对照：标准的人神经干细胞DNA作为对照。

2).神经干细胞STR分析的波形图。

(1)FAM标记波形图，见图13、图14和图15；(2)JOE标记波形图，见图16、图17和图18(3)TAM标记波形图，见图19、图20和图21。

三种标记波形图中的样本分别是1号人神经干细胞(NSC)培养2个月；2号NSC培养6个月；3号NSC培养12个月；4号NSC培养30个月；5号NSC混合组(培养2个月，6个月，12个月和30个月)。6号阳性对照：2800M DNA。7号、阴性对照：DEPC水代替DNA。8号、等位基因Ladder。9号为对照。

三种荧光标记的人神经干细胞培养2个月，6个月，12个月，30个月和混合组与标准的人神经干细胞波形图的图形一致。说明我们长期培养人神经干细胞是人神经干细胞，而且长期培养的人神经干细胞没有基因变异，遗传是稳定的。

实施例5神经干细胞端粒酶鉴定

端粒是保护染色体末端稳定必不可少的结构。端粒长度的维持需要端粒酶活性的存在。永生细胞和肿瘤细胞能够长期生存，端粒酶起到了重要的作用。端粒酶与细胞的增殖、分化和不死性有着极为密切的关系，端粒酶显著增高与细胞癌变和细胞凋亡或衰老有正相关。

干细胞是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。但其在体外长期培养中，分裂次数很多，存在细胞癌变的可能，因此，长期培养过程中，对其进行安全性检测极为重要。本实验通过对端粒酶活性的检测，判断长期培养神经干细胞是否可能成为癌变细胞和细胞凋亡。

实验方法

1).分组：长期培养人神经干细胞，对不同培养时间进行分组。

1)、样本1为培养2个月人神经干细胞(NSC)，3.6×10⁵个细胞；

2)、样本2为培养6个月NSC，2.325×10⁵个细胞；

3)、样本3为培养12个月NSC，2.34×10⁵个细胞；

4)、样本4为培养24个月NSC，1.85×10⁵个细胞；

5)、培养2个月IMR-32肿瘤细胞，2.4×10⁵个细胞；

6)、培养2个月IMR-32肿瘤细胞，2.6×10⁵个细胞，加RNA酶的对照；

7)、阳性对照为试剂盒提供，为冻干粉加入20μl DEPC水而成；

8)、阴性对照为试剂盒提供。

2).试剂盒：

Roche公司生产的试剂盒，名称为Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA Kit.编号：11854666910。

3)、制备细胞

(1)取连续培养2-24个月的人神经干细胞(NSC)球，弃上清，用D-Hanks液清洗2遍；

(2)0.25％胰蛋白酶(1∶5D-Hanks液体稀释)37℃消化5min(肿瘤细胞IMR-32取消此步骤)，移入15ml离心管中；

(3)4℃955g离心5min，弃上清液，加DMEM培养液打散；

(4)加1∶10稀释台盼蓝染色(20μl细胞+80μl染液)，计数；

(5)取约2x 10⁵细胞于1.5ml EP管内，4℃3000g离心5min，弃上清；

(6)3000g离心5min，弃上清液，加D-Hank’s液悬浮沉淀细胞，重复1次；3000g离心5min，弃上清液；

4)、提取RNA及PCR

(1)将细胞小团在200μl裂解试剂(Lysis reagent，1液)中重悬，冰上预冷并提吸至少3次，冰中孵育30min。如果将冷冻细胞团用于提取，加入裂解液前在冰上融化细胞团。

(2)4℃16000g离心20min，取上清液移入离心管中；

(3)将25μl反应复合物(Reaction mixture，2液)加入适合PCR扩增的管中，加入3μl细胞提取物(相当于3x 10³细胞或50ug总蛋白)。并加入无菌水至总体积50ul，所有吸取步骤在冰上进行；

(4)TRAP-PCR。

5)、ELISA检测

(1)取20μl变性试剂(Denaturation reagent，3液)于离心管中(若有大量样本，建议使用无核酸酶包被的微孔板MTP)，加入5μl PCR扩增产物，20℃孵育10分钟；

(2)加入225μl杂交缓冲液(Hybrization buffer，4液)，振荡器混匀；

(3)取100μl混合物加入MTP微孔板中，盖好金属纸，37℃300rpm振荡器中孵育2h；

(4)弃去全部液体，以清洗缓冲液(Washing buffer，5液体，试剂盒10×，使用时稀释为1×)洗3次，每孔250μl，每次至少30秒，弃去冲洗液；

(5)加入100μl抗-DIG-POD工作液(Anti-DIG-POD，6液，使用时50倍稀释，配制成工作液)，盖好金属纸，20℃300rpm振荡器中孵育2h；

(6)弃去液体，每孔250μl清洗缓冲液冲洗5次，每次至少1.5min，小心弃去冲洗缓冲液；

(7)加入100μl TMB底物溶液(TMB substrate soulation，8液)，盖上金属纸，20℃300rpm振荡器中孵育20min；

(8)加入100μl终止液(Stop reagent，9液)，终止反应；

(9)待POD底物的颜色从蓝转黄，30min内分别检测450nm、690nm吸光度值。

实验结果

1)、TRAP-PCR ELISA实验结果

不同培养时间人神经干细胞对端粒酶的影响见表2。

表2.不同培养时间人神经干细胞对端粒酶的影响

注：5、为肿瘤细胞；7、阳性对照为试剂盒提供，为冻干粉加入20μl DEPC水而成。

从表2显示5号肿瘤细胞和7号阳性对照组均显示出较高的端粒酶活性，而2个月、6个月、12个月和24个月培养的神经干细胞与阴性对照及空白组均未显示出端粒酶活性增强作用。实验表明用我们的长期培养人神经干细胞的方法没有增加端粒酶活性，说明这种方法培养的人神经干细胞没有癌变倾向，体现出极高的安全性。

实施例6

一种神经干细胞培养基，其组分为：肝素钠100μg，维生素E10μg，人重组胰岛素5mg，腐胺0.5mg，亚硒酸钠2μg，人转铁蛋白2mg，黄体酮2μg，L－谷氨酰胺300mg，4-羟乙基哌嗪乙磺酸5.8g，人重组表皮生长因子10μg，人重组碱性成纤维生长因子10μg，维生素C葡萄糖苷20mg，庆大霉素100000IU，DMEM/F12培养基12克，去离子水1000ml。其配制方法同实施例1。

实施例7

一种神经干细胞培养基，其组分为：肝素钠1000μg，维生素E100μg，人重组胰岛素50mg，腐胺5mg，亚硒酸钠10μg，人转铁蛋白10mg，黄体酮10μg，L－谷氨酰胺310mg，4-羟乙基哌嗪乙磺酸6.0g，人重组表皮生长因子100μg，人重组碱性成纤维生长因子100μg，维生素C葡萄糖苷200mg，庆大霉素400000IU，DMEM/F12培养基12克，去离子水1000ml。其配制方法同实施例1。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (1)

1.一种神经干细胞培养基进行人神经干细胞体外长期培养扩增方法，其特征在于：采用所述神经干细胞培养基进行培养扩增，细胞瓶置于5% CO₂、 37℃温度培养箱中进行培养，根据细胞增殖情况，每3-4天半量更换神经干细胞培养基一次；

神经干细胞在神经干细胞培养基中连续培养20-30天，神经干细胞的干细胞球直径为500-1000微米时，把含有干细胞球的培养基用100-200 ml注射器吸入，经干细胞球切割器切割，干细胞球切割器为不锈钢筛网，不锈钢筛网的孔径为100μm-320μm；使每1个神经干细胞球切割成3-8小块，每块的直径为30-200微米，切成小块的干细胞团放到新培养瓶中，并加入一半新配制的神经干细胞培养基和另一半使用后的神经干细胞培养基互相混合，按1:2或1:4比例分瓶传代继续培养；

该神经干细胞培养基的组分为：

肝素钠 200μg，

维生素 E 30 μg，

人重组胰岛素 25 mg，

腐胺 1.6 mg，

亚硒酸钠 6 μg，

人转铁蛋白 5.5 mg，

黄体酮 7 μg，

L－谷氨酰胺 300mg，

4-羟乙基哌嗪乙磺酸 5.9 g，

人重组表皮生长因子 20μg，

人重组碱性成纤维生长因子 20μg，

维生素 C 葡萄糖苷 50 mg，

庆大霉素 40000 IU ，

DMEM/F12 培养基 12 克，

去离子水 1000ml。